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Immunology and Infection

Eak 16-द्वितीय के साथ FACS शुद्ध Thymic उपकला कोशिकाओं के 3-डी एकत्रीकरण को बढ़ावा देना / EAKIIH6 स्वयं कोडांतरण हाइड्रोजेल

Published: June 27, 2016 doi: 10.3791/54062
Automatic Translation
1, 2, 1, 1, 1, 1, 1,3, 2, 1,3
1Institute of Cellular Therapeutics, Allegheny Health Network, 2Division of Pharmaceutical Sciences, Mylan School of Pharmacy, Duquesne University, 3Department of Biological Sciences, Carnegie Mellon University

Introduction

थाइमस प्राथमिक लसीकावत् अंग रोगज़नक़ प्रतिक्रियाशील, आत्म-सहिष्णु टी कोशिकाओं की एक विविध आबादी की पीढ़ी है कि अर्जित प्रतिरक्षा प्रणाली के समारोह के लिए आवश्यक है के लिए जिम्मेदार है। यह एक गतिशील अंग जहां विकासशील thymocytes, लिम्फोसाइट पूर्वज कोशिकाओं के रूप में अस्थि मज्जा से आकर बसा है स्पंज की तरह तीन आयामी (3-डी) थाइमिक स्ट्रोमा की मैट्रिक्स के माध्यम से विस्थापित, गुजरना वंश विनिर्देश और भेदभाव, और अंततः के रूप में बसने परिपक्व टी कोशिकाओं। यह अच्छी तरह से प्रोग्राम किया प्रक्रिया की सफलता काफी हद तक पलायन thymocytes और आवासीय थाइमिक उपकला कोशिकाओं (Tecs), थाइमिक स्ट्रोमा के प्रमुख जनसंख्या है कि स्थापित करने और थाइमस microenvironment की अखंडता को बनाए रखने के लिए आवश्यक हैं के बीच परस्पर बात पर निर्भर करता है।

उनकी संरचनात्मक स्थान और अद्वितीय कार्य के आधार पर, Tecs दो सबसेट में बांटा जा सकता है: कोर्टेक्स में Tecs (cTECs) कि जिम्मेदारी हैंआत्म-एमएचसी (प्रमुख उतक अनुरूपता जटिल) के चयन के लिए असंभव टी कोशिकाओं (सकारात्मक चयन), और मज्जा में Tecs (mTECs) कि autoreactive टी कोशिकाओं (नकारात्मक चयन) 1,2 को नष्ट करने के लिए आवश्यक हैं प्रतिबंधित। कई कारकों (जैसे, उम्र बढ़ने, संक्रमण, विकिरण, दवा उपचार) अपरिवर्तनीय नुकसान थाइमिक उपकला करने के लिए, हो सकता है समझौता प्रतिरक्षा अनुकूली में जिसके परिणामस्वरूप। कई प्रयासों के बावजूद, थाइमिक समारोह बहाल करने में कठिनाई थाइमिक microenvironment पुन: पेश करने के कारण चुनौतीपूर्ण हो गया है। विशेष रूप से, थाइमिक तीन आयामी (3-डी) के विन्यास, अस्तित्व और Tecs के समारोह के लिए महत्वपूर्ण है, जबकि Tecs एक 2 डी वातावरण में तेजी से सुसंस्कृत thymopoiesis 3,4 के लिए महत्वपूर्ण जीनों की अभिव्यक्ति में कमी।

EAK16-द्वितीय (AEAEKAKAEAEAKAK) और इसकी सी टर्मिनल histidinylated एनालॉग EAKIIH6 (AEAEKAKAEAEAKAKHHHHHH) कम आणविक वजन, amphiphilic ओलिगोपेप्टाइड कि विआयनीकृत wate में घुलनशील हैंजब ईओण ताकत 20 मिमी NaCl (मानव शरीर के तरल पदार्थ में सामान्य नमक एकाग्रता है 154 मिमी) से अधिक से अवगत कराया आर, लेकिन β-तंतुओं के लिए फार्म का जमाना गुज़रना पड़ता है। यह पर्यावरण संवेदनशील संपत्ति उन्हें बहुमुखी इमारत ब्लॉकों 3 डी संरचनाओं फार्म के लिए बनाता है। परिसरों एक एडाप्टर प्रोटीन दवाओं व अन्य जैविक अणुओं लंगर के रूप में सेवा कर सकते हैं (: EAKII-H6 पर उनका टैग एक डॉकिंग तंत्र है, जो विरोधी उनकी IgGs / एफसी बाध्यकारी पुनः संयोजक प्रोटीन ए / जी (पीए / जी αH6) प्रदान करता है जैसे, एंटीबॉडी) हाइड्रोजेल समग्र 5-8 पर।

हम पहले से दिखा दिया है कि फ्लोरोसेंट लेबल आईजीजी अणुओं हाइड्रोजेल पर लंगर डाले अप करने के लिए 13 दिन 9 के लिए इंजेक्शन स्थल पर बनाए रखा जा सकता है। इसके अलावा, जब αH6: विरोधी सीडी 4 IgGs साथ लंगर पीए / जी एडेप्टर EAK16-द्वितीय / EAKIIH6 (eak) हाइड्रोजेल करने के लिए जोड़ा गया था, सीडी 4+ टी कोशिकाओं विशेष रूप से 10 पर कब्जा कर लिया गया था। इसी तरह की तकनीक का उपयोग करना, हम हाल ही में दिखा दिया है कि Tecs सी के 3-डी एकत्रीकरण(: पीए / जी: αEpCAM αH6) टीईसी-विशिष्ट विरोधी EpCAM एंटीबॉडी ले जाने एडाप्टर परिसरों के साथ eak हाइड्रोजेल में पदोन्नत किया जा ould। जब नग्न चूहों के गुर्दे कैप्सूल के नीचे प्रत्यारोपित, टीईसी समूहों eak हाइड्रोजेल में एम्बेडेड प्रभावी ढंग से विवो 11,12 में कार्यात्मक टी कोशिकाओं के विकास का समर्थन कर सकते हैं।

यहाँ हम हमारे विधि वर्णन जल्दी और प्रभावी प्रतिदीप्ति सक्रिय सेल छँटाई (FACS) के साथ Tecs शुद्ध और eak हाइड्रोजेल प्रणाली के साथ 3-डी टीईसी समुच्चय उत्पन्न करते हैं।

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Protocol

सभी प्रयोगों में प्रयुक्त जानवर प्रोटोकॉल की समीक्षा की और Allegheny स्वास्थ्य नेटवर्क / Allegheny सिंगर अनुसंधान संस्थान के संस्थागत पशु की देखभाल और उपयोग समिति द्वारा अनुमोदित के तहत ALLEGHENY-सिंगर अनुसंधान संस्थान में जानवरों की सुविधा में रखे थे।

1. कोलेजिनेस साथ थाइमस पचाने

  1. हार्वेस्ट थाइमस ग्रंथियों।
    1. एक कार्बन डाइऑक्साइड में 3-5 सप्ताह पुरानी C57BL6 / जम्मू चूहों (सीओ 2) चैम्बर Euthanize थाइमस ग्रंथियों फसल के लिए। विस्तार में, 3-5 मिनट के लिए सीओ 2 के तहत प्रेरण कक्ष में चूहों प्लेस और हृदय या सांस की गिरफ्तारी की पुष्टि करने से मौत की पुष्टि करें।
    2. अपनी पीठ पर शव रख दी है और 70% इथेनॉल के साथ शरीर को गीला। एक तेज, सीधे विदारक अपने पेट पर त्वचा के माध्यम से कैंची के साथ एक छोटा सा क्षैतिज चीरा। दोनों सिरों (सिर और पैर) इतना है कि यह अंदर से बाहर कर दिया जाता है पर त्वचा खींच।
    3. विदारक कैंची बस के नीचे के साथ एक क्षैतिज कटौती करेंसबसे कम पसली और डायाफ्राम के माध्यम से बग़ल में कटौती। एक संदंश के साथ जिफाएडा प्रक्रिया पकड़ो और पसलियों पर दोनों पक्षों को आगे बढ़ने के बीच से काट दिया। पसलियों / उरोस्थि ऊपर खींचो तो यह है कि थाइमस स्पष्ट रूप से दिखाई दे रहा है।
      नोट: थाइमस सीधे दिल के शीर्ष पर स्थित है, 2 पालियों के होते हैं और एक सफेद पारदर्शी रंग का है।
    4. एक घुमावदार संदंश का प्रयोग, धीरे स्कूप और संयोजी ऊतक और समाधान धोने में हस्तांतरण के बंद थाइमस पालियों खींच (सामग्री की सूची देखें)।
  2. 9 मिलीलीटर RPMI 1640 (रोसवेल पार्क मेमोरियल संस्थान मध्यम-1640), 0.025 मिलीग्राम / एमएल शुद्ध कोलेजिनेस, 10 मिमी HEPES [4- (2-hydroxyethyl) -1-piperazineethanesulfonic एसिड], और 0.2 मिलीग्राम / एमएल के मिश्रण से पाचन समाधान तैयार एक 50 मिलीलीटर अपकेंद्रित्र ट्यूब में DNase मैं। उपयोग करें जब तक 37 डिग्री सेल्सियस पानी के स्नान में पाचन समाधान रखें।
    नोट: तैयार पाचन समाधान की राशि अप करने के लिए पांच वयस्क माउस thymi है, जो एक 5 मिलीलीटर polystyrene दौर में एक साथ incubated किया जा सकता के लिए पर्याप्त हैनीचे ट्यूब।
  3. एक 60 मिमी टिशू कल्चर से युक्त 5-6 मिलीलीटर RPMI 1640 डिश के लिए थाइमस स्थानांतरण।
  4. लिम्फोसाइट बाहर बह जाने की छोटे टुकड़ों में 28 जी इंसुलिन सिरिंज सुई (लगभग 1 मिमी 3 वर्ग) के साथ थाइमस काटना।
  5. RPMI 1640 गिलास पाश्चर विंदुक के साथ पेट्री डिश में है के साथ थाइमिक टुकड़े कुल्ला। पकवान झुकाव और थाइमिक टुकड़े नीचे करने के लिए समझौता। धीरे-धीरे aspirate और एक गिलास पिपेट का उपयोग RPMI 1640 सतह पर तैरनेवाला त्यागें। कांच विंदुक के साथ 4-5 बार 5-6 मिलीलीटर RPMI 1640 के साथ इस rinsing चरण को दोहराएँ जब तक समाधान कम अपारदर्शी है।
    नोट: कांच pipettes इस कदम पर सिफारिश कर रहे हैं, क्योंकि थाइमिक टुकड़े प्लास्टिक के लिए छड़ी करने के लिए, थाइमिक ऊतकों के अत्यधिक नुकसान में जिसके परिणामस्वरूप करते हैं। प्रक्रिया के बाकी के लिए, प्लास्टिक pipettes का उपयोग करें।
  6. अंतिम कुल्ला करने के बाद, 1.5 चरण में वर्णित के रूप में सतह पर तैरनेवाला त्यागें। 3 मिलीग्राम पाचन समाधान जोड़ें और एक 5 मिलीलीटर दौर नीचे पी में थाइमस टुकड़े और समाधान के लिए स्थानांतरणolystyrene ट्यूब।
  7. एक ट्यूब रोटेटर पर ट्यूब प्लेस और 12 आरपीएम की घूर्णन गति में 6 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं।
  8. ऊष्मायन के बाद, थाइमिक टुकड़े गंभीरता से ट्यूब के नीचे करने के लिए व्यवस्थित करते हैं। पाश्चर विंदुक के साथ सतह पर तैरनेवाला लीजिए और समाधान धोने के 10 मिलीलीटर के साथ एक 50 मिलीलीटर अपकेंद्रित्र ट्यूब में हस्तांतरण। 5 मिनट के लिए 300 XG पर अपकेंद्रित्र, तैरनेवाला त्यागें और 10 मिलीलीटर धोने के समाधान में कोशिकाओं resuspend। बर्फ पर रखें।
  9. दोहराएँ 5 मिलीलीटर दौर नीचे polystyrene ट्यूब में थाइमिक टुकड़े पर दो बार 1.6-1.8 कदम। एक ही 50 मिलीलीटर ट्यूब में सतह पर तैरनेवाला पूल।
    नोट: केन्द्रापसारण दूसरे और तीसरे धोने के लिए आवश्यक नहीं है।
  10. अंतिम पाचन के बाद, 2 मिलीलीटर की प्लास्टिक सीरम वैज्ञानिक विंदुक के साथ ऊपर और नीचे pipet और 50 मिलीलीटर अपकेंद्रित्र ट्यूब ट्यूब और हस्तांतरण में किसी भी शेष टुकड़े नीचे तोड़ने के लिए।
  11. अपकेंद्रित्र 5 मिनट के लिए 300 XG पर 50 मिलीलीटर ट्यूब, वाशिंग buffe के 10 मिलीलीटर में सतह पर तैरनेवाला, resuspend aspirateआर और 100 माइक्रोन सेल झरनी के माध्यम से फिल्टर। बर्फ पर रखें।

असंतत घनत्व ढाल के साथ Tecs के संवर्धन 2.

  1. 2.4 मिलीलीटर घनत्व ढाल मध्यम (60% w / पानी में iodixanol के वी) और 9.6 मिलीलीटर धोने के समाधान के मिश्रण से 21% घनत्व ढाल समाधान तैयार है।
  2. 5 मिनट और 2.5 मिलीलीटर धोने बफर में resuspend के लिए 300 XG पर कदम 1.11 से 50 मिलीलीटर संग्रह ट्यूब में अलग थाइमिक कोशिकाओं अपकेंद्रित्र।
  3. सेल निलंबन के लिए 20 मिलीलीटर RPMI 1640 मध्यम जोड़ें।
  4. एक इलेक्ट्रॉनिक pipettor के साथ एक 10 मिलीलीटर सीरम वैज्ञानिक pipet में 21% घनत्व ढाल समाधान के 12 मिलीलीटर भरें। 50 मिलीलीटर अपकेंद्रित्र ट्यूब युक्त कोशिकाओं के तल पर सीरम वैज्ञानिक pipet की नोक प्लेस, और घनत्व ढाल समाधान गुरुत्वाकर्षण के माध्यम से ट्यूब के नीचे करने के लिए पलायन करने की अनुमति देते हैं।
    1. धीरे अलग घनत्व की दो परतों पैदा खत्म करने के लिए pipet से घनत्व ढाल समाधान निष्कासित।
  5. 600 XG fo पर अपकेंद्रित्रआर एक झूलते बाल्टी रोटर में आरटी पर 20 मिनट। धीमी स्तर पर मंदी दर निर्धारित करें।
  6. एक नया 50 मिलीलीटर ट्यूब को शीर्ष स्तर और इंटरफ़ेस स्थानांतरण।
    नोट: Tecs की सबसे इंटरफेस में रखा जाता है। लिम्फोसाइटों centrifugation के बाद ट्यूब के नीचे वेग होगा। इन कोशिकाओं को अन्य उद्देश्यों के लिए इस्तेमाल हो रहे हैं, तो तीन बार के लिए 20 मिलीलीटर धोने के समाधान के साथ गोली कुल्ला। कपड़े धोने बफर के 10 मिलीलीटर में कोशिकाओं Resuspend।
  7. धोने के समाधान के लिए 40 मिलीलीटर ट्यूब के लिए कदम 2.6 और अपकेंद्रित्र में 400 XG पर 6 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर जोड़ें। सतह पर तैरनेवाला, एक pipet के साथ महाप्राण निकालने के लिए।
  8. कदम 2.7 में वर्णित के रूप में कपड़े धोने और आकांक्षा 2 बार दोहराएँ।
  9. समाधान धोने के 2 मिलीलीटर में Resuspend और एक hemocytometer के साथ कोशिकाओं की गिनती।

3. FACS के साथ अलग Tecs

  1. 1x10 6 कोशिकाओं / 100 μl की एकाग्रता समाधान और हस्तांतरण धोने के साथ में 2.9 कदम से कोशिकाओं को समायोजित करेंएक 5 मिलीलीटर दौर नीचे ट्यूब (polypropylene या polystyrene, के रूप में प्रवाह सॉर्टर के निर्देश के द्वारा अनुशंसित) के लिए कोशिकाओं।
  2. 1x10 6 कोशिकाओं प्रति 2 μl विरोधी एफसी रिसेप्टर आईजीजी जोड़ें और 10 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं।
  3. (: 150 कमजोर पड़ने, नमूना प्रति 10 μl 1) और विरोधी EpCAM विरोधी CD45 जोड़ें (1: 100 कमजोर पड़ने, नमूना प्रति 10 μl) एंटीबॉडी और अधिक से अधिक 20 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं।
  4. 4 डिग्री सेल्सियस पर 6 मिनट के लिए 400 XG पर 2 मिलीलीटर धोने के समाधान और सेंट्रीफ्यूज के साथ कोशिकाओं को धो लें। एक विंदुक के साथ सतह पर तैरनेवाला aspirate।
  5. 1 मिलीलीटर 1x फॉस्फेट बफर खारा (पीबीएस) में कोशिकाओं Resuspend।
  6. 100 माइक्रोन झरनी के माध्यम से फ़िल्टर।
  7. छँटाई साधन के लिए कोशिकाओं को लागू करें। लिम्फोसाइट और टीईसी आबादी पक्ष-बिखरे हुए प्रकाश (एसएससी) / आगे-बिखरे हुए प्रकाश (एफएससी) पैनल (मृत कोशिकाओं), तो 13 छँटाई के लिए के लिए CD45- EpCAM + चयन किया आबादी पर गेट पर छोटी कोशिकाओं को छोड़कर चयन करें।

4. जीटीईसी / eak समुच्चय के eneration

नोट: अभिकर्मक तैयारी और सेल लामिना हुड के तहत मिश्रण को शामिल चरणों का प्रदर्शन।

  1. एक बाँझ 1.5 मिलीलीटर microcentrifuge ट्यूब में विरोधी उनकी टैग आईजीजी के 4 μl, विरोधी EpCAM आईजीजी के 8 μl और पीए / जी के 2.6 μl मिश्रण से पीए / जी एडाप्टर परिसरों तैयार है, और 5 मिनट के लिए आरटी पर सेते हैं।
  2. धोने के समाधान, और pipet एक कम बाष्पीकरणीय, 96 अच्छी तरह से दौर नीचे टिशू कल्चर प्लेट में से एक अच्छी तरह से करने के लिए 100 μl के साथ 5x10 4 कोशिकाओं / एमएल के लिए कदम 3.7 से हल Tecs समायोजित करें। कोशिकाओं को 14.6 μl पीए / जी एडाप्टर परिसरों जोड़ें। 4 डिग्री सेल्सियस पर 20 मिनट के लिए एक कमाल मंच पर थाली रखें।
  3. 200 μl धोने के समाधान के साथ एक बार धो लें। 6 मिनट के लिए 400 XG पर थाली अपकेंद्रित्र। एक micropipette के साथ सतह पर तैरनेवाला त्यागें।
  4. 200 μl 10% sucrose के समाधान के साथ एक बार धो लें। 6 मिनट के लिए 400 XG पर अपकेंद्रित्र। एक micropipette के साथ सतह पर तैरनेवाला त्यागें।
  5. 30 μl 10% s में Resuspend कोशिकाओंअच्छी तरह से प्रति terile सूक्रोज समाधान।
  6. EAKIIH6 के 10 μl (7.5 मिलीग्राम / एमएल) जोड़ें और आरटी पर 5 मिनट के लिए सेते हैं।
  7. टीईसी मिश्रण करने के लिए EAK16-द्वितीय के 20 μl (10 मिलीग्राम / एमएल) जोड़ें।
  8. जमाना आरंभ करने के लिए व्यवस्था करने के लिए पूरा मध्यम के 100 μl जोड़ें। एक मंच पर एक प्रकार के बरतन प्लेट आरटी पर 15-20 मिनट के लिए रखें।
  9. 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में थाली प्लेस और 5% सीओ 2। 2-4 घंटे के बाद, पूरा माध्यम से एक और 100 μl जोड़ें।
  10. उपयोग करें जब तक हर दूसरे दिन मध्यम बदलें।
    1. महाप्राण जेल परेशान एक micropipette का उपयोग और धीरे अच्छी तरह से दीवार के लिए विंदुक टिप रखकर पूर्व गर्म माध्यम के 100 μl जोड़ने के बिना सतह से माध्यम के 100 μl।

5. टीईसी / eak समुच्चय की विशेषता

  1. विवो में टीईसी / eak समुच्चय के समारोह की जांच करने के लिए, एक athymic नग्न के गुर्दे कैप्सूल के तहत हे / एन संस्कृति और प्रत्यारोपण के बाद टीईसी / eak हाइड्रोजेल इकट्ठामाउस, पहले प्रक्रिया 11,14 वर्णित का उपयोग।
  2. नग्न चूहों 4-6 सप्ताह विरोधी सीडी 4 के एक कॉकटेल के साथ पोस्ट प्रत्यारोपण और दाग, -CD8, -CD45 से EDTA युक्त रक्त संग्रह ट्यूब में 50-100 μl रक्त के नमूनों की कटाई के द्वारा परिधि में टी कोशिकाओं के विकास की निगरानी और -CD3 12 एंटीबॉडी।
  3. से फ्लो के साथ परिधीय रक्त ल्यूकोसाइट्स (FCM) में टी लिम्फोसाइटों के प्रतिशत का विश्लेषण करें, एकल कोशिका विश्लेषण सॉफ्टवेयर का उपयोग कर 12।

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Representative Results

CD45- stromal कोशिकाओं को समृद्ध करने के घनत्व ढाल जुदाई प्रोटोकॉल का उपयोग की प्रभावशीलता की जांच करने के लिए, दोनों इंटरफेस और उपजी लिम्फोसाइट छर्रों से काटा कोशिकाओं विरोधी CD45 और विरोधी EpCAM एंटीबॉडी के साथ दाग रहे थे। दोनों विरोधी Ulex Europaeus agglutinin 1 (UEA1) और विरोधी MHC वर्ग द्वितीय एंटीबॉडी भी धुंधला कॉकटेल आगे CTEC और mTEC सबसेट की पहचान करने में शामिल थे। जैसा कि चित्र 1 में दिखाया गया है, हम नियमित रूप से 15-20 गुना Tecs के संवर्धन के लिए करीब प्राप्त करने में सक्षम थे।

Eak हाइड्रोजेल में Tecs के एकत्रीकरण की जांच करने के लिए, Tecs 4 सप्ताह पुराने B6.ROSA लाख टन / एमजी चूहों, जो सर्वत्र झिल्ली बाध्य, लाल फ्लोरोसेंट tdTomato अणुओं एक्सप्रेस से अलग थे। टीईसी समुच्चय, जैसा कि ऊपर वर्णित तैयार है, इन विट्रो में दो दिनों के लिए सुसंस्कृत थे और एक confocal खुर्दबीन के नीचे की जांच (

आकृति 1
Tecs की चित्रा 1. प्रवाह cytometric विश्लेषण घनत्व ढाल समाधान के साथ समृद्ध है। प्रकोष्ठों टीईसी आबादी (CD45- EpCAM +) भेद करने के लिए विरोधी CD45 और विरोधी EpCAM एंटीबॉडी के साथ दाग रहे थे। वाम पैनल: एंजाइम पाचन के बाद Thymic कोशिकाओं, घनत्व ढाल प्रक्रिया से पहले। मध्य पैनल: ऊपर परत में कोशिकाओं और घनत्व ढाल समाधान के साथ अलगाव के बाद इंटरफ़ेस। सही पैनल:। Pelleted कोशिकाओं (लिम्फोसाइट गोली) घनत्व ढाल समाधान के साथ अलगाव के बाद यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र 2
चित्र 2। लाख टन / एमजी चूहों से काटा Tecs FACS के साथ अलग थे। Tecs समूहों 96 अच्छी तरह से थाली में, eak हाइड्रोजेल में एम्बेडेड थे सुसंस्कृत और दिन 2. वाम पैनल, Tecs आईजीजी एंटीबॉडी के साथ लेबल रहे थे पर काटा गया; सही पैनल, Tecs विरोधी EpCAM एंटीबॉडी के साथ लेबल रहे थे। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

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Discussion

जबकि Tecs थाइमिक स्ट्रोमा के प्रमुख जनसंख्या कर रहे हैं और संरचना और थाइमस ग्रंथि के कार्य के लिए आवश्यक भूमिका निभाते हैं, वे कुल थाइमिक कोषमयता के बारे में केवल 0.1-0.5% प्रतिनिधित्व करते हैं। उन्होंने यह भी नाजुक कोशिकाओं के रूप में कोशिका मृत्यु के उच्च प्रतिशत कभी कभी यानी, उपचार बाह्य मैट्रिक्स (ईसीएम) से Tecs अलग कर देना, collagenase पाचन के बाद मनाया जाता है। उनकी दुर्लभता (~ 200,000 माउस थाइमस प्रति) और कमजोरी यह एक चुनौतीपूर्ण कार्य Tecs को अलग-थलग करने के लिए बनाया है। टीईसी अलगाव में अत्यधिक शुद्ध collagenase की हाल ही में उपयोग में काफी enzymatic पाचन 15-19 निम्नलिखित जीवित कोशिकाओं की संख्या में वृद्धि हुई है।

हालांकि, Tecs की बहुत छोटी संख्या उनके विश्लेषण और अलगाव के लिए एक बड़ी चुनौती बनी हुई है, के रूप में एंटीबॉडी की बड़ी मात्रा में कोशिका की सतह लेबलिंग के लिए आवश्यक हैं और घटनाओं की अत्यधिक संख्या FACS द्वारा एकत्र होने की जरूरत है। जबकि एंटीबॉडी साधनाडी चुंबकीय मनका प्रौद्योगिकी CD45 + thymocytes चूस लेना करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, उनकी बड़ी मात्रा में यह आर्थिक रूप से लंबे समय में निषेधात्मक बना देता है। हम प्रभावी रूप से एक सरल, एक कदम घनत्व ढाल centrifugation साथ Tecs 15-20 गुना समृद्ध करने में सक्षम थे। Iodixanol घनत्व ढाल माध्यम की आईएसओ आसमाटिक संपत्ति अपने आकार, आकार और घनत्व 20-22 के आधार पर कोशिकाओं की जुदाई की अनुमति देता है। यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि पवित्रता और Tecs की उपज घनत्व ढाल इस्तेमाल किया माध्यम का प्रतिशत से प्रभावित हैं। घनत्व ढाल माध्यम के कम प्रतिशत (18-20% वी / वी) इंटरफेस में Tecs के उच्च शुद्धता, लेकिन कम उपज में परिणाम होगा। इसके विपरीत, जब उच्च iodixanol एकाग्रता (22% वी / वी) का इस्तेमाल किया जाता है, थाइमिक कोशिकाओं की बड़ी मात्रा में Tecs के कम प्रतिशत के साथ एकत्र किया जा सकता है। iodixanol की एकाग्रता प्रयोग का उद्देश्य के आधार पर समायोजित किया जाना चाहिए। Tecs की पवित्रता को काफी हद तक घनत्व ढाल समाधान की उपयोगिता के साथ सुधार हुआ है, वहीं यह shoulपर जोर दिया जाना घ है कि कोशिकाओं को शीर्ष स्तर और इंटरफ़ेस से एकत्र अभी भी CD45 + कोशिकाओं की एक अपेक्षाकृत उच्च अंश (चित्रा 1) होते हैं। इसलिए, जब केवल टीईसी आबादी इस प्रयोग के रूप में आवश्यक है, सेल छँटाई महत्वपूर्ण है, हालांकि इस अतिरिक्त प्रक्रिया कोशिकाओं के कुछ नुकसान का कारण है और अधिक समय की आवश्यकता हो सकती है हो सकता है।

एक एकल या एकाधिक आंत अंगों अस्तर परतों में व्यवस्था की उपकला कोशिकाओं के अधिकांश के विपरीत, Tecs थाइमस स्ट्रोमा, जो अपने अस्तित्व और समारोह के लिए आवश्यक है में 3-डी विन्यास में व्यवस्थित होते हैं। पीए / जी: αEpCAM एडाप्टर परिसरों स्वयं कोडांतरण eak हाइड्रोजेल प्रणाली 3-डी टीईसी समुच्चय है कि सप्ताह में तीन आणविक αH6 द्वारा मध्यस्थता कर रहे हैं के गठन की सुविधा। ध्यान से, से ठीक ट्यूनिंग सांद्रता और EAK16-द्वितीय / EAKIIH6 ओलिगोपेप्टाइड, porosity और हाइड्रोजेल के घनत्व के अनुपात में पोषक तत्वों के प्रवाह और thymocytes के प्रवास के लिए अनुमति देने के लिए समायोजित किया जा सकता है। दरअसल, कार्यात्मकएल टी कोशिकाओं athymic नग्न टीईसी / eak कंपोजिट साथ प्रतिरोपित चूहों में उत्पन्न किया गया।

इस eak हाइड्रोजेल प्रणाली में दोष यह है कि इस मौजूदा प्रोटोकॉल के साथ, विशेष सेल रचना एक निर्धारित क्षेत्र के लिए स्थानीय नहीं किया जा सकता है। एक भौतिक वातावरण में एक थाइमस दो अलग-अलग डिब्बों, जिसमें Tecs के विशिष्ट प्रकार रहते हैं, मज्जा में कोर्टेक्स में cTECs और mTECs के शामिल है। साथ हमारी प्रणाली यहाँ वर्णित है, दोनों cTECs और mTECs EpCAM, एक सामान्य उपकला मार्कर के साथ लेबल रहे हैं। इसलिए यह अनुमान लगाया है कि गठन हाइड्रोजेल में समुच्चय Tecs के दोनों उपप्रकार भी शामिल है। cTECs और mTECs आम bipotent टीईसी पूर्वज से प्राप्त हालांकि, टी कोशिकाओं के विकास में अपनी भूमिका को स्पष्ट रूप से विशिष्ट हैं। कॉर्टेक्स थाइमस जहां अपरिपक्व थाइमिक पूर्वज कोशिकाओं में प्रवेश करने में पहला क्षेत्र है, और सकारात्मक चयन जगह 23 लेता है। तब चयनित कक्षों डब्ल्यू के माध्यम से मस्तिष्क क्षेत्र में कदम और mTECs के साथ बातचीत,hich आत्म प्रतिक्रियाशील कोशिकाओं नकारात्मक चयन 24 से समाप्त हो जाते हैं। इसके अलावा, यह दिखा दिया है कि जीन की 25% विभिन्न cTECs और mTECs 25 के बीच व्यक्त कर रहे हैं। इन निष्कर्षों टी सेल विकास की प्रभावकारिता में वृद्धि करने के लिए टीईसी कैंपेन्स के एकत्रीकरण को बढ़ावा देने के महत्व को रेखांकित करते हैं। एक संभव दृष्टिकोण इस तरह cTECs के लिए विरोधी cytokeratin 8, और mTECs के लिए विरोधी cytokeratin 5 के रूप में या तो cTECs या mTECs के लिए विशिष्ट सतह अणुओं को लक्षित विभिन्न एंटीबॉडी का उपयोग करने के लिए है।

भविष्य नैदानिक ​​आवेदन के दृष्टिकोण से, टीईसी समूहों biodegradable हाइड्रोजेल में एम्बेडेड अनुकूली प्रतिरक्षा प्रणाली है कि इस तरह के आयु वर्ग के व्यक्तियों में अनुकूली प्रतिरक्षा प्रणाली के कायाकल्प के रूप में विभिन्न चिकित्सा शर्तों, के लिए महत्वपूर्ण हो सकता है मिलाना के रूप में इंजेक्शन "मिनी थाइमस इकाइयों" समारोह हो सकता है , या ठोस अंग प्रत्यारोपण में दाता विशिष्ट सहिष्णुता उत्प्रेरण।

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Acknowledgments

इस काम के स्वास्थ्य के राष्ट्रीय संस्थान द्वारा समर्थित किया गया था R21 AI113000 (wsm) और R01 AI123392 (YF) अनुदान।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
TEC Isolation
70% Ethanol Decon Laboratories 2701(1 Gallon) Ethanol 200 Proof, deionized water
Dissecting scissors, straight Fine Science Tools, Inc. 91460-11
Graefe forceps, straight Fine Science Tools, Inc. 11053-10
Graefe forceps, curved Fine Science Tools, Inc. 11052-10
Washing solution 1x PBS, 0.1% BSA, 2 mM EDTA
1x PBS (Phosphate buffered saline) Gibco 10010-023
BSA (Bovine serum albumin) Sigma A1470-100G
EDTA (ethylenediaminetetraacetic acid) Invitrogen 15575-038
Digestion solution 9 ml RPMI-1640, 0.025 mg/ml Liberase TM Research grade, 10 mM HEPES, 0.2 mg/ml DNaseI
RPMI-1640 Gibco 11879-020
Liberase TM Research Grade Roche 05 401 127 001 referred as "purified collagenase"
1 M HEPES Lonza 17-737E
Dnase I Roche 10 104 159 001
50 ml Centrifuge tube Corning 430290
60 mm tissue culture dish Falcon 353002
1/2 cc U-100 Insulin syringe 28 1/2 G Becton Dickinson 329461
5 ml Polystyrene round-bottom tube Falcon 352058
5 ml glass pipet Fisher Healthcare 13-678-27E Use for rinsing the thymic fragments. Thymic fragments tend to stick to the wall with plastic pipets.
MACSmix tube rotator Miltenyi 130-090-753
100 µm Cell strainer Falcon 352360
Density gradient medium: OptiPrep Axis-Shield
Cell Sorting
5 ml Polypropylene round-bottom tube Falcon 352063
Anti-mouse CD16/CD32 (Fc Block) BD Biosciences 553142 Use as undiluted, 2 µl per sample
Anti-mouse CD45-PercpCy5.5 eBioscience 45-0451-80 Use at 1:150, 10 µl per sample
Anti-mouse CD326 (EpCAM)-PE eBioscience 12-5791-82 Use at 1:100, 10 µl per sample
BD Influx BD Biosciences
Single cell analysis software FlowJo
EAK Gel Assembly
Anti-His-Tag AnaSpec 29673 "anti-His-Tag IgG"
Purified anti-mouse CD326 (EpCAM) BioLegend 118202 "anti-EpCAM IgG"
Recombinant protein A/G Pierce Biotechnology
1.5 ml Safe-Lock Tubes, Biopur, Sterile Fisher Healthcare 05-402-24B referred as "1.5 ml microcentrifuge tube"
96-well, Tissue culture plate, Round-bottom with low evaporation lid BD Falcon 353917
Rocking platform: Nutator Mixer no.1105 BD Clay Adams
10% sucrose Sigma S0389 Prepare with sterile distilled water
EAK16-II (AcNH-AEAEAKAKAEAEAKAK-CONH2) American Peptide Company  custom synthesized, 10 mg/ml
EAKIIH6 (AcNH-AEAEAKAKAEAEAKAKHHHHHH-CONH2) American Peptide Company  custom synthesized, 7.5 mg/ml
Complete medium RPMI-1640, 10% FBS, 1% Pen/Strep, 1% L-glutamine, 1% NEAA, 5 mM HEPES, 50 µM 2-Mercaptoethanol
RPMI-1640 Gibco 11879-020
FBS (Fetal Bovine Serum) Atlanta Biologicals S11150 Heat inactivated before use
Pen/Strep Gibco 15140-122
L-glutamine 200 mM (100x) Gibco 25030-081
NEAA (non-essential amino acid) 100x Gibco 11140-050
1 M HEPES BioWhittaker 17-737E
2-Mercaptoethanol (100x) Millipore ES-007-E
Platform shaker: The Belly Dancer Stovall Life Sciences Inc. model: USBDbo

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References

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इम्यूनोलॉजी अंक 112 Thymic उपकला कोशिकाओं हाइड्रोजेल घनत्व ढाल आत्म विधानसभा EAK16 थाइमस पुनर्निर्माण
Eak 16-द्वितीय के साथ FACS शुद्ध Thymic उपकला कोशिकाओं के 3-डी एकत्रीकरण को बढ़ावा देना / EAKIIH6 स्वयं कोडांतरण हाइड्रोजेल
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Tajima, A., Liu, W., Pradhan, I.,… More

Tajima, A., Liu, W., Pradhan, I., Bertera, S., Lakomy, R. A., Rudert, W. A., Trucco, M., Meng, W. S., Fan, Y. Promoting 3-D Aggregation of FACS Purified Thymic Epithelial Cells with EAK 16-II/EAKIIH6 Self-assembling Hydrogel. J. Vis. Exp. (112), e54062, doi:10.3791/54062 (2016).

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