Introduction
Tymus är det primära lymfoida organ som ansvarar för genereringen av en skiftande population av patogenfria reaktiva, självtoleranta T-celler som är av avgörande betydelse för funktionen av det förvärvade immunsystemet. Det är ett dynamiskt organ där u-tymocyter, invandrade från benmärgen som lymfocyt progenitorceller, migrerar genom den svampliknande tredimensionell (3-D) matrisen i tymus stroma, undergår lineage-specifikation och differentiering, och så småningom utvandra som mogna T-celler. Framgången för detta väl programmerad process beror till stor del på överhörning mellan de flytt tymocyter och bostads tymiska epitelceller (TEC), den dominerande befolkningen i tymus stroma som är nödvändiga för att etablera och upprätthålla integriteten i bräss mikromiljö.
Baserat på deras anatomiska läge och unika funktion kan TEC delas in i två undergrupper: de TEC i hjärnbarken (cTECs) som är responrar för att välja själv MHC (major histocompatibility complex) begränsade T-celler (positiv selektion), och TEC i medulla (mTECs) som är väsentliga för att avlägsna autoreaktiva T-celler (negativ selektion) 1,2. Många faktorer (t.ex. åldrande, infektion, strålning, läkemedelsbehandlingar) kan orsaka irreversibla skador på tymus epitel, vilket resulterar i nedsatt adaptiv immunitet. Trots många försök har återställa tymus funktion varit utmanande på grund av svårigheten att återge tymus mikromiljö. Noterbart är tymisk tredimensionell (3-D) -konfiguration kritisk för överlevnaden och funktionen av TEC, medan TEC odlas i ett 2-D miljö snabbt minska uttrycket av gener som är kritiska för thymopoiesis 3,4.
EAK16-II (AEAEKAKAEAEAKAK) och dess C-terminala histidinylated analog EAKIIH6 (AEAEKAKAEAEAKAKHHHHHH) är låg molekylvikt, amfifila oligopeptider som är lösliga i avjoniserat water, men undergår gelning för att bilda p-fibriller när de utsätts för jonstyrka högre än 20 mM NaCl (normal saltkoncentrationen i human kroppsvätska är 154 mM). Miljö lyhörd egenskap gör dem mångsidiga byggstenar för att bilda 3D-strukturer. His-tagg på EAKII-H6 tillhandahåller ett dockningsmekanism, genom vilken de anti-His IgG / Fc-bindande rekombinant protein A / G (αH6: pA / G) komplex kan fungera som en adapter för att förankra proteinläkemedel och andra biomolekyler ( t.ex., antikroppar) på hydrogel sammansatta 5-8.
Vi har tidigare visat att fluorescensmärkta IgG-molekyler förankrade på hydrogelen kan hållas kvar vid injektionsstället under upp till 13 dagar 9. När vidare αH6: pA / G-adaptrar förankrade med anti-CD4-IgG tillsattes till EAK16-II / EAKIIH6 (EAK) hydrogel, CD4 + T-celler specifikt fångade 10. Genom att använda liknande teknik, har vi nyligen visat att 3D-aggregering av TEC cOuld främjas i EAK hydrogel med adapter komplex bär TEC-specifika anti-EpCAM antikroppar (αH6: PA / G: αEpCAM). När transplanteras under njur kapslar av nakna möss, kan TEC kluster inbäddade i EAK hydrogel effektivt stödja utvecklingen av funktionella T-celler in vivo 11,12.
Här illustrerar vi vår metod för att snabbt och effektivt rena TEC med fluorescensaktiverad cellsortering (FACS) och generera 3-D TEC aggregat med EAK-hydrogel-system.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla de djur som används i försöken inhystes i djuranläggningen vid Allegheny-Singer Research Institute under granskats och godkänts av Institutional Animal Care och användning kommittén för Allegheny Health Network / Allegheny Singer Research Institute protokoll.
1. smälta Thymus med kollagenas
- Harvest thymus.
- Euthanize 3-5 veckor gamla C57BL6 / J-möss i en koldioxid (CO 2) kammare att skörda thymus. I detalj, placera mössen i kammaren under CO 2 induktion för 3-5 min och bekräfta döden genom att verifiera hjärt- eller andningsstillestånd.
- Låg stommen på dess baksida och fukta kroppen med 70% etanol. Gör ett litet horisontellt snitt med en skarp, raka dissekera sax på dess buk genom huden. Dra huden på båda ändar (huvud och ben) så att den är vänd ut och in.
- Gör ett horisontellt snitt med dissekera sax knapptdet lägsta revbenet och skär genom membranet i sidled. Håll xiphoid processen med en pincett och skär mitten av ribborna fortgår upp på båda sidor. Dra upp revben / bröstbenet så att bräss syns tydligt.
Notera: Thymus ligger direkt ovanpå hjärtat, består av 2 lober och är av en vit genomskinlig färg. - Med hjälp av en böjd pincett, försiktigt skopa och dra bräss lober bort från bindväv och överföring tvättlösning (se lista över material).
- Förbereda matsmältningen lösning genom blandning av 9 ml RPMI-1640 (Roswell Park Memorial Institute medel 1640), 0,025 mg / ml renad kollagenas, 10 mM HEPES [4- (2-hydroxietyl) -1-piperazinetansulfonsyra], och 0,2 mg / ml DNas i i ett 50 ml centrifugrör. Hålla uppslutningslösningen i 37 ° C vattenbad fram till användning.
Obs: Mängden av uppslutningslösning framställd är tillräcklig för upp till fem vuxna möss Thymi, vilket kan inkuberas tillsammans i en 5 ml polystyren rund-bottenröret. - Överför bräss till en 60 mm vävnadsodlingsskål innehållande 5-6 ml RPMI-1640.
- Dissekera tymus med 28 G insulinspruta nålen i små bitar (ca 1 mm 3 fyrkant) att låta lymfocyterna strömma ut.
- Skölj de tymiska bitar med RPMI-1640 som är i petriskål med glas pasteurpipett. Luta skålen och låt tymiska fragment sedimentera till botten. Sakta aspirera och kasta RPMI-1640 vätskan med hjälp av en glaspipett. Upprepa detta sköljningssteg med 5-6 ml RPMI-1640 för 4-5 gånger med glaspipett tills lösningen är mindre ogenomskinlig.
Obs: Glaspipetter rekommenderas vid detta steg, eftersom tymiska fragment tenderar att hålla sig till plast, vilket resulterar i stor förlust av tymus vävnader. För resten av förfarandet, använda plastpipetter. - Efter sista sköljningen, kasta supernatanten såsom beskrivs i steg 1,5. Tillsätt 3 ml matsmältningen lösning och överföra bräss bitar och lösningen i en 5 ml rundbottnad polystyrene röret.
- Placera röret på en tub rotator och inkubera vid 37 ° C under 6 min vid en rotationshastighet av 12 varv per minut.
- Efter inkubation, låt tymiska fragment sedimentera till botten av röret med självtryck. Samla in supernatanten med pasteurpipett och överför till ett 50 ml centrifugrör med 10 ml tvättlösning. Centrifugera vid 300 xg under 5 min, kasta supernatanten och resuspendera cellerna i 10 ml tvättlösning. Håll på is.
- Upprepa steg 1,6-1,8 två gånger på de tymiska fragmenten i de 5 ml rundbottnad polystyrenrör. Pool supernatanten i samma 50 ml rör.
Anmärkning: Centrifugeringen är inte nödvändigt för den andra och den tredje tvättningen. - Efter den sista matsmältningen, pipettera upp och ned med 2 ml plast serologisk pipett för att bryta ned eventuella kvarvarande fragment i röret och överföring till 50 ml centrifugrör.
- Centrifugera 50 ml rör vid 300 xg under 5 min, aspirera supernatanten, återsuspendera i 10 ml tvätt buffer och filtrera genom 100 | im cellfilter. Håll på is.
2. Anrikning av TEC med kontinuerliga densitetsgradient
- Förbered 21% densitetsgradient lösning genom att blanda 2,4 ml densitetsgradient-medium (60% vikt / volym av jodixanol i vatten) och 9,6 ml tvättlösning.
- Centrifugera dissocierade tymusceller i 50 ml provröret från steg 1,11 vid 300 xg under 5 min och återsuspendera i 2,5 ml tvättbuffert.
- Tillsätt 20 ml RPMI-1640-medium till cellsuspensionen.
- Fyll 12 ml av 21% densitetsgradient lösning i en 10 ml serologisk pipett med en elektronisk pipett. Placera toppen av det serologiska pipett på botten av de 50 ml centrifugrör innehållande celler, och tillåta densitetsgradientlösningen rinna till botten av röret med hjälp av gravitationen.
- utvisa försiktigt densitetsgradientlösningen från pipett till slut att generera de två skikten av olika densiteter.
- Centrifugera vid 600 xg for 20 min vid RT i en svängande-hink rotor. Ställ in inbromsningstakten på den långsammaste nivå.
- Överföra det översta lagret och gränssnittet i ett annat 50 ml rör.
Notera: De flesta av de TEC behålls i gränssnittet. Lymfocyter kommer att fällas till botten av röret efter centrifugering. Om dessa celler skall användas för andra ändamål, skölj pelleten med 20 ml tvättlösning tre gånger. Resuspendera cellerna i 10 ml tvättbuffert. - Lägga tvättlösning upp till 40 ml till röret i steg 2,6 och centrifugera vid 400 xg under 6 min vid 4 ° C. För att ta bort supernatanten, aspirera med en pipett.
- Upprepa tvättningen och de aspiration ytterligare 2 gånger såsom beskrivits i steg 2,7.
- Resuspendera i 2 ml tvättlösning och räkna cellerna med en hemocytometer.
3. Isola TEC med FACS
- Justera celler från steg 2,9 i en koncentration av 1x10 6 celler / 100 | il med tvättlösning och överföringcellerna till en 5 ml rundbottnad rör (polypropylen eller polystyren, som rekommenderas av instruktioner flödet sorterare).
- Lägg 2 | il anti-Fc-receptor-IgG per 1x10 6 celler och inkubera vid 4 ° C under 10 min.
- Lägg anti-CD45 (1: 150 spädning, 10 | j, l per prov) och anti-EpCAM (1: 100 spädning, 10 | j, l per prov) antikroppar och inkubera vid 4 ° C i mer än 20 min.
- Tvätta cellerna med 2 ml tvättlösning och centrifugera vid 400 xg under 6 min vid 4 ° C. Aspirera supernatanten med en pipett.
- Resuspendera cellerna i 1 ml 1x fosfatbuffrad saltlösning (PBS).
- Filtrera genom 100 | am sil.
- Applicera cellerna till sorteringsinstrument. Välj lymfocyter och TEC befolkningen exklusive de minsta cellerna på sido spritt ljus (SSC) / framåt spritt ljus (FSC) panel (döda celler), sedan grinden på den valda populationen för CD45- EpCAM + för sortering 13.
4. Generation av TEC / EAK Aggregates
Obs: Utför reagensberedning och steg som involverar cell blandning under den laminära huva.
- Förbereda pA / G adapter komplexen genom att blanda 4 | il av anti-His-tag-IgG, 8 | il av anti-EpCAM-IgG och 2,6 | il av pA / G i ett sterilt 1,5 ml mikrocentrifugrör, och inkubera vid RT i 5 min.
- Justera de sorterade TEC från steg 3,7 till 5x10 4 celler / ml med tvättlösning, och pipettera 100 | il till en brunn i en låg evaporativ, 96-brunnars rundbottnad vävnadsodlingsplatta. Lägg 14.6 il pA / G adapter komplex till cellerna. Placera plattan på en gungande plattform under 20 min vid 4 ° C.
- Tvätta en gång med 200 ^ il tvättlösning. Centrifugera plattan vid 400 xg under 6 min. Kassera supernatanten med en mikropipett.
- Tvätta en gång med 200 | j, l 10% sackaroslösning. Centrifugera vid 400 xg under 6 min. Kassera supernatanten med en mikropipett.
- Resuspendera cellerna i 30 pl 10% sterile sackaroslösning per brunn.
- Tillsätt 10 | il av EAKIIH6 (7,5 mg / ml) och inkubera under 5 min vid RT.
- Tillsätt 20 | il av EAK16-II (10 mg / ml) till TEC blandningen.
- Tillsätt 100 | il av fullständigt medium till systemet för att initiera gelning. Placera plattan på en plattform skakare under 15-20 min vid RT.
- Placera plattan i inkubatorn vid 37 ° C och 5% CO2. Efter 2-4 timmar, lägga till ytterligare 100 pl komplett medium.
- Ändra mediet varannan dag fram till användning.
- Aspirera 100 ul av mediet från ytan utan att störa gelén med användning av en mikropipett och försiktigt tillsätt 100 | il av förvärmt medium genom att placera pipettspetsen till väggen av brunnen.
5. Karakterisering av TEC / EAK Aggregates
- För att undersöka funktionen hos TEC / EAK aggregat in vivo, samla TEC / EAK hydrogel efter O / N-kulturen och transplantation under njurkapseln av en atymiska naknamus, med hjälp av tidigare beskrivna proceduren 11,14.
- Övervaka utvecklingen av T-celler i periferin genom att skörda 50-100 pl blodprov i EDTA-innehållande bloduppsamlingsrör från nakna möss 4-6 veckor efter transplantation och fläcken med en cocktail av anti-CD4, -CD8, -CD45 och -CD3 antikroppar 12.
- Analysera den procentsats av T-lymfocyter i perifert blod leukocyter med flödescytometri (FCM), med hjälp av en enda cell analysprogramvara 12.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
För att undersöka effekten av att använda densitetsgradient separation protokoll att berika CD45- stromaceller, skördades cellerna från både gränssnittet och de utfällda lymfocyt pellets färgas med anti-CD45 och anti-EpCAM-antikroppar. Både anti-ÄRTTÖRNE agglutinin en (UEA1) och anti-MHC klass II-antikroppar ingick också i färgning cocktail att ytterligare identifiera de CTEC och MTEC delmängder. Som visas i figur 1, kunde vi rutinmässigt uppnå nära till 15-20 gånger anrikning av TEC.
För att undersöka den samling TEC i EAK hydrogel, var TEC isolerades från 4 veckor gamla B6.ROSA mT / Mg-möss, vilka ubiquitously uttrycker de membranbundna, röda fluorescerande tdTomato molekyler. TEC aggregat, framställda såsom beskrivits ovan, odlades under två dagar in vitro och undersöktes under ett konfokalmikroskop ( 
Figur 1. Flödescytometrisk analys av TEC berikad med densitetsgradientlösningen. Celler färgades med anti-CD45 och anti-EpCAM-antikroppar för att särskilja TEC populationen (CD45- EpCAM +). Vänster paneler: tymusceller efter enzymsmältning, innan densitetsgradienten förfarande. Mitten paneler: Celler i det översta lagret och gränssnittet efter separation med densitetsgradientlösningen. Höger sida:. Pelleterade cellerna (lymfocyter pellets) efter separation med densitetsgradientlösningen Klicka här för att se en större version av denna siffra. 
Figur 2.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Medan TEC är den dominerande befolkningen i tymus stroma och spelar viktiga roller för struktur och funktion av thymus, de endast utgör ca 0,1-0,5% av den totala tymus cellularitet. De är också känsliga celler så höga procentsatser av celldöd är ibland observerats efter kollagenasdigestion, dvs, behandlingen för att dissociera TEC från den extracellulära matrisen (ECM). Deras sällsynthet (~ 200.000 per mus bräss) och bräcklighet gjorde det en utmaning att isolera TEC. Den senaste användningen av högrenat kollagenas i TEC isolering avsevärt ökat antalet levande celler efter den enzymatiska nedbrytning 15-19.
Men den mycket litet antal TEC fortfarande en stor utmaning för sin analys och isolering, som behövs stora mängder antikroppar för märkning av cellytan och överdrivna antal händelser måste samlas in genom FACS. Medan antikropp-konjugatd magnetisk pärla teknik kan användas för att tömma CD45 + tymocyter, gör deras stora mängder det ekonomiskt oöverkomliga i det långa loppet. Vi kunde effektivt berika TEC 15-20 gånger med en enkel, ett steg densitetsgradientcentrifugering. Iso-osmotiska egenskap hos iodixanol densitetsgradient-medium medger separation av celler baserat på deras former, storlekar och densiteter 20-22. Det bör noteras att renheten och utbytet av TEC påverkas av den procentuella andelen av densitetsgradienten medium som används. Lägre andel av densitetsgradient-medium (18-20% volym / volym) kommer att resultera i högre renhet av TEC i gränssnittet men lägre utbyte. När däremot högre jodixanol koncentration (22% volym / volym) används, kan större mängd tymusceller samlas med lägre andel av TEC. Koncentrationen av iodixanol bör justeras baserat på syftet med försöket. Medan renheten hos TEC till stor del förbättras med nyttan av densitetsgradienten lösning, shoul detd understrykas att de celler som samlats in från det översta lagret och gränssnittet innehåller fortfarande en relativt hög andel av CD45 + -celler (Figur 1). Därför, när endast den TEC befolkningen krävs som i detta experiment, kommer cellsortering vara avgörande, även om denna extra procedur kan orsaka viss förlust av celler och kräver mer tid.
Till skillnad från de flesta av de epitelceller som är anordnade i en enda eller flera skikt som bekläder viscerala organ, är TEC organiserad i 3-D-konfiguration i tymus stroma, vilket är väsentligt för deras överlevnad och funktion. Det självsamlande EAK hydrogelsystem underlättar bildandet av 3-D-TEC aggregat som medieras av den tri-molekylära αH6: pA / G: αEpCAM adapter komplex. Att notera, genom att finjustera de koncentrationer och förhållanden av EAK16-II / EAKIIH6 oligopeptider, porositeten och densiteten av hydrogelen kan justeras för att tillåta flödet av näringsämnen och migreringen av tymocyter. Faktiskt, functionaL T-celler genererades i atymiska nakna möss som transplanterats med TEC / EAK kompositer.
Nackdelen i detta EAK hydrogel system är att med den nuvarande protokoll, specifik cellkomposition kan inte lokaliseras till ett visst område. I en fysisk miljö en bräss består av två olika avdelningar, i vilka specifika typer av TEC bor, cTECs i hjärnbarken och mTECs i märgen. Med vårt system som beskrivs här, är både cTECs och mTECs märkt med EpCAM, en allmän epitel markör. Därför är det spekulerats i att aggregaten i den bildade hydrogelen omfattar både subtyper av TEC. Även cTECs och mTECs härrör från gemensam bipotent TEC stamfäder, sina roller i utvecklingen av T-celler är klart utmärkande. Cortex är den första regionen i tymus där de omogna tymiska progenitorceller in, och positiv selektion sker 23. Då de markerade cellerna flytta in i märg regionen och interagera med mTECs genom which de självreaktiva celler elimineras genom negativ selektion 24. Vidare har det visats att 25% av de gener som är differentiellt uttryckta mellan cTECs och mTECs 25. Dessa fynd understryker vikten av att främja aggregering av TEC grupper för att öka effekten av T-cellutveckling. En möjlig metod är att använda olika antikroppar inriktade ytmolekyler som är specifika för antingen cTECs eller mTECs, såsom anti-cytokeratin 8 för cTECs, och anti-cytokeratin 5 för mTECs.
Ur framtida klinisk tillämpning kan TEC kluster inbäddade i den biologiskt nedbrytbara hydrogel fungera som injicerbara "mini bräss enheter" för att modulera det adaptiva immunsystemet som kan vara viktigt för olika medicinska tillstånd, såsom föryngra det adaptiva immunsystemet hos äldre personer eller inducera donatorspecifik tolerans i fast organtransplantation.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Detta arbete stöddes delvis av National Institutes of Health bidrag R21 AI113000 (WSM) och R01 AI123392 (YF).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| TEC Isolation | |||
| 70% Ethanol | Decon Laboratories | 2701(1 Gallon) | Ethanol 200 Proof, deionized water |
| Dissecting scissors, straight | Fine Science Tools, Inc. | 91460-11 | |
| Graefe forceps, straight | Fine Science Tools, Inc. | 11053-10 | |
| Graefe forceps, curved | Fine Science Tools, Inc. | 11052-10 | |
| Washing solution | 1x PBS, 0.1% BSA, 2 mM EDTA | ||
| 1x PBS (Phosphate buffered saline) | Gibco | 10010-023 | |
| BSA (Bovine serum albumin) | Sigma | A1470-100G | |
| EDTA (ethylenediaminetetraacetic acid) | Invitrogen | 15575-038 | |
| Digestion solution | 9 ml RPMI-1640, 0.025 mg/ml Liberase TM Research grade, 10 mM HEPES, 0.2 mg/ml DNaseI | ||
| RPMI-1640 | Gibco | 11879-020 | |
| Liberase TM Research Grade | Roche | 05 401 127 001 | referred as "purified collagenase" |
| 1 M HEPES | Lonza | 17-737E | |
| Dnase I | Roche | 10 104 159 001 | |
| 50 ml Centrifuge tube | Corning | 430290 | |
| 60 mm tissue culture dish | Falcon | 353002 | |
| 1/2 cc U-100 Insulin syringe 28 1/2 G | Becton Dickinson | 329461 | |
| 5 ml Polystyrene round-bottom tube | Falcon | 352058 | |
| 5 ml glass pipet | Fisher Healthcare | 13-678-27E | Use for rinsing the thymic fragments. Thymic fragments tend to stick to the wall with plastic pipets. |
| MACSmix tube rotator | Miltenyi | 130-090-753 | |
| 100 µm Cell strainer | Falcon | 352360 | |
| Density gradient medium: OptiPrep | Axis-Shield | ||
| Cell Sorting | |||
| 5 ml Polypropylene round-bottom tube | Falcon | 352063 | |
| Anti-mouse CD16/CD32 (Fc Block) | BD Biosciences | 553142 | Use as undiluted, 2 µl per sample |
| Anti-mouse CD45-PercpCy5.5 | eBioscience | 45-0451-80 | Use at 1:150, 10 µl per sample |
| Anti-mouse CD326 (EpCAM)-PE | eBioscience | 12-5791-82 | Use at 1:100, 10 µl per sample |
| BD Influx | BD Biosciences | ||
| Single cell analysis software | FlowJo | ||
| EAK Gel Assembly | |||
| Anti-His-Tag | AnaSpec | 29673 | "anti-His-Tag IgG" |
| Purified anti-mouse CD326 (EpCAM) | BioLegend | 118202 | "anti-EpCAM IgG" |
| Recombinant protein A/G | Pierce Biotechnology | ||
| 1.5 ml Safe-Lock Tubes, Biopur, Sterile | Fisher Healthcare | 05-402-24B | referred as "1.5 ml microcentrifuge tube" |
| 96-well, Tissue culture plate, Round-bottom with low evaporation lid | BD Falcon | 353917 | |
| Rocking platform: Nutator Mixer no.1105 | BD Clay Adams | ||
| 10% sucrose | Sigma | S0389 | Prepare with sterile distilled water |
| EAK16-II (AcNH-AEAEAKAKAEAEAKAK-CONH2) | American Peptide Company | custom synthesized, 10 mg/ml | |
| EAKIIH6 (AcNH-AEAEAKAKAEAEAKAKHHHHHH-CONH2) | American Peptide Company | custom synthesized, 7.5 mg/ml | |
| Complete medium | RPMI-1640, 10% FBS, 1% Pen/Strep, 1% L-glutamine, 1% NEAA, 5 mM HEPES, 50 µM 2-Mercaptoethanol | ||
| RPMI-1640 | Gibco | 11879-020 | |
| FBS (Fetal Bovine Serum) | Atlanta Biologicals | S11150 | Heat inactivated before use |
| Pen/Strep | Gibco | 15140-122 | |
| L-glutamine 200 mM (100x) | Gibco | 25030-081 | |
| NEAA (non-essential amino acid) 100x | Gibco | 11140-050 | |
| 1 M HEPES | BioWhittaker | 17-737E | |
| 2-Mercaptoethanol (100x) | Millipore | ES-007-E | |
| Platform shaker: The Belly Dancer | Stovall Life Sciences Inc. | model: USBDbo |
References
- Anderson, G., Jenkinson, E. J., Moore, N. C., Owen, J. J. MHC class II-positive epithelium and mesenchyme cells are both required for T-cell development in the thymus. Nature. 362, 70-73 (1993).
- Fan, Y., et al. Thymus-specific deletion of insulin induces autoimmune diabetes. The EMBO J. 28, 2812-2824 (2009).
- Mohtashami, M., Zuniga-Pflucker, J. C. Three-dimensional architecture of the thymus is required to maintain delta-like expression necessary for inducing T cell development. J Immunol. 176, 730-734 (2006).
- Pinto, S., et al. An organotypic coculture model supporting proliferation and differentiation of medullary thymic epithelial cells and promiscuous gene expression. J Immunol. 190, 1085-1093 (2013).
- Fung, S. Y., Yang, H., Chen, P. Formation of colloidal suspension of hydrophobic compounds with an amphiphilic self-assembling peptide. Colloids Surf B Biointerfaces. 55, 200-211 (2007).
- Jun, S., et al. Self-assembly of the ionic peptide EAK16: the effect of charge distributions on self-assembly. Biophys J. 87, 1249-1259 (2004).
- Saunders, M. J., et al. Engineering fluorogen activating proteins into self-assembling materials. Bioconjug Chem. 24, 803-810 (2013).
- Zhang, S., Holmes, T., Lockshin, C., Rich, A. Spontaneous assembly of a self-complementary oligopeptide to form a stable macroscopic membrane. Proc of the Natl Acad Sci U S A. 90, 3334-3338 (1993).
- Wen, Y., et al. Coassembly of amphiphilic peptide EAK16-II with histidinylated analogues and implications for functionalization of beta-sheet fibrils in vivo. Biomaterials. 35, 5196-5205 (2014).
- Zheng, Y., et al. A peptide-based material platform for displaying antibodies to engage T cells. Biomaterials. 32, 249-257 (2011).
- Tajima, A., et al. Bioengineering mini functional thymic units with EAK16-II/EAKIIH6 self-assembling hydrogel. Clin Immunol. 160, 82-89 (2015).
- Fan, Y., et al. Bioengineering Thymus Organoids to Restore Thymic Function and Induce Donor-Specific Immune Tolerance to Allografts. Mol Ther. 23, 1262-1277 (2015).
- Fan, Y., et al. Thymus-specific deletion of insulin induces autoimmune diabetes. The EMBO J. 28, 2812-2824 (2009).
- Fan, Y., et al. Compromised central tolerance of ICA69 induces multiple organ autoimmunity. J Autoimmun. 53, 10-25 (2014).
- Palumbo, M. O., Levi, D., Chentoufi, A. A., Polychronakos, C. Isolation and characterization of proinsulin-producing medullary thymic epithelial cell clones. Diabetes. 55, 2595-2601 (2006).
- Williams, K. M., et al. Single cell analysis of complex thymus stromal cell populations: rapid thymic epithelia preparation characterizes radiation injury. Clin Transl Sci. 2, 279-285 (2009).
- McLelland, B. T., Gravano, D., Castillo, J., Montoy, S., Manilay, J. O. Enhanced isolation of adult thymic epithelial cell subsets for multiparameter flow cytometry and gene expression analysis. J Immunol Methods. 367, 85-94 (2011).
- Seach, N., Wong, K., Hammett, M., Boyd, R. L., Chidgey, A. P. Purified enzymes improve isolation and characterization of the adult thymic epithelium. J Immunol methods. 385, 23-34 (2012).
- Xing, Y., Hogquist, K. A. Isolation, identification, and purification of murine thymic epithelial cells. J Vis Exp. , e51780 (2014).
- Graham, J. M. Separation of monocytes from whole human blood. ScientificWorldJournal. 2, 1540-1543 (2002).
- Li, X., Donowitz, M. Fractionation of subcellular membrane vesicles of epithelial and nonepithelial cells by OptiPrep density gradient ultracentrifugation. Methods Mol Biol. 440, 97-110 (2008).
- Mita, A., et al. Purification method using iodixanol (OptiPrep)-based density gradient significantly reduces cytokine chemokine production from human islet preparations, leading to prolonged beta-cell survival during pretransplantation culture. Transplant Proc. 41, 314-315 (2009).
- Anderson, G., Takahama, Y. Thymic epithelial cells: working class heroes for T cell development and repertoire selection. Trends Immunol. 33, 256-263 (2012).
- Kyewski, B., Klein, L. A central role for central tolerance. Annu Rev Immunol. 24, 571-606 (2006).
- St-Pierre, C., et al. Transcriptome sequencing of neonatal thymic epithelial cells. Sci Rep. 3, 1860 (2013).
