Introduction
O timo é o órgão linfóide primário responsável pela geração de uma população diversa de células, T auto-tolerante patógeno-reactivo que é essencial à função do sistema imune adquirida. Ele é um órgão dinâmico onde timócitos em desenvolvimento, emigraram da medula óssea como células de linfócitos progenitoras, migram através da tridimensional (3-D) de matriz semelhante a esponja do estroma tímico, submeter a linhagem de especificação e diferenciação, e, eventualmente, emigrar quanto madura T-células. O êxito deste processo bem programado depende em grande parte da conversa cruzada entre os timócitos migram e as células epiteliais tímicas residenciais (TEC), a população predominante do estroma tímico que são essenciais para o estabelecimento e a manutenção da integridade do microambiente timo.
Com base na sua localização anatômica e função original, TEC pode ser dividido em dois subconjuntos: os TEC no córtex (CTECs), que são responsável por selecionando auto-MHC (complexo principal de histocompatibilidade) restringiu as células T (seleção positiva), e os TEC na medula (mTECs) que são essenciais para a eliminação de células T auto-reativas (seleção negativa) 1,2. Muitos fatores (por exemplo, envelhecimento, infecção, irradiação, tratamentos de drogas) pode causar danos irreversíveis ao epitélio do timo, resultando na imunidade adaptativa comprometida. Apesar de numerosas tentativas, restaurando a função do timo tem sido difícil devido à dificuldade em reproduzir o microambiente do timo. Notavelmente, a configuração do timo tridimensional (3-D) é crítico para a sobrevivência e função de TEC, enquanto TEC cultivadas num ambiente de 2-D diminuir rapidamente a expressão de genes críticos para a timopoiese 3,4.
EAK16-II (AEAEKAKAEAEAKAK) e o seu análogo histidinylated C-terminal EAKIIH6 (AEAEKAKAEAEAKAKHHHHHH) são de baixo peso molecular, oligopéptidos anfifílicas que são solúveis até o final desionizadaR, mas que são submetidos a gelificação para formar p-fibrilas quando expostos à força iónica mais elevada do que 20 mM de NaCl (concentração normal de sal no fluido corporal humano é de 154 mM). Esta propriedade responsiva ambiental torna-os blocos de construção versáteis para formar estruturas 3D. A His-tag em EAKII-H6 proporciona um mecanismo de encaixe, pelo que os anti-His IgG / Fc-proteína de ligação recombinante A / G (αH6: PA / g) complexos podem servir como um adaptador para ancorar fármacos de proteína e outras biomoléculas ( por exemplo, anticorpos) no composto 5-8 hidrogel.
Foi anteriormente demonstrado que as moléculas de IgG marcado com fluorescentes ancoradas no hidrogel pode ser mantida no local de injecção para até 13 dias 9. Além disso, quando os αH6: adaptadores pA / G ancorados com anti-CD4 IgG foram adicionados ao hidrogel EAK16-II / EAKIIH6 (EAK), células T CD4 + foram especificamente capturado 10. Utilizando uma técnica semelhante, temos demonstrado recentemente que o 3-D agregação de TEC could ser promovida em EAK hidrogel com complexos de adaptadores que transportam os anticorpos anti-EpCAM específico-TEC (αH6: PA / G: αEpCAM). Quando transplantadas sob as cápsulas dos rins de ratinhos nude, os aglomerados TEC incorporados no hidrogel EAK pode efectivamente suportar o desenvolvimento de células T funcionais in vivo 11,12.
Aqui, ilustramos nosso método para purificar rapidamente e eficazmente com TEC de células activadas por fluorescência (FACS) e gerar 3-D agregados TEC com o sistema de EAK hidrogel.
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Protocol
Todos os animais utilizados nos experimentos foram alojados no biotério do Instituto de Pesquisa Allegheny-Singer no âmbito do protocolo revisto e aprovado pelo Comitê de Cuidado e Uso Institucional Animal do / Allegheny Instituto de Pesquisa Cantor Allegheny Health Network.
1. digerindo o Thymus com colagenase
- Colheita timo.
- Euthanize camundongos 3-5 semanas de idade C57BL6 / J em um dióxido de carbono (CO 2) da câmara para colher timo. Em detalhe, colocar os murganhos na câmara sob indução de CO 2 durante 3-5 min e confirmar a morte verificando paragem cardíaca ou respiratória.
- Coloque a carcaça em suas costas e molhar o corpo com 70% de etanol. Fazer uma pequena incisão horizontal com uma afiada, tesouras de dissecação retas em seu abdômen através da pele. Puxar a pele em ambas as extremidades (cabeça e pernas) para que ele seja virado do avesso.
- Faça um corte horizontal com as tesouras de dissecação pouco menosa última costela e cortar através do diafragma para os lados. Segurar o processo xifóide com uma pinça e corte a meio das nervuras procedendo-se em ambos os lados. Puxar para cima o costelas / esterno de modo a que o timo é claramente visível.
Nota: timo situa-se na parte superior do coração, é composto por 2 lóbulos e é de uma cor branca translúcida. - Usando um fórceps curvos, gentilmente colher e puxe os lóbulos do timo fora do tecido conjuntivo e transferência de solução de lavagem (veja a lista de materiais).
- Preparar a solução de digestão por mistura de 9 ml de RPMI-1640 (Roswell Park Memorial Institute forma-1640), 0,025 mg / ml de colagenase purificada, HEPES 10 mM [ácido 4- (2-hidroxietil) -1-piperazinoetanossulfónico], e 0,2 mg / ml ADNase I em um tubo de centrífuga de 50 ml. Manter a solução de digestão em 37 ° C banho de água até à sua utilização.
Nota: A quantidade de solução de digestão preparada é suficiente para timos rato até cinco adulto, que pode ser incubada em conjunto em um 5 ml redonda poliestirenotubo inferior. - Transferir o timo para um prato de cultura de tecidos de 60 milímetros contendo 5-6 ml de RPMI-1640.
- Dissecar o timo com 28 G agulha de insulina seringa em pedaços pequenos (cerca de 1 mm 3 quadrado) para permitir que os linfócitos fluir para fora.
- Lavar as peças do timo com meio RPMI-1640 que se encontra na placa de Petri com uma pipeta de Pasteur de vidro. Incline o prato e deixar que os fragmentos do timo para liquidar o fundo. Lentamente Aspirar e desprezar o sobrenadante RPMI-1640 usando uma pipeta de vidro. Repetir esta etapa de lavagem com 5-6 ml de RPMI-1640 para 4-5 vezes com uma pipeta de vidro, até a solução é menos opaca.
Nota: pipetas de vidro são recomendados nesta etapa, uma vez que fragmentos de timo tendem a se ater ao plástico, resultando em perda excessiva de tecidos do timo. Para o resto do procedimento, utilizam pipetas de plástico. - Após a lavagem final, desprezar o sobrenadante tal como descrito no passo 1.5. Adicionar solução de digestão 3 ml e transferir as peças timo e a solução em 5 ml de p de fundo redondotubo olystyrene.
- Colocar o tubo num rotor tubo e incubar a 37 ° C durante 6 min a uma velocidade de rotação de 12 rpm.
- Após a incubação, os fragmentos de timo deixar assentar no fundo do tubo pela gravidade. Recolhe-se o sobrenadante com uma pipeta de Pasteur e transferir para um tubo de centrífuga de 50 ml com 10 ml de solução de lavagem. Centrifuga-se a 300 xg durante 5 minutos, descarta-se o sobrenadante e ressuspender as células em solução de lavagem de 10 ml. Manter em gelo.
- Repita os passos 1,6-1,8 duas vezes sobre os fragmentos do timo nos 5 mL de tubo de poliestireno de fundo redondo. A piscina do sobrenadante no mesmo tubo de 50 ml.
Nota: A centrifugação não é necessário que a segunda e a terceira lavagem. - Após a digestão final, pipeta cima e para baixo com uma pipeta sorológica 2 ml de plástico para quebrar quaisquer fragmentos restantes no tubo e transferência para o tubo de centrífuga de 50 ml.
- Centrifugar o tubo de 50 ml a 300 xg durante 5 min, aspirar o sobrenadante, ressuspender em 10 ml de lavagem da-manhãr e filtrar através de 100 mm filtro celular. Manter em gelo.
2. Enriquecimento de TEC com gradiente de densidade descontínua
- Preparar a solução de gradiente de densidade de 21% por mistura de 2,4 ml de meio de gradiente de densidade (60% w / v de iodixanol em água) e 9,6 ml de solução de lavagem.
- Centrifugar as células dissociadas do timo no tubo de 50 ml de recolha a partir do passo 1.11 a 300 xg durante 5 min e ressuspender em tampão 2,5 ml de lavagem.
- Adicionar meio de 20 ml de RPMI-1640 à suspensão de células.
- Encha 12 ml de solução de gradiente de densidade de 21% em 10 ml pipeta sorológica com uma pipeta eletrônico. Colocar a ponta da pipeta serológica na parte inferior das células de 50 ml tubo de centrífuga contendo, e permitir que a solução do gradiente de densidade para drenar para a parte inferior do tubo por meio de gravidade.
- Suavemente expelir a solução com gradiente de densidade a partir da pipeta para terminar a geração de as duas camadas de densidades diferentes.
- Centrifugar a 600 xg foR 20 min a RT num rotor oscilante de balde. Definir a taxa de desaceleração no nível mais lento.
- Transferir a camada superior e a interface para um novo tubo de 50 ml.
Nota: A maior parte das TEC são retidos na interface. Linfócitos irá precipitar para o fundo do tubo após a centrifugação. Se estas células estão a ser usados para outros fins, lavar o sedimento com 20 ml de solução de lavagem por três vezes. Ressuspender as células em 10 ml de tampão de lavagem. - Adicionar a solução de lavagem até 40 mL ao tubo no passo 2.6 e centrifugar a 400 xg durante 6 minutos a 4 ° C. Para remover o sobrenadante, aspirado com uma pipeta.
- Repetir a lavagem e a aspiração mais 2 vezes como descrito na etapa 2.7.
- Ressuspender em 2 ml de solução de lavagem e contar as células com um hemocitómetro.
3. TEC de isolamento com FACS
- Ajustar as células do passo 2.9, na concentração de 1x10 6 células / 100 ul com solução de lavagem e transferênciaas células para um tubo de 5 ml de fundo redondo (polipropileno ou poliestireno, como recomendado pelas instruções do classificador de fluxo).
- Adicionar IgG anti-receptor de Fc de 2 ul por 1x10 6 células e incubar a 4 ° C durante 10 min.
- Adicionar anti-CD45 (diluição 1: 150, 10 ul por cada amostra) e anti-EpCAM: anticorpos (uma diluição de 100, 10 ul por cada amostra) e incubar a 4 ° C durante mais de 20 min.
- Lavam-se as células com solução de lavagem de 2 ml e centrifugar a 400 xg durante 6 minutos a 4 ° C. Aspirar o sobrenadante com uma pipeta.
- Ressuspender as células em uma solução salina tamponada com fosfato mL 1x (PBS).
- Filtrar através de filtro de 100 um.
- Aplicar as células para o instrumento de triagem. Selecione o linfócito e da população TEC excluindo as menores células na luz dispersa-lateral (SSC) / light forward-espalhados (FSC) painel (células mortas), então portão à população selecionada para CD45- EpCAM + para classificar 13.
4. Generation da TEC / EAK Agregados
Nota: Execute preparação de reagentes e as etapas que envolvem células misturando sob a capa laminar.
- Preparar complexos de adaptador de pA / L por mistura de 4 ul de anti-His-tag IgG, 8 ul de anti-EpCAM IgG e 2,6 ul de pA / L em 1,5 ml de um tubo de microcentrífuga estéril, e incubar à TA durante 5 min.
- Ajustar as TEC ordenados do passo 3.7 a 5x10 4 culas / ml com solução de lavagem, e pipeta de 100 uL para um poço de uma evaporação baixa, de 96 poços de fundo redondo com placa de cultura de tecido. Adicionar 14.6 ul de adaptadores complexos pA / L para as células. Colocar a placa sobre uma plataforma oscilante durante 20 min a 4 ° C.
- Lavar uma vez com 200 ul de solução de lavagem. Centrifugar a placa a 400 x g durante 6 min. Descartar o sobrenadante com uma micropipeta.
- Lavar uma vez com solução de sacarose de 200 jil de 10%. Centrifugar a 400 xg durante 6 minutos. Descartar o sobrenadante com uma micropipeta.
- Ressuspender as células em 30 ul de 10% ssolução de sacarose terile por poço.
- Adicionar 10 ul de EAKIIH6 (7,5 mg / ml) e incubar durante 5 min à TA.
- Adicionar 20 ul de EAK16-II (10 mg / ml) para a mistura do TCE.
- Adicionar 100 ul de meio completo para o sistema para iniciar a gelificação. Colocar a placa num agitador de plataforma durante 15-20 min à temperatura ambiente.
- Colocar a placa na incubadora a 37 ° C e 5% de CO 2. Após 2-4 h, adicionar mais 100 ul de meio completo.
- Mudança de meio todos os outros dias até à sua utilização.
- Aspirar 100 ul do meio a partir da superfície sem perturbar o gel utilizando uma micropipeta e suavemente adicionar 100 uL de meio de pré-aquecido, colocando a ponta da pipeta para a parede do poço.
5. Caracterização do TCE / EAK Agregados
- Para examinar a função dos agregados TCE / EAK in vivo, recolher o TCE / EAK hidrogel após a cultura D / N e transplante sob a cápsula renal de um nu atímicosrato, usando anteriormente procedimento descrito 11,14.
- Acompanhar o desenvolvimento de células T na periferia colhendo amostras de sangue 50-100 ul para dentro do tubo de recolha de sangue com EDTA do ratinhos nus 4-6 semanas após o transplante e mancha com um coquetel de anti-CD4, -CD8, -CD45 e -CD3 anticorpos 12.
- Analisar as percentagens de linfócitos T nos leucócitos do sangue periférico com citometria de fluxo (FCM), usando software de análise de uma única célula 12.
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Representative Results
Para examinar a eficácia de separação usando o protocolo de gradiente de densidade para enriquecer as células estromais CD45-, células colhidas a partir da interface e as pelotas de linfócitos precipitados foram coradas com anticorpos anti-EpCAM anti-CD45 e. Tanto anti-Ulex europaeus 1 Aglutinina (UEA1) e anticorpos anti-MHC de classe II foram também incluídas no coquetel de coloração para continuar a identificar os subconjuntos CTEC e MTEC. Como mostrado na Figura 1, que foram capazes de alcançar rotineiramente perto de 15-20 vezes o enriquecimento da TEC.
Para examinar a agregação dos TEC no hidrogel EAK, TEC foram isolados de ratos B6.ROSA mT / MG velho de 4 semanas, que ubiquitously expressam as moléculas, tdTomato fluorescência vermelha ligada à membrana. Agregados TEC, preparados como acima descrito, foram cultivadas durante dois dias in vitro e examinado sob um microscópio confocal ( 
Figura 1. Análise de citometria de fluxo de TEC enriquecido com a solução do gradiente de densidade. As células foram coradas com anticorpos anti-EpCAM anti-CD45 e para distinguir população TCE (CD45- EpCAM +). painéis esquerdos: células do timo após a digestão enzimática, antes do procedimento de gradiente de densidade. painéis Média: células da camada superior e da interface após a separação com a solução de gradiente de densidade. Painéis da direita:. Células peletizada (pelotas de linfócitos), após separação com a solução de gradiente de densidade Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura. 
Figura 2.
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Discussion
Enquanto TEC são a população predominante do estroma tímico e desempenham papéis essenciais para a estrutura e a função das glândulas de timo, eles representam apenas cerca de 0,1-0,5% da celularidade do timo total. Eles também são células frágeis como elevadas percentagens de morte celular são ocasionalmente observados após a digestão de colagenase, ou seja, o tratamento de TEC dissociar a partir da matriz extracelular (ECM). Sua raridade (~ 200.000 por timo mouse) e fragilidade tornou uma tarefa desafiadora para isolar TEC. A utilização recente de colagenase altamente purificada isoladamente TEC aumentaram significativamente o número de células vivas após a digestão enzimática 15-19.
No entanto, o número muito pequeno de TEC continua a ser um grande desafio para a sua análise e isolamento, como são necessárias grandes quantidades de anticorpos para a rotulagem da superfície celular e um número excessivo de eventos precisam ser recolhidos por FACS. Enquanto anticorpo conjugadod tecnologia grânulo magnético pode ser usado para esgotar CD45 + timócitos, a sua grande quantidade torna economicamente proibitivo no longo prazo. Fomos capazes de enriquecer efetivamente TEC 15-20 vezes com uma densidade etapa de centrifugação simples, gradiente. A propriedade de iso-osmótica do meio de gradiente de densidade de iodixanol permite a separação das células com base na suas formas, tamanhos e densidades de 20-22. Deve notar-se que a pureza e o rendimento da TEC são afectados pela percentagem do meio de gradiente de densidade utilizado. percentagem mais baixa do meio de gradiente de densidade (18-20% v / v) irá resultar numa maior pureza de TEC na interface mas menor rendimento. Em contraste, quando a concentração mais elevada de iodixanol (22% v / v) é utilizado, uma quantidade maior de células do timo pode ser recolhido com menor percentagem de TEC. A concentração de iodixanol deve ser ajustada com base no objectivo do ensaio. Embora a pureza da TEC é largamente melhorada com a utilidade da solução de gradiente de densidade, que should ser enfatizado que as células recolhidas a partir da camada superior e a interface ainda conter uma fracção relativamente elevada de células CD45 + (Figura 1). Portanto, quando apenas a população do TCE é necessária como nesta experiência, separação de células será crucial, embora este procedimento extra pode causar alguma perda de células e requer mais tempo.
Ao contrário da maioria das células epiteliais dispostos em uma única ou múltiplas camadas que revestem os órgãos viscerais, TEC estão organizados numa configuração 3-D no estroma do timo, que é essencial para a sua sobrevivência e função. O sistema de EAK hidrogel de auto-montagem facilita a formação de agregados de 3-D do TEC que são mediadas pela αH6 tri-molecular: PA / g: complexos adaptador αEpCAM. É de notar, por afinar as concentrações e proporções do EAK16-II / EAKIIH6 oligopéptidos, a porosidade e a densidade do hidrogel pode ser ajustada para permitir que o fluxo de nutrientes e a migração de timócitos. Com efeito, functionaAs células T l foram gerados em ratinhos nus atímicos transplantados com os compósitos TEC / EAK.
A desvantagem neste sistema hidrogel EAK é que, com este protocolo atual, composição célula específica não pode ser localizada para uma área designada. Em um ambiente físico um timo é constituído por dois compartimentos distintos, em que os tipos específicos de TEC, residem CTECs no córtex e na medula em mTECs. Com o nosso sistema aqui descrito, tanto CTECs mTECs e são rotulados com EpCAM, um marcador geral epitelial. Por isso, é especulado que os agregados formados no hidrogel inclui ambos os subtipos de TEC. Embora CTECs e mTECs derivar de progenitores TEC comum bipotent, seus papéis no desenvolvimento de células T são claramente distinto. Córtex é a primeira região do timo onde as células progenitoras imaturas timo entrar, e a selecção positiva ocorre 23. Em seguida, as células selecionadas mover para a região medular e interagir com mTECs, através which as células auto-reactivas são eliminados por selecção negativa 24. Além disso, demonstrou-se que 25% dos genes são expressos diferencialmente entre CTECs e mTECs 25. Estas conclusões salientam a importância de promover a agregação de subconjuntos TEC para aumentar a eficácia do desenvolvimento de células T. Uma abordagem possível é a utilização de anticorpos diferentes de segmentação moléculas de superfície específicas, quer CTECs ou mTECs, tais como anti-citoqueratina 8 para CTECs, e anti-citoqueratina 5 para mTECs.
Do ponto de vista de aplicação clínica futuro, os aglomerados TEC incorporados no hidrogel biodegradável pode funcionar como injectáveis "mini unidades timo" para modular o sistema imunitário adaptativo que pode ser importante para várias condições médicas, tais como a rejuvenescer o sistema imunitário adaptativo em indivíduos idosos , ou indução de tolerância específica do dador no transplante de órgão sólido.
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Acknowledgments
Este trabalho foi financiado em parte pelos Institutos Nacionais de Saúde concede R21 AI113000 (WSM) e R01 AI123392 (YF).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| TEC Isolation | |||
| 70% Ethanol | Decon Laboratories | 2701(1 Gallon) | Ethanol 200 Proof, deionized water |
| Dissecting scissors, straight | Fine Science Tools, Inc. | 91460-11 | |
| Graefe forceps, straight | Fine Science Tools, Inc. | 11053-10 | |
| Graefe forceps, curved | Fine Science Tools, Inc. | 11052-10 | |
| Washing solution | 1x PBS, 0.1% BSA, 2 mM EDTA | ||
| 1x PBS (Phosphate buffered saline) | Gibco | 10010-023 | |
| BSA (Bovine serum albumin) | Sigma | A1470-100G | |
| EDTA (ethylenediaminetetraacetic acid) | Invitrogen | 15575-038 | |
| Digestion solution | 9 ml RPMI-1640, 0.025 mg/ml Liberase TM Research grade, 10 mM HEPES, 0.2 mg/ml DNaseI | ||
| RPMI-1640 | Gibco | 11879-020 | |
| Liberase TM Research Grade | Roche | 05 401 127 001 | referred as "purified collagenase" |
| 1 M HEPES | Lonza | 17-737E | |
| Dnase I | Roche | 10 104 159 001 | |
| 50 ml Centrifuge tube | Corning | 430290 | |
| 60 mm tissue culture dish | Falcon | 353002 | |
| 1/2 cc U-100 Insulin syringe 28 1/2 G | Becton Dickinson | 329461 | |
| 5 ml Polystyrene round-bottom tube | Falcon | 352058 | |
| 5 ml glass pipet | Fisher Healthcare | 13-678-27E | Use for rinsing the thymic fragments. Thymic fragments tend to stick to the wall with plastic pipets. |
| MACSmix tube rotator | Miltenyi | 130-090-753 | |
| 100 µm Cell strainer | Falcon | 352360 | |
| Density gradient medium: OptiPrep | Axis-Shield | ||
| Cell Sorting | |||
| 5 ml Polypropylene round-bottom tube | Falcon | 352063 | |
| Anti-mouse CD16/CD32 (Fc Block) | BD Biosciences | 553142 | Use as undiluted, 2 µl per sample |
| Anti-mouse CD45-PercpCy5.5 | eBioscience | 45-0451-80 | Use at 1:150, 10 µl per sample |
| Anti-mouse CD326 (EpCAM)-PE | eBioscience | 12-5791-82 | Use at 1:100, 10 µl per sample |
| BD Influx | BD Biosciences | ||
| Single cell analysis software | FlowJo | ||
| EAK Gel Assembly | |||
| Anti-His-Tag | AnaSpec | 29673 | "anti-His-Tag IgG" |
| Purified anti-mouse CD326 (EpCAM) | BioLegend | 118202 | "anti-EpCAM IgG" |
| Recombinant protein A/G | Pierce Biotechnology | ||
| 1.5 ml Safe-Lock Tubes, Biopur, Sterile | Fisher Healthcare | 05-402-24B | referred as "1.5 ml microcentrifuge tube" |
| 96-well, Tissue culture plate, Round-bottom with low evaporation lid | BD Falcon | 353917 | |
| Rocking platform: Nutator Mixer no.1105 | BD Clay Adams | ||
| 10% sucrose | Sigma | S0389 | Prepare with sterile distilled water |
| EAK16-II (AcNH-AEAEAKAKAEAEAKAK-CONH2) | American Peptide Company | custom synthesized, 10 mg/ml | |
| EAKIIH6 (AcNH-AEAEAKAKAEAEAKAKHHHHHH-CONH2) | American Peptide Company | custom synthesized, 7.5 mg/ml | |
| Complete medium | RPMI-1640, 10% FBS, 1% Pen/Strep, 1% L-glutamine, 1% NEAA, 5 mM HEPES, 50 µM 2-Mercaptoethanol | ||
| RPMI-1640 | Gibco | 11879-020 | |
| FBS (Fetal Bovine Serum) | Atlanta Biologicals | S11150 | Heat inactivated before use |
| Pen/Strep | Gibco | 15140-122 | |
| L-glutamine 200 mM (100x) | Gibco | 25030-081 | |
| NEAA (non-essential amino acid) 100x | Gibco | 11140-050 | |
| 1 M HEPES | BioWhittaker | 17-737E | |
| 2-Mercaptoethanol (100x) | Millipore | ES-007-E | |
| Platform shaker: The Belly Dancer | Stovall Life Sciences Inc. | model: USBDbo |
References
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