Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Измерение гранулоцитов и моноцитов Фагоцитоз и окислительный взрыв активности в крови человека

Published: September 12, 2016 doi: 10.3791/54264
Automatic Translation
1, 1, 2, 3, 3
1Human Performance Laboratory, North Carolina Research Campus, Appalachian State University, 2Department of Biology, Appalachian State University, 3David H. Murdock Research Institute

Introduction

Гранулоцитов и моноцитов фагоцитоз / окислительный взрыв (OB) анализ активности представляет собой простой, прямолинейный метод , который часто используется для сбора информации о врожденной иммунной функции после длительной и интенсивной тренировки. 1-4 При изучении реакции иммунной системы на стимул, гранулоциты и моноциты представляют особый интерес , так как они играют центральную роль в защите хозяина и первые иммунные клетки аккумулировать в месте инфекции. 5 Нейтрофилы, тип гранулоцитов, первые клетки к транслокации в поврежденных мышц ткани после интенсивных физических упражнений. 6 Фагоцитоз и ОВ активности являются наиболее распространенными мерами гранулоцитов и моноцитов функции, 7 и являются предпочтительными в качестве показателей врожденной функции иммунных клеток из - за их центральной роли в обоих инфекционного процесса и процесса ремонта.

Анализ, описанный в этой рукописи UtiliZES базовый поток цитометра, чтобы обеспечить количественное определение гранулоцитов и моноцитов фагоцитоз и активность OB в цельной крови. Использование цельной крови в этой технике является предпочтительным, так как оно позволяет анализ будет проводиться без процедуры очистки больших затрат времени. Этот анализ может быть легко изменена, чтобы приспособить множество научно-исследовательских проектов и возможностей лаборатории. Например, Ляо и др. Использовали подобную технику , чтобы показать , что нейтрофильный OB активность повышается и нейтрофилами фагоцитоза уменьшается следующим черепно - мозговой травмы. 8 В другом примере, McFarlin и др. Описал элегантную модификацию этого метода, использующего аллофикоцианин (APC ) -conjugated CD66b и высокопроизводительный тандем APC-конъюгированного маркировки с CD45 на основе изображений проточной цитометрии для классификации гранулоцитов с точки зрения их фагоцитоза и ОВ деятельности. 7,9

Наша исследовательская группа использовала различные приспособления этого тэchnique как показатель врожденной иммунной функции избыточным весом, ожирением и спортивных групп населения в течение почти 20 лет. 10,11 Приведенный ниже текст будет обеспечить читателя шаг за шагом инструкции для выполнения этого анализа и выделить области , которые читатель может адаптироваться для удовлетворения потребностей своих исследований.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Примечание: Все процедуры сбора крови были проведены в соответствии с руководящими принципами, установленными Аппалачи государственного университета совет Review (ASU) Институциональная (IRB).

1. Анализ Получение

  1. Собрать, подготовить и организовать материалы, указанные для данной процедуры (пожалуйста, обратитесь к таблице конкретных материалов / оборудования).
    1. Этикетка 12 х 75 мм трубки.
      1. Этикетка две трубки для каждого участника: одна трубка для анализа фагоцитоза (этикетка эту трубку с черными чернилами, и "F" для флуоресцеинизотиоцианатом [FITC]) и одну пробирку для анализа О.Б. активности (маркировать эту трубку с красными чернилами и " H "для dihydroethidium [HE]).
        Примечание: Использование стерильных 12 х 75 мм труб рекомендуется свести к минимуму непреднамеренные активацию клеток и связанного с ним увеличение фонового шума.
      2. Добавьте три пробирки для анализа управления: одну трубку для анализа фагоцитоза (контроль FITC: этикетка эту трубку с BlacK чернил и "F"), одна трубка для анализа О.Б. активности (ОН контроль: маркировать эту трубку с красными чернилами и "H"), а также одну трубку для отрицательного контроля (кровь только: маркировать эту трубку с зелеными чернилами и "только кровь").
    2. Подготовьте растворы по крайней мере за один день до дня проведения анализа.
      1. Готовят стерильный фосфатно-солевой буфер (PBS). Разбавляют 100 мл 10х PBS с 900 мл 18,2 МОм H 2 O. Фильтр стерилизовать с фильтром с размером пор 0,2 мкм. Хранить при температуре 4 ° С до использования.
      2. Подготовьте стерильный PBS-глюкозу. Растворить 1,0 г глюкозы в 100 мл PBS. Фильтр стерилизовать с фильтром с размером пор 0,2 мкм. Хранить при температуре 4 ° С до использования.
      3. Приготовьте стерильный 0,1 М цитратный буфер. Растворить 1,2 г лимонной кислоты и 1,1 г цитрата натрия в 100 мл 18,2 МОм H 2 O. Доводят рН до 4,0. Фильтр стерилизовать с фильтром с размером пор 0,2 мкм. Хранить при температуре 4 ° С до использования.
      4. Подготовка исходного раствора он. рesuspend 1,0 мг HE в 1,0 мл диметилсульфоксида (ДМСО). Осторожно перемешать, аликвоты и хранят при температуре -20 ° С до использования.
      5. Подготовка FITC-меченый стафилококк (S. стафилококк) маточный раствор (2 х 10 9 частиц / мл). Ресуспендируют 10 мг FITC-меченного S. стафилококк в 1,5 мл (или соответствующее количество) PBS. Разделить на три 500 мкл аликвоты и разрушать ультразвуком в соответствии с рекомендациями производителя. Аликвоты и хранят при -20 ° С до использования.
      6. Подготовьте непомеченное S. Исходный раствор стафилококк (2 х 10 9 частиц / мл). Ресуспендируют 100 мг немеченого S. стафилококк в 15 мл (или соответствующее количество) PBS. Разделить на тридцать 500 мкл аликвоты и разрушать ультразвуком в соответствии с рекомендациями производителя. Аликвоты и хранят при -20 ° С до использования.
    3. Подготовить свежие рабочие решения на день анализа.
      1. Подготовка рабочего раствора HE. Передача 10 мклпротаявшая HE раствор 990 мкл PBS-глюкозы. Защита от света и держать на льду до использования.
      2. Подготовка FITC-меченого S. стафилококк рабочего раствора (133,333 частиц / мкл). Передача 70 мкл талой FITC-меченого S. стафилококк раствор 980 мкл PBS. Защита от света и держать на льду до использования.
      3. Подготовьте непомеченное S. стафилококк рабочего раствора (133,333 частиц / мкл). Передача 70 мкл талой немаркированной S. стафилококк раствор 980 мкл PBS. Защита от света и держать на льду до использования.
      4. Приготовьте раствор резкого охлаждения. Добавить 750 мкл 0,4% трипанового синего раствора до 11,25 мл стерильного 0,1 М цитратного буфера. Хранить в бане с ледяной водой до использования.
    4. Есть сертифицированный Phlebotomist забор крови в соответствии с рекомендациями Всемирной организации здравоохранения для забора крови.
      1. Нарисуйте кровь в один 4 мл пробирку для сбора крови , содержащей K 2 ЭДТА. Вверт сбора крови трубки в соответствии с инструкциями изготовителя. Хранить пробирку для сбора крови при комнатной температуре на настольном качалке до использования. Используйте эту кровь для полного анализа крови (CBC) с белых кровяных клеток (WBC) дифференциального анализа, описанного в пункте 1.2.1.
      2. Нарисуйте кровь в пробирку для сбора один 4 мл крови, содержащей гепарин лития. Переверните пробирку для сбора крови в соответствии с инструкциями изготовителя. Хранить пробирку для сбора крови при комнатной температуре на настольном качалке до использования. Используйте эту кровь для анализа моноцитов и гранулоцитов фагоцитоза и активности OB, описанной в шаге 2.
  2. Определить количество бактерий (то есть, золотистого стафилококка) , которые будут необходимы для завершения анализа для каждого образца.
    1. С помощью гематологического анализатора для выполнения CBC с WBC дифференциального анализа на крови, как описано в инструкции изготовителя. Запишите количество лейкоцитов (в клетках / мл),% нейтрофильных и%Значения моноцитов.
    2. С помощью уравнения ниже, чтобы определить, нейтрофилами и моноцитов подсчета для каждого образца.
      Количество нейтрофилов (в клетках / мл) =% × Нейтрофильная WBC (в кл / мл)
      Количество моноцитов (в клетках / мл) =% моноцитов × WBC (в кл / мл)
    3. С помощью уравнения ниже, чтобы определить количество фагоцитов для каждого образца и количество фагоцитов, присутствующих в 100 мкл образца.
      Количество фагоцита (в кл / мл) = количество нейтрофилов (в клетках / мл) + моноцитов (в кл / мл)
      Количество фагоцитами в 100 мкл = (кол       -цикл фагоцитоза (в клетках / мл)) / 10
    4. С помощью приведенного ниже уравнения для определения количества бактерий (то есть, золотистого стафилококка) , которые необходимы для каждого образца и количество ФИТЦ-меченым S. стафилококк или немаркированные S. стафилококк рабочего раствора (133,333 частиц / мл) , которые должны быть добавлены в каждую пробирку.
      Примечание: целевые бактерии: соотношение фагоцитов составляет 8: 1.
      Количество бактерий требуется =Количество фагоцитами в 100 мкл × 8
      Объем FITC или немаркированные рабочего раствора , необходимого (в мкл) = (количество бактерий , необходимых) / (133,333 частиц / мкл)

2. Выполните Пробирной

  1. Подготовьте всю кровь для анализа.
    1. Для каждого участника и контрольной трубки, используют наконечник пипетки расширенной длины, чтобы передать 100 мкл цельной крови из пробирки для сбора крови лития гепарином на дно помеченную 12 х 75 мм трубки. Заменить колпачки.
      Примечание: Будьте осторожны, чтобы избежать попадания крови на сторонах мм трубок 12 х 75.
    2. Используйте микропипетки добавить 10 мкл рабочего раствора ОН к трубам, помеченных красными чернилами и "H", в том числе трубки управления HE. Заменить колпачки и вихревую на короткое время.
    3. Инкубируйте все пробирки в водяную баню C 37 ° в течение 15 мин. Затем сразу же передавать все пробирки на водяной бане со льдом в течение 12 мин.
      Примечание: Используйте открытую металлическую стойкуи осторожно встряхните стойку каждые 5 минут, чтобы убедиться, что трубы быстро и адекватно нагретый или охлажденный.
  2. Добавить бактерии (например, золотистого стафилококка) для образца и контрольных трубок.
    1. Используйте микропипетки , чтобы добавить соответствующее количество (рассчитанное на шаге 1.2.4) немеченого S. стафилококк рабочий раствор в пробирки , помеченных красными чернилами и "H", в том числе трубки управления HE. Заменить колпачки и вихревую на короткое время.
    2. Используйте микропипетки , чтобы добавить соответствующее количество (рассчитанное на шаге 1.2.4) из FITC-меченого S. стафилококк рабочий раствор в пробирки , помеченных черными чернилами , и "F", в том числе трубки управления FITC. Заменить колпачки и вихревую на короткое время.
    3. Vortex "кровь только" контрольную пробирку, но не добавляют ни тип бактерий (то есть, золотистого стафилококка) к нему.
    4. Инкубируйте все пробирки в водяную баню C 37 ° в течение 20 мин. Используйте открытую металлическую стойку и аккуратно встряхнуть стойку каждые 5 минутчтобы гарантировать, что трубки быстро и адекватно нагреваются. После инкубационного периода, немедленно передать все пробирки на водяной бане со льдом в течение 1 мин.
  3. Вымойте клетки.
    1. Используйте ретранслятор пипетки для добавления 100 мкл охлажденного льдом раствора закалочной во все пробирки. Заменить колпачки, вихревые кратко, а затем инкубируют все пробирки на льду в течение 1 мин.
    2. Используйте ретранслятор пипетки для добавления 1 мл охлажденного льдом PBS во все пробирки. Vortex кратко, а затем добавьте еще 2 мл охлажденного льдом PBS во все пробирки и заменить колпачки. Центрифуга все пробирки в течение 5 мин при температуре 4 ° С и 270 мкг, а затем аспирата супернатант.
    3. Повторите шаг 2.3.2 один раз (всего 2 стирок).
  4. Подготовка проб для проточной цитометрии.
    1. Используйте ретранслятор пипетки для добавления 50 мкл охлажденного льдом эмбриональной телячьей сыворотки во все пробирки. Кратко вихрь все пробирки.
    2. Перенесите все трубки к соответствующему каруселью и использовать автоматизированное рабочее место клеточного препарата гемолитика с красной крови челл (RBC) лизировать и фиксирующих реагентов для лизиса эритроцитов и фиксируют лейкоциты, как описано в инструкции изготовителя WBC.
    3. После того, как автоматизированная ячейка гемолитика подготовки рабочей станции запуска завершена, оберните трубы в алюминиевую фольгу и хранить в 4 ° C холодильнике до проточной цитометрии анализа может быть выполнена.

3. Проточная цитометрия Приобретение

  1. Настройка системы проточной цитометрии.
    1. Разминка проточной цитометрии системы, как указано в инструкции, предоставленной изготовителем. Затем проверьте уровни реагентов и емкости для отработанных чернил. При необходимости заполнения резервуаров с реагентами и / или опустошить бак отходов.
    2. Используйте "Clean Panel", чтобы запустить систему цикл очистки. Затем запустите выравнивание и проверки струйная флуоросферы, и убедитесь, что коэффициент половинной пика вариации (HPCV) для каждого детектора находится в пределах заданного диапазона, описанного в контроле качества (QC) протоколы предоставлены производствар.
  2. Создание анализа конкретных приобретение и установка приборов протоколов.
    1. Создание опробования конкретных протоколов приобретения для фагоцитоза и ОВ активности анализов.
      Примечание: протоколы сбора данных, описанные здесь, могут быть адаптированы для использования на любой проточной цитометрии с синим лазером (488 нм), фильтр (530/30) для FITC, и фильтр (575/26) для HE.
      1. Открыть проточной цитометрии программного обеспечения сбора системы и создать "новый протокол".
      2. Выберите "FL1 параметр" для анализа фагоцитоза (FITC) и "FL2 Параметр" для анализа OB активности (HE).
      3. Создание графики (т.е. вперед разброс [FSC] против бокового рассеяния [SSC] точка участка, FL1 гистограмма, FL2 гистограмма) , необходимых для приобретения.
      4. Создание полигональных областей для WBC (белых кровяных телец), гранулоцитов и моноцитов популяции на FSC против SSC участка и создают линейные области на гистограмме FL1 и FL2. Установить & #34; Stop Count "50000 событий для WBC ворот.
      5. Сохраните протоколы с именами анализа конкретных.
    2. Создание опробования конкретных инструментов настройки протоколов для фагоцитоза и ОВ активности анализов.
      1. Перетащите "опробования специализированные протоколы сбора" (определенные в пункте 3.2.1) из "Resource Explorer," к "Acquisition Manager" на проточной цитометрии программного обеспечения сбора системы.
        Примечание: Информация об Добавленный таким образом всегда будет появляться в конце списка.
      2. Введите информацию об образце в рабочем списке, и сохранить рабочий список.
      3. Удалить Контрольный образец трубки от 4 ° C холодильник и дать им возможность уравновешивания до комнатной температуры в течение 15 мин. Затем кратко вихрь каждого образца контрольную пробирку.
      4. Используйте "опробования специализированные протоколы сбора" , определенные в пункте 3.2.1 , чтобы запустить отрицательный контрольный образец (то есть, только кровь) и положительный контрольобразцы (т.е. HE контроль, контроль FITC) через систему проточной цитометрии. Обзор гистограмм и отрегулируйте ФЭУ (ФЭУ) напряжений в FITC и фикоэритрин (РЕ) каналов по мере необходимости.
      5. Vortex контрольные образцы и передавать их в проточной цитометрии системы карусельного типа в соответствии с порядком на рабочем листе. Затем поместите каруселью в камере для отбора проб и нажмите на кнопку Цитометр панели "Пуск", чтобы получить данные для контрольных образцов. Сохранить "XXX Настройка Pro" Настройка протокола.
  3. Приобретать образцы исследования в системе проточной цитометрии.
    1. Удалите исследование образцов трубки от 4 ° C холодильник и позволяют уравновешиваться до комнатной температуры в течение 15 мин.
    2. В то время как образцы уравновешивания, перетащить предопределенные исследования конкретных протоколов сбора в пространстве рабочего списка, чтобы сделать рабочий список проекта.
    3. Убедитесь, что "протокол настройки" связан с &# 34;. Анализа конкретных Настройка протоколов " , определенные в пункте 3.2.2 Затем введите идентифицирующую информацию (например, название исследования, рисовать номер, номер посещения, с учетом ID) для каждой трубки в рабочий список.
    4. После 15-минутного периода уравновешивания, вихревых исследуемых образцов и передавать их в проточной цитометрии системы карусельного типа в соответствии с порядком на рабочем листе. Затем поместите каруселью в камере для отбора проб и нажмите на кнопку Цитометр панели "Пуск", чтобы получить данные для исследуемых образцов.
    5. Обзор качества данных путем проверки эффективности РБК лизиса и WBC распределения клеток подгруппы, пропорции, абсолютного количества и интенсивности флуоресценции на отчет панели каждого образца.
      Примечание: Качество данных считается приемлемым, если все эти критерии находятся в пределах своих предопределенных пределах. Если все критерии не выполняются, образец должен быть переработано.
    6. Чистый и выключить систему проточной цитометрии. Храните проточной цитометрииданные о двух разных дисках компьютера, чтобы предотвратить случайную потерю данных.

Анализ 4. Данные

  1. Провести анализ фагоцитоза.
    1. Объединить все фагоцитоза (т.е. F-меченого) выборка данных и список управления режима (LMD) файлы данных в одну папку. Затем откройте проточной цитометрии программного обеспечения для анализа и перетащить файлы в выборочном пространстве.
    2. Установите WBC, гранулоцитов, моноцитов и Лимфоцит ворота.
      1. Дважды щелкните на имени файла, чтобы открыть любой из "контрольных образцов FITC". Используйте раскрывающиеся меню, чтобы установить ось х на "FSC" и "линейный" и у-ось "ССК" и "линейный".
      2. Используйте "селектор многоугольник ворота", чтобы подготовить ворота общей WBC населения.
        ПРИМЕЧАНИЕ: Не забудьте включить все клетки по краям диаграммы. Добавьте эти ворота "WBC".
      3. Дважды щелкните на "новый WBC ворота" и использовать нижепреведенноговниз меню, чтобы установить ось х на «FSC» и «линейной» и у-ось "SSC" и "Линейная".
      4. Используйте "селектор многоугольник ворот", чтобы установить "гранулоцитарный ворота" и моноцитов ворота ", а затем с помощью" эллиптическую селектора ", чтобы установить" лимфоцит ворота ". На каждом ворота соответственно. Перетащите" данные ворот (%) "в сторону так, чтобы клетки легко просматривать.
    3. Установите "фагоцитоза положительные ворота» и «фагоцитоз Отрицательная ворота» для населения гранулоцитов и моноцитов.
      1. Дважды щелкните на "контрольном образце FITC", используемый на шаге 4.1.2.1. Затем нажмите на "Гранулоцита ворота" и использовать раскрывающиеся меню, чтобы установить ось х, чтобы "FL1" и "Log" и у-ось "ССК" и "линейный".
      2. Используйте "квадрат селектора" установить "фагоцитоза отрицательный ворота" и "фагоцитоза ПостулироватьАйв ворота ".
        Примечание: Так как контрольные образцы FITC не получали бактериальных (т.е. золотистого стафилококка) раздражители, все клетки должны быть теоретически фагоцитоза отрицательным. Используйте по своему усмотрению при установлении границ для этих групп населения.
      3. Повторите шаг 4.1.3.1 и 4.1.3.2 Шаг для населения моноцитов.
    4. Добавить статистика для "% от WBC", "интенсивности флуоресценции" и "% фагоцитоза позитивных клеток» для популяций гранулоцитов и моноцитов.
      1. Нажмите на кнопку "контрольного образца FITC", используемый на шаге 4.1.2.1. Выделите "гранулоцитарный ворота", а затем нажмите на кнопку "Рабочее пространство" и "Добавить статистику". Выделите "геометрическое среднее" и "FL1 Log" и нажмите кнопку "Добавить". Затем выбрал "Частота от родительского" статистики и нажмите кнопку "Добавить".
        ПРИМЕЧАНИЕ: Это даст интенсивность флуоресценции (среднее геометрическое) всего населения и гранулоцитовпроцент WBC (родителя), которые являются гранулоциты.
      2. Нажмите на кнопку "контрольного образца FITC", используемый на шаге 4.1.2.1. Выделите "фагоцитоза положительные ворота» населения гранулоцитов, а затем нажмите на кнопку "Рабочее пространство" и "Добавить статистику". Выделите "геометрическое среднее" и "FL1 Log" и нажмите кнопку "Добавить". Затем выберите "Частота из Родитель" статистики и нажмите кнопку "Добавить".
        ПРИМЕЧАНИЕ: Это даст интенсивность флуоресценции (среднее геометрическое) фагоцитарной положительных гранулоцитов и процент гранулоцитов (Parent), которые являются фагоцитоз положительными.
      3. Повторите шаг 4.1.4.1 и 4.1.4.2 Шаг для населения моноцитов.
      4. Нажмите на кнопку "контрольного образца FITC", используемый на шаге 4.1.2.1. Выделите "лимфоцит ворота", а затем нажмите на кнопку "Рабочее пространство" и "Добавить статистику". Выделите "Частота от родительского" статистики и нажмите кнопку "Добавить".
        ПРИМЕЧАНИЕ: Этодаст процент WBC (родителя), которые являются лимфоциты.
      5. Выделите все ворота и статистики, созданных в контрольном образце FITC, используемый на стадии 4.1.2.1. Перетащите их в "Все образцы" на панели "Группа" в верхней части экрана.
        ПРИМЕЧАНИЕ: Это будет применять эти параметры для всех исследуемых образцов.
      6. Сохранить и название работы в качестве WSP-файла в той же папке, содержащей папку LMD.
    5. Отрегулируйте отдельные ворота образца.
      1. Нажмите на "первой пробы" в наборе данных и убедитесь, что WBC ворот соответствующим образом подходит распределение клеток на экране. Если этого не произойдет, нажмите и перетащите края ворот отрегулировать ворота для этого образца. Нажмите на кнопку "стрелка вправо" (т.е. "˃") , чтобы перейти к следующему образцу. Повторите этот шаг, пока не будут рассмотрены все образцы.
      2. Нажмите на "WBC ворота" для первой выборки в наборе данных и убедитесь, что "Гранulocyte ворота "," моноцитов ворота ", и" Лимфоцит ворота "для каждого образца надлежащим образом соответствовать распределение ячеек на экране. Выполните необходимую настройку. Нажмите на кнопку" стрелка вправо "(т.е." ˃ ") , чтобы перейти к следующему образцу ,
      3. Повторите шаг 4.1.5.2 до всех образцов были рассмотрены. Затем нажмите кнопку "Сохранить".
    6. Отображение данных в электронной программе электронных таблиц.
      1. Нажмите на иконку "Table Editor" в верхней части экрана. Нажмите кнопку "Изменить", "Ключевые слова" и "$ Date", чтобы включать дату отбора проб на конечную таблицу. Затем нажмите кнопку "Изменить", "Ключевые слова" и "@ SAMPLEID1", чтобы включить идентификацию выборки на окончательную таблицу. Повторите эти действия для "@ SAMPLEID2", "@ SAMPLEID3", и "@ SAMPLEID4".
      2. Настройка экрана "Table Editor" и экран "образец", чтобы они могли одновременно просматривать на экране компьютера. Селект любой "образец" на листе примера. Затем перетащите каждый статистический интерес к "Table Editor".
        1. Перетащите "Frequency. Из Родитель" статистики, перечисленных в разделе "Гранулоцита ворота" к "Таблица Editor". Тип "% WBC как гранулоциты" в столбце "Имя" в "Table Editor".
        2. Перетащите "среднее геометрическое" статистики, перечисленные под "Гранулоцита ворота" к "Таблица Editor". Тип "Геометрическая средняя флуоресценция, гранулоциты" в столбце "Имя" в "Table Editor".
        3. Перетащите "Frequency. Из Родитель" статистики, перечисленных в разделе "гранулоцитов / фагоцитоза положительные ворота" к "Таблица Editor". Тип "% фагоцитоза Положительные Гранулоцитов" в столбце "Имя" в "Table Editor".
        4. Перетащите "Среднее геометрическое" статистики, перечисленных в разделе "гранулоцитов / фагоцитоза положительные ворота" к йе "Редактор таблиц". Тип "Геометрическая средняя флуоресценция, фагоцитоз Положительные гранулоциты" в столбце "Имя" в "Table Editor".
        5. Перетащите "Frequency. Из Родитель" статистики, перечисленных в разделе "моноцитов ворота" к "Таблица Editor". Тип "% WBC как моноциты" в столбце "Имя" в "Table Editor".
        6. Перетащите "среднее геометрическое" статистики, перечисленные под "моноцитов ворота" к "Таблица Editor". Тип "Геометрическая средняя флуоресценция, моноцитов" в столбце "Имя" в "Table Editor".
        7. Перетащите "Frequency. Из Родитель" статистики, перечисленных в разделе "моноциты / фагоцитоза положительные ворота" к "Таблица Editor". Тип "% фагоцитоза Положительные моноцитов" в столбце "Имя" в "Table Editor".
        8. Перетащите "Среднее геометрическое" статистики, перечисленных в разделе "моноциты / Phagocytosis положительные ворота "к" Таблица Editor ". Тип" Геометрическая средняя флуоресценция, фагоцитоз моноцитов Позитивный "под" "колонке" Имя таблицы Editor ".
        9. Перетащите "Frequency. Из Родитель" статистики, перечисленных в разделе "ворота" лимфоцитов в "Таблица Editor". Тип "% WBC в лимфоцитах" в столбце "Имя" в "Table Editor".
      3. Перетащите параметры, видимые в таблице "Редактор", пока они не расположены в порядке предпочтения.
      4. Нажмите кнопку "Сохранить". Затем нажмите кнопку "Создать таблицу" для отображения данных в формате электронной таблицы. Нажмите на кнопку "Сохранить как", чтобы сохранить и имя работы в качестве .xlsx файла.
  2. Повторите шаг 4.1 для анализа OB активности (то есть, H-меченый) образцы и контролировать LMD файлы данных.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Не забудьте заменить все ссылки на фагоцитоз со ссылками на OB деятельности.

    3. Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Продолжительное и интенсивное упражнение оказывает глубокое воздействие на врожденной иммунной функции, в том числе естественной функции клеток-киллеров, макрофагов цитокинами ответ на вирусные инфекции, и гранулоцитов и моноцитов фагоцитоза и OB деятельности. Многочисленные исследования показывают, что гранулоцитов и моноцитов фагоцитоза значительно возрастает после окончания упражнений, отражающие воспаление, вызванное повреждением мышц и метаболических потребностей. В противоположность этому, гранулоцитов и моноцитов О.Б. активность снижается после окончания упражнений и может быть одним Иммунная индикатором повышенной восприимчивости к инфекции. Например, на рисунке 1 показано , что фагоцитоз S. стафилококк гранулоцитов немедленно и 1,5-ч увеличилась после 75 км езды на велосипеде боя (70% VO 2MAX), возвращается в нормальное русло к следующему утру. Моноцитов фагоцитоз аналогичным образом зависит от этого уровня упражнений. На рисунке 2 показано , что гранулоцитов OB активности является снижениеd в течение по крайней мере 21-ч после 75-км езды на велосипеде. Моноцитов OB активность также уменьшается после 75 км езды на велосипеде.

Гранулоцитов и моноцитов фагоцитоз S. стафилококк, но не гранулоцитов и ОВ активность моноцитов, коррелируют с системным воспалением биомаркеров Рисунок 3 показывает скромную корреляцию между гранулоцитов фагоцитоза и сывороточного С-реактивного белка (CRP) уровней (Pearson продукт-момент корреляции;. г = 0,44; р <0,01 ) в 106 с избыточной массой тела / ожирением женщин. Сыворотка CRP также коррелирует с моноцитов фагоцитоза S. стафилококк (Pearson продукт-момент корреляции; г = 0,30; р <0,01). Кроме того, нейтрофилы крови / лейкоцитов подсчет (Pearson продукт-момент корреляции; г = 0,62 и г = 0,61, соответственно; р <0,001), индекс массы тела (Pearson продукт-момент корреляции; г = 0,50 и г = 0,40, соответственно; P <0,001), сывороточные уровни инсулина (г = 0,30 и г =0,23; P <0,03), а также в крови уровни A 1c (Pearson продукт-момент корреляции; г = 0,28 и г = 0,21, соответственно, р <0,04) коррелируют с гранулоцитов и моноцитов фагоцитоза S. стафилококк. В целом, эти данные указывают на то, что высокие гранулоцитов и моноцитов фагоцитоза в состоянии покоя испытуемых свидетельствует о системное воспаление.

Рисунок 1
Рисунок 1: Гранулоцитарный Фагоцитоз пораженной Intense упражнения на выносливость гранулоцитов фагоцитоза увеличилась сразу и 1,5-час после того, как 75-километровой велосипедной бой на уровне 70% от VO 2MAX.. К 21-ч после физических упражнений, гранулоцитов фагоцитоз вернулся чуть-чуть ниже уровня, существовавшего до физических упражнений. * указывает на то отличается от предварительной тренировки (повторных измерений ANOVA с парного критерия Стьюдента после специального анализа, в случае необходимости, N = 19; p <0,05). Значения меня± стандартная ошибка. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

фигура 2

Рис . 2: Гранулоцитарный окислительный взрыв активность зависит от интенсивных упражнений на выносливость залповой активности гранулоцитов оксидативного сразу уменьшилось, 1,5 ч и 21-ч после 75-километровой велосипедной бой на уровне 70% от VO 2MAX. * указывает на то отличается от предварительной тренировки (повторных измерений ANOVA с парного критерия Стьюдента после специального анализа, в случае необходимости, N = 19; p <0,05). Значения представляют собой среднее ± стандартная ошибка. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

. Рисунок 3: Гранулоцитарный Фагоцитоз коррелируется с системным воспалением с избыточной массой тела / ожирением женщин гранулоцитов фагоцитоз коррелируется с сывороткой С-реактивного белка, широко распространенным биомаркеров системного воспаления (Пирсона-момент корреляции, N = 87; г = 0,44; P <0,01). Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Эта рукопись представляет собой протокол шаг за шагом для определения двух показателей гранулоцитов и функции моноцитов. Мы определили несколько шагов, которые имеют решающее значение для успеха этого анализа. Одним из таких шагов является ледяная баня инкубационный, который происходит непосредственно перед добавлением бактерий. Тщательное охлаждение всех образцов позволит свести к минимуму влияние температуры на фагоцитоз и OB деятельности. Другим важным шагом является добавление бактерий к каждому образцу. A 8: 1 бактерии: соотношение фагоцитов дает оптимальные результаты; Однако другие исследователи могут найти, что это отношение будет необходимо модифицировать для получения подходящих результатов. Другим важным шагом является использование RBC лизису и WBC фиксирующих реагентов для лизиса эритроциты и лейкоциты исправить. Использование этого таких реагентов обеспечивает полный лизис эритроцитах и ​​позволяет исследователям безопасно хранить обработанные образцы при температуре 4 ° С в течение ночи, а затем запустить их через поток цитометра на следующий день. Предыдущая работа (неопубликованные) IndicАтеш, что РБК лизис и фиксация WBC может быть использован для задержки проточной цитометрии фиксированных образцов на целых 12 часов без ущерба для целостности данных.

Эта процедура может быть легко изменены в соответствии с возможностями и интересами исследователя, но следует подчеркнуть, что оптимизация необходима при адаптации сделаны. Некоторые из наиболее распространенных приспособлений, которые были зарегистрированы являются целевыми бактериями, маркированной / зонда и времени инкубации. Исследователи дали исключительные результаты , когда кишечная палочка 7,8 используется вместо S. стафилококка в качестве целевого патогена (как на 8: 1 отношение). Грибок, такие как Saccharomyces CEREVISIAE, также могут быть пригодны в качестве замены для E. палочки. Кроме того, исследователи часто используют рН-чувствительный молекулярный зонд, 7,12 вместо FITC, в качестве зонда для фагоцитоза. Аналогично, зонды, кроме ОН обычно используются для измерения OB активности, includinг dichlorofluorescin диацетат (DCF-DA) 10 и дигидрородамин 123 (DHR). 13 Сообщения о времени инкубации варьируется от 20 мин до 120 мин, 12,14,15 с McFarlin сообщает , что максимальное время реакции может варьироваться в зависимости от бактериальной мишени. 7 Он должен также следует отметить , что оптимальные периоды инкубации может варьироваться между фагоцитоз и OB аспектов анализа. 7

Как и во всех лабораторных анализов, поиск и устранение неисправностей может быть необходимо при создании этой техники в новой обстановке исследования. Авторы советуют, что оптимизация бактерий: отношение фагоцитов является ключом к успеху для данного анализа. Авторы также отмечают, что данные из образца должны быть исключены из анализа, если менее 80% клеток в популяции гранулоцитов из не-заболевшего участника являются FITC положительным; В этой ситуации, образец может быть повторно собран и повторно проанализированы, если это возможно.

Есть несколько разные ограничения награнулоцитов и моноцитов фагоцитоз и анализ активности OB описано в этой рукописи. Одним из таких ограничений является исключительное использование FSC и SSC, чтобы идентифицировать популяции клеток, представляющих интерес. Использование маркеров клеточной поверхности позволит исследователи однозначно идентифицировать популяции клеток. 10 Тем не менее, добавление этой функции потребует более основного потока цитометр, и, таким образом , выходит за рамки данной статьи. Другим ограничением данного анализа является то, что он опирается на эффективность трипанового синего для гашения флуоресценции зондов, которые не были усвоены иммунных клеток, представляющих интерес. Зонд 7,12 молекулярный рН-чувствительный может быть использован в качестве альтернативы FITC в тех ситуациях , когда интернализации вызывает беспокойство. Поскольку такой зонд только флуоресцентный в кислых средах, таких как те, в эндоцитических везикул, приобретенная флуоресценции представляет только Интернализованная частицы. Кроме того, некоторые исследователи критиковали текущий анализ, потому что это сделатьES не включают в параллельный набор образцов, которые инкубируют в ледяной воде, а не при 37 ° С, чтобы контролировать для базовой активности иммунных клеток. В ряде случаев мы включили этот "состояние льда" при выполнении гранулоцитов и моноцитов фагоцитоз и активность OB анализа, и обнаружили, что это не приводит к существенному улучшению качества данных (неопубликованные).

Таким образом, эта рукопись описывает методику измерения фагоцитоза и OB активности в гранулоцитах и ​​моноцитах. Это простой, простой тест, который может быть легко модифицирована для учета лабораторных возможностей и научных интересов. В упражнении и ожирения с наукой исследований, связанных, эта мера врожденной иммунной функции позволит исследователь исследовать эффекты многих потенциальных контрмер, включая потерю веса, использование пищевых добавок, диетических мероприятий, а также другие изменения образа жизни. После освоения этой техники, исследователи будут иметь возможность следить за остройи хронические изменения в функции иммунных клеток в ответ на диеты, физических упражнений, а также многих других раздражителей.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Acknowledgments

Авторы хотели бы признать Zack, Кейси Шу Джона и Линн Cialdella-Kam за их помощь в ходе оптимизации этой процедуры.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
12 x 75 mm tubes, with cap VWR 20170-579 You will need 2 tubes per sample ("H" and "F") plus 3 tubes per batch (for assay controls; "F", "H", and "Blood only").
PBS (10x), pH 7.4 Life Technologies 70011-044
Bottle top 0.2 µm cellulose acetate filter (500 ml capacity) Fisher Scientific 09-741-07 
Glucose, powder Life Technologies 15023-021
Citric acid (anhydrous, cell culture tested, plant cell culture tested) Sigma-Aldrich C2404-100G
Sodium citrate tribasic dihydrate Sigma-Aldrich S4641-25G
Dihydroethidium (Hydroethidine) (HE) Life Technologies D11347
Dimethyl sulfoxide (DMSO) Anhydrous Life Technologies D12345
Staphylococcus aureus (Wood strain without protein A) BioParticles, fluorescein conjugate (FITC) Life Technologies S2851
Staphylococcus aureus (Wood strain without protein A) BioParticles, unlabeled Life Technologies S-2859
Trypan Blue Solution, 0.4% Life Technologies 15250-061
4.0 ml vacutainer containing 7.2 mg K2EDTA, spray-dried VWR BD367861 You will need 1 K2EDTA blood collection tube per sample.
4.0 ml vacutainer containing 68 USP units Lithium Heparin, spray-coated VWR BD367884 You will need 1 Lithium Heparin blood collection tube per sample.
COULTER Ac·T 5diff CP Beckman Coulter 6605705 i.e., hematology analyzer
COULTER Ac·T 5diff Rinse Beckman Coulter 8547167
COULTER Ac·T 5diff Fix Beckman Coulter 8547171
COULTER Ac·T 5diff WBC Lyse Beckman Coulter 8547170
COULTER Ac·T 5diff Hgb Lyse Beckman Coulter 8547168
COULTER Ac·T 5diff Cal Calibrator Beckman Coulter 7547175
COULTER Ac·T 5diff Control Plus Beckman Coulter 7547198
AcT 5diff Diluent Beckman Coulter 8547169
200 µl extended-length pipette tips VWR 37001-526
Insulated ice pan VWR 89198-980 For ice water bath.
Open metal tube rack VWR 60916-702
Fetal Bovine Serum Life Technologies 26140-111
TQ-Prep Workstation Beckman Coulter 6605429 i.e., automated cell lyse preparation workstation
ImmunoPrep Reagent System Beckman Coulter 7546999 i.e., RBC lyse/WBC fix reagent system
Cytomics FC500 MCL Flow Cytometry System with CXP Software Beckman Coulter 626553
IsoFlow Sheath Fluid Beckman Coulter 8547008
COULTER CLENZ Beckman Coulter 8546929
Flow-Check Fluorospheres  Beckman Coulter 6605359 i.e., alignment and fluidics verification fluorospheres
FlowJo Software FlowJo FlowJo i.e., flow cytometry analysis software
Excel Software Microsoft Microsoft Excel i.e., electronic spreadsheet program

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Nieman, D. C., et al. Influence of pistachios on performance and exercise-induced inflammation, oxidative stress, immune dysfunction, and metabolite shifts in cyclists: a randomized, crossover trial. PLoS One. 9, e113725 (2014).
  2. Knab, A. M., et al. Effects of a freeze-dried juice blend powder on exercise-induced inflammation, oxidative stress, and immune function in cyclists. Appl Physiol Nutr Metab. 39, 381-385 (2014).
  3. Konrad, M., et al. The acute effect of ingesting a quercetin-based supplement on exercise-induced inflammation and immune changes in runners. Int J Sport Nutr Exerc Metab. 21, 338-346 (2011).
  4. Nieman, D. C., et al. Immune and inflammation responses to a 3-day period of intensified running versus cycling. Brain Behav Immun. 39, 180-185 (2014).
  5. Nieman, D. C., et al. Carbohydrate supplementation affects blood granulocyte and monocyte trafficking but not function after 2.5 h of running. Am J Clin Nutr. 66, 153-159 (1997).
  6. Tidball, J. G. Inflammatory cell response to acute muscle injury. Med Sci Sports Exerc. 27, 1022-1032 (1995).
  7. McFarlin, B. K., Williams, R. R., Venable, A. S., Dwyer, K. C., Haviland, D. L. Image-based cytometry reveals three distinct subsets of activated granulocytes based on phagocytosis and oxidative burst. Cytometry A. 83, 745-751 (2013).
  8. Liao, Y., Liu, P., Guo, F., Zhang, Z. Y., Zhang, Z. Oxidative burst of circulating neutrophils following traumatic brain injury in human. PLoS One. 8, e68963 (2013).
  9. McFarlin, B. K., Venable, A. S., Prado, E. A., Henning, A. L., Williams, R. R. Image-based flow cytometry technique to evaluate changes in granulocyte function in vitro. J Vis Exp. , (2014).
  10. Nieman, D. C., et al. Immune response to obesity and moderate weight loss. Int J Obes Relat Metab Disord. 20, 353-360 (1996).
  11. Nieman, D. C., et al. Immune function in female elite rowers and non-athletes. Br J Sports Med. 34, 181-187 (2000).
  12. Ichii, H., et al. Iron sucrose impairs phagocytic function and promotes apoptosis in polymorphonuclear leukocytes. Am J Nephrol. 36, 50-57 (2012).
  13. Gomes, A., Fernandes, E., Lima, J. L. Fluorescence probes used for detection of reactive oxygen species. J Biochem Biophys Methods. 65, 45-80 (2005).
  14. Gruger, T., et al. Negative impact of linezolid on human neutrophil functions in vitro. Chemotherapy. 58, 206-211 (2012).
  15. Dementhon, K., El-Kirat-Chatel, S., Noel, T. Development of an in vitro model for the multi-parametric quantification of the cellular interactions between Candida yeasts and phagocytes. PLoS One. 7, e32621 (2012).

Tags

Immunology выпуск 115 фагоцитоз окислительный взрыв моноцитов гранулоцитов врожденный иммунитет проточной цитометрии
Измерение гранулоцитов и моноцитов Фагоцитоз и окислительный взрыв активности в крови человека
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Meaney, M. P., Nieman, D. C.,… More

Meaney, M. P., Nieman, D. C., Henson, D. A., Jiang, Q., Wang, F. Z. Measuring Granulocyte and Monocyte Phagocytosis and Oxidative Burst Activity in Human Blood. J. Vis. Exp. (115), e54264, doi:10.3791/54264 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter