Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Medição de granulócitos e monócitos fagocitose e oxidativo Atividade Burst no Sangue

Published: September 12, 2016 doi: 10.3791/54264
Automatic Translation
1, 1, 2, 3, 3
1Human Performance Laboratory, North Carolina Research Campus, Appalachian State University, 2Department of Biology, Appalachian State University, 3David H. Murdock Research Institute

Introduction

A explosão de granulócitos e monócitos fagocitose / oxidativo (OB) ensaio da atividade é uma técnica simples e direta que é frequentemente usado para reunir informações sobre a função imunológica inata após o exercício prolongado e intenso. 1-4 Ao estudar a resposta do sistema imunológico a um estímulo, granulócitos e monócitos são de particular interesse porque eles desempenham um papel central na defesa do hospedeiro e são as primeiras células do sistema imunológico a se acumular no local de infecção. 5 neutrófilos, um tipo de granulócitos, são as primeiras células de se translocar para o músculo danificado tecidos após o exercício intenso. 6 fagocitose ea atividade de OB são as medidas mais comuns da função de granulócitos e monócitos, 7 e são preferidos como indicadores da função celular imune inato por causa de seu papel central, tanto no processo de infecção e o processo de reparação.

O ensaio descrito no presente Utili manuscritozes um citómetro de fluxo de base para proporcionar uma determinação quantitativa da fagocitose de granulócitos e monócitos e atividade de OB no sangue total. O uso de sangue inteiro nesta técnica é vantajosa porque permite o ensaio a ser conduzido sem um procedimento de purificação que consomem tempo. Este ensaio pode ser facilmente modificado para acomodar uma variedade de modelos de investigação e de capacidades de laboratório. Por exemplo, Liao et al., Utilizou uma técnica semelhante para demonstrar que a actividade dos neutrófilos OB é aumentada e neutrófilos fagocitose é diminuída após lesão cerebral traumática. 8 Num outro exemplo, McFarlin et al. Descrevem uma modificação elegante desta técnica que utiliza aloficocianina (APC ) -conjugated CD66b e de alto desempenho conjunto rotulagem CD45 APC conjugada com a citometria de fluxo baseada em imagem para classificar os granulócitos em termos de suas atividades fagocitose e OB. 7,9

Nosso grupo de pesquisa tem usado várias adaptações desta technique como um indicador da função imune inata em populações com sobrepeso, obesas, e atléticas por quase 20 anos. 10,11 O texto abaixo irá fornecer o leitor com instruções passo-a-passo para a realização deste ensaio e destacar as áreas que o leitor possa se ​​adaptar para atender às necessidades de suas pesquisas.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

NOTA: Todos os procedimentos de recolha de sangue foram conduzidos de acordo com as diretrizes estabelecidas pela Appalachian State University (ASU) Institutional Review Board (IRB).

Ensaio 1. Preparação

  1. Reunir, preparar e organizar os materiais especificados para o procedimento (por favor, consulte a Tabela de materiais específicos / Equipamentos).
    1. Rotular 12 x 75 mm tubos.
      1. Etiqueta de dois tubos para cada participante: um tubo para o ensaio de fagocitose (rotular este tubo com tinta preta e um "F" para isotiocianato de fluoresceína [FITC]) e um tubo para o ensaio de actividade de OB (rotular este tubo com tinta vermelha e um " H "para dihydroethidium [HE]).
        NOTA: O uso de estéreis 12 x 75 mm tubos é recomendado para minimizar a ativação celular indesejada e aumento associado no ruído de fundo.
      2. Rotular três tubos para os controles de análise: um tubo para o ensaio de fagocitose (controlo de FITC: rotular esse tubo com black tinta e um "F"), um tubo para o ensaio de atividade de OB (HE controle: rotular esse tubo com tinta vermelha e um "H"), e um tubo para o controle negativo (Blood apenas: rotular esse tubo com tinta verde e "somente o sangue").
    2. Preparar soluções de reserva, pelo menos, um dia antes do dia do ensaio.
      1. Prepara-se o soro fisiológico tamponado com fosfato estéril (PBS). Diluir 100 ml de 10x PBS com 900 ml de 18,2 mohms H 2 O. Filtro de esterilizar com um filtro de 0,2 um. Armazenar a 4 ° C até à sua utilização.
      2. Prepare o PBS-glicose estéril. Dissolve-se 1,0 g de glucose em 100 ml de PBS. Filtro de esterilizar com um filtro de 0,2 um. Armazenar a 4 ° C até à sua utilização.
      3. Preparar o tampão de citrato 0,1 M estéril. Dissolve-se 1,2 g de ácido cítrico e 1,1 g de citrato de sódio em 100 ml de 18,2 mohms H 2 O. Ajustar o pH para 4,0. Filtro de esterilizar com um filtro de 0,2 um. Armazenar a 4 ° C até à sua utilização.
      4. Preparar a solução estoque HE. Resuspend 1,0 mg de HE em 1,0 ml de sulfóxido de dimetilo (DMSO). Misturar suavemente, alíquota, e armazenar a -20 ° C até à sua utilização.
      5. Preparar a solução de estoque marcado com FITC Staphylococcus aureus (S. aureus) (2 x 10 9 partículas / ml). Ressuspender 10 mg de S. marcado com FITC aureus em 1,5 ml (ou quantidade adequada) de PBS. Divide-se em três 500 mL alíquotas e sonicate de acordo com a recomendação do fabricante. Alíquotas e armazenar a -20 ° C até à sua utilização.
      6. Prepare o S. não marcado solução estoque aureus (2 x 10 9 partículas / ml). Ressuspender 100 mg de S. não marcado aureus em 15 ml (ou quantidade adequada) de PBS. Divida em trinta 500 mL alíquotas e sonicate de acordo com a recomendação do fabricante. Alíquotas e armazenar a -20 ° C até à sua utilização.
    3. Preparar soluções de trabalho de fresco no dia do ensaio.
      1. Preparar a solução de trabalho HE. Transferem-se 10 ul desolução estoque descongelado HE para 990 ul de PBS-glicose. Proteger da luz e manter em gelo até à sua utilização.
      2. Prepara-se o S. marcado com FITC Solução de trabalho de aureus (133,333 partículas / ul). Transferir 70 uL de descongelado S. marcado com FITC solução estoque aureus para 980 ul de PBS. Proteger da luz e manter em gelo até à sua utilização.
      3. Prepare o S. não marcado Solução de trabalho de aureus (133,333 partículas / ul). Transferir 70 uL de S. descongeladas não marcado solução estoque aureus para 980 ul de PBS. Proteger da luz e manter em gelo até à sua utilização.
      4. Preparar a solução de têmpera. Adicionar 750 ul de solução de azul de tripano a 0,4% para 11,25 ml de tampão de citrato 0,1 M estéril. Tenha em um banho de gelo-água até à sua utilização.
    4. Tenha um phlebotomist certificada tirar sangue de acordo com as diretrizes da Organização Mundial da Saúde para a retirada de sangue.
      1. Tirar sangue em um 4 ml tubo de colheita de sangue contendo K 2 EDTA. Dentrotubo de recolha de sangue vert de acordo com as instruções do fabricante. Manter o tubo de recolha de sangue à temperatura ambiente num agitador rotativo de bancada até à sua utilização. Utilize este sangue para o hemograma completo (CBC) com a análise de células brancas do sangue (WBC) diferencial descrito no Passo 1.2.1.
      2. Tirar sangue em tubo de recolha de um 4 ml de sangue contendo heparina de lítio. Inverta tubo de recolha de sangue de acordo com as instruções do fabricante. Mantenha tubo de coleta de sangue à temperatura ambiente num agitador de bancada até o uso. Use este sangue para o ensaio de fagocitose de monócitos e granulócitos e a actividade de OB descrito no Passo 2.
  2. Determinar a quantidade de bactérias (por exemplo, S. aureus), que irá ser necessária para completar o ensaio para cada amostra.
    1. Usar um analisador de hematologia para executar um CBC com diferencial WBC análise no sangue, tal como descrito nas instruções do fabricante. Tome nota do número de leucócitos (em células / ml),% de neutrófilos, e%valores de monócitos.
    2. Use as equações abaixo para determinar as contagens de neutrófilos e monócitos para cada amostra.
      Contagem de neutrófilos (em células / mL) =% × Neutrófilos WBC (em células / ml)
      Contagem de monócitos (em células / mL) =% de monócitos × WBC (em células / ml)
    3. Use as equações abaixo para determinar a contagem de fagócitos para cada amostra e o número de fagócitos, em 100 ul de amostra.
      Contagem de fagócitos (no células / mL) = número de neutrófilos (em células / ml) + contagem de monócitos (em células / ml)
      Número de fagócitos em 100 ul = (contagem Fagocitário (em células / ml)) / 10
    4. Utilizar a equação abaixo para determinar o número de bactérias (por exemplo, S. aureus) necessários para cada amostra e a quantidade de S. marcado com FITC aureus ou não marcado S. aureus solução de trabalho (133,333 partículas / ml) que deve ser adicionada a cada tubo.
      NOTA: A bactéria alvo: relação de fagócitos é de 8: 1.
      Número de bactérias necessárias =Número de fagócitos, em 100 ul de 8 ×
      O volume de solução de trabalho com FITC ou não marcada necessária (em ul) = (número de bactérias necessárias) / (133,333 partículas / ul)

2. Execute Assay

  1. Prepare sangue total para o ensaio.
    1. Para cada tubo de controlo participante e, utilizar uma pipeta de ponta prolongada de comprimento para transferir 100 ul de sangue inteiro a partir do tubo de recolha de sangue com heparina de lítio para a parte inferior de um tubo adequadamente rotulados de 12 x 75 mm. Substituir caps.
      NOTA: Tenha cuidado para evitar que o sangue nas laterais dos 12 x 75 mm tubos.
    2. Usar uma micropipeta para adicionar 10 ul de solução de HE aos tubos marcados com tinta vermelha e um "H", incluindo o tubo de controlo de HE de trabalho. Substitua as tampas e vortex brevemente.
    3. Incubar todos os tubos em um banho de água a 37 ° C durante 15 min. Em seguida, transferir imediatamente todos os tubos para um banho de gelo-água durante 12 min.
      NOTA: Use um rack de metal abertae agite a cremalheira cada 5 minutos para assegurar que os tubos são rápida e adequadamente aquecida ou refrigerada.
  2. Adicionar bactérias (ou seja, S. aureus) para os tubos de amostra e de controlo.
    1. Usar uma micropipeta para adicionar a quantidade adequada (calculado no passo 1.2.4) de S. não marcado Solução de trabalho de aureus aos tubos marcados com tinta vermelha e um "H", incluindo o tubo de controlo de HE. Substitua as tampas e vortex brevemente.
    2. Usar uma micropipeta para adicionar a quantidade adequada (calculado no passo 1.2.4) de S. marcado com FITC Solução de trabalho de aureus aos tubos marcadas com tinta preta e um "M", incluindo o tubo de controlo de FITC. Substitua as tampas e vortex brevemente.
    3. Vortex o "sangue apenas" tubo de controlo, mas não adicionar qualquer um dos tipos de bactérias (por exemplo, S. aureus) para ele.
    4. Incubar todos os tubos em um banho de água a 37 ° C durante 20 min. Use um rack de metal aberta e gentilmente agite o suporte a cada 5 minutospara assegurar que os tubos são de forma rápida e adequadamente aquecida. Após o período de incubação, transferir imediatamente todos os tubos para um banho de gelo-água durante 1 min.
  3. Lavam-se as células.
    1. Usar uma pipeta de repetição para adicionar 100 ul de solução de paragem gelada a todos os tubos. Substitua as tampas, vortex brevemente, e depois incubar todos os tubos em gelo durante 1 min.
    2. Usar uma pipeta de repetição para adicionar 1 mL de PBS arrefecido em gelo a todos os tubos. Vortex brevemente, e em seguida, adicione um adicional de 2 ml de PBS gelado para todos os tubos e substituir as tampas. Centrifugar todos os tubos durante 5 min a 4 ° C e 270 xg, e, em seguida, aspirar o sobrenadante.
    3. Repita o passo 2.3.2 uma vez (total de 2 lavagens).
  4. Preparar as amostras para citometria de fluxo.
    1. Usar uma pipeta de repetição para adicionar 50 uL de soro fetal de bovino gelada a todos os tubos. Resumidamente vortex todos os tubos.
    2. Transferir todos os tubos para um carrossel apropriado e usar uma estação de trabalho automatizado preparação lise celular com cel vermelhas do sanguel (RBC), que fixa a lise e WBC reagentes para lisar os glóbulos vermelhos e fixar os glóbulos brancos, como descrito nas instruções do fabricante.
    3. Após a lise celular automatizado de execução da estação de trabalho de preparação foi concluída, enrole tubos em papel de alumínio e armazenar em um C geladeira a 4 ° até que a citometria de fluxo análise pode ser realizada.

3. Fluxo de Aquisição Citometria

  1. Configuração do sistema de citometria de fluxo.
    1. Aqueça o citometria de fluxo do sistema, conforme o manual de instruções fornecido pelo fabricante. Em seguida, verificar os níveis de reagente e do tanque de resíduos. Se necessário, encher os tanques de reagentes e / ou esvaziar o tanque de resíduos.
    2. Use o recurso "Painel Clean" para executar o sistema de ciclo limpo. Em seguida, executar as fluorosferas de alinhamento e de verificação de fluidos, e assegurar que o coeficiente de meia-pico de variação (HPCV) para cada detector está dentro do intervalo pré-definido descrito no controle de qualidade (QC) protocolos fornecidos pelo fabricanter.
  2. Criar aquisição específicos de ensaio e protocolos de configuração do instrumento.
    1. Criar protocolos de aquisição específicas de ensaio para os ensaios de fagocitose e atividade OB.
      NOTA: Os protocolos de aquisição aqui descritos podem ser adaptados para uso em qualquer citómetro de fluxo com um laser azul (488 nm), um filtro (530/30) para FITC, e um filtro (575/26) para HE.
      1. Abra a citometria de fluxo software de aquisição de sistema e criar um "New Protocol".
      2. Escolha o "parâmetro FL1" para o ensaio de fagocitose (FITC) e o "parâmetro FL2" para o ensaio de actividade de OB (HE).
      3. Criar as parcelas (ou seja, dispersão para a frente [FSC] vs. lado de dispersão [SSC] gráfico de pontos, FL1 histograma, FL2 histograma) necessária para a aquisição.
      4. Criar regiões poligonais para o WBC (glóbulos brancos), de granulócitos e monócitos populações sobre a trama SSC FSC vs. e criar regiões lineares sobre os histogramas FL1 e FL2. Definir a & #34; Pare de Contagem "de 50.000 eventos para o portão WBC.
      5. Salvar os protocolos com nomes específicos do ensaio.
    2. Criar uma configuração do instrumento de protocolos específicos do ensaio para os ensaios de fagocitose e a actividade de OB.
      1. Arraste e solte os "protocolos específicos do ensaio de aquisição" (definido no passo 3.2.1) a partir do "Resource Explorer" para a "Aquisição Manager" na citometria de fluxo software de aquisição de sistema.
        NOTA: As informações adicionadas desta forma será sempre aparecem no final da lista de trabalho.
      2. Insira as informações de exemplo para a lista de trabalho, e salvar a lista de trabalho.
      3. Retire os tubos da amostra de controlo a partir do 4 ° C frigorífico e permitir que eles atinjam a temperatura ambiente durante 15 min. Então, vortex brevemente cada tubo de amostra de controlo.
      4. Use os "protocolos de aquisição específico do ensaio" definidos no Passo 3.2.1 para executar a amostra de controlo negativo (ou seja, somente no sangue) e o controlo positivoamostras (isto é, HE controlo, controlo de FITC) através do sistema de citometria de fluxo. Reveja os histogramas e ajustar o tubo fotomultiplicador (PMT) tensões dos canais ficoeritrina (PE) FITC e conforme necessário.
      5. Vortex as amostras de controlo e transferi-los para a citometria de fluxo carrossel sistema de acordo com a ordem na lista de trabalho. Em seguida, coloque o carrossel na câmara de amostragem e clique no botão Citómetro Toolbar "Iniciar" para aquisição de dados para as amostras de controlo. Salve o "xxx Configuração Pro" protocolo de configuração.
  3. Adquirir amostras de estudo sobre o sistema de citometria de fluxo.
    1. Retire os tubos da amostra de estudo a 4 ° C frigorífico e deixar equilibrar à temperatura ambiente durante 15 min.
    2. Enquanto as amostras de equilíbrio, arraste os protocolos de aquisição específicos de estudo pré-definidos para o espaço da lista de trabalho para fazer uma lista de trabalho do projeto.
    3. Confirmar que o "protocolo de definição" está ligada à &# 34;. Protocolos de configuração específica de ensaio "definidos no Passo 3.2.2 Em seguida, digite as informações de identificação (por exemplo, nome estudo, desenhar número, número de visita, sujeitos ID) para cada tubo na lista de trabalho.
    4. Após o período de equilíbrio de 15 min, as amostras de estudo de vórtice e transferi-los para a citometria de fluxo carrossel sistema de acordo com a ordem na lista de trabalho. Em seguida, coloque o carrossel na câmara de amostragem e clique no botão Citómetro Toolbar "Iniciar" para adquirir dados para as amostras de estudo.
    5. Rever a qualidade dos dados, inspecionando a eficiência RBC lise e a distribuição subgrupo de células WBC, proporções, contagens absolutas e intensidades de fluorescência no painel relatório de cada amostra.
      NOTA: A qualidade dos dados é considerado aceitável se a todos esses critérios estão dentro de seus limites pré-definidos. Se todos os critérios não forem cumpridos, a amostra deve ser reprocessado.
    6. Limpo e desligar o sistema de citometria de fluxo. Armazenar a citometria de fluxodados sobre dois discos de computador diferentes para evitar a perda acidental de dados.

Análise 4. Dados

  1. Realizar a análise fagocitose.
    1. Consolidar todos os arquivos de dados de dados de modo de amostra e lista de controle (LMD) fagocitose (ie, F-identificadas) em uma única pasta. Em seguida, abra a citometria de fluxo de software de análise e arrastar os arquivos para o espaço amostral.
    2. Defina o WBC, granulócitos, monócitos e de linfócitos portões.
      1. Dê um duplo clique no nome do arquivo para abrir qualquer uma das "amostras de controlo FITC". Use os menus suspensos para definir o eixo-x para "FSC" e "linear" e o eixo-y para "SSC" e "linear".
      2. Utilize o "selector portão polígono" para preparar um portão da população WBC total.
        NOTA: Certifique-se de incluir todas as células nas bordas do gráfico. Rotular esta porta "WBC".
      3. Dê um duplo clique sobre o "novo portão WBC" e usar o dropmenus para definir o eixo-x para "FSC" e "linear" e o eixo dos y para "SSC" e "linear".
      4. Utilize o "selector portão polígono" para definir o "Granulócitos gate" e monócitos gate ", e depois usar o" selector portão elíptica "para definir a" Linfócitos gate ". Rotular cada portão em conformidade. Arraste os" dados de porta (%) "off para o lado para que as células são facilmente visualizados.
    3. Defina a "fagocitose portão positivo" e "A fagocitose portão Negativo" para as populações de granulócitos e monócitos.
      1. Dê um duplo clique sobre o "amostra de controlo FITC" utilizado no Passo 4.1.2.1. Em seguida, clique sobre o "portão de granulócitos" e usar os menus drop-down para definir o eixo-x para "FL1" e "Log" eo eixo y para "SSC" e "Linear".
      2. Utilize o "selector portão quadrado" para definir uma "fagocitose gate negativo" e um "fagocitose Positive gate ".
        Observação: Uma vez que as amostras de controlo não recebeu FITC (ou seja, S. aureus) estímulos bacterianas, todas as células devem ser teoricamente fagocitose negativo. Usar discrição ao estabelecer os limites para essas populações.
      3. Repita o passo 4.1.3.1 e 4.1.3.2 Passo para a população de monócitos.
    4. Adicionar estatísticas para a "% de WBC", "a intensidade de fluorescência", e "células positivas% de fagocitose" para as populações de granulócitos e monócitos.
      1. Clique na "amostra de controlo FITC" utilizado no Passo 4.1.2.1. Destaque o "Granulócitos gate" e clique em "Área de trabalho" e "Adicionar Estatística". Realce "Média Geométrica" ​​e "FL1 Log" e clique em "Adicionar". Em seguida, escolheu o "Frequência de Pais" estatística e clique em "Adicionar".
        NOTA: Este vai dar a intensidade de fluorescência (média geométrica) de toda a população de granulócitos ea percentagem de WBC (progenitor) que são granulócitos.
      2. Clique na "amostra de controlo FITC" utilizado no Passo 4.1.2.1. Destaque o "fagocitose portão positivo" da população de granulócitos e clique em "Área de trabalho" e "Adicionar Estatística". Realce "Média Geométrica" ​​e "FL1 Log" e clique em "Adicionar". Em seguida, escolha a opção "Frequência de Pais" estatística e clique em "Adicionar".
        NOTA: Este vai dar a intensidade de fluorescência (média geométrica) dos granulócitos positivos fagocitose e a percentagem de granulócitos (pai) que são fagocitose positivo.
      3. Repita o passo 4.1.4.1 e 4.1.4.2 Passo para a população de monócitos.
      4. Clique na "amostra de controlo FITC" utilizado no Passo 4.1.2.1. Destaque o "Linfócitos gate" e clique em "Área de trabalho" e "Adicionar Estatística". Destaque a "Frequência de Pais" estatística e clique em "Adicionar".
        NOTA: Estevai dar a percentagem de WBC (progenitor) que são linfócitos.
      5. Destaque todas as portas e estatísticas criadas na amostra de controlo FITC utilizada no Passo 4.1.2.1. Arrastá-los para "Todos os Amostras" no painel "Grupo" no topo da tela.
        NOTA: Isto irá aplicar essas configurações para todas as amostras de estudo.
      6. Salve e trabalho nome como um arquivo .wsp na mesma pasta que contém a pasta LMD.
    5. Ajustar portões de amostras individuais.
      1. Clique na "primeira amostra" no conjunto de dados e confirmar que o portão WBC se encaixa adequadamente a distribuição de células na tela. Se isso não acontecer, clique e arraste as bordas do porta ajustar o portão para que a amostra. Clique na "seta para a direita" (ie, "˃") para avançar para a próxima amostra. Repita este passo até que todas as amostras foram revistos.
      2. Clique no "gate WBC" para a primeira amostra no conjunto de dados e confirmar que o "Granulocyte portão "," monócitos gate "e" Linfócitos gate "para cada amostra encaixam adequadamente a distribuição de células na tela. Ajuste conforme necessário. Clique no botão" seta para a direita "(ie," ˃ ") para avançar para a próxima amostra .
      3. Repita o passo 4.1.5.2 até que todas as amostras foram revistos. Em seguida, clique em "Save".
    6. Exibir os dados em um programa de planilha eletrônica.
      1. Clique no ícone "Editor de Tabela" no topo da tela. Clique em "Editar", "Palavras-chave", e "$ DATE" para incluir a data de amostragem na planilha final. Em seguida, clique em "Editar", "Palavras-chave" e "@ SAMPLEID1" para incluir a identificação de amostragem na planilha final. Repita o procedimento para "@ SAMPLEID2", "@ SAMPLEID3" e "@ SAMPLEID4".
      2. Ajuste a tela "Editor de Tabelas" ea tela "amostra" para que ambos possam ser visualizados na tela do computador. Select qualquer "amostra" na folha de amostra. Em seguida, arraste cada estatística de interesse para o "Editor de Tabelas".
        1. Arraste o "Freq. De Pais" estatística listados sob o "portão de granulócitos" para o "Editor de Tabelas". Digite "% WBC como Granulócitos" sob a coluna "Nome" do "Editor de Tabelas".
        2. Arraste a estatística "Média Geométrica" ​​listados sob o "portão de granulócitos" para o "Editor de Tabelas". Digite "Média Geométrica de fluorescência, Granulócitos" sob a coluna "Nome" do "Editor de Tabelas".
        3. Arraste o "Freq. De Pais" estatística listado sob o "Granulócitos / A fagocitose positiva porta" para o "Editor de Tabelas". Digite "% Fagocitose Granulócitos positivos" na coluna "Nome" do "Editor de Tabelas".
        4. Arraste a estatística "Média Geométrica" ​​listados sob o "Granulócitos / A fagocitose positiva gate" para the "Editor de Tabelas". Digite "Média Geométrica de fluorescência, fagocitose Granulócitos positivos" na coluna "Nome" do "Editor de Tabelas".
        5. Arraste o "Freq. De Pais" estatística listados sob o "portão de monócitos" para o "Editor de Tabelas". Digite "% WBC como monócitos" sob a coluna "Nome" do "Editor de Tabelas".
        6. Arraste a estatística "Média Geométrica" ​​listados sob o "portão de monócitos" para o "Editor de Tabelas". Digite "Média Geométrica de fluorescência, monócitos" sob a coluna "Nome" do "Editor de Tabelas".
        7. Arraste o "Freq. De Pais" estatística listado sob o "monócitos / A fagocitose positiva porta" para o "Editor de Tabelas". Digite "% Fagocitose monócitos positivos" na coluna "Nome" do "Editor de Tabelas".
        8. Arraste a estatística "Média Geométrica" ​​listados sob o "monócitos / Phagocytose Positivo porta "para o" Editor de Tabelas ". Digite" Média Geométrica de fluorescência, fagocitose monócitos positivos "no âmbito do" "coluna do" Nome do Editor de Tabelas ".
        9. Arraste o "Freq. De Pais" estatística listado sob o "Linfócitos porta" para o "Editor de Tabelas". Digite "% WBC como linfócitos" sob a coluna "Nome" do "Editor de Tabelas".
      3. Arraste e solte os parâmetros visíveis no "Editor de tabela" até que eles estão dispostos na ordem de preferência.
      4. Clique em "Save". Em seguida, clique em "Criar Mesa" para exibir os dados em um formato de planilha. Clique em "salvar como" para salvar e trabalhar nome como .xlsx arquivo.
  2. Repita Passo 4.1 para o ensaio de actividade de OB (ou seja, H-rotulado) amostras e controlar os ficheiros de dados LMD.
    NOTA: Certifique-se de substituir todas as referências a fagocitose com referências a atividade OB.

    3. Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

o exercício prolongado e intenso tem profundos efeitos sobre a função imunológica inata, incluindo a função natural killer células, resposta mediada por citocinas por macrófagos à infecção viral, e de granulócitos e fagocitose de monócitos e actividade OB. Vários estudos indicam que granulócitos e monócitos fagocitose aumenta significativamente pós-exercício, refletindo a inflamação induzida por lesão muscular e demandas metabólicas. Em contraste, a actividade de granulócitos e monócitos de OB diminui pós-exercício e pode ser um indicador de imune susceptibilidade aumentada a infecções. Por exemplo, a Figura 1 mostra que a fagocitose de S. aureus por granulócitos é aumentada imediatamente e 1,5 horas após a 75 km de ciclismo ataque (70% VO2max), voltando ao normal na manhã seguinte. Monócitos fagocitose é igualmente afectadas por este nível de exercício. Figura 2 mostra que a actividade de granulócitos OB é diminuiçãod por pelo menos 21 horas após a 75 km de ciclismo. atividade de monócitos OB é também diminuiu depois de 75 km de bicicleta.

Granulócitos e monócitos fagocitose de S. aureus, mas não granulócitos e atividade OB monócitos, estão correlacionados com biomarcadores inflamação sistêmica Figura 3 mostra a correlação modesta entre fagocitose de granulócitos e os níveis séricos de proteína C-reativa (PCR) (Pearson produto-momento de correlação;. r = 0,44; P <0,01 ) em 106 mulheres com sobrepeso / obesidade. PCR soro também está correlacionado com a fagocitose de monócitos de S. aureus (Pearson produto-momento de correlação; r = 0,30; P <0,01). Além disso, neutrófilos no sangue / contagem de leucócitos (Pearson produto-momento de correlação; r = 0,62 e r = 0,61, respectivamente; P <0,001), índice de massa corporal (Pearson produto-momento de correlação; r = 0,50 e r = 0,40, respectivamente; P <0,001), os níveis de insulina no soro (r = 0,30 e r =0,23; P <0,03), e os níveis sanguíneos Um 1C (produto-momento de Pearson correlação; r = 0,28 e r = 0,21, respectivamente; P <0,04) são correlacionados com granulócitos e monócitos fagocitose de S. aureus. Em geral, estes dados indicam que a alta e a fagocitose de monócitos granulócitos em indivíduos de repouso é indicativo da inflamação sistémica.

figura 1
Figura 1: granulócitos fagocitose é afetados pelo exercício Endurance Intense granulócitos fagocitose aumentou imediatamente e 1,5 horas após a 75 km luta ciclismo a 70% do VO2 máx.. Por 21 horas pós-exercício, granulócitos fagocitose voltou a ligeiramente abaixo dos níveis pré-exercício. * indica diferente do pré-exercício (medidas repetidas ANOVA com a análise de teste t pareado post-hoc, quando for o caso; N = 19; P <0,05). Os valores são mimum ± erro padrão. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2

Figura 2:. Granulócitos oxidativo Atividade Explosão é afectada pela actividade de ruptura de Granulócitos oxidativo Intense Endurance exercício diminuiu imediatamente, 1,5 hr e 21 hr após um 75 km luta ciclismo a 70% do VO2 máx. * indica diferente do pré-exercício (medidas repetidas ANOVA com a análise de teste t pareado post-hoc, quando for o caso; N = 19; P <0,05). Os valores são médias ± erro padrão. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

. Figura 3: granulócitos fagocitose está correlacionada com sistêmico Inflamação no excesso de peso / Mulheres obesas granulócitos fagocitose foi correlacionada com a proteína do soro C-reativa, um marcador biológico amplamente aceito da inflamação sistêmica (Pearson produto-momento de correlação; N = 87; r = 0,44; P <0,01). por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Este manuscrito fornece um protocolo passo-a-passo para a determinação dos dois indicadores de granulócitos e monócitos. Foram identificadas algumas etapas que são críticos para o sucesso deste ensaio. Um tal passo é a incubação em banho de gelo que ocorre imediatamente antes da adição de bactérias. arrefecimento exaustiva de todas as amostras irá minimizar o efeito da temperatura sobre a actividade de fagocitose e OB. Um outro passo crucial é a adição de bactérias para cada amostra. A 8: 1 bactérias: relação fagócitos produz os melhores resultados; no entanto outros investigadores pode encontrar que este rácio irá precisar de ser modificados para produzir resultados úteis. Outro passo fundamental é o uso da RBC lise e reagentes de fixação WBC para lisar os glóbulos vermelhos e glóbulos brancos corrigir. A utilização de tais reagentes esta garante uma lise completa das hemácias e permite aos investigadores para armazenar de forma segura as amostras processadas a 4 ° C durante a noite, e, em seguida, executá-los através do citómetro de fluxo no dia seguinte. trabalhos anteriores (não publicado) indicates que RBC lise e fixação de WBC podem ser usados ​​para atrasar a citometria de fluxo de amostras fixadas por até 12 horas sem comprometer a integridade dos dados.

Este procedimento pode ser facilmente modificado para atender as capacidades e interesses do pesquisador, mas deve ser enfatizado que a otimização é necessário quando adaptações são feitas. Algumas das adaptações mais comuns que foram relatados são as bactérias alvo, a etiqueta / sonda e o tempo de incubação. Os investigadores produziram resultados excepcionais quando 7,8 Escherichia coli é utilizado em lugar de S. aureus como o agente patogénico alvo (tanto na proporção 8: 1). Um fungo, tal como Saccharomyces cerevisiae, podem também ser adequadas como um substituto para E. coli. Além disso, os investigadores utilizam frequentemente uma sonda molecular sensível ao pH, em vez de 7,12 FITC, como sonda para a fagocitose. Da mesma forma, sondas outro do que são geralmente utilizados para medir a actividade de OB, incluindg dichlorofluorescin diacetato (DCF-DA) 10 e dihydrorhodamine 123 (DHR). 13 tempos de incubação relatados variam de 20 min a 120 min, 12,14,15 com relatórios McFarlin que o tempo de resposta máxima pode variar de alvo bacteriana 7 Deveria. também notar-se que os tempos de incubação óptimos podem variar entre os aspectos fagocitose e OB do ensaio. 7

Tal como acontece com todos os ensaios de laboratório, resolução de problemas pode ser necessário ao estabelecer esta técnica em um novo ambiente de pesquisa. Os autores sugerem que a otimização das bactérias: relação de fagócitos é a chave do sucesso para este ensaio. Os autores também notam que os dados a partir de uma amostra deve ser descartado de análise, se menos do que 80% das células na população de granulócitos a partir de um participante não doente são FITC positivo; nesta situação, a amostra pode ser re-recolhido e re-analisados, se possível.

Há algumas limitações àgranulócitos e monócitos fagocitose e ensaio de actividade OB descrito neste manuscrito. Uma tal limitação é o uso exclusivo do FSC e SSC para identificar as populações de células de interesse. A utilização de marcadores da superfície celular que permitem que os investigadores para identificar positivamente as populações de células. 10 No entanto, a adição desta característica iria exigir mais de um citómetro de fluxo de base, e é, assim, para além do âmbito deste manuscrito. Uma outra limitação deste ensaio é que ele se baseia na eficácia de azul de tripano para extinguir a fluorescência de sondas que não foram internalizados pelas células imunes de interesse. Um 7,12 sonda molecular sensível ao pH pode ser utilizada como uma alternativa a FITC em situações em que a internalização é uma preocupação. Uma vez que uma tal sonda fluorescente é única em ambientes ácidos, tais como aqueles em vesículas endocíticas, a fluorescência adquirida representa apenas partículas internalizadas. Além disso, vários investigadores têm criticado o ensaio atual, porque ele fazES não incluem um conjunto paralelo de amostras que é incubadas em água de gelo, em vez de a 37 ° C para controlar a actividade de células imunitárias de linha de base. Em várias ocasiões, que incluiu esta "condição de gelo", quando da realização do ensaio de granulócitos e fagocitose de monócitos e actividade OB, e descobriu que ele não melhorar significativamente a qualidade dos dados (não publicados).

Em resumo, este manuscrito descreve uma técnica para a medição da actividade de fagocitose e OB em granulócitos e monócitos. Este é um ensaio simples e direta que pode ser facilmente modificada para contabilizar as capacidades laboratoriais e interesses de pesquisa. No exercício a ciência e investigação relacionada com a obesidade, esta medida da função imune inata permitirá que o investigador para explorar os efeitos de muitas medidas defensivas potenciais, incluindo perda de peso, uso do suplemento, intervenções dietéticas, e outras mudanças de estilo de vida. Após a dominar esta técnica, os pesquisadores serão capazes de monitorar agudae alterações crônicas na função imune celular em resposta à dieta, exercício, e muitos outros estímulos.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Acknowledgments

Os autores gostariam de reconhecer Zack Shue, Casey John e Lynn Cialdella-Kam para a sua assistência durante a otimização deste processo.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
12 x 75 mm tubes, with cap VWR 20170-579 You will need 2 tubes per sample ("H" and "F") plus 3 tubes per batch (for assay controls; "F", "H", and "Blood only").
PBS (10x), pH 7.4 Life Technologies 70011-044
Bottle top 0.2 µm cellulose acetate filter (500 ml capacity) Fisher Scientific 09-741-07 
Glucose, powder Life Technologies 15023-021
Citric acid (anhydrous, cell culture tested, plant cell culture tested) Sigma-Aldrich C2404-100G
Sodium citrate tribasic dihydrate Sigma-Aldrich S4641-25G
Dihydroethidium (Hydroethidine) (HE) Life Technologies D11347
Dimethyl sulfoxide (DMSO) Anhydrous Life Technologies D12345
Staphylococcus aureus (Wood strain without protein A) BioParticles, fluorescein conjugate (FITC) Life Technologies S2851
Staphylococcus aureus (Wood strain without protein A) BioParticles, unlabeled Life Technologies S-2859
Trypan Blue Solution, 0.4% Life Technologies 15250-061
4.0 ml vacutainer containing 7.2 mg K2EDTA, spray-dried VWR BD367861 You will need 1 K2EDTA blood collection tube per sample.
4.0 ml vacutainer containing 68 USP units Lithium Heparin, spray-coated VWR BD367884 You will need 1 Lithium Heparin blood collection tube per sample.
COULTER Ac·T 5diff CP Beckman Coulter 6605705 i.e., hematology analyzer
COULTER Ac·T 5diff Rinse Beckman Coulter 8547167
COULTER Ac·T 5diff Fix Beckman Coulter 8547171
COULTER Ac·T 5diff WBC Lyse Beckman Coulter 8547170
COULTER Ac·T 5diff Hgb Lyse Beckman Coulter 8547168
COULTER Ac·T 5diff Cal Calibrator Beckman Coulter 7547175
COULTER Ac·T 5diff Control Plus Beckman Coulter 7547198
AcT 5diff Diluent Beckman Coulter 8547169
200 µl extended-length pipette tips VWR 37001-526
Insulated ice pan VWR 89198-980 For ice water bath.
Open metal tube rack VWR 60916-702
Fetal Bovine Serum Life Technologies 26140-111
TQ-Prep Workstation Beckman Coulter 6605429 i.e., automated cell lyse preparation workstation
ImmunoPrep Reagent System Beckman Coulter 7546999 i.e., RBC lyse/WBC fix reagent system
Cytomics FC500 MCL Flow Cytometry System with CXP Software Beckman Coulter 626553
IsoFlow Sheath Fluid Beckman Coulter 8547008
COULTER CLENZ Beckman Coulter 8546929
Flow-Check Fluorospheres  Beckman Coulter 6605359 i.e., alignment and fluidics verification fluorospheres
FlowJo Software FlowJo FlowJo i.e., flow cytometry analysis software
Excel Software Microsoft Microsoft Excel i.e., electronic spreadsheet program

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Nieman, D. C., et al. Influence of pistachios on performance and exercise-induced inflammation, oxidative stress, immune dysfunction, and metabolite shifts in cyclists: a randomized, crossover trial. PLoS One. 9, e113725 (2014).
  2. Knab, A. M., et al. Effects of a freeze-dried juice blend powder on exercise-induced inflammation, oxidative stress, and immune function in cyclists. Appl Physiol Nutr Metab. 39, 381-385 (2014).
  3. Konrad, M., et al. The acute effect of ingesting a quercetin-based supplement on exercise-induced inflammation and immune changes in runners. Int J Sport Nutr Exerc Metab. 21, 338-346 (2011).
  4. Nieman, D. C., et al. Immune and inflammation responses to a 3-day period of intensified running versus cycling. Brain Behav Immun. 39, 180-185 (2014).
  5. Nieman, D. C., et al. Carbohydrate supplementation affects blood granulocyte and monocyte trafficking but not function after 2.5 h of running. Am J Clin Nutr. 66, 153-159 (1997).
  6. Tidball, J. G. Inflammatory cell response to acute muscle injury. Med Sci Sports Exerc. 27, 1022-1032 (1995).
  7. McFarlin, B. K., Williams, R. R., Venable, A. S., Dwyer, K. C., Haviland, D. L. Image-based cytometry reveals three distinct subsets of activated granulocytes based on phagocytosis and oxidative burst. Cytometry A. 83, 745-751 (2013).
  8. Liao, Y., Liu, P., Guo, F., Zhang, Z. Y., Zhang, Z. Oxidative burst of circulating neutrophils following traumatic brain injury in human. PLoS One. 8, e68963 (2013).
  9. McFarlin, B. K., Venable, A. S., Prado, E. A., Henning, A. L., Williams, R. R. Image-based flow cytometry technique to evaluate changes in granulocyte function in vitro. J Vis Exp. , (2014).
  10. Nieman, D. C., et al. Immune response to obesity and moderate weight loss. Int J Obes Relat Metab Disord. 20, 353-360 (1996).
  11. Nieman, D. C., et al. Immune function in female elite rowers and non-athletes. Br J Sports Med. 34, 181-187 (2000).
  12. Ichii, H., et al. Iron sucrose impairs phagocytic function and promotes apoptosis in polymorphonuclear leukocytes. Am J Nephrol. 36, 50-57 (2012).
  13. Gomes, A., Fernandes, E., Lima, J. L. Fluorescence probes used for detection of reactive oxygen species. J Biochem Biophys Methods. 65, 45-80 (2005).
  14. Gruger, T., et al. Negative impact of linezolid on human neutrophil functions in vitro. Chemotherapy. 58, 206-211 (2012).
  15. Dementhon, K., El-Kirat-Chatel, S., Noel, T. Development of an in vitro model for the multi-parametric quantification of the cellular interactions between Candida yeasts and phagocytes. PLoS One. 7, e32621 (2012).

Tags

Immunology edição 115 fagocitose burst oxidativo monócitos granulócitos imunidade inata citometria de fluxo
Medição de granulócitos e monócitos fagocitose e oxidativo Atividade Burst no Sangue
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Meaney, M. P., Nieman, D. C.,… More

Meaney, M. P., Nieman, D. C., Henson, D. A., Jiang, Q., Wang, F. Z. Measuring Granulocyte and Monocyte Phagocytosis and Oxidative Burst Activity in Human Blood. J. Vis. Exp. (115), e54264, doi:10.3791/54264 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter