Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Måling granulocytt og Monocyte Fagocytose og Oksidativt Burst Aktiviteten i Human Blood

Published: September 12, 2016 doi: 10.3791/54264
Automatic Translation
1, 1, 2, 3, 3
1Human Performance Laboratory, North Carolina Research Campus, Appalachian State University, 2Department of Biology, Appalachian State University, 3David H. Murdock Research Institute

Introduction

Den granulocytter og monocytter fagocytose / oksidative utbrudd (OB) aktivitetsanalyse er en enkel, rett-frem teknikk som ofte brukes til å samle informasjon om medfødte immunforsvaret ved langvarig og intensiv trening. 1-4 Når studere responsen fra immunsystemet til å en stimulus, granulocytter og monocytter er av spesiell interesse fordi de spiller en sentral rolle i vertens forsvar og er de første immunceller til å akkumulere på stedet for infeksjon. 5 nøytrofile, en type granulocytt, er de første cellene til translocate til skadet muskel vev etter intensiv trening. 6 Fagocytose og OB-aktivitet er de mest vanlige målinger av granulocytt og monocytt-funksjon, 7 og er foretrukket som indikatorer på medfødte immuncellefunksjon på grunn av deres sentrale rolle i både den infeksjonsprosessen og reparasjonsprosessen.

Analysen beskrevet i dette manuskriptet utilizes en grunnleggende flowcytometer for å tilveiebringe en kvantitativ bestemmelse av granulocytt og monocytt-fagocytose og OB-aktivitet i fullblod. Bruken av helblod i denne teknikk er fordelaktig fordi det tillater analysen som skal utføres uten en tidkrevende renseprosedyren. Denne analysen kan lett bli endret for å imøtekomme en rekke forskningsdesign og lab evner. For eksempel, Liao et al., Benyttes en lignende teknikk for å vise at nøytrofil OB-aktivitet økes og nøytrofil fagocytose blir redusert etter traumatisk hjerneskade. 8 I et annet eksempel, McFarlin et al., Beskrives et elegant modifikasjon av denne teknikk som bruker allofykocyanin (APC ) konjugert CD66b og høy ytelse tandem APC-konjugert CD45 merking med bildebasert flowcytometri å klassifisere granulocytter i forhold til deres fagocytose og OB-aktiviteter. 7,9

Vår forskningsgruppe har brukt ulike tilpasninger av denne technique som en indikator på medfødte immunfunksjonen hos overvektige, overvektige, og atletisk populasjoner i nesten 20 år. 10,11 Teksten under vil gi leseren med trinn-for-trinn-instruksjoner for å utføre denne analysen og lyse områder at leseren kan tilpasse for å møte behovene til sin forskning.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

MERK: Alle blod samling prosedyrer ble utført i samsvar med retningslinjene fastsatt av Appalachian State University (ASU) Institutional Review Board (IRB).

1. Analyse Forberedelse

  1. Samle, forberede og organisere materialet som er spesifisert for inngrepet (se tabell over spesifikke materialer / utstyr).
    1. Merk 12 x 75 mm rør.
      1. Etikett to rør for hver deltaker: ett rør for fagocytose analysen (merke dette røret med sort blekk og en "F" for fluoresceinisotiocyanat [FITC]) og ett rør for OB aktivitetsanalyse (merke dette røret med rødt blekk og en " H "for dihydroethidium [HE]).
        MERK: Bruk av sterile 12 x 75 mm rør vil redusere utilsiktet cellulær aktivering og tilhørende økning i bakgrunnsstøy.
      2. Etikett tre rør for analyse kontroller: ett rør for fagocytose analysen (FITC kontroll: merke dette røret med svak blekk og en "F"), ett rør for OB aktivitetsanalyse (HE kontroll: merke dette rør med rødt blekk og en "H"), og en slange for den negative kontrollen (Blood bare: merke dette rør med grønn blekk og "blod only").
    2. Fremstille stamløsninger minst en dag før dagen for analysen.
      1. Fremstille steril fosfatbufret saltløsning (PBS). Fortynn 100 ml 10x PBS med 900 ml 18,2 Megohm H 2 O. Filter sterilisere med et 0,2 mikrometer filter. Oppbevar ved 4 ° C inntil bruk.
      2. Forbered sterile PBS-glukose. Oppløs 1,0 g glucose i 100 ml PBS. Filter sterilisere med et 0,2 mikrometer filter. Oppbevar ved 4 ° C inntil bruk.
      3. Forbered sterile 0,1 M citratbuffer. Oppløs 1,2 g sitronsyre og 1,1 g natriumcitrat i 100 ml 18,2 Megohm H 2 O. Juster pH-verdien til 4,0. Filter sterilisere med et 0,2 mikrometer filter. Oppbevar ved 4 ° C inntil bruk.
      4. Klargjør HE stamløsning. Resuspend 1,0 mg HE i 1,0 ml dimetylsulfoksyd (DMSO). Bland forsiktig, delmengde, og oppbevar ved -20 ° C inntil bruk.
      5. Forbered FITC-merket Staphylococcus aureus (S. aureus) stamløsning (2 x 10 9 partikler / ml). Gjensuspender 10 mg av FITC-merket S. aureus på 1,5 ml (eller passende mengde) i PBS. Del inn i tre 500 ul porsjoner og sonicate i henhold til produsentens anbefaling. Delmengde og oppbevares ved -20 ° C inntil bruk.
      6. Klargjør umerkede S. aureus stamløsning (2 x 10 ni partikler / ml). Suspender 100 mg umerket S. aureus i 15 ml (eller passende mengde) i PBS. Dele inn i tretti 500 ul porsjoner og sonicate i henhold til produsentens anbefaling. Delmengde og oppbevares ved -20 ° C inntil bruk.
    3. Fremstille friske arbeidsløsninger på analysedagen.
      1. Klargjør HE arbeidsløsning. Overfør 10 mL avtint HE stamløsning til 990 mL PBS-glukose. Beskytt mot lys og holde på is inntil bruk.
      2. Forbered FITC-merket S. aureus arbeidsløsning (133,333 partikler / ul). Overfør 70 mL av tint FITC-merket S. aureus stamløsning til 980 ul PBS. Beskytt mot lys og holde på is inntil bruk.
      3. Klargjør umerkede S. aureus arbeidsløsning (133,333 partikler / ul). Overføring 70 mL av tint umerket S. aureus stamløsning til 980 ul PBS. Beskytt mot lys og holde på is inntil bruk.
      4. Forbered slukke løsning. Legg 750 mL av 0,4% trypanblått-oppløsning til 11,25 ml steril 0,1 M sitratbuffer. Hold en is-vannbad før bruk.
    4. Ha en sertifisert phlebotomist trekke blod ifølge Verdens helseorganisasjon retningslinjer for tegning blod.
      1. Trekke blod inn i en 4 ml blod samling rør som inneholder K 2 EDTA. Ivert blod samling rør i henhold til produsentens instruksjoner. Hold blodprøverøret ved romtemperatur på en benk-top rocker inntil bruk. Bruk dette blodet for fullstendig blodtelling (CBC) med hvite blodceller (WBC) differensial analyse er beskrevet i trinn 1.2.1.
      2. Trekke blod inn i en 4 ml blod samling rør som inneholder litium heparin. Vend blod samling rør i henhold til produsentens instruksjoner. Hold blodprøverøret ved RT på en benk-top rocker inntil bruk. Bruk av dette blod for monocytt og granulocytt-fagocytose og OB-aktivitetsanalyse som er beskrevet i trinn 2.
  2. Bestemme mengden av bakterier (dvs. S. aureus) som vil være nødvendig for å fullføre analysen for hver prøve.
    1. Bruk en hematologimaskin å utføre en CBC med WBC differensialanalyse på blodet som beskrevet i produsentens instruksjoner. Noter antall hvite blodlegemer (i celler / ml),% nøytrofile, og%Monocytter verdier.
    2. Bruke ligningene nedenfor for å bestemme de nøytrofile og monocytt teller for hver prøve.
      Nøytrofiltall (i celler / ml) =% nøytrofile × WBC (i celler / ml)
      Monocyte count (i celler / ml) =% Monocyte × WBC (i celler / ml)
    3. Bruke ligningene nedenfor for å bestemme den fagocyttsystemet tellingen for hver prøve, og antallet fagocytter som er tilstede i 100 ul prøve.
      Phagocyte count (i celler / ml) = Nøytrofiltall (i celler / ml) + Monocyte count (i celler / ml)
      Antall fagocytter i 100 pl = (fagocytt teller (i celler / ml)) / 10
    4. Bruke ligningen nedenfor for å bestemme antall bakterier (dvs. S. aureus) som trengs for hver prøve, og mengden av FITC-merket S. aureus eller umerket S. aureus arbeidsløsning (133,333 partikler / ml) som skal tilsettes til hvert rør.
      MERK: målet bakterier: phagocyte forholdet er 8: 1.
      Antall bakterier som trengs =Antall fagocytter i 100 pl x 8
      Volum av FITC eller umerket arbeidsoppløsningen nødvendig (i ul) = (antall bakterier nødvendig) / (133,333 partikler / ul)

2. Utfør analysen

  1. Forbered helblod for analysen.
    1. For hver deltaker og kontrollrør, bruke en utvidet lengde pipette for å overføre 100 ul helblod fra litium heparin blodprøverøret til bunnen av en hensiktsmessig merket 12 x 75 mm rør. Bytt caps.
      MERK: Vær forsiktig for å unngå å få blod på sidene av de 12 x 75 mm rør.
    2. Bruke en mikropipette for å legge til 10 ul av HE arbeidsløsning til rørene merket med rødt blekk og en "H", herunder HE kontrollrøret. Bytt caps og vortex kort.
    3. Inkuber alle rørene i et 37 ° C vannbad i 15 min. Deretter, umiddelbart overføre alle rør til et is-vannbad i 12 min.
      MERK: Bruk en åpen metallstativog rist stativet hver 5 min for å sikre at rørene er hurtig og tilstrekkelig oppvarmet eller kjølt.
  2. Legg bakterier (dvs. S. aureus) til prøve- og kontrollrørene.
    1. Bruk en mikropipette for å legge til riktig mengde (beregnet i trinn 1.2.4) av umerket S. aureus arbeidsløsning til rørene merket med rødt blekk og en "H", herunder HE kontrollrøret. Bytt caps og vortex kort.
    2. Bruk en mikropipette for å legge til riktig mengde (beregnet i trinn 1.2.4) av FITC-merket S. aureus arbeidsløsning til rørene merket med sort blekk og en "F", herunder FITC kontrollrøret. Bytt caps og vortex kort.
    3. Vortex "Kun blod" styrerøret, men ikke legge til en av typene av bakterier (dvs. S. aureus) til den.
    4. Inkuber alle rørene i et 37 ° C vannbad i 20 min. Bruk en åpen metall rack og rist stativet hvert 5 minfor å sikre at rørene er hurtig og tilstrekkelig varme. Etter inkubasjonsperioden, umiddelbart overføre alle rør til et is-vannbad i 1 min.
  3. Vask cellene.
    1. Bruke en repeater pipette for å legge til 100 mL iskald stoppoppløsning til alle rør. Bytt caps, vortex kort, og deretter inkuber alle rør på is i 1 min.
    2. Bruke en repeater pipette for å legge til 1 ml av iskald PBS til alle rør. Vortex kort, og deretter legge til en ekstra 2 ml iskald PBS til alle rør og erstatte caps. Sentrifuger alle rør i 5 minutter ved 4 ° C og 270 xg, og deretter aspirer supernatanten.
    3. Gjenta trinn 2.3.2 én gang (totalt 2 vasker).
  4. Forbered prøver for flowcytometri.
    1. Bruke en repeater pipette for å legge til 50 pl iskald føtalt bovint serum til alle rør. I korthet vortex alle rør.
    2. Overfør alle rør til en hensiktsmessig karusellen og bruke en automatisert celle Lyse forberedelse arbeidsstasjon med rødt blod cell (RBC) lysere og WBC fikse reagenser for å lysere RBC og fikse WBC som beskrevet i produsentens instruksjoner.
    3. Etter den automatiserte celle lyse forberedelse arbeidsstasjon løp er ferdig, pakk rør i aluminiumsfolie og oppbevar i en 4 ° C kjøleskapet til kan utføres flowcytometri analyse.

3. Flowcytometri Acquisition

  1. Oppsett av flowcytometri system.
    1. Varm opp flowcytometri systemet som anvist i bruksanvisningen gitt av produsenten. Deretter kontrollerer reagensstasjonene og avfall tanknivåer. Om nødvendig, fyll reagensstasjonene tanker og / eller tømme avfallstanken.
    2. Bruk "Clean Panel" til å kjøre systemet ren syklus. Deretter kjører justerings og lufthåndtering verifisering Fluorospheres, og sørge for at den halve peak variasjonskoeffisienten (HPCV) for hver detektor er innenfor de forhåndsdefinerte område beskrevet i kvalitetskontroll (QC) protokoller leveres av produksjonr.
  2. Lag analysespesifikke oppkjøp og instrument sette protokoller.
    1. Lag analysespesifikke anskaffelsesprotokoller for fagocytose og OB aktivitetsanalyser.
      MERK: anskaffelsesprotokoller som er beskrevet her kan tilpasses for bruk på en hvilken som helst strømningscytometer med en blå laser (488 nm), et filter (530/30) for FITC, og et filter (575/26) for HE.
      1. Åpne flowcytometri system oppkjøpet programvaren og opprette en "Ny Protocol".
      2. Velg "FL1 Parameter" for fagocytose analysen (FITC) og "FL2 Parameter" for OB aktivitetsanalyse (HE).
      3. Lag tomter (dvs. frem scatter [FSC] vs side scatter [SSC] dot plot, FL1 histogram, FL2 histogram) som kreves for oppkjøpet.
      4. Lag polygonale regioner for WBC (hvite blodlegemer), granulocytter og monocytter populasjoner på FSC versus SSC tomten og lage lineære områder på FL1 og FL2 histogrammer. Sett en & #34; Stopp Count "på 50.000 hendelser for WBC gate.
      5. Redd protokoller med analysespesifikke navn.
    2. Lag analysespesifikke instrument sette protokoller for fagocytose og OB aktivitetsanalyser.
      1. Dra og slipp "analysespesifikke anskaffelsesprotokoller" (definert i trinn 3.2.1) fra "Resource Explorer" til "Acquisition Manager" på flowcytometri system oppkjøpet programvare.
        MERK: Informasjon som er lagt på denne måten vil alltid vises på slutten av arbeidslisten.
      2. Skriv inn prøven informasjon i arbeidslisten, og lagre arbeidslisten.
      3. Fjern kontrollprøverørene fra 4 ° C kjøleskap og la dem ekvilibrere til romtemperatur i 15 min. Deretter kort vortex hver kontroll prøverør.
      4. Bruk "analysespesifikke protokoller innhentings" som er definert i trinn 3.2.1 for å kjøre den negative kontrollprøven (dvs. blod bare) og den positive kontrollenprøver (dvs. HE kontroll, FITC kontroll) gjennom flowcytometri system. Gjennomgå histogrammer og juster fotomultiplikatorrøret (PMT) spenninger FITC og fysoerytrin (PE) kanaler etter behov.
      5. Vortex kontrollprøvene og overføre dem til flowcytometri system karusellen i henhold til rekkefølgen på arbeidslisten. Deretter plasserer karusellen i prøvekammeret og klikk på cytometeret Toolbar "Start" -knappen for å skaffe data for kontrollprøvene. Lagre "xxx Stille Pro" innstilling protokollen.
  3. Tilegne seg læreprøver på flowcytometri system.
    1. Fjern de studie prøverørene fra 4 ° C kjøleskap og la den ekvilibrere til romtemperatur i 15 min.
    2. Mens prøvene equilibrating, drar de forhåndsdefinerte studiespesifikke anskaffelsesprotokoller til arbeidslisten plass til å gjøre et prosjekt arbeidsliste.
    3. Bekrefte at "-innstillingen protokoll" er koblet til &# 34;. Analysespesifikke innstillinger protokoller "er definert i trinn 3.2.2 Deretter skriver du inn opplysninger som kan identifisere (f.eks studie navn, tegne nummer, besøk nummer, emne ID) for hvert rør inn i arbeidsliste.
    4. Etter 15 minutters utjevningsperiode, vortex studie prøver og overføre dem til flowcytometri system karusellen i henhold til rekkefølgen på arbeidslisten. Deretter plasserer karusellen i prøvekammeret og klikk på cytometeret Toolbar "Start" -knappen for å skaffe data for studieprøvene.
    5. Vurdere kvaliteten av dataene ved å inspisere RBC lysis effektivitet og den WBC celleundergruppefordeling, proporsjoner, absolutte tellinger, og fluorescensintensiteter på rapporten panel av hver prøve.
      MERK: Datakvaliteten vurderes som akseptabelt hvis alle disse kriteriene er innenfor sine forhåndsdefinerte grenser. Hvis alle kriteriene ikke er oppfylt, bør prøven behandles på nytt.
    6. Ren og slå av flowcytometri system. Oppbevar flowcytometridata på to forskjellige datadisker for å hindre utilsiktet tap av data.

4. Data Analysis

  1. Utfør fagocytose analyse.
    1. Konsolidere alle fagocytose (dvs. F-merket) prøve og iste modus data (LMD) datafiler i en enkelt mappe. Deretter åpner du flowcytometri analyse programvare og dra filene inn i prøverommet.
    2. Sett WBC, granulocytt, Monocyte, og Lymfocytter porter.
      1. Dobbeltklikk på filnavnet for å åpne noen av de "FITC kontrollprøver". Bruk rullegardinmenyene for å sette x-aksen til "FSC" og "lineær" og y-aksen til "SSC" og "lineær".
      2. Bruk "polygon porten velgeren" for å fremstille en port av den totale WBC populasjonen.
        MERK: Sørg for å inkludere alle cellene på kantene av diagrammet. Merk dette gate "WBC".
      3. Dobbeltklikk på den "nye WBC gate" og bruke rulledown menyer for å sette x-aksen til "FSC" og "Linear" og y-aksen til "SSC" og "Linear".
      4. Bruk "polygon gate velgeren" for å sette "granulocytt gate" og Monocyte gate ", og deretter bruke" elliptiske gate velgeren "for å sette" lymfocyttkontroll gate ". Merk hver gate tilsvarende. Dra" gate data (%) "ut til siden slik at cellene blir lett sett.
    3. Sett "Fagocytose Positive gate" og "Fagocytose Negative gate" for granulocytter og monocytter populasjoner.
      1. Dobbeltklikk på "FITC kontrollutvalget" brukt i trinn 4.1.2.1. Deretter klikker du på "granulocytt gate" og bruk rullegardinmenyene til å sette x-aksen til "FL1" og "Log" og y-aksen til "SSC" og "Linear".
      2. Bruk "torget gate velgeren" for å sette en "Fagocytose Negative gate" og en "Fagocytose positive gate ".
        MERK: Siden FITC kontrollprøvene ikke har fått bakterielle (dvs. S. aureus) stimuli, bør alle cellene teoretisk være fagocytose negativ. Bruk skjønn ved fastsettelsen av grensene for disse populasjonene.
      3. Gjenta trinn 4.1.3.1 og trinn 4.1.3.2 for monocytt befolkningen.
    4. Legg statistikk for «% av WBC", "fluorescens intensitet", og "% fagocytose positive celler" for granulocytter og monocytter populasjoner.
      1. Klikk på "FITC kontrollutvalget" brukt i trinn 4.1.2.1. Marker "granulocytt gate", og klikk deretter på "arbeidsområde" og "Legg til statistikk". Marker "Geometriske Mean" og "FL1 Log" og klikk "Legg til". Deretter valgte "Frequency of Parent" statistikk og klikk "Legg til".
        MERK: Dette vil gi fluorescens intensitet (geometrisk gjennomsnitt) av hele granulocytter befolkningen ogprosentandelen av WBC (moder) som befinner granulocytter.
      2. Klikk på "FITC kontrollutvalget" brukt i trinn 4.1.2.1. Marker "Fagocytose Positive gate" av granulocytt befolkningen, og klikk deretter på "arbeidsområde" og "Legg til statistikk". Marker "Geometriske Mean" og "FL1 Log" og klikk "Legg til". Deretter velger du "Frequency of Parent" statistikk og klikk "Legg til".
        MERK: Dette vil gi fluorescens intensitet (geometrisk gjennomsnitt) av fagocytose positive granulocytter og prosentandelen av granulocytter (overordnede) som er fagocytose positive.
      3. Gjenta trinn 4.1.4.1 og trinn 4.1.4.2 for monocytt befolkningen.
      4. Klikk på "FITC kontrollutvalget" brukt i trinn 4.1.2.1. Marker "Lymphocyte gate", og klikk deretter på "arbeidsområde" og "Legg til statistikk". Marker "Frequency of Parent" statistikk og klikk "Legg til".
        MERK: Dettegir prosentandelen av WBC (moder) som er lymfocytter.
      5. Marker alle portene og statistikk opprettet i FITC kontrollutvalget brukes i trinn 4.1.2.1. Dra dem inn i "Alle Samples" i "konsernet" panel på toppen av skjermen.
        MERK: Dette vil bruke disse innstillingene på alle studieprøvene.
      6. Lagre og navn arbeid som .wsp fil i samme mappe som inneholder LMD mappe.
    5. Juster individuelle prøve porter.
      1. Klikk på "første prøven" i datasettet og bekrefter at WBC gate hensiktsmessig passer cellen distribusjon på skjermen. Hvis den ikke gjør det, klikke og dra kantene på porten justere gate for at prøven. Klikk på "pil høyre" (dvs. "˃") for å gå videre til neste prøve. Gjenta dette trinnet til alle prøvene har blitt anmeldt.
      2. Klikk på "WBC gate" for den første prøven i datasettet og bekrefter at "Granulocyte gate "," Monocyte gate ", og" lymfocytter gate "for hver prøve på riktig plass i cellen distribusjon på skjermen. Juster etter behov. Klikk på" pil høyre "(dvs." ˃ ") for å gå videre til neste prøve .
      3. Gjenta trinn 4.1.5.2 før alle prøver er gjennomgått. Deretter klikker du på "Lagre".
    6. Vise data i et elektronisk regnearkprogram.
      1. Klikk på ikonet "Table Editor" øverst på skjermen. Klikk på "Edit", "søkeord", og "$ DATE" for å inkludere prøvetaking dato på det endelige regnearket. Deretter klikker du på "Rediger", "søkeord", og "@ SAMPLEID1" for å inkludere prøvetaking identifikasjon på det endelige regnearket. Gjenta for "@ SAMPLEID2", "@ SAMPLEID3", og "@ SAMPLEID4".
      2. Juster "Table Editor" skjerm og "sample" skjerm, slik at de kan både sees på dataskjermen. Select noen "sample" på prøven ark. Deretter drar hver statistikk av interesse for "Table Editor".
        1. Dra "Freq. Parent" statistikk oppført under "granulocytt gate" til "Table Editor". Type "% WBC som Granulocytter" under "Navn" -kolonnen i "Table Editor".
        2. Dra "Geometric Mean" statistikk oppført under "granulocytt gate" til "Table Editor". Skriv "Geometrisk gjennomsnittlig fluorescens, granulocytter" under "Navn" -kolonnen i "Table Editor".
        3. Dra "Freq. Parent" statistikk oppført under "granulocytt / Fagocytose Positiv gate" til "Table Editor". Type "% fagocytose Positive Granulocytter" under "Navn" -kolonnen i "Table Editor".
        4. Dra "Geometric Mean" statistikk oppført under "granulocytt / Fagocytose Positiv gate" til the "Table Editor". Skriv "Geometrisk gjennomsnittlig fluorescens, fagocytose Positive Granulocytter" under "Navn" -kolonnen i "Table Editor".
        5. Dra "Freq. Parent" statistikk oppført under "Monocyte gate" til "Table Editor". Type "% WBC som Monocytter" under "Navn" -kolonnen i "Table Editor".
        6. Dra "Geometric Mean" statistikk oppført under "Monocyte gate" til "Table Editor". Skriv "Geometrisk gjennomsnittlig fluorescens, monocytter" under "Navn" -kolonnen i "Table Editor".
        7. Dra "Freq. Parent" statistikk oppført under "Monocyte / Fagocytose Positiv gate" til "Table Editor". Skriv "% fagocytose Positive Monocytter" under "Navn" -kolonnen i "Table Editor".
        8. Dra "Geometric Mean" statistikk oppført under "Monocyte / Phagocytosis Positiv gate "til" Table Editor ". Type" Geometrisk gjennomsnittlig fluorescens, fagocytose Positive Monocytter "under" Navn "-kolonnen i" Table Editor ".
        9. Dra "Freq. Parent" statistikk oppført under "lymfocyttkontroll gate" til "Table Editor". Type "% WBC som lymfocytter" under "Navn" -kolonnen i "Table Editor".
      3. Dra og slipp parametrene synlige i "Table Editor" før de er ordnet i ønsket rekkefølge.
      4. Klikk "Lagre". Deretter klikker du på "Create Table" for å vise dataene i et regneark format. Klikk på "lagre som" for å lagre og navn arbeidet som .xlsx-fil.
  2. Gjenta trinn 4.1 for OB aktivitetsanalyse (dvs. H-merket) prøver og kontrollere LMD datafiler.
    MERK: Pass på å erstatte alle referanser til fagocytose med referanser til OB aktivitet.

    3. Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Langvarig og intensiv trening har dyptgripende virkninger på medfødte immunforsvar, inkludert natural killer celle funksjon, makrofag cytokin-mediert reaksjon på virusinfeksjon, og granulocytter og monocytt fagocytose og OB aktivitet. Flere studier tyder på at granulocytter og monocytter fagocytose øker betydelig etter trening, noe som reflekterer den betennelse indusert av muskelskader og metabolske krav. I kontrast, granulocytter og monocytter OB aktiviteten avtar etter trening og kan være en immun indikator på økt mottakelighet for infeksjoner. For eksempel viser figur 1 at fagocytose av S. aureus av granulocytter økes umiddelbart og 1,5-timers etter en 75-km sykling bout (70% VO2max), tilbake til det normale ved neste morgen. Monocytt-fagocytose er på lignende måte berørt av dette nivået av øvelsen. Figur 2 viser at granulocytt OB-aktivitet er redusertd for minst 21-timer etter 75-km sykling. Monocyte OB aktivitet er også redusert etter at 75-km sykling.

Granulocytter og monocytt fagocytose av S. aureus, men ikke granulocytter og monocytter OB aktivitet, er korrelert til systemisk inflammasjon biomarkører Figur 3 viser beskjeden sammenheng mellom granulocytter fagocytose og serum C-reaktivt protein (CRP) nivåer (Pearson produkt-moment korrelasjon;. r = 0,44, p <0,01 ) i 106 overvektige / overvektige kvinner. Serum CRP er også korrelert til monocytt fagocytose av S. aureus (Pearson produkt-moment korrelasjon, r = 0,30; p <0,01). I tillegg blod nøytrofile / leukocyttverdiene (Pearson produkt-moment korrelasjon, r = 0,62 og r = 0,61, henholdsvis; P <0,001), body mass index (Pearson produkt-moment korrelasjon, r = 0,50 og r = henholdsvis 0,40,; P <0,001), seruminsulinnivåer (r = 0,30 og r =0,23; P <0,03), og blod A 1C nivåer (Pearson produkt-moment korrelasjon, r = 0,28 og r = 0,21, henholdsvis; P <0,04) er korrelert til granulocytter og monocytter fagocytose av S. aureus. Generelt sett indikerer disse data at høy granulocytt og monocytt-fagocytose i hvile fag er et tegn på systemisk inflammasjon.

Figur 1
Figur 1: granulocytt Fagocytose er påvirket av sterk utholdenhet øvelse granulocytt fagocytose økte umiddelbart og 1,5-timers etter en 75-km sykling bout på 70% av VO2max.. Ved 21-timer etter trening, returneres granulocytter fagocytose til litt under pre-trening nivåer. * indikerer forskjellig fra pre-trening (Gjentatte tiltak ANOVA med paret t-test post-hoc analyse, når det passer, N = 19; p <0,05). Verdier er megen ± standard feil. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 2

Figur 2:. Granulocytt Oksidativt Burst aktivitet er påvirket av sterk utholdenhet øvelse granulocytt oksidativt utbrudd aktivitet redusert umiddelbart, 1,5-timers, og 21-timers etter en 75-km sykling bout på 70% av VO2max. * indikerer forskjellig fra pre-trening (Gjentatte tiltak ANOVA med paret t-test post-hoc analyse, når det passer, N = 19; p <0,05). Verdier er gjennomsnitt ± standard feil. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

. Figur 3: granulocytt Fagocytose er korrelert med systemisk inflammasjon i overvekt / overvektige kvinner granulocytt fagocytose ble korrelert til serum C-reaktivt protein, en allment akseptert biomarkør for systemisk inflammasjon (Pearson produkt-moment korrelasjon; N = 87; r = 0,44; P <0,01). klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Dette manuskriptet gir en trinn-for-trinn-protokoll for bestemmelse av to indikatorer på granulocytt og monocytt-funksjon. Vi har identifisert noen skritt som er avgjørende for å lykkes i denne analysen. Et slikt trinn er isbadet inkubasjon som inntreffer umiddelbart før tilsetningen av bakterier. Grundig avkjøling av alle prøvene vil minimalisere effekten av temperatur på fagocytose og OB-aktivitet. Et annet kritisk punkt er tilsetningen av bakterier til hver prøve. En 8: 1 bakterier: phagocyte forholdet produserer optimalt resultat; imidlertid andre forskere kan finne at dette forhold må modifiseres for å fremstille egnede resultater. Et annet kritisk punkt er bruk av RBC Lysing og WBC feste reagenser for å lysere RBC og fikse WBCs. Bruken av denne slike reagenser sikrer fullstendig lyse av de røde blodceller og gjør det mulig for forskere for trygg oppbevaring av behandlede prøver ved 4 ° C over natten, og deretter kjøre dem gjennom strømningscytometer den neste dag. Tidligere arbeid (upublisert) indiskAtes at RBC Lysing og WBC feste kan brukes til å forsinke flowcytometri av faste prøver av så mange som 12 timer uten at det går dataintegritet.

Denne prosedyren kan enkelt endres for å møte de evner og interesser forsker, men det bør understrekes at optimalisering er nødvendig når tilpasninger er gjort. Noen av de vanligste tilpasningene som er rapportert er til målet bakterier, etiketten / sonde, og inkubasjonstiden. Forskere har gitt gode resultater når Escherichia coli 7,8 blir benyttet i stedet for S. aureus som målpatogenet (både på 8: 1 forhold). En sopp, så som Saccharomyces cerevisiae, kan også være egnet som en erstatning for E. coli. I tillegg har forskere ofte bruker et pH-følsomt molekylær probe, 7,12 istedenfor FITC, som probe for fagocytose. Likeledes sonder annet enn han blir ofte brukt for å måle OB aktivitet, including dichlorofluorescin diacetate (DCF-DA) 10 og dihydrorhodamine 123 (DHR). 13 Rapporterte inkubasjonstider varierer fra 20 min til 120 min, 12,14,15 med McFarlin rapporterer at maksimal responstid kan variere fra bakteriell målet. 7 Det bør også bemerkes at de optimale inkubasjonstidene kan variere mellom fagocytose og OB aspekter av analysen. 7

Som med alle laboratorieanalyser, kan feilsøking være nødvendig ved etablering av denne teknikken i en ny forskningsrapport setting. Forfatterne anbefaler at optimalisering av bakterier: phagocyte forholdet er nøkkelen til suksess for denne analysen. Forfatterne også merke til at dataene fra en prøve skal kastes fra analyse hvis færre enn 80% av cellene i granulocytter befolkningen fra et ikke-syk deltaker er FITC positive; i denne situasjon, kan prøven på nytt oppsamlet og re-analyserte, hvis det er mulig.

Det er noen begrensninger igranulocytter og monocytt fagocytose og OB aktivitet analysen beskrevet i dette manuskriptet. En slik begrensning er eksklusiv bruk av FSC og SSC å identifisere cellepopulasjoner av interesse. Bruken av celleoverflatemarkører ville tillate forskere til positivt å identifisere cellepopulasjoner. 10 Imidlertid er tilsetningen av denne funksjonen vil kreve mer enn en basisk flowcytometer, og er således utenfor rammen av dette manuskriptet. En annen begrensning ved denne analyse er at den er avhengig av effekten av trypanblått for å slukke fluorescensen av sonder som ikke er internalisert av immuncellene av interesse. Et pH-følsomt molekylær sonde 7,12 kan brukes som et alternativ til FITC i situasjoner hvor internalisering er en bekymring. Siden en slik sonde er bare fluorescerende i sure miljøer slik som i endocytiske vesikler, representerer den ervervede fluorescens bare internaliserte partikler. I tillegg har flere forskere kritisert den nåværende analysen fordi det gjøres ikke inkludere en parallell sett av prøvene som er inkubert i is-vann i stedet for ved 37 ° C for å kontrollere for referanseimmuncelleaktivitet. Ved flere anledninger har vi tatt denne "isforhold" når du utfører granulocytter og monocytt fagocytose og OB aktivitetsanalyse, og funnet ut at det ikke forbedre kvaliteten på dataene (upubliserte).

Oppsummert beskriver dette manuskriptet en teknikk for å måle fagocytose og OB aktivitet i granulocytter og monocytter. Dette er en enkel og grei metode som lett kan modifiseres til å gjøre rede for laboratorium evner og forskningsinteresser. I øvelsen vitenskapelig og fedme relatert forskning, vil dette tiltaket av medfødte immunforsvar la etterforsker for å undersøke effekten av mange mulige mottiltak, inkludert vekttap, supplement bruk, kosttilskudd intervensjoner, og andre endringer i livsstil. Ved å beherske denne teknikken, vil forskerne kunne overvåke akuttog kroniske forandringer i immuncellefunksjonen i respons til kosthold, mosjon, og mange andre stimuli.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Acknowledgments

Forfatterne ønsker å takke Zack Shue, Casey John og Lynn Cialdella-Kam for deres hjelp under optimalisering av denne prosedyren.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
12 x 75 mm tubes, with cap VWR 20170-579 You will need 2 tubes per sample ("H" and "F") plus 3 tubes per batch (for assay controls; "F", "H", and "Blood only").
PBS (10x), pH 7.4 Life Technologies 70011-044
Bottle top 0.2 µm cellulose acetate filter (500 ml capacity) Fisher Scientific 09-741-07 
Glucose, powder Life Technologies 15023-021
Citric acid (anhydrous, cell culture tested, plant cell culture tested) Sigma-Aldrich C2404-100G
Sodium citrate tribasic dihydrate Sigma-Aldrich S4641-25G
Dihydroethidium (Hydroethidine) (HE) Life Technologies D11347
Dimethyl sulfoxide (DMSO) Anhydrous Life Technologies D12345
Staphylococcus aureus (Wood strain without protein A) BioParticles, fluorescein conjugate (FITC) Life Technologies S2851
Staphylococcus aureus (Wood strain without protein A) BioParticles, unlabeled Life Technologies S-2859
Trypan Blue Solution, 0.4% Life Technologies 15250-061
4.0 ml vacutainer containing 7.2 mg K2EDTA, spray-dried VWR BD367861 You will need 1 K2EDTA blood collection tube per sample.
4.0 ml vacutainer containing 68 USP units Lithium Heparin, spray-coated VWR BD367884 You will need 1 Lithium Heparin blood collection tube per sample.
COULTER Ac·T 5diff CP Beckman Coulter 6605705 i.e., hematology analyzer
COULTER Ac·T 5diff Rinse Beckman Coulter 8547167
COULTER Ac·T 5diff Fix Beckman Coulter 8547171
COULTER Ac·T 5diff WBC Lyse Beckman Coulter 8547170
COULTER Ac·T 5diff Hgb Lyse Beckman Coulter 8547168
COULTER Ac·T 5diff Cal Calibrator Beckman Coulter 7547175
COULTER Ac·T 5diff Control Plus Beckman Coulter 7547198
AcT 5diff Diluent Beckman Coulter 8547169
200 µl extended-length pipette tips VWR 37001-526
Insulated ice pan VWR 89198-980 For ice water bath.
Open metal tube rack VWR 60916-702
Fetal Bovine Serum Life Technologies 26140-111
TQ-Prep Workstation Beckman Coulter 6605429 i.e., automated cell lyse preparation workstation
ImmunoPrep Reagent System Beckman Coulter 7546999 i.e., RBC lyse/WBC fix reagent system
Cytomics FC500 MCL Flow Cytometry System with CXP Software Beckman Coulter 626553
IsoFlow Sheath Fluid Beckman Coulter 8547008
COULTER CLENZ Beckman Coulter 8546929
Flow-Check Fluorospheres  Beckman Coulter 6605359 i.e., alignment and fluidics verification fluorospheres
FlowJo Software FlowJo FlowJo i.e., flow cytometry analysis software
Excel Software Microsoft Microsoft Excel i.e., electronic spreadsheet program

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Nieman, D. C., et al. Influence of pistachios on performance and exercise-induced inflammation, oxidative stress, immune dysfunction, and metabolite shifts in cyclists: a randomized, crossover trial. PLoS One. 9, e113725 (2014).
  2. Knab, A. M., et al. Effects of a freeze-dried juice blend powder on exercise-induced inflammation, oxidative stress, and immune function in cyclists. Appl Physiol Nutr Metab. 39, 381-385 (2014).
  3. Konrad, M., et al. The acute effect of ingesting a quercetin-based supplement on exercise-induced inflammation and immune changes in runners. Int J Sport Nutr Exerc Metab. 21, 338-346 (2011).
  4. Nieman, D. C., et al. Immune and inflammation responses to a 3-day period of intensified running versus cycling. Brain Behav Immun. 39, 180-185 (2014).
  5. Nieman, D. C., et al. Carbohydrate supplementation affects blood granulocyte and monocyte trafficking but not function after 2.5 h of running. Am J Clin Nutr. 66, 153-159 (1997).
  6. Tidball, J. G. Inflammatory cell response to acute muscle injury. Med Sci Sports Exerc. 27, 1022-1032 (1995).
  7. McFarlin, B. K., Williams, R. R., Venable, A. S., Dwyer, K. C., Haviland, D. L. Image-based cytometry reveals three distinct subsets of activated granulocytes based on phagocytosis and oxidative burst. Cytometry A. 83, 745-751 (2013).
  8. Liao, Y., Liu, P., Guo, F., Zhang, Z. Y., Zhang, Z. Oxidative burst of circulating neutrophils following traumatic brain injury in human. PLoS One. 8, e68963 (2013).
  9. McFarlin, B. K., Venable, A. S., Prado, E. A., Henning, A. L., Williams, R. R. Image-based flow cytometry technique to evaluate changes in granulocyte function in vitro. J Vis Exp. , (2014).
  10. Nieman, D. C., et al. Immune response to obesity and moderate weight loss. Int J Obes Relat Metab Disord. 20, 353-360 (1996).
  11. Nieman, D. C., et al. Immune function in female elite rowers and non-athletes. Br J Sports Med. 34, 181-187 (2000).
  12. Ichii, H., et al. Iron sucrose impairs phagocytic function and promotes apoptosis in polymorphonuclear leukocytes. Am J Nephrol. 36, 50-57 (2012).
  13. Gomes, A., Fernandes, E., Lima, J. L. Fluorescence probes used for detection of reactive oxygen species. J Biochem Biophys Methods. 65, 45-80 (2005).
  14. Gruger, T., et al. Negative impact of linezolid on human neutrophil functions in vitro. Chemotherapy. 58, 206-211 (2012).
  15. Dementhon, K., El-Kirat-Chatel, S., Noel, T. Development of an in vitro model for the multi-parametric quantification of the cellular interactions between Candida yeasts and phagocytes. PLoS One. 7, e32621 (2012).

Tags

Immunologi fagocytose oksidativt utbrudd monocytter granulocytter medfødt immunitet flowcytometri
Måling granulocytt og Monocyte Fagocytose og Oksidativt Burst Aktiviteten i Human Blood
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Meaney, M. P., Nieman, D. C.,… More

Meaney, M. P., Nieman, D. C., Henson, D. A., Jiang, Q., Wang, F. Z. Measuring Granulocyte and Monocyte Phagocytosis and Oxidative Burst Activity in Human Blood. J. Vis. Exp. (115), e54264, doi:10.3791/54264 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter