Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

قياس الحبيبية والوحيدات البلعمة ومؤكسد آخر انفجار في الدم البشري

Published: September 12, 2016 doi: 10.3791/54264
Automatic Translation
1, 1, 2, 3, 3
1Human Performance Laboratory, North Carolina Research Campus, Appalachian State University, 2Department of Biology, Appalachian State University, 3David H. Murdock Research Institute

Introduction

ومحببة والوحيدات البلعمة / التأكسدي انفجار (OB) النشاط الاختبار هو بسيط، وتقنية مستقيم إلى الأمام التي كثيرا ما تستخدم لجمع المعلومات عن وظيفة المناعة الفطرية التالية ممارسة طويلة ومكثفة. 1-4 عند دراسة استجابة الجهاز المناعي ل حافز، المحببة وحيدات ذات أهمية خاصة لأنها تلعب دورا محوريا في الدفاع المضيف وهي الخلايا المناعية الأولى لتتراكم في موقع الإصابة. 5 العدلات، وهو نوع من محببة، هي الخلايا الأولى للنقل من داخل العضلات التالفة الأنسجة التالية ممارسة مكثفة. 6 البلعمة والنشاط OB هي التدابير الأكثر شيوعا من المحببات والوحيدات وظيفة و 7 و يفضل كمؤشرات للالفطرية وظيفة الخلايا المناعية بسبب دورها المركزي في كل من عملية العدوى وعملية الإصلاح.

الفحص الموضحة في هذه utili مخطوطةZES تدفق الأساسي الكريات لتوفير تحديد كمية محببة والبلعمة الوحيدات والنشاط OB في الدم الكامل. استخدام الدم الكامل في هذه التقنية هو مفيد لأنه يسمح للفحص لإجراء دون إجراء تنقية تستغرق وقتا طويلا. هذا الاختبار يمكن بسهولة أن يتم تعديل لاستيعاب مجموعة متنوعة من التصاميم البحوث وقدرات المختبر. على سبيل المثال، لياو وآخرون تستخدم تقنية مماثلة لاظهار ان النشاط العدلات OB وزيادة ونقص العدلات البلعمة التالية إصابات في الدماغ. 8 وفي مثال آخر، وصفت McFarlin وآخرون. تعديلا أنيقة من هذه التقنية التي تستخدم allophycocyanin (APC ) -conjugated CD66b وجنبا إلى جنب عالية الأداء APC مترافق CD45 وضع العلامات مع الصورة القائمة على التدفق الخلوي لتصنيف المحببة من حيث الأنشطة البلعمة وOB بهم. 7،9

وقد استخدم فريق البحث لدينا التعديلات المختلفة لهذه الشركة المصرية للاتصالاتchnique كمؤشر على وظيفة المناعة الفطرية في السكان يعانون من زيادة الوزن، السمنة، ورياضية لنحو 20 عاما. 10،11 النص أدناه سوف توفر للقارئ مع إرشادات خطوة بخطوة لأداء هذا الاختبار وتسليط الضوء على المجالات التي يمكن للقارئ أن تتكيف لتلبية احتياجات أبحاثهم.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

ملاحظة: أجريت جميع إجراءات جمع الدم وفقا للمبادئ التوجيهية التي وضعتها جامعة ولاية الآبالاش (ASU) لجنة المراجعة المؤسساتية (IRB).

1. إعداد الفحص

  1. جمع وإعداد وتنظيم المواد المحددة لإجراء العملية (يرجى الرجوع إلى جدول المواد معينة / المعدات).
    1. تسمية 12 × 75 ملم أنابيب.
      1. التسمية أنبوبين لكل مشارك: أنبوب واحد لفحص البلعمة (تسمية هذا الأنبوب مع الحبر الأسود و "واو" لثيوسيانات فلوريسئين [FITC]) وأنبوب واحد لفحص النشاط OB (تسمية هذا الأنبوب مع بالحبر الأحمر و" H "لdihydroethidium [سعادة]).
        ملاحظة: استخدام معقم 12 × 75 ملم أنابيب ويوصى للحد من تنشيط الخلايا غير مقصود وزيادة المرتبطة بها في ضجيج في الخلفية.
      2. تسمية ثلاثة أنابيب لعناصر الفحص: أنبوب واحد لفحص البلعمة (السيطرة FITC: تسمية هذا الأنبوب مع BLACك حبر و "واو")، أنبوب واحد لفحص النشاط OB (HE التحكم: تسمية هذا الأنبوب مع بالحبر الأحمر و "H")، وأنبوب واحد للسيطرة سلبية (الدم فقط: تسمية هذا الأنبوب مع الحبر الأخضر و "الدم فقط").
    2. إعداد حلول الأوراق المالية من قبل ما لا يقل عن يوم واحد في اليوم للفحص.
      1. إعداد العقيمة مخزنة المالحة الفوسفات (PBS). تمييع 100 مل من 10X برنامج تلفزيوني مع 900 مل من 18.2 MΩ H 2 O. تصفية تعقيم مع فلتر 0.2 ميكرون. تخزينها في 4 درجات مئوية حتى الاستخدام.
      2. إعداد برنامج تلفزيوني العقيمة الجلوكوز. حل 1.0 غرام من الجلوكوز في 100 مل من برنامج تلفزيوني. تصفية تعقيم مع فلتر 0.2 ميكرون. تخزينها في 4 درجات مئوية حتى الاستخدام.
      3. إعداد المخزن المؤقت 0.1 M سترات العقيمة. حل 1.2 غرام من حمض الستريك و 1.1 غرام من سيترات الصوديوم في 100 مل من 18.2 MΩ H 2 O. ضبط درجة الحموضة إلى 4.0. تصفية تعقيم مع فلتر 0.2 ميكرون. تخزينها في 4 درجات مئوية حتى الاستخدام.
      4. إعداد محلول المخزون سعادة. Resuspend 1.0 ملغ من سعادة في 1.0 مل من سلفوكسيد ثنائي ميثيل ([دمس]). المزيج بلطف، قسامة، وتخزينها في -20 درجة مئوية حتى الاستخدام.
      5. إعداد FITC المسمى المكورات العنقودية الذهبية (S. الذهبية) حل سهم (2 × 10 9 الجسيمات / مل). و resuspend 10 ملغ من S. FITC المسمى الذهبية في 1.5 مل (أو كمية مناسبة) من برنامج تلفزيوني. تقسيمها إلى 500 ثلاثة مكل ويصوتن وفقا لتوصية الشركة الصانعة. قسامة ومخزن في -20 درجة مئوية حتى الاستخدام.
      6. إعداد S. الخالي من الملصقات حل الأسهم الذهبية (2 × 10 9 الجسيمات / مل). و resuspend 100 ملغ من الخالي من الملصقات س. الذهبية في 15 مل (أو كمية مناسبة) من برنامج تلفزيوني. تقسيمها إلى 500 ثلاثين مكل ويصوتن وفقا لتوصية الشركة الصانعة. قسامة ومخزن في -20 درجة مئوية حتى الاستخدام.
    3. إعداد الحلول عمل جديدة في يوم الفحص.
      1. تحضير محلول العمل سعادة. نقل 10 ميكرولتر منمذاب سعادة حل سهم إلى 990 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني الجلوكوز. يحفظ بعيدا عن الضوء والحفاظ على الجليد حتى الاستخدام.
      2. إعداد S. FITC المسمى حل الذهبية العمل (133333 الجسيمات / ميكرولتر). نقل 70 ميكرولتر من إذابة S. FITC المسمى الذهبية حل الأوراق المالية إلى 980 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني. يحفظ بعيدا عن الضوء والحفاظ على الجليد حتى الاستخدام.
      3. إعداد S. الخالي من الملصقات حل الذهبية العمل (133333 الجسيمات / ميكرولتر). نقل 70 ميكرولتر من إذابة س الخالي من الملصقات الذهبية حل الأوراق المالية إلى 980 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني. يحفظ بعيدا عن الضوء والحفاظ على الجليد حتى الاستخدام.
      4. إعداد الحل إخماد. إضافة 750 ميكرولتر من 0.4٪ التريبان حل الأزرق إلى 11.25 مل من العازلة 0.1 M سترات العقيمة. تبقي في حمام الماء المثلج حتى الاستخدام.
    4. هل لديك فصاد مصدقة رسم الدم وفقا للمبادئ التوجيهية لمنظمة الصحة العالمية لسحب الدم.
      1. سحب الدم إلى واحدة 4 مل أنبوب جمع الدم التي تحتوي على K 2 EDTA. فيفير أنبوب جمع الدم وفقا لتعليمات الشركة الصانعة. حافظ على أنبوب جمع الدم في درجة حرارة الغرفة على مقعد بين كبار الروك حتى الاستخدام. استخدام هذا الدم للتعداد الدم الكامل (CBC) مع تحليل خلايا الدم البيضاء (WBC) التفاضلية هو موضح في الخطوة 1.2.1.
      2. سحب الدم في أنبوب مجموعة واحدة 4 مل الدم التي تحتوي على الهيبارين الليثيوم. عكس أنبوب جمع الدم وفقا لتعليمات الشركة الصانعة. حافظ على أنبوب جمع الدم في RT على مقعد بين كبار الروك حتى الاستخدام. استخدام هذا الدم لفحص الوحيدات والبلعمة محببة والنشاط OB هو موضح في الخطوة 2.
  2. تحديد كمية البكتيريا (أي بكتريا المكورة العنقودية البرتقالية) التي من شأنها أن تكون هناك حاجة لاستكمال الفحص لكل عينة.
    1. استخدام محلل أمراض الدم لإجراء CBC مع التحليل التفاضلي مجلس الملاكمة العالمي في الدم كما هو موضح في تعليمات الشركة الصانعة. تقديم مذكرة من عدد كرات الدم البيضاء (في خلية / مل)،٪ العدلات، و٪قيم الوحيدات.
    2. استخدام المعادلات أدناه لتحديد العدلة والوحيدات التهم لكل عينة.
      عدد العدلات (في خلية / مل) = ×٪ العدلات WBC (في خلية / مل)
      عدد الوحيدات (في خلية / مل) =٪ الوحيدات × WBC (في خلية / مل)
    3. استخدام المعادلات أدناه لتحديد عدد بلعمية لكل عينة وعدد من البالعات الحالية في 100 ميكرولتر من العينة.
      عدد بلعمية (في خلية / مل) = عدد العدلات (في خلية / مل) + عدد الوحيدات (في خلية / مل)
      عدد البالعات في 100 ميكرولتر = (عدد بلعمية (في خلية / مل)) / 10
    4. استخدام المعادلة التالية لتحديد عدد من البكتيريا (أي بكتريا المكورة العنقودية البرتقالية) اللازمة لكل عينة وكمية من س FITC المسمى الذهبية أو الخالي من الملصقات س. حل الذهبية العمل (133333 الجسيمات / مل) التي ينبغي أن يضاف إلى كل أنبوب.
      ملاحظة: البكتيريا المستهدفة: نسبة بلعمية هو 8: 1.
      عدد من البكتيريا اللازمة =عدد البالعات في 100 ميكرولتر × 8
      حجم محلول العمل FITC أو الخالي من الملصقات اللازمة (في ميكرولتر) = (عدد من البكتيريا الحاجة) / (133333 الجسيمات / ميكرولتر)

2. تنفيذ الفحص

  1. إعداد الدم الكامل للمقايسة.
    1. لكل أنبوب مشارك والسيطرة، واستخدام ماصة طول الموسعة لنقل 100 ميكرولتر من الدم الكامل من أنبوب جمع الدم الليثيوم هيبارين إلى أسفل أنبوب المسمى بشكل مناسب 12 × 75 مم. استبدال أغطية.
      ملاحظة: كن حذرا لتجنب الحصول على الدم على الجانبين من أنابيب 12 × 75 مم.
    2. استخدام micropipette لإضافة 10 ميكرولتر من سعادة حل للأنابيب المسمى بحبر أحمر و "H"، بما في ذلك أنبوب تحكم معالي العمل. استبدال القبعات ودوامة لفترة وجيزة.
    3. احتضان جميع الأنابيب في 37 ° C حمام الماء لمدة 15 دقيقة. ثم، ونقل على الفور جميع الأنابيب إلى حمام الماء الثلج لمدة 12 دقيقة.
      ملاحظة: استخدام رف معدني مفتوحويهز بلطف رف كل 5 دقائق للتأكد من أن الأنابيب هي بسرعة وبشكل كاف تحسنت أو مبردة.
  2. إضافة بكتيريا (أي بكتريا المكورة العنقودية البرتقالية) لعينة ومراقبة أنابيب.
    1. استخدام micropipette إلى إضافة كمية مناسبة (المحسوبة في الخطوة 1.2.4) من الخالي من الملصقات س. حل العاملة الذهبية للأنابيب المسمى بحبر أحمر و "H"، بما في ذلك أنبوب تحكم سعادة. استبدال القبعات ودوامة لفترة وجيزة.
    2. استخدام micropipette إلى إضافة كمية مناسبة (المحسوبة في الخطوة 1.2.4) س FITC المسمى حل العاملة الذهبية للأنابيب وصفت مع الحبر الأسود و "واو"، بما في ذلك أنبوب السيطرة FITC. استبدال القبعات ودوامة لفترة وجيزة.
    3. دوامة "الدم فقط" أنبوب السيطرة، ولكن لا تضيف أي نوع من البكتيريا (أي بكتريا المكورة العنقودية البرتقالية) إليه.
    4. احتضان جميع الأنابيب في 37 ° C حمام الماء لمدة 20 دقيقة. استخدام رف معدني مفتوح ويهز بلطف رف كل 5 دقائقللتأكد من أن أنابيب وتحسنت بسرعة وعلى نحو كاف. بعد فترة الحضانة، ونقل على الفور جميع الأنابيب إلى حمام الماء الثلج لمدة 1 دقيقة.
  3. غسل الخلايا.
    1. استخدام ماصة مكرر لإضافة 100 ميكرولتر من حل إخماد الجليد البارد لجميع الأنابيب. استبدال القبعات، ودوامة لفترة وجيزة، ثم احتضان جميع الأنابيب على الجليد لمدة 1 دقيقة.
    2. استخدام ماصة مكرر لإضافة 1 مل من الجليد الباردة برنامج تلفزيوني لجميع الأنابيب. دوامة لفترة وجيزة، ثم قم بإضافة 2 مل إضافية من الجليد الباردة برنامج تلفزيوني لجميع الأنابيب واستبدال أغطية. الطرد المركزي جميع الأنابيب لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية و 270 x ج، ثم نضح طاف.
    3. كرر الخطوة 2.3.2 وقت واحد (ما مجموعه 2 يغسل).
  4. تحضير عينات للالتدفق الخلوي.
    1. استخدام ماصة مكرر لإضافة 50 ميكرولتر من مصل بقري جنيني من الجليد البارد لجميع الأنابيب. لفترة وجيزة دوامة جميع أنابيب.
    2. نقل جميع الأنابيب إلى دائري المناسب واستخدام الخلايا ليز إعداد محطة العمل الآلي مع سل الدم الحمراءل (RBC) الناشر وWBC تحديد الكواشف لليز كرات الدم الحمراء وإصلاح الكريات البيضاء كما هو موضح في تعليمات الشركة الصانعة.
    3. بعد اكتمال الخلية ليز إعداد محطة العمل تشغيل الآلي، والتفاف الأنابيب في رقائق الألومنيوم وتخزينها في 4 درجات مئوية الثلاجة حتى تحليل التدفق الخلوي يمكن أن يؤديها.

3. التدفق الخلوي اكتساب

  1. إعداد نظام التدفق الخلوي.
    1. الاحماء التدفق الخلوي النظام كما هو مشروح في دليل المستخدم المقدمة من قبل الشركة المصنعة. ثم، والتحقق من مستويات كاشف وخزان النفايات. إذا لزم الأمر، وملء خزانات الكاشف و / أو تفريغ خزان النفايات.
    2. استخدام "لوحة نظيفة" ميزة لتشغيل نظام الدورة نظيفة. ثم قم بتشغيل المواءمة والتحقق FLUIDICS fluorospheres، والتأكد من أن نصف ذروة معامل الاختلاف (HPCV) لكل كاشف هو ضمن نطاق محدد مسبقا موضح في مراقبة الجودة (QC) البروتوكولات التي تقدمها صناعةص.
  2. إنشاء الحيازة فحص معين والبروتوكولات وضع الصك.
    1. وضع بروتوكولات الحيازة فحص محدد لالبلعمة والنشاط OB المقايسات.
      ملاحظة: بروتوكولات اكتساب الموصوفة هنا يمكن تكييفها للاستخدام في أي قياس التدفق الخلوي مع الليزر الأزرق (488 نانومتر)، وهو مرشح (530/30) لFITC، ومرشح (575/26) للسعادة.
      1. فتح التدفق الخلوي برنامج الحصول على النظام وإنشاء "بروتوكول جديد".
      2. اختيار "FL1 معلمة" للمقايسة البلعمة (FITC) و "FL2 المعلمة" لفحص النشاط OB (HE).
      3. خلق المؤامرات (أي مبعثر إلى الأمام [FSC] مقابل الجانب مبعثر [SSC] مؤامرة نقطة، FL1 الرسم البياني، FL2 الرسم البياني) المطلوبة لاقتناء.
      4. إنشاء مناطق متعددة الأضلاع لكريات الدم البيضاء (خلايا الدم البيضاء)، محببة والوحيدات السكان على FSC مقابل مؤامرة محكمة أمن الدولة وإنشاء مناطق الخطية على رسوم بيانية FL1 وFL2. مجموعة من & #34؛ وقف عدد "من 50،000 الأحداث لبوابة مكافحة حرائق آبار النفط.
      5. حفظ البروتوكولات مع الأسماء فحص معين.
    2. إنشاء بروتوكولات الفحص محدد وضع أداة لالبلعمة والنشاط OB المقايسات.
      1. سحب وإسقاط "بروتوكولات الفحص محدد الاستحواذ" (المعرفة في الخطوة 3.2.1) من "مستكشف الموارد" إلى "مدير اقتناء" على التدفق الخلوي برنامج الحصول على النظام.
        ملاحظة: المعلومات المضافة في هذه الطريقة تظهر دائما في نهاية worklist.
      2. أدخل معلومات العينة في worklist، وحفظ worklist.
      3. إزالة أنابيب العينات التحكم من 4 درجات مئوية الثلاجة والسماح لهم لكي تتوازن إلى درجة حرارة الغرفة لمدة 15 دقيقة. ثم، دوامة لفترة وجيزة كل أنبوب العينة الضابطة.
      4. استخدام "بروتوكولات الحيازة فحص معين" المحدد في الخطوة 3.2.1 لتشغيل العينة سيطرة سلبية (أي الدم فقط) والسيطرة الايجابيةعينات (أي سعادة السيطرة، السيطرة FITC) من خلال نظام التدفق الخلوي. مراجعة رسوم بيانية وضبط أنبوب مضخم (PMT) الفولتية من FITC وقنوات فيكوإيريترين (PE) حسب الحاجة.
      5. دوامة العينات السيطرة ونقلها إلى التدفق الخلوي دائري النظام وفقا للترتيب على worklist. ثم، ضع دائري في غرفة المعاينة وانقر على شريط الأدوات زر عداد الكريات "ابدأ" لاكتساب البيانات لعينات السيطرة. حفظ "XXX وضع برو" بروتوكول الإعداد.
  3. الحصول على عينات الدراسة على نظام التدفق الخلوي.
    1. إزالة أنابيب عينة الدراسة من 4 درجات مئوية الثلاجة والسماح لتتوازن إلى درجة حرارة الغرفة لمدة 15 دقيقة.
    2. في حين أن العينات وتوازنه، اسحب بروتوكولات اكتساب دراسة معينة محددة مسبقا إلى الفضاء worklist لجعل worklist المشروع.
    3. تأكد من أن "بروتوكول إعداد" مرتبط &# 34؛.-فحص محدد بروتوكولات إعداد "المحدد في الخطوة 3.2.2 ثم أدخل معلومات تعريفية (على سبيل المثال، اسم الدراسة، واستخلاص عدد، عدد الزيارة معرف يخضع) لكل أنبوب في قائمة العمل.
    4. بعد فترة موازنة 15 دقيقة، وعينات الدراسة دوامة ونقلها إلى التدفق الخلوي دائري النظام وفقا للترتيب على worklist. ثم، ضع دائري في غرفة المعاينة وانقر على شريط الأدوات زر عداد الكريات "ابدأ" لاكتساب البيانات لعينات الدراسة.
    5. مراجعة نوعية البيانات عن طريق فحص كفاءة RBC تحلل وتوزيع خلية فرعية مكافحة حرائق آبار النفط، نسب، التهم المطلقة، وكثافة مضان على لوحة تقرير كل عينة.
      ملاحظة: يعتبر جودة البيانات ليكون مقبولا إذا كان كل من هذه المعايير ضمن حدودها محددة مسبقا. إذا لم يتم استيفاء جميع المعايير، يجب أن تعاد معالجة العينة.
    6. نظيفة وإيقاف تشغيل نظام التدفق الخلوي. تخزين التدفق الخلويالبيانات على اثنين من محركات الأقراص كمبيوتر مختلفة لمنع فقدان البيانات غير مقصود.

تحليل 4. البيانات

  1. إجراء تحليل البلعمة.
    1. توحيد جميع البلعمة (أي إف المسمى) ملفات البيانات بيانات عينة وقائمة مراقبة الوضع (LMD) في مجلد واحد. ثم، فتح التدفق الخلوي برامج التحليل وسحب الملفات إلى فضاء العينة.
    2. تعيين WBC، الحبيبية، الوحيدات، والخلايا الليمفاوية البوابات.
      1. انقر نقرا مزدوجا فوق اسم الملف لفتح أي من "عينات السيطرة FITC". استخدم القوائم المنسدلة لضبط محور س إلى "فوجيتسو سيمنز كمبيوترز" و "الخطي"، والمحور الصادي إلى "محكمة أمن الدولة" و "الخطية".
      2. استخدام "محدد بوابة المضلع" لإعداد بوابة من مجموع السكان كريات الدم البيضاء.
        ملاحظة: تأكد من تضمين كافة الخلايا على حواف الرسم البياني. تسمية هذه البوابة "WBC".
      3. انقر نقرا مزدوجا على "بوابة مكافحة حرائق آبار النفط الجديدة" واستخدام drop-أسفل القوائم لضبط محور س إلى "فوجيتسو سيمنز كمبيوترز" و "الخطي"، والمحور الصادي إلى "محكمة أمن الدولة" و "الخطية".
      4. استخدام "محدد بوابة المضلع" لتعيين "الحبيبية بوابة" والوحيدات البوابة "، ومن ثم استخدام" محدد بوابة بيضاوي الشكل "لتعيين" الخلايا الليمفاوية البوابة ". تسمية كل باب وفقا لذلك. اسحب" البيانات بوابة (٪) "قبالة إلى جانب ذلك أن الخلايا التي يمكن مشاهدتها بسهولة.
    3. تعيين "البلعمة إيجابي البوابة" و "البلعمة بوابة السلبية" للمحببة والوحيدات السكان.
      1. انقر نقرا مزدوجا فوق على "عينة السيطرة FITC" المستخدمة في الخطوة 4.1.2.1. ثم، انقر على "بوابة الحبيبية" واستخدام القوائم المنسدلة لضبط محور س إلى "FL1" و "دخول" والمحور الصادي إلى "محكمة أمن الدولة" و "الخطية".
      2. استخدام "محدد بوابة مربع" لتحديد "البلعمة بوابة السلبية" و "البلعمة يفترضإيف البوابة ".
        ملاحظة: بما أن عينات السيطرة FITC لم يحصل البكتيرية (أي بكتريا المكورة العنقودية البرتقالية) المحفزات، يجب أن يكون كل من خلايا البلعمة من الناحية النظرية السلبية. استخدام السلطة التقديرية عند وضع حدود لهؤلاء السكان.
      3. كرر الخطوة 4.1.3.1 والخطوة 4.1.3.2 للسكان الوحيدات.
    4. إضافة إحصاءات عن "٪ من WBC"، "كثافة مضان"، و "٪ البلعمة خلايا إيجابية" للمحببة والوحيدات السكان.
      1. انقر على "عينة السيطرة FITC" المستخدمة في الخطوة 4.1.2.1. تسليط الضوء على "الحبيبية البوابة"، ثم انقر على "مساحة عمل" و "إضافة الإحصاء". تسليط الضوء على "الهندسية المتوسط" و "FL1 دخول" ثم انقر على "إضافة". ثم اختار "تواتر الرئيسي" الإحصائية وانقر على "إضافة".
        ملاحظة: وهذا يعطي كثافة مضان (هندسي) من السكان محببة كامل ونسبة كريات الدم البيضاء (الأم) التي هي المحببة.
      2. انقر على "عينة السيطرة FITC" المستخدمة في الخطوة 4.1.2.1. تسليط الضوء على "البلعمة بوابة الإيجابية" للسكان محببة، ثم اضغط على "مساحة عمل" و "إضافة الإحصاء". تسليط الضوء على "الهندسية المتوسط" و "FL1 دخول" ثم انقر على "إضافة". ثم اختر "التردد من الأم" الإحصائية وانقر على "إضافة".
        ملاحظة: وهذا يعطي كثافة مضان (هندسي) من البلعمة المحببة إيجابية والنسبة المئوية للالمحببة (الأم) التي هي البلعمة إيجابية.
      3. كرر الخطوة 4.1.4.1 والخطوة 4.1.4.2 للسكان الوحيدات.
      4. انقر على "عينة السيطرة FITC" المستخدمة في الخطوة 4.1.2.1. تسليط الضوء على "الخلايا الليمفاوية البوابة"، ثم انقر على "مساحة عمل" و "إضافة الإحصاء". تسليط الضوء على "تواتر الرئيسي" الإحصائية وانقر على "إضافة".
        ملاحظة: هذاسيعطي نسبة كريات الدم البيضاء (الأم) التي هي الخلايا الليمفاوية.
      5. تسليط الضوء على جميع البوابات والإحصاءات التي تم إنشاؤها في العينة الضابطة FITC المستخدمة في الخطوة 4.1.2.1. جرها إلى "جميع العينات" في لوحة "المجموعة" في الجزء العلوي من الشاشة.
        ملاحظة: هذا تطبيق هذه الإعدادات على كل من عينات الدراسة.
      6. حفظ والعمل اسم كملف .wsp في نفس المجلد الذي يحتوي على المجلد LMD.
    5. ضبط بوابات عينة الفردية.
      1. انقر على "العينة الأولى" في مجموعة البيانات والتأكد من أن بوابة WBC يناسب المناسب لتوزيع الخلايا التي تظهر على الشاشة. إذا لم يحدث ذلك، انقر واسحب حواف البوابة ضبط بوابة لتلك العينة. انقر على "السهم الأيمن" (أي "˃") للتقدم إلى عينة المقبلة. كرر هذه الخطوة حتى يتم النظر في جميع العينات.
      2. انقر على "بوابة مكافحة حرائق آبار النفط" بالنسبة للعينة الأولى في مجموعة البيانات والتأكد من أن "غرانulocyte البوابة "،" الوحيدات البوابة "، و" الخلايا الليمفاوية بوابة "لكل عينة تناسب المناسب لتوزيع الخلايا التي تظهر على الشاشة. ضبط حسب الحاجة. انقر على" السهم الأيمن "(أي" ˃ ") للتقدم إلى عينة القادمة .
      3. وقد تم استعراض كرر الخطوة 4.1.5.2 حتى جميع العينات. ثم، انقر فوق "حفظ".
    6. عرض البيانات في برنامج جداول البيانات الإلكترونية.
      1. انقر على أيقونة "محرر الجدول" في الجزء العلوي من الشاشة. انقر على "تحرير"، "كلمات"، و "$ تاريخ" لتشمل تاريخ أخذ العينات على جدول النهائي. ثم، انقر فوق "كلمات" "تحرير"، و "@ SAMPLEID1" لتشمل تحديد أخذ العينات على جدول النهائي. كرر ل "@ SAMPLEID2"، "@ SAMPLEID3"، و "@ SAMPLEID4".
      2. ضبط "محرر الجدول شاشة" و "عينة" الشاشة حتى يتمكنوا من كلا يتم عرضه على شاشة الكمبيوتر. سيليط م أي "عينة" على ورقة عينة. ثم، اسحب كل إحصائية تهم "محرر الجدول".
        1. اسحب "التكرار. من الأم" الإحصائية المدرجة في "بوابة محببة" إلى "محرر الجدول". اكتب "٪ WBC كما المحببة" تحت عمود "الاسم" من "محرر الجدول".
        2. اسحب "الهندسية المتوسط" الإحصائية المدرجة في "بوابة محببة" إلى "محرر الجدول". اكتب "الهندسية متوسط ​​الإسفار، المحببة" تحت عمود "الاسم" من "محرر الجدول".
        3. اسحب "التكرار. من الأم" الإحصائية المدرجة في "الحبيبية / البلعمة إيجابي البوابة" إلى "محرر الجدول". اكتب "٪ البلعمة المحببة إيجابي" تحت عمود "الاسم" من "محرر الجدول".
        4. اسحب الإحصائية "الهندسية المتوسط" المدرجة في "الحبيبية / البلعمة إيجابي البوابة" إلى thه "محرر الجدول". اكتب "الهندسية متوسط ​​الإسفار، البلعمة المحببة إيجابي" تحت عمود "الاسم" من "محرر الجدول".
        5. اسحب "التكرار. من الأم" الإحصائية المدرجة في "بوابة الوحيدات" إلى "محرر الجدول". اكتب "٪ WBC كما حيدات" تحت عمود "الاسم" من "محرر الجدول".
        6. اسحب "الهندسية المتوسط" الإحصائية المدرجة في "بوابة الوحيدات" إلى "محرر الجدول". اكتب "الهندسية متوسط ​​الإسفار، وحيدات" تحت عمود "الاسم" من "محرر الجدول".
        7. اسحب "التكرار. من الأم" الإحصائية المدرجة في "الوحيدات / البلعمة إيجابي البوابة" إلى "محرر الجدول". اكتب "٪ البلعمة وحيدات إيجابي" تحت عمود "الاسم" من "محرر الجدول".
        8. اسحب الإحصائية "الهندسية المتوسط" المدرجة في "الوحيدات / Phagocytosis إيجابي البوابة "إلى" محرر الجدول "اكتب" الهندسية متوسط ​​الإسفار، البلعمة وحيدات إيجابي "تحت عنوان" "عمود" اسم محرر الجدول ".
        9. اسحب "التكرار. من الأم" الإحصائية المدرجة في "الخلايا الليمفاوية البوابة" إلى "محرر الجدول". اكتب "٪ WBC كما الخلايا اللمفاوية" تحت عمود "الاسم" من "محرر الجدول".
      3. سحب وإسقاط المعلمات مرئية في "محرر الجدول" حتى يتم ترتيب بالترتيب المفضل.
      4. انقر على "حفظ". ثم انقر على "إنشاء جدول" لعرض البيانات في شكل جداول. اضغط على "حفظ باسم" لحفظ والعمل اسم ملف .xlsx.
  2. كرر الخطوة 4.1 لفحص النشاط OB (أي H المسمى) عينات ومراقبة ملفات البيانات LMD.
    ملاحظة: تأكد من استبدال جميع الإشارات إلى البلعمة مع إشارات إلى النشاط OB.

    3. Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

ممارسة طويلة ومكثفة لها آثار عميقة على وظيفة المناعة الفطرية، بما في ذلك الطبيعية وظيفة القاتل الخلية، استجابة بلعم بوساطة خلوى للعدوى الفيروسية، ومحببة والبلعمة الوحيدات والنشاط OB. وتشير دراسات متعددة أن محببة والوحيدات زيادة البلعمة بشكل كبير بعد ممارسة، والتي تعكس الالتهاب الناجم عن تلف العضلات ومطالب الأيضية. في المقابل، يقلل محببة وOB الوحيدات النشاط بعد ممارسة الرياضة وقد يكون مؤشر المناعة واحد من زيادة التعرض للعدوى. على سبيل المثال، ويبين الشكل 1 أن البلعمة س يتم زيادة الذهبية من قبل المحببة على الفور و 1.5-ساعة بعد 75 كيلومترا الدراجات نوبة (70٪ VO 2MAX)، تعود إلى وضعها الطبيعي من صباح اليوم التالي. الوحيدات البلعمة يتأثر مماثل هذا المستوى من ممارسة الرياضة. ويوضح الشكل 2 أن النشاط محببة OB هو انخفاضد ما لا يقل عن 21 ساعة بعد 75 كم ركوب الدراجات. وانخفض النشاط الوحيدات OB أيضا بعد 75 كم ركوب الدراجات.

محببة والوحيدات البلعمة س الذهبية، ولكن ليس محببة والنشاط OB الوحيدات، ترتبط إلى المؤشرات الحيوية التهاب النظامية الشكل 3 يبين ارتباط متواضع بين البلعمة محببة ومصل بروتين سي التفاعلي (CRP) المستويات (بيرسون المنتج لحظة الارتباط؛ ص = 0.44؛ P <0.01 ) في 106 من النساء يعانون من زيادة الوزن / السمنة. يرتبط ارتباطا مصل البروتين أيضا إلى البلعمة الوحيدات من س. الذهبية (بيرسون المنتج لحظة الارتباط، ص = 0.30؛ P <0.01). وبالإضافة إلى ذلك، والدم العدلة / التهم الكريات البيض (بيرسون المنتج لحظة الارتباط، ص = 0.62 و r = 0.61، على التوالي؛ P <0.001)، ومؤشر كتلة الجسم (بيرسون المنتج لحظة الارتباط، ص = 0.50 و r = 0.40، على التوالي؛ P <0.001)، ومستويات الأنسولين في الدم (ص = 0.30 و r =ترتبط P <0.04) لمحببة والوحيدات البلعمة س، 0.23؛ P <0.03)، والدم مستويات و1C (بيرسون المنتج لحظة الارتباط، ص = 0.28 و r = 0.21، على التوالي الذهبية. بشكل عام، وتشير هذه البيانات إلى أن محببة عالية والبلعمة الوحيدات في موضوعات الراحة يدل على والالتهابات.

شكل 1
يتأثر الحبيبية البلعمة من ممارسة التحمل مكثفة زاد الحبيبية البلعمة فورا و 1.5-ساعة بعد 75 كيلومترا الدراجات نوبة في 70٪ من VO 2MAX: الشكل 1. قبل 21 ساعة بعد التمرين، عادت محببة البلعمة إلى أقل قليلا من مستويات ما قبل ممارسة الرياضة. * يشير تختلف من مرحلة ما قبل التمرين (التدابير المتكررة أنوفا مع اختبار t تحليل الاقتران بعد خاص، عند الاقتضاء؛ ن = 19؛ P <0.05). القيم هي ليخطأ القياسي ±. الرجاء النقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 2

الشكل 2: الحبيبية مؤكسد آخر انفجار يتأثر مكثفة التحمل ممارسة النشاط انفجار الحبيبية الأكسدة انخفض فورا، 1.5 ساعة، و21 ساعة بعد 75 كيلومترا الدراجات نوبة في 70٪ من VO 2MAX. * يشير تختلف من مرحلة ما قبل التمرين (التدابير المتكررة أنوفا مع اختبار t تحليل الاقتران بعد خاص، عند الاقتضاء؛ ن = 19؛ P <0.05). القيم يعني ± الخطأ المعياري. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

. الشكل (3): يرتبط الحبيبية البلعمة مع الجهازية التهاب في النساء زائدات الوزن / السمنة ارتبط الحبيبية البلعمة لبروتين مصل سي التفاعلي، العلامات البيولوجية المقبولة على نطاق واسع من الالتهابات (بيرسون المنتج لحظة الارتباط؛ ن = 87؛ ص = 0.44؛ P <0.01). الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

توفر هذه المخطوطة بروتوكول خطوة بخطوة لتحديد مؤشرين للمحببة وظيفة الوحيدات. لقد حددنا بعض الخطوات التي تعتبر بالغة الأهمية لنجاح هذا الاختبار. واحدة من هذه الخطوة هي حضانة الجليد حمام الذي يحدث مباشرة قبل إضافة البكتيريا. سوف تبريد شامل لجميع عينات تقليل تأثير درجة الحرارة على البلعمة وOB النشاط. خطوة حاسمة أخرى هي إضافة البكتيريا على كل عينة. و8: 1 البكتيريا: نسبة بلعمية تنتج أفضل النتائج. لكن باحثين آخرين قد تجد أن هذه النسبة سوف تحتاج إلى تعديل لتحقيق نتائج مناسبة. خطوة حاسمة أخرى هي استخدام RBC الناشر والكواشف تحديد WBC إلى ليز كرات الدم الحمراء وإصلاح الكريات البيضاء. استخدام هذا هذه الكواشف يضمن تحلل كامل لكرات الدم الحمراء وتمكن الباحثون لتخزين بأمان عينات معالجتها في 4 درجات مئوية خلال الليل، ومن ثم تشغيلها من خلال قياس التدفق الخلوي في اليوم التالي. العمل السابق (غير منشورة) الهنديةآتش أن RBC الناشر وتحديد WBC يمكن أن تستخدم لتأخير التدفق الخلوي من العينات التي تحددها ما يصل الى 12 ساعة دون التأثير على سلامة البيانات.

هذا الإجراء يمكن بسهولة تعديلها لتلبية قدرات ومصالح الباحث، ولكن ينبغي التأكيد على أن الأمثل هو ضروري عند إجراء التعديلات. وهناك عدد قليل من التعديلات الأكثر شيوعا التي تم الإبلاغ عنها هي للبكتيريا الهدف، والتسمية / التحقيق، وفترة حضانة. لقد أنتج الباحثون نتائج استثنائية عند استخدام كولاي 7،8 في مكان س. الذهبية كما الممرض الهدف (سواء في 8: نسبة 1). فطر، مثل خميرة الخباز، قد تكون أيضا مناسبة كبديل للE. القولونية. وبالإضافة إلى ذلك، الباحثين في كثير من الأحيان استخدام مسبار الجزيئية الحساسة درجة الحموضة، 7،12 بدلا من FITC، والتحقيق لالبلعمة. وبالمثل، تحقيقات بخلاف تستخدم سعادة عادة لقياس النشاط OB، منها:ز dichlorofluorescin ثنائي الأسيتات (DCF-DA) 10 وdihydrorhodamine 123 (شعبة الموارد البشرية). 13 حضانة مرات المبلغ عنها تختلف من 20 دقيقة إلى 120 دقيقة، 12،14،15 مع McFarlin التقارير أن زمن الاستجابة القصوى قد تختلف من هدف البكتيرية. 7 وينبغي كما تجدر الإشارة إلى أن قد تختلف الأوقات الحضانة المثلى بين البلعمة وOB جوانب الفحص. 7

كما هو الحال مع جميع فحوصات المخبرية، قد يكون من الضروري استكشاف الأخطاء وإصلاحها عند وضع هذه التقنية في إعداد البحوث الجديدة. الكتاب تنصح أن تعظيم الاستفادة من البكتيريا: نسبة بلعمية هي مفتاح النجاح لهذا الاختبار. يشير الكتاب أيضا إلى أن البيانات من عينة يجب التخلص من التحليل إذا أقل من 80٪ من الخلايا في عدد السكان محببة من المشاركين غير المريضة هي FITC إيجابية. في هذه الحالة، عينة يمكن إعادة جمعها وإعادة تحليلها، إن أمكن.

وهناك قيود قليلة علىمحببة والوحيدات البلعمة وOB النشاط فحص وصفها في هذه المخطوطة. واحد مثل هذا التقييد هو استخدام الحصري من FSC والتعاون بين بلدان الجنوب لتحديد السكان خلية من الفائدة. فإن استخدام علامات سطح الخلية تسمح للباحثين لتحديد إيجابيا السكان الخلية. 10 ومع ذلك، فإن إضافة هذه الميزة تتطلب أكثر من تدفق الأساسية الكريات، وبالتالي فهو خارج نطاق هذه المخطوطة. الحد أخرى من هذا الاختبار هو أنه يعتمد على فعالية الأزرق التريبان لإرواء مضان تحقيقات التي لم يتم استيعابها من قبل الخلايا المناعية للاهتمام. والجزيئي التحقيق 7،12 الحساسة درجة الحموضة يمكن أن تستخدم كبديل للFITC في الحالات التي يكون فيها استيعاب مصدر قلق. لأن مثل هذا التحقيق هو فلوري الوحيد في البيئات الحمضية مثل تلك الموجودة في الحويصلات التقامي، يمثل مضان المكتسبة الجسيمات المنضوية فقط. وبالإضافة إلى ذلك، وانتقد العديد من الباحثين الفحص الحالي لأنه فعلوفاق لا تشمل مجموعة موازية من العينات التي تم المحتضنة في الماء المثلج بدلا من 37 درجة مئوية للسيطرة على خط الأساس نشاط الخلايا المناعية. في عدة مناسبات، وأدرجنا هذا "حالة الجليد" عند تنفيذ محببة والبلعمة الوحيدات والنشاط OB الفحص، وجدت أنه لا يحسن بشكل ملحوظ نوعية البيانات (غير منشورة).

وباختصار، توضح هذه المخطوطة تقنية لقياس البلعمة وOB النشاط في المحببة وحيدات. هذا هو بسيط، فحص بسيط يمكن تعديلها بسهولة لحساب قدرات المختبرات واهتماماته البحثية. في ممارسة علمي والبحوث المتعلقة بالسمنة، وهذا مقياس وظيفة المناعة الفطرية يسمح للمحقق لاستكشاف آثار عديدة المضادة المحتملة، بما في ذلك فقدان الوزن، واستخدام المكملات، والتدخلات الغذائية، وتغيير نمط الحياة الأخرى. على إتقان هذه التقنية، وسوف يقوم الباحثون أن تكون قادرة على رصد الحادةوالتغيرات المزمنة في وظيفة الخلايا المناعية في الاستجابة إلى النظام الغذائي، وممارسة، والعديد من المحفزات الأخرى.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Acknowledgments

فإن الكتاب أن نعترف زاك شو كيسي جون، ولين Cialdella كام على المساعدة التي قدموها خلال الاستفادة المثلى من هذا الإجراء.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
12 x 75 mm tubes, with cap VWR 20170-579 You will need 2 tubes per sample ("H" and "F") plus 3 tubes per batch (for assay controls; "F", "H", and "Blood only").
PBS (10x), pH 7.4 Life Technologies 70011-044
Bottle top 0.2 µm cellulose acetate filter (500 ml capacity) Fisher Scientific 09-741-07 
Glucose, powder Life Technologies 15023-021
Citric acid (anhydrous, cell culture tested, plant cell culture tested) Sigma-Aldrich C2404-100G
Sodium citrate tribasic dihydrate Sigma-Aldrich S4641-25G
Dihydroethidium (Hydroethidine) (HE) Life Technologies D11347
Dimethyl sulfoxide (DMSO) Anhydrous Life Technologies D12345
Staphylococcus aureus (Wood strain without protein A) BioParticles, fluorescein conjugate (FITC) Life Technologies S2851
Staphylococcus aureus (Wood strain without protein A) BioParticles, unlabeled Life Technologies S-2859
Trypan Blue Solution, 0.4% Life Technologies 15250-061
4.0 ml vacutainer containing 7.2 mg K2EDTA, spray-dried VWR BD367861 You will need 1 K2EDTA blood collection tube per sample.
4.0 ml vacutainer containing 68 USP units Lithium Heparin, spray-coated VWR BD367884 You will need 1 Lithium Heparin blood collection tube per sample.
COULTER Ac·T 5diff CP Beckman Coulter 6605705 i.e., hematology analyzer
COULTER Ac·T 5diff Rinse Beckman Coulter 8547167
COULTER Ac·T 5diff Fix Beckman Coulter 8547171
COULTER Ac·T 5diff WBC Lyse Beckman Coulter 8547170
COULTER Ac·T 5diff Hgb Lyse Beckman Coulter 8547168
COULTER Ac·T 5diff Cal Calibrator Beckman Coulter 7547175
COULTER Ac·T 5diff Control Plus Beckman Coulter 7547198
AcT 5diff Diluent Beckman Coulter 8547169
200 µl extended-length pipette tips VWR 37001-526
Insulated ice pan VWR 89198-980 For ice water bath.
Open metal tube rack VWR 60916-702
Fetal Bovine Serum Life Technologies 26140-111
TQ-Prep Workstation Beckman Coulter 6605429 i.e., automated cell lyse preparation workstation
ImmunoPrep Reagent System Beckman Coulter 7546999 i.e., RBC lyse/WBC fix reagent system
Cytomics FC500 MCL Flow Cytometry System with CXP Software Beckman Coulter 626553
IsoFlow Sheath Fluid Beckman Coulter 8547008
COULTER CLENZ Beckman Coulter 8546929
Flow-Check Fluorospheres  Beckman Coulter 6605359 i.e., alignment and fluidics verification fluorospheres
FlowJo Software FlowJo FlowJo i.e., flow cytometry analysis software
Excel Software Microsoft Microsoft Excel i.e., electronic spreadsheet program

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Nieman, D. C., et al. Influence of pistachios on performance and exercise-induced inflammation, oxidative stress, immune dysfunction, and metabolite shifts in cyclists: a randomized, crossover trial. PLoS One. 9, e113725 (2014).
  2. Knab, A. M., et al. Effects of a freeze-dried juice blend powder on exercise-induced inflammation, oxidative stress, and immune function in cyclists. Appl Physiol Nutr Metab. 39, 381-385 (2014).
  3. Konrad, M., et al. The acute effect of ingesting a quercetin-based supplement on exercise-induced inflammation and immune changes in runners. Int J Sport Nutr Exerc Metab. 21, 338-346 (2011).
  4. Nieman, D. C., et al. Immune and inflammation responses to a 3-day period of intensified running versus cycling. Brain Behav Immun. 39, 180-185 (2014).
  5. Nieman, D. C., et al. Carbohydrate supplementation affects blood granulocyte and monocyte trafficking but not function after 2.5 h of running. Am J Clin Nutr. 66, 153-159 (1997).
  6. Tidball, J. G. Inflammatory cell response to acute muscle injury. Med Sci Sports Exerc. 27, 1022-1032 (1995).
  7. McFarlin, B. K., Williams, R. R., Venable, A. S., Dwyer, K. C., Haviland, D. L. Image-based cytometry reveals three distinct subsets of activated granulocytes based on phagocytosis and oxidative burst. Cytometry A. 83, 745-751 (2013).
  8. Liao, Y., Liu, P., Guo, F., Zhang, Z. Y., Zhang, Z. Oxidative burst of circulating neutrophils following traumatic brain injury in human. PLoS One. 8, e68963 (2013).
  9. McFarlin, B. K., Venable, A. S., Prado, E. A., Henning, A. L., Williams, R. R. Image-based flow cytometry technique to evaluate changes in granulocyte function in vitro. J Vis Exp. , (2014).
  10. Nieman, D. C., et al. Immune response to obesity and moderate weight loss. Int J Obes Relat Metab Disord. 20, 353-360 (1996).
  11. Nieman, D. C., et al. Immune function in female elite rowers and non-athletes. Br J Sports Med. 34, 181-187 (2000).
  12. Ichii, H., et al. Iron sucrose impairs phagocytic function and promotes apoptosis in polymorphonuclear leukocytes. Am J Nephrol. 36, 50-57 (2012).
  13. Gomes, A., Fernandes, E., Lima, J. L. Fluorescence probes used for detection of reactive oxygen species. J Biochem Biophys Methods. 65, 45-80 (2005).
  14. Gruger, T., et al. Negative impact of linezolid on human neutrophil functions in vitro. Chemotherapy. 58, 206-211 (2012).
  15. Dementhon, K., El-Kirat-Chatel, S., Noel, T. Development of an in vitro model for the multi-parametric quantification of the cellular interactions between Candida yeasts and phagocytes. PLoS One. 7, e32621 (2012).

Tags

علم المناعة، العدد 115، البلعمة، انفجار الأكسدة، الوحيدات، محببة، والحصانة الفطرية، التدفق الخلوي
قياس الحبيبية والوحيدات البلعمة ومؤكسد آخر انفجار في الدم البشري
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Meaney, M. P., Nieman, D. C.,… More

Meaney, M. P., Nieman, D. C., Henson, D. A., Jiang, Q., Wang, F. Z. Measuring Granulocyte and Monocyte Phagocytosis and Oxidative Burst Activity in Human Blood. J. Vis. Exp. (115), e54264, doi:10.3791/54264 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter