Introduction
顆粒球及び単球貪食/酸化的バースト（OB）活性アッセイ頻繁に長時間の、集中運動後の先天性免疫機能に関する情報を収集するために使用されるシンプルな、ストレートフォワードの手法である。1-4に対する免疫系の応答を研究するときこれらは宿主防御において中心的な役割を果たし、感染部位に蓄積するための第一の免疫細胞であるため、刺激、顆粒球および単球は、特に重要である。5好中球、顆粒球の種類は、損傷した筋肉内に移行する最初の細胞であります激しい運動後の組織。6食作用およびOBの活動は、顆粒球や単球機能、7の最も一般的な尺度であり、なぜなら、感染プロセスと修復プロセスの両方におけるそれらの中心的役割の自然免疫細胞機能の指標として好ましいです。
この原稿utiliに記載のアッセイ全血における顆粒球や単球食作用およびOBの活動の定量的な決意を提供するために、サイトメーターの基本的な流れをZES。それは、アッセイは、時間のかかる精製操作なしで行われることを可能にするため、この技術では全血を使用することが有利です。このアッセイは、容易に研究設計および実験室機能の様々に適応するように修正することができます。例えば、リャオらは 、その好中球OB活性を示すために同様の技術を利用したが、外傷性脳損傷後に増加し、好中球の食作用低下する。8の別の実施例では、McFarlin らは 、アロ使用するこの技術のエレガントな修飾（APC記載しました）それらの食作用およびOB活動に関して顆粒球を分類するCD66bと画像ベースのフローサイトメトリーと高性能タンデムAPC共役CD45標識を抱合。7,9
私たちの研究グループは、このテの様々な適応を使用していますほぼ20年間、太りすぎ肥満、および運動競技集団における先天性免疫機能の指標としてchnique。10,11のテキストは、以下のこのアッセイを実行するためのステップバイステップの手順を読者に提供し、読者が適応させることができる領域を強調表示します彼らの研究のニーズを満たすことができます。
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Protocol
注：すべての血液採取手順は、アパラチア州立大学（ASU）治験審査委員会（IRB）によって定められたガイドラインに従って行いました。
1.アッセイの準備
- 収集、準備、および（特定の材料/機器の表を参照してください）手順のために指定された資料を整理します。
- 12×75mmのチューブにラベルを付けます。
- 各参加者のラベル2つのチューブ：食作用アッセイのための1つのチューブ（黒インクおよびフルオレセインイソチオシアネートのための "F" [FITC]で、このチューブにラベルを付ける）とOB活性アッセイのための1つのチューブ（赤インクでこのチューブにラベルを付け、 "ジヒドロ用H "[HE]）。
注：無菌の12×75mmの管の使用は意図されない細胞の活性化と、バックグラウンドノイズの関連する増加を最小限にすることをお勧めします。 - 食作用アッセイのための1つのチューブ（FITC制御：BLACでこのチューブにラベルを付けアッセイ対照用の3本のチューブにラベルを付けますKインクと「F」）、OB活性アッセイ（HE制御のための1つのチューブ：赤インクと「H」で、このチューブにラベルを付ける）、およびネガティブコントロールのための1つのチューブ（血液のみ：緑色のインクで、このチューブにラベルを付けますそして「血液のみ」）。
- 各参加者のラベル2つのチューブ：食作用アッセイのための1つのチューブ（黒インクおよびフルオレセインイソチオシアネートのための "F" [FITC]で、このチューブにラベルを付ける）とOB活性アッセイのための1つのチューブ（赤インクでこのチューブにラベルを付け、 "ジヒドロ用H "[HE]）。
- アッセイの日前に少なくとも1日のストック溶液を準備します。
- 滅菌リン酸緩衝生理食塩水（PBS）を準備します。 18.2MΩH 2 Oの900ミリリットルで10倍のPBS 100ミリリットルを希釈0.2μmのフィルターで滅菌フィルター。使用するまで4℃で保存。
- 滅菌PBS - グルコースを準備します。 PBS 100mlにグルコースを1.0g溶解します。 0.2μmのフィルターで滅菌フィルター。使用するまで4℃で保存。
- 無菌の0.1Mクエン酸緩衝液を準備します。 18.2MΩH 2 O 100ml中のクエン酸、1.2gのクエン酸ナトリウムを1.1g溶解pHを4.0に調整します。 0.2μmのフィルターで滅菌フィルター。使用するまで4℃で保存。
- HEストック溶液を準備します。 Rジメチルスルホキシド（DMSO）の1.0ミリリットルでHEの1.0 mgのesuspend。穏やかに混合し、アリコートし、使用するまで-20℃で保存します。
- FITC標識黄色ブドウ球菌 （ 黄色ブドウ球菌 ）のストック溶液（2×10 9粒子/ ml）を準備します。 FITC標識S. 10mgを再懸濁PBSの1.5ミリリットル中の黄色ブドウ球菌 （または適切な量）。製造業者の推奨に従って3500μlアリコート超音波処理に分けます。使用するまで-20℃で小分けし、店舗。
- 非標識S.を準備黄色ブドウ球菌ストック溶液（2×10 9粒子/ ml）。非標識S. 100mgを再懸濁PBSの15ミリリットル（または適切な量）で黄色ブドウ球菌 。製造業者の推奨に従って30500μlアリコート超音波処理に分けます。使用するまで-20℃で小分けし、店舗。
- アッセイの日に新しい作業溶液を調製します。
- HE作業溶液を準備します。 10μlのを転送PBS-グルコース990μlのにHEストック溶液を解凍しました。光から保護し、使用するまで氷上に保ちます。
- FITC標識S.を準備します球菌ワーキング溶液（133333粒子/μL）。転送解凍したFITC標識S.70μlのPBSの980マイクロリットルまで球菌原液。光から保護し、使用するまで氷上に保ちます。
- 非標識S.を準備球菌ワーキング溶液（133333粒子/μL）。転送解凍した非標識S.70μlのPBSの980マイクロリットルまで球菌原液。光から保護し、使用するまで氷上に保ちます。
- クエンチ溶液を準備します。無菌の0.1Mクエン酸緩衝液の11.25ミリリットルに0.4％トリパンブルー溶液の750μlのを追加します。氷水浴中で使用するまで保管してください。
- 認定瀉血専門医は、血液を描画するための世界保健機関（WHO）のガイドラインに従って血を引く必要があります。
- K 2 EDTAを含む1 4ミリリットル採血管に血液を描画します。に製造業者の指示に従ってVERT採血管。使用するまでベンチトップロッカー上で室温で採血管を保管してください。ステップ1.2.1で説明した白血球（WBC）微分解析と完全血球算定（CBC）のために、この血液を使用してください。
- リチウムヘパリンを含有するものを4ml採血管に血液を引き込みます。製造業者の指示に従って採血管を反転させます。使用するまでベンチトップロッカーにRTで採血管を保管してください。ステップ2で説明した単球および顆粒球食作用およびOB活性アッセイのために、この血液を使用してください。
- 12×75mmのチューブにラベルを付けます。
- 各サンプルのアッセイを完了するために必要とされるであろう（ すなわち 、 黄色ブドウ球菌 ）細菌の量を決定します。
- メーカーの説明書に記載されているように、血液のWBC微分解析でCBCを実行するために血液分析装置を使用してください。 WBC（細胞/ mlで）数、％好中球、および％をメモします単球値。
- 各サンプルの好中球と単球数を決定するために、以下の式を使用してください。
（細胞/ mlで）好中球数=（細胞/ mlで）％好中球×WBC
（細胞/ mlで）単球数=（細胞/ mlで）WBC×％の単球 - 各サンプルの貪食細胞数および100μlの試料中に存在する食細胞の数を決定するには、以下の式を使用してください。
（細胞/ mlで）食細胞カウントは（細胞/ mlで）（細胞/ mlで）好中球数+単球数を=
100μl中の食細胞の数=（細胞/ mlでの食細胞数（））/ 10 - 各サンプルのために必要な細菌（ 例えば 、 黄色ブドウ球菌 ）の数およびFITC標識Sの量を決定するために、以下の式を使用して黄色ブドウ球菌または非標識S.各チューブに添加されるべきである黄色ブドウ球菌ワーキング溶液（133333個/ mlで）。
注：標的細菌：食細胞の比率が8：1です。
必要な細菌の数=100μlの×8における食細胞の数
（μLで）必要なFITCまたは非標識作業溶液の体積=（必要な細菌の数）/（133333粒子/μL）
2.アッセイを行います
- アッセイのために、全血を準備します。
- 各参加者とコントロールチューブについては、適切に標識された12×75mmのチューブの底にヘパリンリチウム採血管からの全血100μlのを転送するために拡張された長さのピペットチップを使用します。キャップを交換してください。
注：12×75ミリメートル管の側面に血液が入らないように注意してください。 - HE制御管を含む赤インクと「H」で標識されたチューブにHE作業溶液10μlを追加するためにマイクロピペットを使用してください。キャップと渦簡単に交換してください。
- 15分間37℃の水浴中ですべてのチューブをインキュベートします。その後、すぐに12分間氷水浴にすべてのチューブを移します。
注：オープンメタルラックを使用しますそして静かにチューブを迅速かつ適切に温めたり冷やしていることを確実にするために、ラックごとに5分を横に振ります。
- 各参加者とコントロールチューブについては、適切に標識された12×75mmのチューブの底にヘパリンリチウム採血管からの全血100μlのを転送するために拡張された長さのピペットチップを使用します。キャップを交換してください。
- サンプルおよび対照チューブに細菌（ すなわち 、 黄色ブドウ球菌）を追加します。
- 適切な量を追加するためにマイクロピペットを使用して、非標識S.の（ステップ1.2.4で計算） HE制御管を含む赤インクと「H」、で標識されたチューブに黄色ブドウ球菌作業溶液。キャップと渦簡単に交換してください。
- FITC標識S.の（ステップ1.2.4で計算された）適切な量を追加するためにマイクロピペットを使用してFITC制御管を含むブラックインクと「F」、で標識されたチューブに黄色ブドウ球菌作業溶液。キャップと渦簡単に交換してください。
- ボルテックス「血液のみ」コントロールチューブが、それへの細菌の種類（ すなわち 、 黄色ブドウ球菌 ）のいずれかを追加しないでください。
- 20分間37℃の水浴中ですべてのチューブをインキュベートします。オープンメタルラックを使用して、ゆっくりとラックに5分ごとに振りますチューブは迅速かつ適切に温めていることを確認します。インキュベーション期間の後、すぐに1分間氷水浴にすべてのチューブを移します。
- 細胞を洗浄。
- すべてのチューブに氷冷したクエンチ溶液100μlを追加するにはリピーターピペットを使用してください。簡単にキャップ、渦を交換し、その後、1分間氷上ですべてのチューブをインキュベートします。
- すべてのチューブに氷冷PBSの1ミリリットルを追加するには、リピーターピペットを使用してください。簡単にボルテックスし、すべてのチューブに氷冷PBSの追加の2ミリリットルを追加し、キャップを交換してください。遠心分離を4℃で5分間、270×gで、とのすべてのチューブは、上清を吸引します。
- 繰り返しステップ2.3.2 1時間（2回の洗浄の合計）。
- フローサイトメトリーのためのサンプルを準備します。
- すべてのチューブに氷のように冷たいウシ胎児血清の50μLを追加するにはリピーターピペットを使用してください。簡単に言えば、すべてのチューブをボルテックス。
- 適切なカルーセルにすべてのチューブを移し、赤血球セル画で自動細胞溶解準備ワークステーションを使用しますリットル（RBC）溶解およびWBCは赤血球を溶解し、製造業者の取扱説明書に記載されているように白血球を固定するための試薬を固定。
- 自動細胞溶解準備ワークステーションの実行が完了した後、フローサイトメトリー分析を行うことができるようになるまで、4℃の冷蔵庫にアルミ箔とストア内チューブを包みます。
3.フローサイトメトリーの取得
- セットアップフローサイトメトリーシステム。
- メーカーが提供するマニュアルの指示に従ってフローサイトメトリーシステムをウォームアップ。その後、試薬および廃液タンクレベルをチェック。必要に応じて、試薬タンクを満たし、および/または廃液タンクを空にします。
- システムクリーンサイクルを実行するには、「クリーンパネル」機能を使用します。そして、アライメントおよび流体工学検証蛍光粒子を実行し、各検出器の変動半値係数（HPCV）は品質管理に記載され所定の範囲内にあることを確認してください（QC）のプロトコルは、製造者によって提供さrを。
- アッセイ固有の集録および計測設定のプロトコルを作成します。
- 食作用およびOB活性アッセイのためのアッセイに固有の取得プロトコルを作成します。
注：ここで説明した取得プロトコルはサイトメーターブルーレーザー（488 nm）を持つ任意の流れで使用するために適合させることができる、FITC用フィルター（530/30）、およびHEのためのフィルタ（26分の575）。- フローサイトメトリーシステム取得ソフトウェアを開き、「新しいプロトコル」を作成します。
- 食作用アッセイのための「FL1パラメータ」（FITC）およびOB活性アッセイのための「FL2パラメータ」（HE）を選択します。
- プロットを作成します（ すなわち 、前方散乱[FSC] 対側方散乱は、[SSC]ドットプロット、FL1ヒストグラム、FL2ヒストグラム）が買収のために必要。
- SSCプロット対 FSCにWBC（白血球）、顆粒球や単球集団のための多角形の領域を作成し、FL1とFL2ヒストグラムに線形領域を作成します。集合A＆＃34; WBCゲートのための50,000のイベントの "カウントを停止します。
- アッセイ固有の名前を持つプロトコルを保存します。
- 食作用およびOB活性アッセイのためのプロトコルを設定するアッセイ固有の楽器を作成します。
- ドラッグアンドフローサイトメトリーシステム収集ソフトの「取得マネージャ」に「リソースエクスプローラ」から（ステップ3.2.1で定義された）」アッセイ固有の取得・プロトコル」をドロップします。
注：この方法で追加情報は常にワークリストの最後に表示されます。 - ワークリストにサンプル情報を入力し、ワークリストを保存します。
- 4℃の冷蔵庫からコントロールサンプル管を取り外し、それらを15分間室温に平衡化することができます。その後、簡単に各制御サンプルチューブをボルテックス。
- 陰性対照サンプルを実行するには、手順3.2.1で定義された「検定固有の取得・プロトコル」を使用します（ つまり 、血液のみ）および陽性対照サンプル（ すなわち 、HE制御、FITC制御）フローサイトメトリーシステムを介して。ヒストグラムを確認し、必要に応じて光電子増倍管（PMT）FITCおよびフィコエリトリン（PE）チャネルの電圧を調整します。
- 対照試料をボルテックスし、ワークリスト上の順序に従ってフローサイトメトリーシステムカルーセルに転送。そして、サンプリングチャンバ内のカルーセルを配置し、対照試料のデータを取得するサイトメーターツールバーの「スタート」ボタンをクリックします。プロトコルを設定する「プロ設定XXX」を保存します。
- ドラッグアンドフローサイトメトリーシステム収集ソフトの「取得マネージャ」に「リソースエクスプローラ」から（ステップ3.2.1で定義された）」アッセイ固有の取得・プロトコル」をドロップします。
- 食作用およびOB活性アッセイのためのアッセイに固有の取得プロトコルを作成します。
- フローサイトメトリーシステムの研究サンプルを取得します。
- 4℃の冷蔵庫から調査サンプル管を取り外し、15分間室温に平衡化することができます。
- サンプルは平衡化されているが、プロジェクトのワークリストを作るためにワークリスト・スペースにあらかじめ定義された研究に固有の取得プロトコルをドラッグします。
- 「設定プロトコルは "＆にリンクされていることを確認します＃34;ステップ3.2.2で定義されたアッセイ固有の設定プロトコル」そして、識別情報を入力します（ 例えば 、研究名、番号、訪問数、対象IDを描く）、ワークリストに各チューブのために。
- 15分の平衡期間の後、渦研究サンプルとワークリスト上の順序に従ってフローサイトメトリーシステムカルーセルに転送。そして、サンプリングチャンバ内のカルーセルを置き、研究サンプルのデータを取得するサイトメーターツールバー「スタート」ボタンをクリックします。
- 各サンプルのレポートパネル上のRBC溶解効率とWBCの細胞亜群分布、割合、絶対数、および蛍光強度を検査することにより、データの品質を確認します。
注：データの品質がこれらの基準のすべてが彼らの事前定義された限度内であれば許容可能であると考えられています。すべての基準が満たされない場合、サンプルは、再処理されるべきです。 - 清潔で、フローサイトメトリーシステムをシャットダウンします。フローサイトメトリーを保管してください二つの異なるコンピュータ・ドライブ上のデータは、偶発的なデータ損失を防止します。
4.データ解析
- 食作用の解析を実行します。
- 単一のフォルダに食作用の全て（ すなわち 、Fで標識された）サンプルおよびコントロールリストモードデータ（LMD）データファイルを統合します。そして、解析ソフト、フローサイトメトリーを開き、サンプル空間にファイルをドラッグします。
- WBC、顆粒球、単球、およびリンパ球ゲートを設定します。
- 「FITCコントロールサンプル」のいずれかを開くには、ファイル名をダブルクリックします。 x軸を設定するには、ドロップダウンメニューを使用し、「FSC」と「線形」とy軸に「SSC」と「線形」へ。
- 総WBC人口のゲートを準備するために、「ポリゴンゲートセレクタ」を使用してください。
注：グラフのエッジでの細胞のすべてを含めるようにしてください。このゲート」WBCを "ラベルを付けます。 - 「新しいWBCゲート」をダブルクリックし、ドロップを使用メニューは、x軸に「FSC」と「線形」およびY軸に「SSC」と「線形」の設定に至るまで。
- "。それに応じて各ゲートにラベルを付けます。ドラッグして" "ポリゴンゲートセレクタ「リンパ球ゲート」に設定する「楕円形のゲートセレクタ」を使用した後、および「「顆粒球ゲート」や単球ゲートを設定するために使用（％）ゲートのデータを「オフ側への細胞が容易に観察されるようになっています。
- 「食作用ポジティブゲート」と顆粒球と単球集団のための「食作用ネガティブゲート」に設定します。
- ステップ4.1.2.1で使用される「FITCコントロールサンプル」をダブルクリックします。そして、「顆粒球ゲート」をクリックして、x軸に「FL1」と「ログ」とy軸に「SSC」と「リニア」に設定するには、ドロップダウンメニューを使用します。
- 「食作用負のゲート」と「食作用の仮定を設定するために、「正方形のゲートセレクタ」を使用しますアイブゲート」。
注：FITC対照試料は、細菌（ すなわち 、 黄色ブドウ球菌 ）の刺激を受けていないので、全ての細胞は、理論的に貪食負でなければなりません。これらの集団のための境界を確立する際に裁量を使用してください。 - 繰り返し、ステップ4.1.3.1および単球集団のためのステップ4.1.3.2。
- "WBCの％」、「蛍光強度」、および顆粒球や単球集団のための"％の食作用陽性細胞」の統計を追加します。
- ステップ4.1.2.1で使用される「FITCコントロールサンプル」をクリックします。 「顆粒球ゲート」をハイライトし、「ワークスペース」をクリックし、「統計の追加」。 「幾何平均」と「FL1ログ」を強調表示し、「追加」をクリックします。そして、「周波数親の「統計を選択し、「追加」をクリックします。
注：これは全体の顆粒球集団の蛍光強度（幾何平均）を与えると、顆粒あるWBC（親）の割合。 - ステップ4.1.2.1で使用される「FITCコントロールサンプル」をクリックします。顆粒球集団の「食作用陽性ゲート」をハイライトし、「ワークスペース」をクリックし、「統計の追加」。 「幾何平均」と「FL1ログ」を強調表示し、「追加」をクリックします。そして、「周波数親の「統計を選択し、「追加」をクリックします。
注：これは食作用ポジティブ顆粒球の蛍光強度（幾何平均）および食作用陽性である顆粒球（親）の割合を与えます。 - 繰り返し、ステップ4.1.4.1および単球集団のためのステップ4.1.4.2。
- ステップ4.1.2.1で使用される「FITCコントロールサンプル」をクリックします。 「リンパ球ゲート」をハイライトし、「ワークスペース」をクリックし、「統計の追加」。 「周波数親の「統計を強調表示し、「追加」をクリックします。
注：このリンパ球であるWBC（親）の割合を与えます。 - ステップ4.1.2.1で使用されるFITC対照試料で作成したゲートと統計情報のすべてを強調表示します。画面の上部にある「グループ」パネルで「すべてのサンプル」にドラッグします。
注：これは研究サンプルのすべてにこれらの設定を適用します。 - LMDのフォルダが含まれている同じフォルダ内の.wspファイルとして作業を保存し、名前を入力します。
- ステップ4.1.2.1で使用される「FITCコントロールサンプル」をクリックします。 「顆粒球ゲート」をハイライトし、「ワークスペース」をクリックし、「統計の追加」。 「幾何平均」と「FL1ログ」を強調表示し、「追加」をクリックします。そして、「周波数親の「統計を選択し、「追加」をクリックします。
- 個々のサンプルゲートを調整します。
- データセット内の「最初のサンプル」をクリックし、WBCゲートが適切に画面上の細胞分布に適合していることを確認します。そうでない場合は、ゲートのエッジがそのサンプルのためのゲートを調整クリックしてドラッグします。次のサンプルに進めるために「右矢印」（ すなわち、「˃」）をクリックします。全てのサンプルが検討されているまで、この手順を繰り返します。
- データセットの最初のサンプルは、「WBCゲート」をクリックし、「グランことを確認ulocyteゲート」、「単球ゲート」、および「リンパ球ゲート」各試料について、適切に画面上の細胞分布をフィット。必要に応じて調整します。をクリックして「右矢印」（ すなわち、「˃ "）次のサンプルに進めるために。
- 全てのサンプルが検討されるまで、ステップ4.1.5.2を繰り返します。次に、「保存」をクリックします。
- 電子スプレッドシートプログラムにデータを表示します。
- 画面の上部にある「テーブル・エディタ」アイコンをクリックします。最終的なスプレッドシート上のサンプリング日を含めるように「編集」、「キーワード」、および「$のDATE」をクリックしてください。そして、最終的なスプレッドシート上のサンプリング識別が含まれるように、「編集」、「キーワード」、および「@ SAMPLEID1」をクリックします。 「SAMPLEID2 @ "、" SAMPLEID3 @」、および「SAMPLEID4 @」に対して繰り返します。
- 彼らは両方のコンピュータの画面上で閲覧することができますので、「テーブルエディタ」画面と「サンプル」画面を調整します。セレサンプルシート上の任意の「サンプル」のct。そして、「テーブル・エディタ」に関心の各統計をドラッグします。
- 「テーブル・エディタ」に「顆粒球ゲート」に記載されている」のFreq。親の「統計をドラッグします。 「テーブル・エディタ」の「名前」列の下に「顆粒球のような％WBC」と入力します。
- 「テーブル・エディタ」に「顆粒球ゲート」の下にリストされている「幾何平均」統計をドラッグします。 「テーブル・エディタ」の「名前」列の下の「幾何平均蛍光、顆粒球」と入力します。
- 「テーブル・エディタ」に「顆粒球/食作用陽性ゲート」の下にリストされている」のFreq。親の「統計をドラッグします。 「テーブル・エディタ」の「名前」列の下に "％食作用陽性顆粒球」と入力します。
- 目に「顆粒球/食作用陽性ゲート」の下にリストされている「幾何平均」統計をドラッグしますE「テーブルエディタ」。 「テーブル・エディタ」の「名前」列の下の「幾何平均蛍光、食作用陽性顆粒球」と入力します。
- 「テーブル・エディタ」に「単球ゲート」に記載されている」のFreq。親の「統計をドラッグします。 「テーブル・エディタ」の「名前」列の下に「単球のような％WBC」と入力します。
- 「テーブル・エディタ」に「単球ゲート」に記載されている「幾何平均」統計をドラッグします。 「テーブル・エディタ」の「名前」列の下の「幾何平均蛍光、単球」と入力します。
- 「テーブル・エディタ」に「単球/食作用陽性ゲート」の下にリストされている」のFreq。親の「統計をドラッグします。 「テーブル・エディタ」の「名前」列の下に "％食作用陽性単球」と入力します。
- 「単球/ Phagocyの下にリストされている「幾何平均」統計をドラッグしますテーブル・エディタ」を「tosis正のゲートは、テーブルエディタ「名前」の欄 ""下 "幾何平均蛍光、食作用陽性単球を」。入力します」。
- 「テーブル・エディタ」に「リンパ球ゲート」に記載されている」のFreq。親の「統計をドラッグします。 「テーブル・エディタ」の「名前」列の下に「リンパ球のような％WBC」と入力します。
- ドラッグアンドそれらは優先順に配置されるまで、「テーブル・エディタ」に表示パラメータをドロップします。
- 「保存」をクリックしてください。次に、スプレッドシート形式でデータを表示するには、「テーブルの作成」をクリックします。 .xlsxファイルとして作業を保存し、名前に「名前を付けて保存」をクリックします。
- OB活性アッセイを繰り返し、ステップ4.1（ すなわち 、H標識）サンプルとLMDデータファイルを制御します。
注：OBの活動を参照して貪食へのすべての参照を代入してください。 - Nieman, D. C., et al. Influence of pistachios on performance and exercise-induced inflammation, oxidative stress, immune dysfunction, and metabolite shifts in cyclists: a randomized, crossover trial. PLoS One. 9, e113725 (2014).
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Representative Results
長時間の集中的な運動は、ナチュラルキラー細胞機能、ウイルス感染に対するマクロファージのサイトカイン媒介応答、および顆粒球と単球の食作用およびOBの活性を含む先天性免疫機能に重大な影響を持っています。複数の研究は、筋損傷および代謝要求により誘発される炎症を反映して、大幅に運動後、その顆粒球と単球貪食増加を示しています。これとは対照的に、顆粒球および単球OBの活動は、運動後に減少し、感染に対する感受性の増加の1免疫の指標とすることができます。例えば、 図1は、Sの食作用を示し、顆粒球によって黄色ブドウ球菌は、次の朝までに正常に戻って、75キロのサイクリング試合（70％VO 2MAX）の直後に増加し、1.5時間です。単球の食作用は、同様に、運動のこのレベルによって影響される。 図2は、顆粒球のOBの活動が減少であることを示しています75キロのサイクリング後少なくとも21時間、D。単球のOB活性はまた、75キロのサイクリング後に減少されます。
S.の顆粒及び単球食作用黄色ブドウ球菌は 、なく、顆粒球及び単球OB活性、全身性炎症バイオマーカーと相関している3は、顆粒球食作用および血清C反応性タンパク質（CRP）レベル（ピアソンの積率相関の間に適度な相関関係を示し ; R = 0.44; P <0.01 ）106太りすぎ/肥満女性インチ血清CRPはまた、Sの単球の食作用と相関しています黄色ブドウ球菌 （ピアソン積率相関; R = 0.30; P <0.01）。また、血中の好中球/白血球数（ピアソン積率相関;それぞれR = 0.62とr = 0.61; P <0.001）、ボディ・マス・インデックス（ピアソン積率相関; R = 0.50とr = 0.40、それぞれ; P <0.001）、血清インスリンレベル（R = 0.30およびr =0.23; P <0.03）、および血液A 1Cレベル （ピアソン積率相関;それぞれR = 0.28とr = 0.21; P <0.04）がSの顆粒球や単球食作用に相関しています黄色ブドウ球菌 。一般に、これらのデータは、静止対象における高い顆粒球及び単球食作用は、全身性炎症の指標であることを示しています。
図1： 顆粒球食作用が強い持久力運動の影響を受けている顆粒球の食作用は、VO 2MAXの70％で、75キロのサイクリング試合直後と1.5時間増加しました。 21時間の運動後では、顆粒球の食作用は、わずかに運動前のレベル以下に戻りました。 *運動前とは異なる示している（t検定事後分析と反復測定ANOVA、適切な場合、N = 19; P <0.05）。値は私です±標準誤差。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図2： 顆粒球酸化バースト活動が激しい持久運動顆粒球酸化バースト活性によって影響されるが VO 2MAXの70％で75キロのサイクリング試合後、すぐに1.5時間、および21-時間を減少させました。 *運動前とは異なる示している（t検定事後分析と反復測定ANOVA、適切な場合、N = 19; P <0.05）。数値は、平均値±標準誤差である。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
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Discussion
この原稿は、顆粒球と単球機能の2つのインジケータの決意のためのステップバイステップのプロトコルを提供します。私たちは、このアッセイの成功に不可欠ないくつかの手順を確認しています。そのような工程は、細菌の添加の直前に発生した氷浴インキュベーションです。すべてのサンプルの徹底的な冷却は、食作用およびOB活性に対する温度の影響を最小限に抑えることができます。もう一つの重要なステップは、各サンプルに細菌を添加することです。 8：1の細菌：食細胞の比率は、最適な結果が得られます。しかし、他の研究者は、この比は、適切な結果を生成するように変更する必要があることを見つけることができます。もう一つの重要なステップは、白血球を赤血球を溶解し、修正するためのRBCの溶解およびWBCの固定試薬の使用です。このような試薬の使用は、赤血球の完全な溶解を確実にかつ安全に4℃で一晩処理したサンプルを保存してから、次の日に、フローサイトメーターを介してそれらを実行するために研究者を可能にします。以前の研究（未発表）インド語RBCの溶解およびWBCの固定データの整合性を損なうことなく、などの多くの12のような時間で固定したサンプルのフローサイトメトリーを遅延させるために使用することができるのATE。
この手順は、簡単に研究者の能力や興味を満たすために変更することができ、適応が行われたときに最適化が必要であることが強調されるべきです。報告されている最も一般的な適応のいくつかは、標的細菌、ラベル/プローブ、およびインキュベーション時間にあります。 大腸菌 7,8は、Sの代わりに使用される場合、研究者は、優れた結果が得られています標的病原体として黄色ブドウ球菌 （8の両方で：1の比率）。例えばサッカロマイセス・セレビシエなどの真菌は、またE.の代替として適切であり得ます大腸菌 。また、研究者は頻繁に食作用のためのプローブとして、pH感受性分子プローブ、代わりにFITCの7,12を使用します 。同様に、HE以外のプローブは、一般的にincludin、OBの活性を測定するために使用されていますグラムdichlorofluorescinジアセテート（DCF-DA）10および123（DHR）をジヒドロローダミン。13報告インキュベーション時間は120分まで20分ごとに異なり、12,14,15 McFarlinと最大応答時間は、細菌のターゲットによって異なる場合がありますことを報告。7それがすべきまた、最適なインキュベーション時間は、アッセイの食作用およびOBの側面の間で変化してもよいことに留意され7
新たな研究の設定で、この技術を確立する際に、すべての実験室アッセイと同様に、トラブルシューティングが必要な場合があります。著者らは、細菌の最適化をアドバイス：食細胞の比率は、このアッセイのための成功の鍵です。著者らはまた、非罹患参加者からの顆粒球集団中の細胞のより少ない80％がFITC陽性である場合は、サンプルからのデータを分析から破棄されるべきであることに注意してください。この状況では、サンプルを再収集することができ、可能な場合、再分析しました。
にいくつかの制限があります。顆粒球と単球食作用し、この原稿に記載OB活性アッセイ。そのような制限は、興味のある細胞集団を同定するためにFSCおよびSSCの排他的な使用です。細胞表面マーカーの使用は、研究者が積極的に細胞集団を同定することを可能にするであろう。10が、この機能の追加は、基本的なフローサイトメーター以上を必要とし、本稿の範囲を超えことです。このアッセイの別の制限は、興味のある免疫細胞によって内在化されなかったプローブの蛍光を消光するためにトリパンブルーの有効性に依存していることです。 pH感受性分子プローブ7,12の内在が懸念される状況でFITCの代替として使用することができます。そのようなプローブは、このようなエンドサイトーシス小胞のもののような酸性の環境で蛍光のみであるため、取得された蛍光は内在粒子のみを表しています。それを行うため、また、いくつかの研究者は、現在のアッセイを批判していますエスベースライン免疫細胞活性を制御するために、氷水中での代わりに37℃でインキュベートされたサンプルのパラレルセットが含まれていませ。いくつかの場面で、我々は顆粒球と単球食作用およびOB活性アッセイを実行するときに、この「氷の状態を "含まれており、それが大幅に（未発表）データの品質を改善しないことがわかりました。
要約すると、この原稿は、顆粒球および単球に食作用およびOB活性を測定するための技術が記載されています。これは、簡単に実験室の能力と研究の利益を考慮するように修正することができる簡単な、簡単なアッセイです。運動科学に及び肥満関連の研究では、先天性免疫機能のこの尺度は、研究者は、体重減少、サプリメントの使用、食事介入、および他のライフスタイルの変化など、多くの潜在的な対策の効果を探求することができます。このテクニックをマスターすると、研究者らは、急性監視することができるようになりますダイエット、運動、および他の多くの刺激に応答して免疫細胞機能における慢性変化。
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Acknowledgments
著者は、この手順の最適化中に彼らの援助のためにザック・シュー、ケーシー・ジョン、およびリンCialdella-カムを承認したいと思います。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 12 x 75 mm tubes, with cap | VWR | 20170-579 | You will need 2 tubes per sample ("H" and "F") plus 3 tubes per batch (for assay controls; "F", "H", and "Blood only"). |
| PBS (10x), pH 7.4 | Life Technologies | 70011-044 | |
| Bottle top 0.2 µm cellulose acetate filter (500 ml capacity) | Fisher Scientific | 09-741-07 | |
| Glucose, powder | Life Technologies | 15023-021 | |
| Citric acid (anhydrous, cell culture tested, plant cell culture tested) | Sigma-Aldrich | C2404-100G | |
| Sodium citrate tribasic dihydrate | Sigma-Aldrich | S4641-25G | |
| Dihydroethidium (Hydroethidine) (HE) | Life Technologies | D11347 | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) Anhydrous | Life Technologies | D12345 | |
| Staphylococcus aureus (Wood strain without protein A) BioParticles, fluorescein conjugate (FITC) | Life Technologies | S2851 | |
| Staphylococcus aureus (Wood strain without protein A) BioParticles, unlabeled | Life Technologies | S-2859 | |
| Trypan Blue Solution, 0.4% | Life Technologies | 15250-061 | |
| 4.0 ml vacutainer containing 7.2 mg K2EDTA, spray-dried | VWR | BD367861 | You will need 1 K2EDTA blood collection tube per sample. |
| 4.0 ml vacutainer containing 68 USP units Lithium Heparin, spray-coated | VWR | BD367884 | You will need 1 Lithium Heparin blood collection tube per sample. |
| COULTER Ac·T 5diff CP | Beckman Coulter | 6605705 | i.e., hematology analyzer |
| COULTER Ac·T 5diff Rinse | Beckman Coulter | 8547167 | |
| COULTER Ac·T 5diff Fix | Beckman Coulter | 8547171 | |
| COULTER Ac·T 5diff WBC Lyse | Beckman Coulter | 8547170 | |
| COULTER Ac·T 5diff Hgb Lyse | Beckman Coulter | 8547168 | |
| COULTER Ac·T 5diff Cal Calibrator | Beckman Coulter | 7547175 | |
| COULTER Ac·T 5diff Control Plus | Beckman Coulter | 7547198 | |
| AcT 5diff Diluent | Beckman Coulter | 8547169 | |
| 200 µl extended-length pipette tips | VWR | 37001-526 | |
| Insulated ice pan | VWR | 89198-980 | For ice water bath. |
| Open metal tube rack | VWR | 60916-702 | |
| Fetal Bovine Serum | Life Technologies | 26140-111 | |
| TQ-Prep Workstation | Beckman Coulter | 6605429 | i.e., automated cell lyse preparation workstation |
| ImmunoPrep Reagent System | Beckman Coulter | 7546999 | i.e., RBC lyse/WBC fix reagent system |
| Cytomics FC500 MCL Flow Cytometry System with CXP Software | Beckman Coulter | 626553 | |
| IsoFlow Sheath Fluid | Beckman Coulter | 8547008 | |
| COULTER CLENZ | Beckman Coulter | 8546929 | |
| Flow-Check Fluorospheres | Beckman Coulter | 6605359 | i.e., alignment and fluidics verification fluorospheres |
| FlowJo Software | FlowJo | FlowJo | i.e., flow cytometry analysis software |
| Excel Software | Microsoft | Microsoft Excel | i.e., electronic spreadsheet program |
