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Immunology and Infection

मानव रक्त में मापने कणांकुर और Monocyte phagocytosis और ऑक्सीडेटिव फट गतिविधि

Published: September 12, 2016 doi: 10.3791/54264
Automatic Translation
1, 1, 2, 3, 3
1Human Performance Laboratory, North Carolina Research Campus, Appalachian State University, 2Department of Biology, Appalachian State University, 3David H. Murdock Research Institute

Introduction

Granulocyte और monocyte phagocytosis / ऑक्सीडेटिव फट (ओ) गतिविधि परख एक सरल, सीधे आगे की तकनीक है कि अक्सर लंबे समय तक और गहन व्यायाम के बाद सहज प्रतिरक्षा समारोह के बारे में जानकारी इकट्ठा करने के लिए प्रयोग किया जाता है। जब 1-4 करने के लिए प्रतिरक्षा प्रणाली की प्रतिक्रिया का अध्ययन एक प्रोत्साहन, granulocytes और monocytes क्योंकि वे मेजबान बचाव में एक केंद्रीय भूमिका निभाते हैं और संक्रमण के स्थल पर जमा करने के पहले प्रतिरक्षा कोशिकाओं रहे हैं विशेष रुचि के हैं। 5 न्यूट्रोफिल, granulocyte का एक प्रकार है, क्षतिग्रस्त मांसपेशियों में सरकाना करने के लिए पहली कोशिकाओं रहे हैं ऊतक गहन व्यायाम के बाद। 6 phagocytosis और ओबी गतिविधि granulocyte और monocyte समारोह, 7 की सबसे आम उपाय कर रहे हैं और दोनों के संक्रमण की प्रक्रिया और मरम्मत की प्रक्रिया में उनकी केंद्रीय भूमिका की वजह से सहज प्रतिरक्षा सेल समारोह के संकेतक के रूप में पसंद कर रहे हैं।

परख इस पांडुलिपि utili में वर्णितमाहिर एक मूल प्रवाह कोशिकामापी granulocyte और monocyte phagocytosis और पूरे रक्त में ओबी गतिविधि का एक मात्रात्मक निर्धारण प्रदान करते हैं। इस तकनीक में पूरे रक्त का उपयोग फायदेमंद है क्योंकि यह अनुमति देता है परख एक समय लेने वाली प्रक्रिया शुद्धि के बिना ही किया जा सकता। इस परख आसानी से अनुसंधान डिजाइन और प्रयोगशाला क्षमताओं की एक किस्म को समायोजित करने के लिए संशोधित किया जा सकता है। उदाहरण के लिए, लियाओ एट अल। इसी तरह की एक तकनीक है कि न्यूट्रोफिल ओबी गतिविधि को दिखाने के लिए उपयोग किया वृद्धि हुई है और न्यूट्रोफिल phagocytosis कमी आई है घाव मस्तिष्क की चोट के बाद। 8 अन्य उदाहरण में, McFarlin एट अल। इस तकनीक allophycocyanin का उपयोग करता है की एक सुंदर संशोधन (एपीसी वर्णित ) छवि के आधार से फ्लो उनकी phagocytosis और ओबी गतिविधियों के संदर्भ में granulocytes वर्गीकृत करने के साथ CD66b और उच्च प्रदर्शन मिलकर एपीसी संयुग्मित CD45 लेबलिंग संयुग्मित। 7,9

हमारे शोध समूह इस ते के विभिन्न रूपांतरों इस्तेमाल किया गया हैलगभग 20 वर्षों के लिए, अधिक वजन मोटापे से ग्रस्त हैं, और पुष्ट आबादी में सहज प्रतिरक्षा समारोह का एक संकेतक के रूप में chnique। 10,11 पाठ नीचे इस परख प्रदर्शन के लिए कदम दर कदम निर्देश के साथ पाठक प्रदान और क्षेत्रों है कि पाठक के लिए अनुकूल हो सकते हैं पर प्रकाश डाला जाएगा उनके अनुसंधान की जरूरतों को पूरा करने के लिए।

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Protocol

नोट: सभी रक्त संग्रह की प्रक्रिया के दिशा-निर्देशों Appalachian राज्य विश्वविद्यालय (ASU) संस्थागत समीक्षा बोर्ड (आईआरबी) द्वारा उल्लिखित के अनुसार आयोजित किया गया।

1. परख तैयारी

  1. , इकट्ठा तैयार है, और माल की प्रक्रिया के लिए निर्दिष्ट व्यवस्थित (विशिष्ट सामग्री / उपकरण की तालिका देखें)।
    1. 12 x 75 मिमी नलियों लेबल।
      1. लेबल प्रत्येक भागीदार के लिए दो ट्यूबों: phagocytosis परख और ओबी गतिविधि परख के लिए एक ट्यूब (काली स्याही और एक fluorescein आइसोथियोसाइनेट के लिए "एफ" [FITC] के साथ इस ट्यूब लेबल) के लिए एक ट्यूब (लाल स्याही और एक साथ इस ट्यूब लेबल " dihydroethidium के लिए एच "[वह])।
        नोट: बाँझ 12 x 75 मिमी ट्यूबों के उपयोग अनायास ही सेलुलर सक्रियण और पृष्ठभूमि शोर में जुड़े वृद्धि को कम करने के लिए सिफारिश की है।
      2. phagocytosis परख के लिए एक ट्यूब (FITC नियंत्रण: परख नियंत्रण के लिए तीन ट्यूबों लेबल blac के साथ इस ट्यूब लेबलकश्मीर स्याही और एक "एफ"), ओ गतिविधि परख के लिए एक ट्यूब (वह नियंत्रण: लाल स्याही और एक "एच"), और नकारात्मक नियंत्रण के लिए एक ट्यूब (रक्त के साथ इस ट्यूब लेबल केवल: हरे रंग की स्याही के साथ इस ट्यूब लेबल और "रक्त केवल")।
    2. कम से कम परख के दिन से पहले एक दिन शेयर समाधान तैयार करें।
      1. बाँझ फॉस्फेट बफर खारा (पीबीएस) तैयार करें। 18.2 MΩ एच 2 ओ के 900 मिलीलीटर के साथ 10x पीबीएस के 100 मिलीलीटर पतला फिल्टर एक 0.2 माइक्रोन फिल्टर के साथ बाँझ। उपयोग करें जब तक 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर।
      2. बाँझ पीबीएस ग्लूकोज तैयार करें। पीबीएस की 100 मिलीलीटर में ग्लूकोज की 1.0 ग्राम भंग। फिल्टर एक 0.2 माइक्रोन फिल्टर के साथ बाँझ। उपयोग करें जब तक 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर।
      3. बाँझ 0.1 एम साइट्रेट बफर तैयार करें। साइट्रिक एसिड का 1.2 जी और 18.2 MΩ एच 2 ओ की 100 मिलीलीटर में सोडियम साइट्रेट की 1.1 ग्राम भंग 4.0 पीएच को समायोजित करें। फिल्टर एक 0.2 माइक्रोन फिल्टर के साथ बाँझ। उपयोग करें जब तक 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर।
      4. वह शेयर समाधान तैयार है। आरesuspend (DMSO) डाइमिथाइल sulfoxide के 1.0 मिलीलीटर में महामहिम के 1.0 मिग्रा। -20 डिग्री सेल्सियस उपयोग करें जब तक मिश्रण धीरे, विभाज्य, और दुकान।
      5. FITC लेबल स्ताफ्य्लोकोच्चुस (एस ऑरियस) शेयर समाधान (2 एक्स 10 9 कणों / एमएल) तैयार करें। FITC लेबल एस के Resuspend 10 मिलीग्राम पीबीएस के 1.5 मिलीलीटर (या उचित मात्रा) में ऑरियस। निर्माता की सिफारिश के अनुसार तीन 500 μl aliquots और sonicate में विभाजित करते हैं। अशेष और -20 डिग्री सेल्सियस उपयोग करें जब तक दुकान।
      6. लेबल हटाया गया एस तैयार ऑरियस शेयर समाधान (2 एक्स 10 9 कणों / एमएल)। लेबल हटाया गया एस के 100 मिलीग्राम Resuspend पीबीएस के 15 मिलीलीटर (या उचित मात्रा) में ऑरियस। निर्माता की सिफारिश के अनुसार तीस 500 μl aliquots और sonicate में विभाजित करते हैं। अशेष और -20 डिग्री सेल्सियस उपयोग करें जब तक दुकान।
    3. परख के दिन पर ताजा काम कर समाधान तैयार करें।
      1. वह काम कर समाधान तैयार है। के 10 μl स्थानांतरणपीबीएस ग्लूकोज के 990 μl, thawed वह शेयर समाधान। प्रकाश से बचाने और उपयोग करें जब तक बर्फ पर रहते हैं।
      2. FITC लेबल एस तैयार ऑरियस काम कर समाधान (133333 कणों / μl)। स्थानांतरण 70 Thawed FITC लेबल एस के μl पीबीएस के 980 μl के लिए ऑरियस शेयर समाधान। प्रकाश से बचाने और उपयोग करें जब तक बर्फ पर रहते हैं।
      3. लेबल हटाया गया एस तैयार ऑरियस काम कर समाधान (133333 कणों / μl)। स्थानांतरण 70 thawed लेबल हटाया गया एस के μl पीबीएस के 980 μl के लिए ऑरियस शेयर समाधान। प्रकाश से बचाने और उपयोग करें जब तक बर्फ पर रहते हैं।
      4. बुझाना समाधान तैयार है। बाँझ 0.1 एम साइट्रेट बफर के 11.25 मिलीलीटर 0.4% trypan नीले समाधान के 750 μl जोड़ें। एक बर्फ नहाने के पानी में उपयोग करें जब तक रखें।
    4. एक प्रमाणित phlebotomist रक्त ड्राइंग के लिए विश्व स्वास्थ्य संगठन के दिशा निर्देशों के अनुसार रक्त आकर्षित किया है।
      1. एक 4 मिलीलीटर रक्त संग्रह युक्त कश्मीर 2 EDTA ट्यूब में रक्त ड्रा। मेंहरा रंग रक्त संग्रह ट्यूब निर्माता के निर्देशों के अनुसार। उपयोग करें जब तक एक बेंच शीर्ष घुमाव पर कमरे के तापमान पर रक्त संग्रह ट्यूब रखें। पूर्ण रक्त गणना (सीबीसी) चरण 1.2.1 में वर्णित सफेद रक्त कोशिका (WBC) अंतर विश्लेषण के साथ के लिए इस खून का प्रयोग करें।
      2. लिथियम हेपरिन युक्त एक 4 मिलीलीटर रक्त संग्रह ट्यूब में रक्त ड्रा। निर्माता के निर्देशों के अनुसार उलटें रक्त संग्रह ट्यूब। उपयोग करें जब तक एक बेंच शीर्ष घुमाव पर आरटी पर रक्त संग्रह ट्यूब रखें। चरण 2 में वर्णित monocyte और granulocyte phagocytosis और ओबी गतिविधि परख के लिए इस खून का प्रयोग करें।
  2. बैक्टीरिया की मात्रा (यानी, एस ऑरियस) के लिए प्रत्येक नमूने के लिए परख पूरा करने के लिए आवश्यक हो जाएगा का निर्धारण करते हैं।
    1. निर्माता के निर्देशों के रूप में वर्णित रक्त पर WBC अंतर विश्लेषण के साथ एक सीबीसी प्रदर्शन करने के लिए एक रुधिर विश्लेषक का उपयोग करें। WBC गिनती का एक नोट (कोशिकाओं में / एमएल),% न्युट्रोफिल, और% बनाओMonocyte मूल्यों।
    2. प्रत्येक नमूना के लिए न्यूट्रोफिल और monocyte मायने रखता है निर्धारित करने के लिए नीचे दिए गए समीकरणों का प्रयोग करें।
      न्युट्रोफिल गिनती (कोशिकाओं में / एमएल) =% न्युट्रोफिल × WBC (कोशिकाओं / एमएल में)
      Monocyte गिनती (कोशिकाओं / एमएल में) = × WBC% Monocyte (कोशिकाओं / एमएल में)
    3. प्रत्येक नमूना के लिए भक्षककोशिकीय गिनती और नमूने के 100 μl में मौजूद फ़ैगोसाइट की संख्या निर्धारित करने के लिए नीचे दिए गए समीकरणों का प्रयोग करें।
      भक्षककोशिकीय गिनती (कोशिकाओं / एमएल) में न्युट्रोफिल गिनती (कोशिकाओं / एमएल में) + Monocyte गिनती (कोशिकाओं / एमएल में) =
      100 μl = में फ़ैगोसाइट की संख्या (भक्षककोशिकीय गिनती (कोशिकाओं में / एमएल)) / 10
    4. बैक्टीरिया (यानी, एस ऑरियस) प्रत्येक नमूने के लिए की जरूरत की संख्या और FITC लेबल एस की राशि का निर्धारण करने के लिए नीचे दिए गए समीकरण का उपयोग ऑरियस या लेबल हटाया गया एस ऑरियस काम कर समाधान (133333 कणों / एमएल) के लिए प्रत्येक ट्यूब में जोड़ा जाना चाहिए।
      नोट: लक्ष्य बैक्टीरिया: भक्षककोशिकीय अनुपात 8: 1 है।
      जीवाणुओं की संख्या जरूरत =फ़ैगोसाइट की संख्या 100 μl × 8 में
      FITC या लेबल हटाया गया काम समाधान की जरूरत है (μl में) की मात्रा = (जरूरत जीवाणुओं की संख्या) / (133333 कणों / μl)

2. परख प्रदर्शन

  1. परख के लिए पूरे रक्त तैयार करें।
    1. प्रत्येक प्रतिभागी और नियंत्रण ट्यूब के लिए, एक उचित लेबल 12 x 75 मिमी ट्यूब के नीचे करने के लिए लिथियम हेपरिन रक्त संग्रह ट्यूब से पूरे रक्त के 100 μl हस्तांतरण करने के लिए एक विस्तारित लंबाई विंदुक टिप का उपयोग करें। टोपी की जगह।
      नोट: 12 x 75 मिमी ट्यूबों के किनारों पर खून हो रहा से बचने के लिए सावधान रहें।
    2. वह काम कर रहा नलियों लाल स्याही और वह नियंत्रण ट्यूब सहित एक "एच", के साथ लेबल करने के लिए समाधान के 10 μl जोड़ने के लिए एक micropipette का प्रयोग करें। कैप और भंवर संक्षेप में बदलें।
    3. 15 मिनट के लिए एक 37 डिग्री सेल्सियस पानी के स्नान में सभी ट्यूबों को सेते हैं। फिर, तुरंत 12 मिनट के लिए एक बर्फ के पानी से स्नान करने के लिए सभी ट्यूबों हस्तांतरण।
      नोट: एक खुला धातु रैक का उपयोग करेंऔर धीरे रैक हर 5 मिनट हिला सुनिश्चित करने के लिए कि ट्यूब जल्दी और पर्याप्त रूप से गर्म या ठंडा कर रहे हैं।
  2. बैक्टीरिया (यानी, एस ऑरियस) नमूना और नियंत्रण ट्यूबों में जोड़े।
    1. लेबल हटाया गया एस के (चरण 1.2.4 में गणना) उचित मात्रा में जोड़ने के लिए एक micropipette का प्रयोग करें नलियों लाल स्याही और वह नियंत्रण ट्यूब सहित एक "एच", के साथ लेबल के लिए ऑरियस काम समाधान। कैप और भंवर संक्षेप में बदलें।
    2. FITC लेबल एस के (चरण 1.2.4 में गणना) उचित मात्रा में जोड़ने के लिए एक micropipette का प्रयोग करें नलियों काली स्याही और एक "एफ" FITC नियंत्रण ट्यूब सहित, के साथ लेबल के लिए ऑरियस काम समाधान। कैप और भंवर संक्षेप में बदलें।
    3. भंवर "रक्त केवल" नियंत्रण ट्यूब, लेकिन यह करने के लिए बैक्टीरिया के किसी भी प्रकार (यानी, एस ऑरियस) जोड़ नहीं है।
    4. 20 मिनट के लिए एक 37 डिग्री सेल्सियस पानी के स्नान में सभी ट्यूबों को सेते हैं। एक खुला धातु रैक का उपयोग करें और धीरे रैक हर 5 मिनट हिलायह सुनिश्चित करने के लिए कि ट्यूब जल्दी और पर्याप्त रूप से गरम कर रहे हैं। ऊष्मायन अवधि के बाद, तुरंत 1 मिनट के लिए एक बर्फ के पानी से स्नान करने के लिए सभी ट्यूबों हस्तांतरण।
  3. कोशिकाओं को धो लें।
    1. सभी ट्यूबों को ठंडा बुझाना समाधान के 100 μl जोड़ने के लिए एक पुनरावर्तक पिपेट का प्रयोग करें। टोपियां, भंवर संक्षिप्त बदलें, और उसके बाद 1 मिनट के लिए बर्फ पर सभी ट्यूबों सेते हैं।
    2. सभी ट्यूबों को ठंडा पीबीएस के 1 मिलीलीटर जोड़ने के लिए एक पुनरावर्तक पिपेट का प्रयोग करें। भंवर संक्षेप में, और उसके बाद सभी ट्यूबों के लिए ठंडा पीबीएस के एक अतिरिक्त 2 मिलीलीटर जोड़ने और टोपी की जगह। अपकेंद्रित्र 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट और 270 XG, और उसके बाद के लिए सभी ट्यूबों सतह पर तैरनेवाला aspirate।
    3. दोहराएँ चरण 2.3.2 एक बार (2 washes की कुल)।
  4. से फ्लो के लिए नमूने तैयार करें।
    1. सभी ट्यूबों को ठंडा भ्रूण गोजातीय सीरम के 50 μl जोड़ने के लिए एक पुनरावर्तक पिपेट का प्रयोग करें। संक्षेप में सभी ट्यूबों भंवर।
    2. एक उचित हिंडोला करने के लिए सभी ट्यूबों स्थानांतरण और लाल रक्त सेल के साथ एक स्वचालित सेल lyse तैयारी कार्य केंद्र का उपयोगएल (आरबीसी) lysing और WBC लाल रक्त कोशिकाओं lyse और निर्माता के निर्देशों के रूप में वर्णित WBCs ठीक करने के लिए अभिकर्मकों फिक्सिंग।
    3. स्वचालित सेल lyse तैयारी वर्कस्टेशन रन पूरा कर लिया है के बाद, जब तक प्रवाह cytometry विश्लेषण किया जा सकता है एक 4 डिग्री सेल्सियस फ्रिज में एल्यूमीनियम पन्नी और दुकान में ट्यूबों लपेटो।

3. फ्लो का अधिग्रहण

  1. सेटअप से फ्लो प्रणाली।
    1. के रूप में उपयोगकर्ता निर्माता द्वारा प्रदान मैनुअल में निर्देशित प्रणाली प्रवाह cytometry गर्म। फिर, अभिकर्मक और अपशिष्ट टैंक स्तर की जांच। यदि आवश्यक हो, अभिकर्मक टैंक को भरने और / या अपशिष्ट टैंक खाली है।
    2. सिस्टम को साफ चक्र चलाने के लिए "स्वच्छ कक्ष" सुविधा का उपयोग करें। फिर, संरेखण और fluidics सत्यापन fluorospheres चलाने के लिए, और सुनिश्चित करें कि प्रत्येक डिटेक्टर के लिए बदलाव के आधे-चोटी का गुणांक (HPCV) गुणवत्ता नियंत्रण में वर्णित पूर्वनिर्धारित सीमा के भीतर है (क्यूसी) प्रोटोकॉल निर्माण द्वारा प्रदान कीआर।
  2. परख-विशिष्ट अधिग्रहण और साधन की स्थापना प्रोटोकॉल बनाएँ।
    1. phagocytosis और ओबी गतिविधि assays के लिए परख-विशिष्ट अधिग्रहण प्रोटोकॉल बनाएँ।
      नोट: अधिग्रहण यहाँ वर्णित प्रोटोकॉल कोशिकामापी एक नीले रंग की लेजर (488 एनएम) के साथ किसी भी प्रवाह पर उपयोग के लिए अनुकूलित किया जा सकता, FITC के लिए एक फिल्टर (530/30), और वह के लिए एक फिल्टर (575/26)।
      1. प्रणाली अधिग्रहण सॉफ्टवेयर प्रवाह cytometry खोलें और एक "नया प्रोटोकॉल" पैदा करते हैं।
      2. phagocytosis परख (FITC) और ओबी गतिविधि परख के लिए "FL2 पैरामीटर" (वह) के लिए "FL1 पैरामीटर" का चयन करें।
      3. भूखंडों बनाएँ (यानी, आगे तितर बितर [एफएससी] बनाम ओर तितर बितर [एसएससी] डॉट साजिश, FL1 हिस्टोग्राम, FL2 हिस्टोग्राम) के अधिग्रहण के लिए जरूरी है।
      4. WBC (श्वेत रक्त कोशिकाओं) के लिए बहुभुज क्षेत्रों बनाएं, FSC बनाम एसएससी भूखंड पर granulocyte और monocyte आबादी और FL1 और FL2 histograms पर रेखीय क्षेत्रों पैदा करते हैं। सेट एक & #34; बंद करो WBC गेट के लिए 50,000 घटनाओं की गणना "।
      5. परख-साथ विशिष्ट नाम प्रोटोकॉल बचाओ।
    2. phagocytosis और ओबी गतिविधि assays के लिए परख-विशिष्ट साधन स्थापना प्रोटोकॉल बनाएँ।
      1. खींचें और प्रणाली अधिग्रहण सॉफ्टवेयर प्रवाह cytometry पर "अधिग्रहण प्रबंधक" के लिए "संसाधन एक्सप्लोरर" से "परख-विशिष्ट अधिग्रहण प्रोटोकॉल" (चरण 3.2.1 में परिभाषित) ड्रॉप।
        नोट: इस तरह से जोड़ा जानकारी हमेशा worklist के अंत में दिखाई देगा।
      2. worklist में नमूना जानकारी दर्ज करें, और worklist बचाने के लिए।
      3. 4 डिग्री सेल्सियस रेफ्रिजरेटर से नियंत्रण नमूना ट्यूबों निकालें और उन्हें 15 मिनट के लिए कमरे के तापमान को संतुलित करने के लिए अनुमति देते हैं। फिर, संक्षेप में प्रत्येक नियंत्रण नमूना ट्यूब भंवर।
      4. (यानी, रक्त केवल) और सकारात्मक नियंत्रण नकारात्मक नियंत्रण नमूना चलाने के लिए "परख-विशिष्ट अधिग्रहण प्रोटोकॉल" चरण 3.2.1 में परिभाषित का प्रयोग करेंनमूने (यानी, वह नियंत्रण, FITC नियंत्रण) से फ्लो प्रणाली के माध्यम से। histograms की समीक्षा करें और जरूरत के रूप में photomultiplier ट्यूब (पीएमटी) FITC और phycoerythrin (पीई) चैनलों के voltages समायोजित करें।
      5. नियंत्रण नमूने भंवर और worklist पर आदेश के अनुसार प्रणाली हिंडोला प्रवाह cytometry के लिए उन्हें स्थानांतरित। फिर, नमूना कक्ष में हिंडोला जगह और नियंत्रण के नमूने के लिए डेटा प्राप्त करने के लिए कोशिकामापी टूलबार "प्रारंभ" बटन पर क्लिक करें। "XXX प्रो सेटिंग" सेटिंग प्रोटोकॉल बचाओ।
  3. से फ्लो सिस्टम पर अध्ययन के नमूने मोल।
    1. 4 डिग्री सेल्सियस रेफ्रिजरेटर से अध्ययन नमूना ट्यूबों निकालें और 15 मिनट के लिए कमरे के तापमान को संतुलित करने के लिए अनुमति देते हैं।
    2. नमूने equilibrating कर रहे हैं, एक परियोजना worklist बनाने के लिए worklist अंतरिक्ष के लिए पूर्वनिर्धारित अध्ययन विशेष अधिग्रहण प्रोटोकॉल खींचें।
    3. पुष्टि करें कि "सेटिंग प्रोटोकॉल" & से जुड़ा हुआ है# 34;। परख-विशिष्ट सेटिंग प्रोटोकॉल "चरण 3.2.2 में परिभाषित फिर, पहचान की जानकारी दर्ज करें (जैसे, अध्ययन नाम, नंबर, यात्रा नंबर, विषय आईडी आकर्षित) काम की सूची में प्रत्येक ट्यूब के लिए।
    4. और 15 मिनट संतुलन अवधि, भंवर अध्ययन के नमूनों के बाद worklist पर आदेश के अनुसार प्रणाली हिंडोला प्रवाह cytometry के लिए उन्हें स्थानांतरित। फिर, नमूना कक्ष में हिंडोला जगह है और अध्ययन के नमूने के लिए डेटा प्राप्त करने के लिए कोशिकामापी टूलबार "प्रारंभ" बटन पर क्लिक करें।
    5. आरबीसी सेल दक्षता और WBC सेल उपसमूह वितरण, अनुपात, पूर्ण मायने रखता है, और प्रतिदीप्ति तीव्रता प्रत्येक नमूने की रिपोर्ट पैनल पर निरीक्षण करके डेटा की गुणवत्ता की समीक्षा करें।
      नोट: डेटा गुणवत्ता स्वीकार्य अगर इन सभी मानदंडों से उनकी पूर्वनिर्धारित सीमा के भीतर हैं माना जाता है। सभी मानदंडों को पूरा नहीं कर रहे हैं, तो नमूना फिर से प्रोसेस किया जाना चाहिए।
    6. स्वच्छ और से फ्लो सिस्टम को बंद। स्टोर से फ्लोदो अलग अलग कंप्यूटर ड्राइव पर डेटा आकस्मिक डेटा हानि को रोकने के लिए।

4. डेटा विश्लेषण

  1. phagocytosis विश्लेषण करते हैं।
    1. एक ही फ़ोल्डर में phagocytosis (यानी, एफ-लेबल) नमूना और नियंत्रण सूची मोड डेटा (LMD) डेटा फ़ाइलों के सभी मजबूत। फिर, विश्लेषण सॉफ्टवेयर प्रवाह cytometry खोलने के लिए और नमूना अंतरिक्ष में फ़ाइलों को खींचें।
    2. WBC, कणांकुर, Monocyte, और लिम्फोसाइट फाटक सेट करें।
      1. "FITC नियंत्रण नमूने" के किसी भी खोलने के लिए फ़ाइल नाम पर डबल क्लिक करें। एक्स अक्ष स्थापित करने के लिए ड्रॉप-डाउन मेनू का उपयोग करें "एफएससी" और "रैखिक" और वाई अक्ष के लिए "एसएससी" और "रैखिक" करने के लिए।
      2. कुल WBC आबादी का एक गेट तैयार करने के लिए "बहुभुज गेट चयनकर्ता" का प्रयोग करें।
        नोट: चार्ट के किनारों पर कोशिकाओं के सभी शामिल करने के लिए सुनिश्चित करें। इस गेट "WBC" लेबल।
      3. "नए WBC गेट 'पर डबल क्लिक करें और ड्रॉप का उपयोगमेनू एक्स अक्ष के लिए "एफएससी" और "रैखिक" और वाई अक्ष के लिए "एसएससी" और "रैखिक" सेट करने के लिए नीचे।
      4. "बहुभुज गेट चयनकर्ता" "कणांकुर गेट" और Monocyte गेट सेट ", और फिर उपयोग करें" अण्डाकार गेट चयनकर्ता लिम्फोसाइट गेट "स्थापित करने के लिए" करने के लिए उपयोग करें "। तदनुसार प्रत्येक गेट लेबल। खींचें" गेट डेटा (%) "तरफ से इतना है कि कोशिकाओं को आसानी से देखा जाता है।
    3. "Phagocytosis सकारात्मक गेट" और granulocyte और monocyte आबादी के लिए "Phagocytosis नकारात्मक गेट" सेट।
      1. "FITC नियंत्रण नमूना" चरण 4.1.2.1 में इस्तेमाल पर डबल क्लिक करें। फिर, "कणांकुर गेट 'पर क्लिक करें और एक्स अक्ष के लिए" FL1 "और" लॉग "और वाई अक्ष के लिए" एसएससी "और" रैखिक "सेट करने के लिए ड्रॉप-डाउन मेनू का उपयोग करें।
      2. एक "Phagocytosis नकारात्मक गेट" और एक "Phagocytosis मंज़ूर स्थापित करने के लिए" वर्ग गेट चयनकर्ता "का प्रयोग करेंIve गेट "।
        नोट: चूंकि FITC नियंत्रण नमूने जीवाणु (यानी, एस ऑरियस) उत्तेजनाओं प्राप्त नहीं किया था, कोशिकाओं के सभी सैद्धांतिक रूप से phagocytosis नकारात्मक होना चाहिए। विवेक का प्रयोग करें जब इन आबादी के लिए सीमाओं की स्थापना।
      3. दोहराएँ चरण 4.1.3.1 और monocyte आबादी के लिए कदम 4.1.3.2।
    4. "WBC का%", "प्रतिदीप्ति तीव्रता", और granulocyte और monocyte आबादी के लिए "% phagocytosis सकारात्मक कोशिकाओं" के लिए आँकड़े जोड़ें।
      1. "FITC नियंत्रण नमूना" चरण 4.1.2.1 में इस्तेमाल पर क्लिक करें। "कणांकुर गेट" हाइलाइट करें, और उसके बाद "कार्यस्थान" पर क्लिक करें और "आँकड़ा जोड़ें"। हाइलाइट "ज्यामितीय मतलब है" और "FL1 लॉग" और "जोड़ें" पर क्लिक करें। तो फिर "माता-पिता की आवृत्ति" आँकड़ों को चुना और "जोड़ें" पर क्लिक करें।
        नोट: इस पूरे granulocyte जनसंख्या के प्रतिदीप्ति तीव्रता (ज्यामितीय मतलब है) दे देंगे औरWBC (माता-पिता) है कि granulocytes की प्रतिशतता।
      2. "FITC नियंत्रण नमूना" चरण 4.1.2.1 में इस्तेमाल पर क्लिक करें। granulocyte आबादी का "Phagocytosis सकारात्मक गेट" हाइलाइट करें, और उसके बाद "कार्यस्थान" पर क्लिक करें और "आँकड़ा जोड़ें"। हाइलाइट "ज्यामितीय मतलब है" और "FL1 लॉग" और "जोड़ें" पर क्लिक करें। तो फिर "माता-पिता की आवृत्ति" आंकड़ा चुनते हैं और "जोड़ें" पर क्लिक करें।
        नोट: इस phagocytosis सकारात्मक granulocytes के प्रतिदीप्ति तीव्रता (ज्यामितीय मतलब है) और granulocytes (माता-पिता) है कि phagocytosis सकारात्मक रहे हैं का प्रतिशत दे देंगे।
      3. दोहराएँ चरण 4.1.4.1 और monocyte आबादी के लिए कदम 4.1.4.2।
      4. "FITC नियंत्रण नमूना" चरण 4.1.2.1 में इस्तेमाल पर क्लिक करें। "लिम्फोसाइट गेट" उजागर, और फिर "कार्यस्थान" पर क्लिक करें और "आँकड़ा जोड़ें"। "माता-पिता की आवृत्ति" आँकड़ों पर प्रकाश डाला और "जोड़ें" पर क्लिक करें।
        नोट: यहWBC (माता-पिता) है कि लिम्फोसाइट का प्रतिशत दे देंगे।
      5. फाटक और आँकड़े FITC नियंत्रण कदम 4.1.2.1 में इस्तेमाल नमूना में बनाया के सभी हाइलाइट करें। स्क्रीन के शीर्ष पर "समूह" पैनल में में "सभी नमूनों" उन्हें खींचें।
        नोट: इस अध्ययन के नमूने के सभी के लिए इन सेटिंग्स लागू होगी।
      6. बचाने के लिए और एक ही फ़ोल्डर कि LMD फ़ोल्डर में एक .wsp फ़ाइल के रूप में नाम काम करते हैं।
    5. व्यक्तिगत नमूना फाटकों को समायोजित करें।
      1. "पहला नमूना" डेटा सेट में पर क्लिक करें और पुष्टि करें कि WBC गेट उचित रूप से स्क्रीन पर सेल वितरण फिट बैठता है। यदि यह नहीं क्लिक करें और खींचें करता गेट के किनारों कि नमूने के लिए गेट समायोजित करें। (यानी, "˃") अगले नमूना के लिए अग्रिम "सही तीर" पर क्लिक करें। इस चरण को दोहराएँ जब तक सभी नमूनों की समीक्षा की गई।
      2. डेटा सेट में पहला नमूना के लिए "WBC गेट 'पर क्लिक करें और इस बात की पुष्टि" ग्रैन किulocyte गेट "," Monocyte गेट ", और" लिम्फोसाइट गेट "(यानी," ˃ ") अगले नमूना के लिए अग्रिम के लिए" प्रत्येक नमूना उचित रूप से स्क्रीन पर सेल वितरण फिट बैठते हैं। जरूरत के रूप में समायोजित करें। पर क्लिक करें "सही तीर ।
      3. दोहराएँ चरण 4.1.5.2 सभी नमूनों तक समीक्षा की गई है। फिर, "सहेजें" पर क्लिक करें।
    6. एक इलेक्ट्रॉनिक स्प्रेडशीट प्रोग्राम में डेटा प्रदर्शित करें।
      1. स्क्रीन के शीर्ष पर "तालिका संपादक" आइकन पर क्लिक करें। अंतिम स्प्रेडशीट पर नमूने तारीख शामिल करने के लिए "संपादित करें", "कीवर्ड", और "$ तिथि" पर क्लिक करें। फिर, अंतिम स्प्रेडशीट पर नमूना पहचान शामिल करने के लिए "संपादित करें", "कीवर्ड", और "@ SAMPLEID1" पर क्लिक करें। के लिए "@ SAMPLEID2", "@ SAMPLEID3", और "@ SAMPLEID4" दोहराएँ।
      2. "तालिका संपादक" स्क्रीन और "नमूना" स्क्रीन तो वे दोनों कंप्यूटर स्क्रीन पर देखी जा सकती है समायोजित करें। Seleसीटी नमूना पत्रक पर किसी भी "नमूना"। फिर, "टेबल संपादक" के लिए ब्याज की प्रत्येक आंकड़ा खींचें।
        1. "तालिका संपादक" के लिए "फ्रीक। जनक की" "कणांकुर गेट" के अंतर्गत सूचीबद्ध आंकड़ा खींचें। प्रकार "Granulocytes रूप% WBC" "तालिका संपादक" का "नाम" स्तंभ के अंतर्गत।
        2. "तालिका संपादक" के लिए "ज्यामितीय मतलब" "कणांकुर गेट" के अंतर्गत सूचीबद्ध आंकड़ा खींचें। टाइप करें "ज्यामितीय मतलब प्रतिदीप्ति, Granulocytes" "तालिका संपादक" का "नाम" स्तंभ के अंतर्गत।
        3. "तालिका संपादक" के लिए "फ्रीक। जनक की" "कणांकुर / Phagocytosis सकारात्मक गेट" के अंतर्गत सूचीबद्ध आंकड़ा खींचें। प्रकार "% Phagocytosis सकारात्मक Granulocytes" "तालिका संपादक" का "नाम" स्तंभ के अंतर्गत।
        4. "ज्यामितीय मतलब" "कणांकुर / Phagocytosis सकारात्मक गेट" के अंतर्गत सूचीबद्ध आंकड़ा खींचें वेंई "तालिका संपादक"। टाइप करें "ज्यामितीय मतलब प्रतिदीप्ति, phagocytosis सकारात्मक Granulocytes" "तालिका संपादक" का "नाम" स्तंभ के अंतर्गत।
        5. "तालिका संपादक" के लिए "फ्रीक। जनक की" "Monocyte गेट" के अंतर्गत सूचीबद्ध आंकड़ा खींचें। प्रकार "Monocytes रूप% WBC" "तालिका संपादक" का "नाम" स्तंभ के अंतर्गत।
        6. "तालिका संपादक" के लिए "ज्यामितीय मतलब" "Monocyte गेट" के अंतर्गत सूचीबद्ध आंकड़ा खींचें। टाइप करें "ज्यामितीय मतलब प्रतिदीप्ति, monocytes" "तालिका संपादक" का "नाम" स्तंभ के अंतर्गत।
        7. "तालिका संपादक" के लिए "फ्रीक। जनक की" "Monocyte / Phagocytosis सकारात्मक गेट" के अंतर्गत सूचीबद्ध आंकड़ा खींचें। "तालिका संपादक" का "नाम" स्तंभ के अंतर्गत "% Phagocytosis सकारात्मक Monocytes" टाइप करें।
        8. खींचें "ज्यामितीय मतलब" "Monocyte / Phagocy के तहत सूचीबद्ध आंकड़ाटेबल संपादक "के लिए" tosis सकारात्मक गेट "। टाइप करें" ज्यामितीय मतलब प्रतिदीप्ति, phagocytosis सकारात्मक Monocytes टेबल संपादक "नाम" का कॉलम "" के तहत "।
        9. "तालिका संपादक" के लिए "फ्रीक। जनक की" "लिम्फोसाइट गेट" के अंतर्गत सूचीबद्ध आंकड़ा खींचें। प्रकार "लिम्फोसाइटों के रूप% WBC" "तालिका संपादक" का "नाम" स्तंभ के अंतर्गत।
      3. खींचें और मापदंडों "तालिका संपादक" में दिखाई ड्रॉप जब तक वे वरीय क्रम में व्यवस्थित कर रहे हैं।
      4. "सहेजें" पर क्लिक करें। फिर, "टेबल बनाएं" एक स्प्रेडशीट स्वरूप में डेटा प्रदर्शित करने के लिए क्लिक करें। पर क्लिक करें बचाने के लिए और .xlsx फ़ाइल के रूप में काम करने के लिए नाम "के रूप में बचाने के लिए"।
  2. ओबी गतिविधि परख के लिए दोहराएँ चरण 4.1 (यानी, एच-लेबल) नमूने और LMD डेटा फ़ाइलों को नियंत्रित करते हैं।
    नोट: ओबी गतिविधि के लिए संदर्भ के साथ phagocytosis के लिए सभी संदर्भों स्थानापन्न करने के लिए सुनिश्चित करें।

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Representative Results

लंबे समय तक और गहन व्यायाम सहज प्रतिरक्षा समारोह पर गहरा प्रभाव, प्राकृतिक किलर सेल समारोह, वायरल संक्रमण के बृहतभक्षककोशिका साइटोकाइन की मध्यस्थता प्रतिक्रिया, और granulocyte और monocyte phagocytosis और ओबी गतिविधि शामिल है। कई अध्ययनों कि granulocyte और monocyte phagocytosis काफी बढ़ जाती है के बाद व्यायाम, सूजन मांसपेशियों की क्षति और चयापचय की मांग से प्रेरित दर्शाती संकेत मिलता है। इसके विपरीत, granulocyte और monocyte ओबी गतिविधि के बाद व्यायाम कम हो जाती है और संक्रमण के लिए वृद्धि की संवेदनशीलता की एक प्रतिरक्षा सूचक हो सकता है। उदाहरण के लिए, चित्रा 1 एस के उस phagocytosis चलता ऑरियस granulocytes तक 75 किलोमीटर साइकिल चालन मुक्केबाज़ी (70% वीओ 2MAX) के तुरंत बाद और 1.5 घंटे की वृद्धि हुई है, अगली सुबह तक सामान्य करने के लिए लौट रहे। Monocyte phagocytosis इसी तरह व्यायाम के इस स्तर से प्रभावित होता है। 2 से पता चलता आंकड़ा है कि granulocyte ओबी गतिविधि कमी हैकम से कम 21 घंटे की 75 किलोमीटर के बाद साइकिल चालन के लिए डी। Monocyte ओबी गतिविधि के बाद भी 75 किलोमीटर साइकिल चालन की कमी हुई है।

एस के granulocyte और monocyte phagocytosis ऑरियस, लेकिन नहीं granulocyte और monocyte ओबी गतिविधि, प्रणालीगत सूजन बायोमार्कर के लिए सहसंबद्ध होते हैं चित्रा 3 granulocyte phagocytosis और सीरम सी-रिएक्टिव प्रोटीन (सीआरपी) के स्तर (पियर्सन उत्पाद-पल सहसंबंध के बीच मामूली संबंध को दर्शाता है;। आर = 0.44, पी <0.01 ) 106 से अधिक वजन / मोटापे से ग्रस्त महिलाओं में। सीरम सीआरपी भी एस के एककेंद्रकश्वेतकोशिका phagocytosis को जोड़ा जाता है ऑरियस (पियर्सन उत्पाद-पल सहसंबंध; आर = 0.30, पी <0.01)। इसके अलावा, रक्त न्यूट्रोफिल / ल्युकोसैट मायने रखता है (पियर्सन उत्पाद-पल सहसंबंध; आर = 0.62 और आर = 0.61, क्रमशः, पी <0.001), बॉडी मास इंडेक्स (पियर्सन उत्पाद-पल सहसंबंध; आर = 0.50 और आर = 0.40 क्रमश:; पी <0.001), सीरम इंसुलिन का स्तर (आर = 0.30 और आर =0.23, पी <0.03), और रक्त एक 1 सी का स्तर (पियर्सन उत्पाद-पल सहसंबंध; आर = 0.28 और आर = 0.21, क्रमशः, पी <0.04) एस के granulocyte और monocyte phagocytosis को सहसंबद्ध होते हैं ऑरियस। सामान्य में, इन आंकड़ों से संकेत मिलता है कि उच्च granulocyte और आराम विषयों में monocyte phagocytosis प्रणालीगत सूजन का संकेत है।

आकृति 1
चित्रा 1: कणांकुर Phagocytosis तीव्र धीरज व्यायाम से प्रभावित है कणांकुर phagocytosis वीओ 2MAX के 70% से कम एक 75 किलोमीटर साइकिल चालन के दौर के बाद तुरंत और 1.5 घंटे की वृद्धि हुई है।। 21 घंटे बाद व्यायाम करके, granulocyte phagocytosis थोड़ा पूर्व अभ्यास के स्तर से नीचे करने के लिए लौट आए। * पूर्व व्यायाम से अलग इंगित करता है (बनती टी परीक्षण के बाद अनौपचारिक विश्लेषण के साथ दोहराया उपायों एनोवा, जब उचित; एन = 19; पी <0.05)। मान मेरे हैंएक ± मानक त्रुटि। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र 2

चित्रा 2:। कणांकुर ऑक्सीडेटिव फट गतिविधि तीव्र धीरज व्यायाम कणांकुर ऑक्सीडेटिव फट गतिविधि से प्रभावित है VO 2MAX के 70% से कम एक 75 किलोमीटर साइकिल चालन के दौर के बाद तुरंत कम, 1.5 घंटे की है, और 21 घंटे की। * पूर्व व्यायाम से अलग इंगित करता है (बनती टी परीक्षण के बाद अनौपचारिक विश्लेषण के साथ दोहराया उपायों एनोवा, जब उचित; एन = 19; पी <0.05)। मूल्यों मतलब ± हैं मानक त्रुटि। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

। चित्रा 3: कणांकुर Phagocytosis अधिक वजन / मोटापे से ग्रस्त महिलाओं में प्रणालीगत सूजन के साथ जोड़ा जाता है कणांकुर phagocytosis, प्रणालीगत सूजन का एक व्यापक रूप से स्वीकार बायोमार्कर (पियर्सन उत्पाद-पल सहसंबंध सीरम सी-रिएक्टिव प्रोटीन के लिए सहसंबद्ध किया गया था; एन = 87; आर = 0.44, पी <0.01)। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

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Discussion

यह पांडुलिपि granulocyte और monocyte समारोह के दो संकेतक के निर्धारण के लिए एक कदम दर कदम प्रोटोकॉल प्रदान करता है। हम कुछ कदम है कि इस परख की सफलता के लिए महत्वपूर्ण हैं की पहचान की है। ऐसा ही एक कदम बर्फ स्नान ऊष्मायन कि तुरंत बैक्टीरिया के अलावा करने से पहले होता है। सभी नमूनों की पूरी तरह से ठंडा phagocytosis और ओबी गतिविधि पर तापमान के प्रभाव को कम कर देंगे। एक और महत्वपूर्ण कदम प्रत्येक नमूने के लिए बैक्टीरिया के अलावा है। एक 8: 1 बैक्टीरिया: भक्षककोशिकीय अनुपात इष्टतम परिणाम पैदा करता है; हालांकि अन्य शोधकर्ताओं पा सकते हैं कि इस अनुपात उपयुक्त परिणाम का उत्पादन करने के लिए संशोधित करने की आवश्यकता होगी। एक और महत्वपूर्ण कदम आरबीसी lysing और WBC फिक्सिंग अभिकर्मकों के उपयोग के लाल रक्त कोशिकाओं lyse और WBCs ठीक करने के लिए है। इस तरह के अभिकर्मकों के उपयोग के लाल रक्त कोशिकाओं की पूरी सेल सुनिश्चित करता है और सुरक्षित रूप से 4 डिग्री सेल्सियस रातोंरात पर कार्रवाई नमूनों की दुकान, और फिर अगले दिन प्रवाह के माध्यम से उन्हें चलाने के लिए सक्षम बनाता है। पिछला काम (अप्रकाशित) IndicAtes कि आरबीसी lysing और WBC फिक्सिंग डेटा अखंडता समझौता किए बिना के रूप में कई के रूप में 12 घंटा से तय नमूने के प्रवाह cytometry देरी करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है।

इस प्रक्रिया को आसानी से क्षमताओं और शोधकर्ता के हितों को पूरा करने के लिए संशोधित किया जा सकता है, लेकिन यह जोर दिया जाना चाहिए कि अनुकूलन के लिए आवश्यक है जब रूपांतरों बना रहे हैं। सबसे आम रूपांतरों है कि सूचित किया गया है के कुछ लक्ष्य बैक्टीरिया, लेबल / जांच, और ऊष्मायन समय के लिए कर रहे हैं। शोधकर्ताओं ने असाधारण परिणाम का उत्पादन किया है जब कोलाई 7.8 एस के स्थान पर प्रयोग किया जाता है लक्ष्य रोगज़नक़ के रूप में ऑरियस (दोनों 8: 1 के अनुपात)। ऐसे Saccharomyces cerevisiae के रूप में एक कवक, भी ई के लिए एक विकल्प के रूप में उपयुक्त हो सकता है कोलाई। इसके अलावा, शोधकर्ताओं अक्सर एक पीएच के प्रति संवेदनशील आणविक जांच, FITC के बजाय 7,12, phagocytosis के लिए जांच के रूप में इस्तेमाल करते हैं। इसी तरह, अन्य जांच की तुलना में वह आमतौर पर ओबी गतिविधि को मापने के लिए उपयोग किया जाता है, includinजी dichlorofluorescin diacetate (डीसीएफ डीए) 10 और 123 dihydrorhodamine (डीएचआर)। 13 की सूचना दी ऊष्मायन बार 20 मिनट से 120 मिनट, McFarlin रिपोर्ट है कि अधिक से अधिक प्रतिक्रिया समय बैक्टीरियल लक्ष्य से भिन्न हो सकते हैं साथ 12,14,15 को बदलती हैं। 7 यह चाहिए यह भी कहा जा सकता है कि इष्टतम ऊष्मायन बार परख के phagocytosis और ओबी पहलुओं के बीच भिन्न हो सकते हैं। 7

सभी प्रयोगशाला assays के साथ के रूप में, समस्या निवारण आवश्यक है जब एक नए शोध में स्थापित करने में इस तकनीक की स्थापना हो सकती है। लेखकों को सलाह देने के बैक्टीरिया की है कि अनुकूलन: भक्षककोशिकीय अनुपात इस परख के लिए सफलता की कुंजी है। लेखकों को भी ध्यान दें कि एक नमूना से डेटा के विश्लेषण से खारिज किया जाना चाहिए अगर एक गैर रोगग्रस्त भागीदार से granulocyte आबादी में कोशिकाओं की तुलना में कम 80% FITC सकारात्मक रहे हैं; इस स्थिति में, नमूना फिर से एकत्र किया जा सकता है और फिर से विश्लेषण किया है, तो संभव है।

वहाँ के लिए कुछ सीमाएं हैंgranulocyte और monocyte phagocytosis और ओबी गतिविधि परख इस पांडुलिपि में वर्णित है। ऐसा ही एक सीमा FSC और एसएससी के अनन्य उपयोग के लिए ब्याज की सेल आबादी की पहचान है। कोशिका की सतह मार्कर के उपयोग शोधकर्ताओं सकारात्मक सेल आबादी की पहचान करने के लिए। 10 हालांकि, यह सुविधा के अलावा कोशिकामापी एक मूल प्रवाह से अधिक की आवश्यकता होगी की अनुमति होगी, और इस पांडुलिपि के दायरे से बाहर इस प्रकार है। इस परख की एक और सीमा यह है कि यह trypan नीले रंग की प्रभावकारिता पर निर्भर करता है कि ब्याज की जांच प्रतिरक्षा कोशिकाओं से भली भाँति नहीं किया गया है की प्रतिदीप्ति बुझाने के लिए है। एक पीएच के प्रति संवेदनशील आणविक जांच 7,12 स्थितियों में, जहां internalization एक चिंता का विषय है में FITC के लिए एक विकल्प के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है। चूंकि इस तरह के एक मामले की जांच में इस तरह के endocytic पुटिकाओं में उन लोगों के रूप में अम्लीय वातावरण में केवल फ्लोरोसेंट है, का अधिग्रहण प्रतिदीप्ति भाँति कणों ही प्रतिनिधित्व करता है। इसके अलावा, कई शोधकर्ताओं वर्तमान परख की आलोचना की है क्योंकि यह करनातों नमूने है कि आधारभूत प्रतिरक्षा सेल गतिविधि को नियंत्रित करने के लिए बर्फ के पानी के बजाय 37 डिग्री सेल्सियस पर incubated का एक समानांतर सेट शामिल नहीं है। कई अवसरों पर, हम इस "बर्फ हालत" जब granulocyte और monocyte phagocytosis और ओबी गतिविधि परख प्रदर्शन शामिल है, और पाया कि यह काफी डेटा (अप्रकाशित) की गुणवत्ता में सुधार नहीं करता है।

सारांश में, इस पांडुलिपि granulocytes और monocytes में phagocytosis और ओबी गतिविधि को मापने के लिए एक तकनीक का वर्णन है। यह एक सरल, सीधा परख है कि आसानी से प्रयोगशाला क्षमताओं और अनुसंधान के हितों के लिए खाते में संशोधित किया जा सकता है। व्यायाम विज्ञान और मोटापे से संबंधित अनुसंधान में, सहज प्रतिरक्षा समारोह के इस उपाय अन्वेषक वजन घटाने, पूरक के उपयोग, आहार हस्तक्षेप, और अन्य जीवन शैली में परिवर्तन सहित कई संभावित countermeasures, के प्रभाव का पता लगाने के लिए अनुमति देगा। पर इस तकनीक के माहिर, शोधकर्ताओं तीव्र निगरानी करने में सक्षम हो जाएगाआहार, व्यायाम, और कई अन्य उत्तेजनाओं के जवाब में प्रतिरक्षा सेल समारोह में और पुरानी बदल जाता है।

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Acknowledgments

लेखक इस प्रक्रिया के अनुकूलन के दौरान उनकी सहायता के लिए जैक Shue, केसी जॉन, और लिन Cialdella-Kam स्वीकार करना चाहते हैं।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
12 x 75 mm tubes, with cap VWR 20170-579 You will need 2 tubes per sample ("H" and "F") plus 3 tubes per batch (for assay controls; "F", "H", and "Blood only").
PBS (10x), pH 7.4 Life Technologies 70011-044
Bottle top 0.2 µm cellulose acetate filter (500 ml capacity) Fisher Scientific 09-741-07 
Glucose, powder Life Technologies 15023-021
Citric acid (anhydrous, cell culture tested, plant cell culture tested) Sigma-Aldrich C2404-100G
Sodium citrate tribasic dihydrate Sigma-Aldrich S4641-25G
Dihydroethidium (Hydroethidine) (HE) Life Technologies D11347
Dimethyl sulfoxide (DMSO) Anhydrous Life Technologies D12345
Staphylococcus aureus (Wood strain without protein A) BioParticles, fluorescein conjugate (FITC) Life Technologies S2851
Staphylococcus aureus (Wood strain without protein A) BioParticles, unlabeled Life Technologies S-2859
Trypan Blue Solution, 0.4% Life Technologies 15250-061
4.0 ml vacutainer containing 7.2 mg K2EDTA, spray-dried VWR BD367861 You will need 1 K2EDTA blood collection tube per sample.
4.0 ml vacutainer containing 68 USP units Lithium Heparin, spray-coated VWR BD367884 You will need 1 Lithium Heparin blood collection tube per sample.
COULTER Ac·T 5diff CP Beckman Coulter 6605705 i.e., hematology analyzer
COULTER Ac·T 5diff Rinse Beckman Coulter 8547167
COULTER Ac·T 5diff Fix Beckman Coulter 8547171
COULTER Ac·T 5diff WBC Lyse Beckman Coulter 8547170
COULTER Ac·T 5diff Hgb Lyse Beckman Coulter 8547168
COULTER Ac·T 5diff Cal Calibrator Beckman Coulter 7547175
COULTER Ac·T 5diff Control Plus Beckman Coulter 7547198
AcT 5diff Diluent Beckman Coulter 8547169
200 µl extended-length pipette tips VWR 37001-526
Insulated ice pan VWR 89198-980 For ice water bath.
Open metal tube rack VWR 60916-702
Fetal Bovine Serum Life Technologies 26140-111
TQ-Prep Workstation Beckman Coulter 6605429 i.e., automated cell lyse preparation workstation
ImmunoPrep Reagent System Beckman Coulter 7546999 i.e., RBC lyse/WBC fix reagent system
Cytomics FC500 MCL Flow Cytometry System with CXP Software Beckman Coulter 626553
IsoFlow Sheath Fluid Beckman Coulter 8547008
COULTER CLENZ Beckman Coulter 8546929
Flow-Check Fluorospheres  Beckman Coulter 6605359 i.e., alignment and fluidics verification fluorospheres
FlowJo Software FlowJo FlowJo i.e., flow cytometry analysis software
Excel Software Microsoft Microsoft Excel i.e., electronic spreadsheet program

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References

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  2. Knab, A. M., et al. Effects of a freeze-dried juice blend powder on exercise-induced inflammation, oxidative stress, and immune function in cyclists. Appl Physiol Nutr Metab. 39, 381-385 (2014).
  3. Konrad, M., et al. The acute effect of ingesting a quercetin-based supplement on exercise-induced inflammation and immune changes in runners. Int J Sport Nutr Exerc Metab. 21, 338-346 (2011).
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  9. McFarlin, B. K., Venable, A. S., Prado, E. A., Henning, A. L., Williams, R. R. Image-based flow cytometry technique to evaluate changes in granulocyte function in vitro. J Vis Exp. , (2014).
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इम्यूनोलॉजी अंक 115 phagocytosis ऑक्सीडेटिव फट एककेंद्रकश्वेतकोशिका granulocyte सहज प्रतिरक्षा प्रवाह cytometry
मानव रक्त में मापने कणांकुर और Monocyte phagocytosis और ऑक्सीडेटिव फट गतिविधि
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Meaney, M. P., Nieman, D. C.,… More

Meaney, M. P., Nieman, D. C., Henson, D. A., Jiang, Q., Wang, F. Z. Measuring Granulocyte and Monocyte Phagocytosis and Oxidative Burst Activity in Human Blood. J. Vis. Exp. (115), e54264, doi:10.3791/54264 (2016).

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