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JoVE Journal Immunology and Infection
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Immunology and Infection

Mess Granulozyten und Monozyten Phagozytose und oxidativer Burst-Aktivität im menschlichen Blut

Published: September 12, 2016 doi: 10.3791/54264
Automatic Translation
1, 1, 2, 3, 3
1Human Performance Laboratory, North Carolina Research Campus, Appalachian State University, 2Department of Biology, Appalachian State University, 3David H. Murdock Research Institute

Introduction

Die Granulozyten und Monozyten Phagozytose / oxidativen Burst (OB) Aktivitätstest ist eine einfache, geradlinige Technik , die häufig verwendet wird , um Informationen über angeborene Immunfunktion nach längerer und intensiver Bewegung zu sammeln. 1-4 Wenn die Antwort des Immunsystems studieren ein Stimulus sind Granulozyten und Monozyten von besonderem Interesse , weil sie eine zentrale Rolle in der Wirtsabwehr und sind die ersten Immunzellen an den Ort der Infektion zu akkumulieren spielen. 5 Neutrophile, eine Art von Granulozyten, sind die ersten Zellen in beschädigten Muskel zu translozieren Gewebe nach intensiver Übung. 6 Phagozytose und OB - Aktivität sind die häufigsten Maßnahmen von Granulozyten und Monozyten - Funktion, 7 und werden als Indikatoren der angeborenen Immunzellfunktion aufgrund ihrer zentralen Rolle in sowohl der Infektion und dem Reparaturprozess bevorzugt.

Der Test in diesem Manuskript utili beschriebenzes eine Grund Durchflusszytometer eine quantitative Bestimmung von Granulozyten und Monozyten Phagozytose und OB-Aktivität in Vollblut zur Verfügung zu stellen. Die Verwendung von Vollblut in dieser Technik ist vorteilhaft, da es die Assay erlaubt ohne zeitraubende Reinigungsverfahren durchgeführt werden. Dieser Test kann leicht eine Vielzahl von Forschungsdesigns und Labor-Fähigkeiten zur Aufnahme geändert werden. B. Liao et al. Verwendeten eine ähnliche Technik , die Neutrophilen - OB - Aktivität zu zeigen , erhöht wird und neutrophile Phagozytose wird nach einer traumatischen Hirnverletzung verringert. 8 In einem anderen Beispiel, McFarlin et al. Beschrieben eine elegante Abwandlung dieser Technik , die Allophycocyanin verwendet (APC ) -konjugierte CD66b und High-Performance - Tandem - APC-konjugierten CD45 - Markierung mit bildbasierten Durchflusszytometrie Granulozyten hinsichtlich ihrer Phagozytose und OB - Aktivitäten zu klassifizieren. 7,9

Unsere Forschungsgruppe hat verschiedene Anpassungen dieser te verwendetchnique als Indikator für die angeborene Immunfunktion bei Übergewicht, fettleibig, und athletische Bevölkerung seit fast 20 Jahren. 10,11 Der Text wird den Leser bieten mit Schritt- für -Schritt - Anleitungen zur Durchführung dieses Tests und Bereiche hervorheben , dass der Leser anpassen kann die Bedürfnisse ihrer Forschung gerecht zu werden.

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Protocol

HINWEIS: Alle Blutsammelverfahren wurden in Übereinstimmung mit den Richtlinien durchgeführt von der Appalachian State University (ASU) Institutional Review Board (IRB) dargelegt.

1. Assay Vorbereitung

  1. Sammeln, vorzubereiten und zu organisieren, die Materialien für das Verfahren angegeben (siehe Tabelle spezifischer Materialien / Ausrüstung).
    1. Etikett 12 x 75 mm Rohre.
      1. Label zwei Röhren für jeden Teilnehmer: ein Rohr für die Phagozytose-Test (Label dieser Röhre mit schwarzer Tinte und ein "F" für Fluoresceinisothiocyanat [FITC]) und ein Rohr für die OB-Aktivitätstest (Label dieses Rohr mit roter Tinte und einem " H "für Dihydroethidium [HE]).
        HINWEIS: Die Verwendung von sterilen 12 x 75 mm Röhrchen sollten unbeabsichtigte zelluläre Aktivierung und damit verbundene Erhöhung der Hintergrundrauschen zu minimieren.
      2. Beschriften drei Röhren für die Assay-Kontrollen: ein Rohr für die Phagozytose-Assay (FITC-Kontrolle: mit der Kennzeichnung dieses Rohr mit schwk Tinte und ein "F"), ein Rohr für die OB-Aktivitätstest (HE Kontrolle: mit der Kennzeichnung dieses Rohr mit roter Tinte und einem "H"), und ein Rohr für die Negativkontrolle (Blut nur: dieses Rohr mit grüner Tinte beschriften und "Blut nur").
    2. Stocklösungen mindestens einen Tag vor dem Tag des Assays.
      1. Bereiten Sie die sterile phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS). Verdünne mit 100 ml 10 - fach PBS mit 900 ml von 18,2 M & Omega; H 2 O. Filter zu sterilisieren mit einem 0,2 um Filter. Lagerung bei 4 ° C bis zur Verwendung.
      2. Bereiten Sie die sterile PBS-Glucose. Man löst 1,0 g Glucose in 100 ml PBS. Filter zu sterilisieren mit einem 0,2 um Filter. Lagerung bei 4 ° C bis zur Verwendung.
      3. Bereiten Sie die sterile 0,1 M Citratpuffer. Man löst 1,2 g Zitronensäure und 1,1 g Natriumcitrat in 100 ml von 18,2 M & Omega; H 2 O. Stellen Sie den pH-Wert auf 4,0. Filter zu sterilisieren mit einem 0,2 um Filter. Lagerung bei 4 ° C bis zur Verwendung.
      4. Bereiten Sie die HE-Stammlösung. Resuspend 1,0 mg HE in 1,0 ml Dimethylsulfoxid (DMSO). Vorsichtig mischen, aliquoten, und bei -20 ° C bis zur Verwendung.
      5. Bereiten Sie die FITC-markiertem Staphylococcus aureus (S. aureus) Stammlösung (2 x 10 9 Partikel / ml). Resuspendieren von 10 mg FITC-markiertem S. aureus in 1,5 ml (oder entsprechende Menge) von PBS. Teilen Sie sich in drei 500 ul Aliquots und beschallen entsprechend den Empfehlungen des Herstellers. Aliquotieren und bei -20 ° C bis zur Verwendung.
      6. Bereiten Sie die unbeschriftete S. aureus - Stammlösung (2 × 10 9 Partikel / ml). Resuspendieren 100 mg unmarkiertem S. aureus in 15 ml (oder entsprechende Menge) von PBS. Teilen Sie sich in dreißig 500 ul Aliquots und beschallen entsprechend den Empfehlungen des Herstellers. Aliquotieren und bei -20 ° C bis zur Verwendung.
    3. Bereiten frische Arbeitslösungen am Tag des Assays.
      1. Bereiten Sie die HE-Arbeitslösung. Übertragung von 10 ulaufgetauten HE Stammlösung zu 990 ul PBS-Glucose. Vor Licht und halten auf Eis bis zum Gebrauch.
      2. Bereiten Sie die FITC-markierten S. aureus - Arbeitslösung (133.333 Partikel / ul). Transfer 70 ul aufgetauten FITC-markiertem S. aureus - Stammlösung zu 980 ul PBS. Vor Licht und halten auf Eis bis zum Gebrauch.
      3. Bereiten Sie die unbeschriftete S. aureus - Arbeitslösung (133.333 Partikel / ul). Transfer 70 ul aufgetaut unmarkierten S. aureus - Stammlösung zu 980 ul PBS. Vor Licht und halten auf Eis bis zum Gebrauch.
      4. Bereiten Sie die Quench-Lösung. In 750 & mgr; l von 0,4% Trypanblau Lösung auf 11,25 ml sterilem 0,1 M Citratpuffer. Halten Sie in einem Eis-Wasserbad bis zur Verwendung.
    4. Haben Sie einen zertifizierten phlebotomist Blut nach der World Health Organization Richtlinien für die Erstellung Blut ziehen.
      1. Zeichnen Sie Blut in ein 4 ml Blutentnahmeröhrchen mit K 2 EDTA. Imvert Blutentnahmeröhrchen nach den Anweisungen des Herstellers. Halten Sie Blutentnahmeröhrchen bei Raumtemperatur auf einem Benchtop-Rocker bis zum Gebrauch. Verwenden Sie dieses Blut für die Blutbild (CBC) mit der weißen Blutzellen (WBC) Differentialanalyse in Schritt 1.2.1 beschrieben.
      2. Zeichnen Sie Blut in ein 4 ml Blutentnahmeröhrchen mit Lithium-Heparin. Invert-Blutsammelröhrchen nach den Anweisungen des Herstellers. Halten Sie Blutentnahmeröhrchen bei RT auf einem Benchtop-Rocker bis zum Gebrauch. Verwenden Sie dieses Blut für die Monozyten- und Granulozyten Phagozytose und OB-Aktivitätstest in Schritt 2 beschrieben.
  2. Bestimmung der Menge der Bakterien (dh S. aureus) , die benötigt wird , um den Test für jede Probe zu vervollständigen.
    1. Verwenden Sie einen Hämatologieanalysator ein CBC mit WBC-Differentialanalyse auf das Blut durchzuführen, wie in den Anweisungen des Herstellers beschrieben. Notieren Sie sich die Leukozytenzahl (in Zellen / ml),% Neutrophile und%Monozyt Werte.
    2. Verwenden Sie die folgenden Gleichungen, die die Neutrophilen und Monozyten zählt für jede Probe zu bestimmen.
      Neutrophilenzahl (in Zellen / ml) =% Neutrophile × WBC (in Zellen / ml)
      Monozytenzahl (in Zellen / ml) =% Monocyten × WBC (in Zellen / ml)
    3. Verwenden Sie die folgenden Gleichungen die Phagozyten Zählung für jede Probe und die Anzahl von Phagozyten in 100 & mgr; l der Probe vorhanden zu bestimmen.
      Phagozyten Zahl (in Zellen / ml) = Neutrophilenzahl (in Zellen / ml) + Monozytenzahl (in Zellen / ml)
      Anzahl von Phagozyten in 100 & mgr; l = (Phagocyte Zahl (in Zellen / ml)) / 10
    4. Verwenden Sie die folgende Gleichung , um die Anzahl von Bakterien (dh S. aureus) für jede Probe und die Menge an FITC-markiertem S. benötigt , um zu bestimmen aureus oder unmarkiert S. aureus - Arbeitslösung (133.333 Partikel / ml) , die zu jedem Röhrchen gegeben werden sollte.
      HINWEIS: Die Zielbakterien: Phagozyten-Verhältnis 8: 1.
      Anzahl der Bakterien benötigt =Anzahl von Phagozyten in 100 & mgr; l × 8
      Volumen von FITC oder unmarkiert Arbeitslösung (in ul) benötigt = (Anzahl der Bakterien benötigt) / (133.333 Partikel / ul)

2. Führen Sie Assay

  1. Bereiten Vollblut für den Assay.
    1. Für jeden Teilnehmer und Steuerrohr, verwenden eine erweiterte Länge Pipettenspitze 100 ul Vollblut aus der Lithium-Heparin-Blutsammelröhrchen an der Unterseite eines entsprechend markierten 12 x 75 mm Rohr zu übertragen. Ersetzen Kappen.
      HINWEIS: Achten Sie darauf, auf den Seiten der 12 x 75 mm Rohre gelangen Blut zu vermeiden.
    2. Verwenden Sie einen Mikro 10 ul hinzufügen von HE zu den Rohren mit roter Tinte markiert und ein "H", einschließlich der HE Steuerrohr-Arbeitslösung. Ersetzen Kappen und Wirbel kurz.
    3. Inkubieren alle Rohre in einem 37 ° C Wasserbad für 15 min. Dann übertragen sofort alle Rohre auf einem Eis-Wasserbad für 12 min.
      HINWEIS: Verwenden Sie eine offene Metallgestellund sanft schütteln Sie das Rack alle 5 Minuten, um sicherzustellen, dass die Rohre schnell und angemessen erwärmt oder gekühlt.
  2. In Bakterien (dh S. aureus) auf die Probe und Kontrollröhrchen.
    1. Verwenden Sie einen Mikro die entsprechende Menge hinzuzufügen (berechnet in Schritt 1.2.4) von unmarkierten S. aureus Arbeitslösung auf die mit roter Tinte markierten Röhrchen und einem "H", einschließlich der Steuerrohr HE. Ersetzen Kappen und Wirbel kurz.
    2. Verwenden Sie einen Mikro die entsprechende Menge hinzuzufügen (berechnet in Schritt 1.2.4) von FITC-markierten S. aureus - Arbeitslösung zu den mit schwarzer Tinte markierten Röhrchen und einem "F", einschließlich der FITC Steuerrohr. Ersetzen Kappen und Wirbel kurz.
    3. Vortex das "Blut nur" Steuerrohr, aber nicht beide Arten von Bakterien (dh S. aureus) , um es hinzuzufügen.
    4. Inkubieren alle Rohre in einem 37 ° C Wasserbad für 20 min. Verwenden Sie ein offenes Metallgestell und sanft schütteln Sie das Rack alle 5 minum sicherzustellen, dass die Rohre schnell und adäquat erwärmt. Nach der Inkubationszeit, übertragen sofort alle Rohre zu einem Eis-Wasser-Bad für 1 min.
  3. Waschen Sie die Zellen.
    1. Verwenden Sie einen Repeater-Pipette 100 ul eiskalter Quench-Lösung in alle Röhrchen hinzuzufügen. Ersetzen Kappen, Wirbel kurz, und dann brüten alle Röhrchen auf Eis für 1 min.
    2. Verwenden Sie einen Repeater-Pipette 1 ml eiskaltem PBS in alle Röhrchen hinzuzufügen. Vortex kurz, und dann weitere 2 ml eiskaltem PBS zu allen Röhrchen hinzufügen und Kappen ersetzen. Zentrifuge alle Röhrchen für 5 min bei 4 ° C und 270 xg und aspirieren dann den Überstand.
    3. Wiederholen Sie Schritt 2.3.2 einmal (insgesamt 2 Wäschen).
  4. Bereiten Sie die Proben für die Durchflusszytometrie.
    1. Verwenden Sie einen Repeater-Pipette 50 ul eiskaltem fötalen Rinderserum zu allen Röhrchen hinzuzufügen. kurz vortexen alle Röhrchen.
    2. Übertragen Sie alle Rohre auf einen geeigneten Karussell und eine automatisierte Zelle lysieren Vorbereitung Workstation mit roten Blut cell (RBC) Lysieren und WBC-Befestigungs Reagenzien, die roten Blutkörperchen und fixieren die WBL zu lysieren, wie in den Anweisungen des Herstellers beschrieben.
    3. Nach der automatisierten Zell lyse Vorbereitung Workstation Lauf abgeschlossen hat, wickeln Rohre in Aluminiumfolie und Speicher in einem 4 ° C Kühlschrank stellen, bis die Durchflusszytometrie-Analyse durchgeführt werden kann.

3. Durchflusszytometrie Acquisition

  1. Richten Sie die Durchflusszytometrie-System.
    1. Wärmen Sie die Durchflusszytometrie-System wie in der Bedienungsanleitung des Herstellers gerichtet. Dann überprüfen Sie die Reagenzien und Abfallbehälter Ebenen. Falls erforderlich, füllen Sie die Reagenzienbehälter und / oder den Abfallbehälter entleeren.
    2. Verwenden Sie die "Clean-Panel" -Funktion das System sauber Zyklus laufen. Dann wird die Ausrichtung und Fluidik Überprüfung Fluorospheres laufen, und stellen Sie sicher, dass der Halbsvariationskoeffizient (HPCV) für jeden Detektor innerhalb des vorgegebenen Bereichs in der Qualitätskontrolle beschrieben ist (QC) Protokolle, die von der Herstellung zur Verfügung gestelltr.
  2. Erstellen Assay spezifische Erfassung und Geräteeinstellung Protokolle.
    1. Erstellen Assay spezifische Akquisitionsprotokolle für die Phagozytose und OB Aktivitätstests.
      HINWEIS: Die Anschaffungs Protokolle hier beschrieben sind, können für die Verwendung auf jedem Durchflusszytometer mit einem blauen Laser (488 nm), ein Filter (530/30) für FITC, und ein Filter (575/26) für HE angepasst werden.
      1. Öffnen Sie die Durchflusszytometrie System Erfassungs-Software und erstellen Sie ein "Neues Protokoll".
      2. Wählen Sie die "FL1 Parameter" für die Phagozytose-Assay (FITC) und der "FL2 Parameter" für den OB-Aktivitätstest (HE).
      3. Erstellen Sie die Plots (dh Vorwärtsstreuung [FSC] vs. Seitenstreuung [SSC] Punktdiagramm, FL1 Histogramm, FL2 - Histogramm) für die Erfassung erforderlich.
      4. Erstellen Sie polygonale Regionen für den WBC (weiße Blutkörperchen), Granulozyten und Monozyten - Populationen auf der FSC gegen SSC Plot und erstellen Sie lineare Bereiche auf den FL1 und FL2 Histogramme. Set a & #Count Stop "von 50.000 Ereignisse um den WBC-Tor; 34.
      5. Speichern Sie die Protokolle mit Assay-spezifischen Namen.
    2. Erstellen Assay spezifische Geräteeinstellung Protokolle für die Phagozytose und OB Aktivitätstests.
      1. Drag & Drop die "Test-spezifischen Akquisitionsprotokolle" (definiert in Schritt 3.2.1) von der "Ressource-Explorer" auf die "Acquisition Manager" auf der Durchflusszytometrie System Erfassungssoftware.
        HINWEIS: Die Informationen in dieser Art und Weise hinzugefügt werden immer am Ende des Arbeitsvorrats angezeigt.
      2. Geben Sie den Probeninformationen in den Arbeitsvorrat und den Arbeitsvorrat zu speichern.
      3. Entfernen Sie die Kontrollprobenröhrchen vom 4ºC Kühlschrank und lassen sie für 15 min auf Raumtemperatur äquilibrieren. Dann kurz vortexen jedes Steuerprobenröhrchen.
      4. Verwenden Sie die "Test-spezifischen Akquisitionsprotokolle" definiert in Schritt 3.2.1 die negative Kontrollprobe (dh Blut nur) und die positive Kontrolle zu laufenProben (dh er die Kontrolle, Steuerung FITC) durch die Durchflusszytometrie - System. Überprüfen Sie die Histogramme und stellen Sie die Fotovervielfacherröhre (PMT) Spannungen des FITC und Phycoerythrin (PE) Kanäle nach Bedarf.
      5. Vortex, um die Kontrollproben und übertragen sie an die Durchflusszytometrie System Karussell nach der Reihenfolge auf der Arbeitsliste. Legen Sie dann das Karussell in der Probenkammer und klicken Sie auf die Cytometer Toolbar Schaltfläche "Start" Daten für die Kontrollproben zu erwerben. Speichern Sie die "xxx Einstellung Pro" Einstellung Protokoll.
  3. Erwerben Studie Proben auf der Durchflusszytometrie-System.
    1. Entfernen Sie die Studie Probenröhrchen aus dem 4 ° C Kühlschrank und auf Raumtemperatur 15 Minuten äquilibrieren.
    2. Während die Proben Äquilibrieren, ziehen Sie die vordefinierten studienspezifischen Akquisitionsprotokolle in den Arbeitsvorrat Raum ein Projekt Vorrat machen.
    3. Bestätigen Sie, dass die "Einstellung Protokoll" auf die & verknüpft ist# 34;. Assay-spezifische Einstellung Protokolle "definiert in Schritt 3.2.2 Geben Sie dann die Identifizierungsinformationen (zB Studienname, zeichnen Nummer, Besuch Nummer, Subjekt - ID) für jedes Rohr in der Arbeitsliste.
    4. Nach dem 15-min Äquilibrierungszeitraums, Wirbel Studie Proben und übertragen sie an die Durchflusszytometrie System Karussell nach der Reihenfolge auf der Arbeitsliste. Legen Sie dann das Karussell in der Probenkammer und klicken Sie auf die Cytometer Toolbar Schaltfläche "Start" Daten für die Studie Proben zu erwerben.
    5. Überprüfen Sie die Qualität der Daten, die durch die RBC-Lyse Effizienz Inspektion und den WBC-Zellenuntergruppe Verteilung, Proportionen, absolute Zahlen und Fluoreszenzintensitäten auf dem Berichtstafel jeder Probe.
      HINWEIS: Die Datenqualität akzeptabel angesehen wird, wenn alle diese Kriterien innerhalb ihrer vorgegebenen Grenzen liegen. Wenn alle Kriterien nicht erfüllt sind, sollten Probe weiterverarbeitet werden.
    6. Sauber und schloß die Durchflusszytometrie System herunter. Lagern Sie die DurchflusszytometrieDaten auf zwei verschiedenen Computer-Laufwerke versehentlichen Datenverlust zu verhindern.

4. Datenanalyse

  1. Führen Sie die Phagozytose Analyse.
    1. Konsolidieren Sie alle der Phagozytose (dh F-markiert) Proben- und Kontrolllistenmodus Daten (LMD) Daten - Dateien in einem einzigen Ordner. Öffnen Sie dann die Durchflusszytometrie-Analyse-Software und ziehen Sie die Dateien in den Probenraum.
    2. Stellen Sie den WBC, Granulozyten, Monozyten und Lymphozyten-Tore.
      1. Doppelklick auf den Dateinamen einen der "FITC Kontrollproben" zu öffnen. Verwenden Sie die Dropdown-Menüs, um den x-Achse "FSC" und "linear" und die y-Achse auf "SSC" und "linear".
      2. Verwenden Sie die "Polygon-Gate-Selektor", um ein Tor der gesamten WBC-Population vorzubereiten.
        HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass alle Zellen an den Rändern des Diagramms aufzunehmen. Beschriften Sie dieses Tor "WBC".
      3. Doppelklicken Sie auf den "neuen WBC-Gate" und verwenden Sie das Drop-Down-Menüs die x-Achse zu "FSC" und "Linear" und die y-Achse auf "SSC" und "Linear" zu setzen.
      4. Verwenden Sie die "Polygon-Gate-Selektor", um den "Granulozyten-Gate" und die Monocyten-Schranke ", und verwenden Sie dann den" Ellipsen Tor Selektor Lymphocyte Tor ", um die zu setzen." "Beschriften Sie jedes Tor entsprechend an. Ziehen Sie die" Gate-Daten (%) "an der Seite, so daß die Zellen leicht betrachtet.
    3. Stellen Sie die "Phagozytose Positive Tor" und das "Phagozytose Negative Tor" für die Granulozyten und Monozyten-Populationen.
      1. Doppelklicken Sie auf die "FITC Kontrollprobe" in Schritt 4.1.2.1 verwendet. Dann klicken Sie auf den "Granulozyten-Gate" und verwenden Sie die Dropdown-Menüs, um die x-Achse zu "FL1" und "Log" zu setzen und die y-Achse auf "SSC" und "Linear".
      2. Verwenden Sie das "Quadrat-Gate-Selektor", um ein "Phagozytose Negative Tor" und eine "Phagozytose Positive Tor ".
        Hinweis: Da der FITC Kontrollproben nicht bakterielle (dh S. aureus) Stimuli erhalten haben, alle Zellen theoretisch Phagozytose negativ sein sollte. Verwenden Ermessen, wenn die Grenzen für diese Bevölkerungsgruppen zu etablieren.
      3. Wiederholen Sie Schritt 4.1.3.1 und 4.1.3.2 Schritt für die Monocytenpopulation.
    4. In Statistiken für "% der WBC", "Fluoreszenzintensität" und "% Phagozytose positiven Zellen" für die Granulozyten und Monozyten-Populationen.
      1. Klicken Sie auf das "FITC Kontrollprobe", die in Schritt 4.1.2.1. Markieren Sie die "Granulozyten-Tor", und klicken Sie dann auf "Arbeitsplatz" und "Add Statistik". Markieren Sie "Geometrisches Mittel" und "FL1 Log" und klicken Sie auf "Hinzufügen". Dann entschied sich für die "Häufigkeit der Parent" Statistik und klicken Sie auf "Hinzufügen".
        Hinweis: Dies wird die Fluoreszenzintensität (geometrisches Mittel) der gesamten Granulozytenpopulation geben undder Anteil der WBC (Eltern), die Granulozyten sind.
      2. Klicken Sie auf das "FITC Kontrollprobe", die in Schritt 4.1.2.1. Markieren Sie das "Phagozytose Positive Tor" der Granulozyten-Population, und klicken Sie dann auf "Arbeitsplatz" und "Add Statistik". Markieren Sie "Geometrisches Mittel" und "FL1 Log" und klicken Sie auf "Hinzufügen". Dann wählen Sie die "Häufigkeit der Parent" Statistik und klicken Sie auf "Hinzufügen".
        Hinweis: Dies wird die Fluoreszenzintensität (geometrisches Mittel) der Phagozytose positiven Granulozyten und den Prozentsatz der Granulozyten geben (Eltern), die Phagozytose positiv sind.
      3. Wiederholen Sie Schritt 4.1.4.1 und 4.1.4.2 Schritt für die Monocytenpopulation.
      4. Klicken Sie auf das "FITC Kontrollprobe", die in Schritt 4.1.2.1. Markieren Sie das "Lymphocyte Tor", und klicken Sie dann auf "Arbeitsplatz" und "Add Statistik". Markieren Sie die "Häufigkeit der Parent" Statistik und klicken Sie auf "Hinzufügen".
        HINWEIS: Diesegeben den Prozentsatz der WBC (Eltern), die Lymphozyten sind.
      5. Markieren Sie alle Tore und in der FITC Kontrollprobe verwendet erstellt Statistiken in Schritt 4.1.2.1. Ziehen Sie sie in "All Samples" in der "Gruppe" Panel am oberen Rand des Bildschirms.
        HINWEIS: Dadurch werden diese Einstellungen zu allen Studienproben anzuwenden.
      6. Speichern und Namen Arbeit als WSP-Datei in dem Ordner, der LMD-Ordner enthält.
    5. Passen Sie einzelne Proben Tore.
      1. Klicken Sie auf das "erste Probe" im Datensatz und bestätigen, dass die WBC-Gate die Zellverteilung auf dem Bildschirm entsprechend passt. Wenn es nicht, klicken Sie auf und ziehen Sie die Ränder des Gate einstellen das Tor für diese Probe. Klicken Sie auf den "Pfeil nach rechts" (dh "˃") , um die nächste Probe zu wechseln . Wiederholen Sie diesen Schritt, bis alle Proben wurden überprüft.
      2. Klicken Sie auf den "WBC-Tor" für die erste Probe in dem Datensatz und bestätigen, dass die "Granulocyte Tor "," Monozyt Tor "und" Lymphocyte Tor "für jede Probe in geeigneter Weise die Zellverteilung auf dem Bildschirm passen. nach Bedarf anpassen. Klicken Sie auf den" Pfeil nach rechts "(dh" ˃ ") , um die nächste Probe voran .
      3. Wiederholen Sie Schritt 4.1.5.2, bis alle Proben wurden überprüft. Klicken Sie dann auf "Speichern".
    6. Zeigen Sie die Daten in einem elektronischen Tabellenkalkulationsprogramm.
      1. Klicken Sie auf das "Table Editor" Symbol am oberen Rand des Bildschirms. Klicken Sie auf "Bearbeiten", "Schlüsselwörter" und "$ DATE", um das Datum der Probenahme auf dem letzten Tabellen enthalten. Klicken Sie dann auf "Bearbeiten", "Keywords" und "@ SAMPLEID1", um die Sampling-Identifikation auf dem letzten Tabellen enthalten. Wiederholen Sie dies für "@ SAMPLEID2", "@ SAMPLEID3" und "@ SAMPLEID4".
      2. Stellen Sie die "Table Editor" Bildschirm und die "Probe" Bildschirm, so dass sie beide können auf dem Computerbildschirm angezeigt werden. Select jede "Probe" auf dem Musterblatt. Ziehen Sie dann jede Statistik von Interesse für den "Table Editor".
        1. Ziehen Sie den "Freq. Von Parent" Statistik aufgelistet unter dem "Granulozyten-Tor" zum "Table Editor". Geben Sie "% WBC als Granulozyten" unter der Spalte "Name" des "Table Editor".
        2. Ziehen Sie das "Geometrisches Mittel" Statistik aufgelistet unter dem "Granulozyten-Tor" zum "Table Editor". Geben Sie "Geometrisches Mittel Fluoreszenz, Granulozyten" unter der Spalte "Name" des "Table Editor".
        3. Ziehen Sie den "Freq. Von Parent" Statistik aufgelistet unter dem "Granulozyten / Phagozytose Positive Tor" zum "Table Editor". Geben Sie "% Phagozytose Positive Granulozyten" unter der Spalte "Name" des "Table Editor".
        4. Ziehen Sie das "Geometrisches Mittel" Statistik aufgelistet unter dem "Granulozyten / Phagozytose Positive Tor" zu the "Table Editor". Geben Sie "Geometrisches Mittel Fluoreszenz, Phagozytose Positive Granulozyten" unter der Spalte "Name" des "Table Editor".
        5. Ziehen Sie den "Freq. Von Parent" Statistik aufgelistet unter dem "Monozyt Tor" zum "Table Editor". Geben Sie "% WBC als Monozyten" unter der Spalte "Name" des "Table Editor".
        6. Ziehen Sie das "Geometrisches Mittel" Statistik aufgelistet unter dem "Monozyt Tor" zum "Table Editor". Geben Sie "Geometrisches Mittel Fluoreszenz, Monozyten" unter der Spalte "Name" des "Table Editor".
        7. Ziehen Sie den "Freq. Von Parent" Statistik aufgeführt im Rahmen der "Monozyt / Phagozytose Positive Tor" zum "Table Editor". Geben Sie "% Phagozytose Positive Monozyten" unter der Spalte "Name" des "Table Editor".
        8. Ziehen Sie das "Geometrisches Mittel" Statistik aufgelistet unter dem "Monozyten / Phagocytose Positive Tor "zum" Table Editor ". Geben Sie" Geometrisches Mittel Fluoreszenz, Phagozytose Positive Monozyten "unter der Spalte" Name "des" Table Editor ".
        9. Ziehen Sie den "Freq. Von Parent" Statistik aufgelistet unter dem "Lymphocyte Tor" zum "Table Editor". Geben Sie "% WBC als Lymphozyten" unter der Spalte "Name" des "Table Editor".
      3. Drag & Drop die Parameter sichtbar in der "Table Editor", bis sie in der bevorzugten Reihenfolge angeordnet sind.
      4. Klicken Sie auf "Speichern". Klicken Sie dann auf "Create Table", um die Daten in einem Tabellenformat anzeigen. Klicken Sie auf "Speichern unter" zu speichern und zu benennen Arbeit als .xlsx-Datei.
  2. Wiederholen Sie Schritt 4.1 für die OB - Aktivitätstest (dh H-markiert) Proben und LMD-Dateien steuern.
    HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass alle Verweise auf die Phagozytose mit Verweisen auf OB-Aktivität zu ersetzen.

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Representative Results

Längerer und intensive Übung hat profunde Auswirkungen auf die angeborene Immunfunktion, einschließlich der natürlichen Killerzellen-Funktion, Makrophagen-Zytokin-vermittelten Immunantwort auf virale Infektionen und Granulozyten und Monozyten Phagozytose und OB-Aktivität. Mehrere Studien zeigen, dass Granulozyten und Monozyten Phagozytose steigt deutlich nach dem Training, um die Entzündung durch Muskelschäden und metabolischen Anforderungen induziert widerspiegelt. Im Gegensatz dazu Granulozyten und Monozyten OB Aktivität abnimmt nach dem Training und kann eine Immun Indikator für eine erhöhte Anfälligkeit für Infektionen. Zum Beispiel 1 zeigt , dass die Phagozytose von S. aureus durch Granulozyten sofort und 1,5 Stunden nach einer 75-km Radfahren Kampf erhöht (70% VO2max), am nächsten Morgen wieder normal. Monozyten Phagozytose wird durch dieses Niveau der Übung in ähnlicher Weise betroffen. 2 zeigt Figur , die Granulozyten - OB - Aktivität Rückgangd für mindestens 21 h nach 75-km Radfahren. Monozyt OB-Aktivität wird auch nach 75-km Radfahren verringert.

Granulozyten und Monozyten Phagozytose von S. aureus, aber nicht Granulocyten und Monocyten - OB - Aktivität korreliert werden , um systemische Entzündung Biomarkern Abbildung 3 zeigt die geringe Korrelation zwischen Granulozyten Phagozytose und Serum - C-reaktives Protein (CRP) -Spiegel (Pearson Produkt-Moment - Korrelations;. r = 0,44; p <0,01 in 106) Übergewicht / adipösen Frauen. Serum CRP wird auch auf Monozyten Phagozytose von S. korreliert aureus (Pearson Produkt-Moment - Korrelation; r = 0,30; p <0,01). Außerdem Blut Neutrophilen / Leukozytenzahl (Pearson Produkt-Moment - Korrelation; r = 0,62 und r = 0,61, p <0,001), Body - Mass - Index (Pearson Produkt-Moment - Korrelation; r = 0,50 und r = 0,40 sind; P <0,001), Serum - Insulinspiegel (r = 0,30 und r =0,23; p <0,03), und Blut A 1C Ebenen (Pearson Produkt-Moment - Korrelation; r = 0,28 und r = 0,21, p <0,04) auf Granulozyten und Monozyten Phagozytose von S. korreliert aureus. Im Allgemeinen zeigen diese Daten, dass hohe Granulozyten und Monozyten Phagozytose in ruhenden Themen indikativ für systemische Entzündung ist.

Abbildung 1
Abbildung 1: Granulozyten Phagozytose wird Betroffen von Intensives Ausdauertraining Granulozyten Phagozytose sofort erhöht und 1,5 Stunden nach einer 75-km Radfahren Kampf bei 70% der VO2max.. Mit dem 21-Stunden-post-exercise, kehrte Granulozyten Phagozytose leicht unter Vorübung Ebenen. * zeigt sich von Vorübung (Wiederholte Messungen ANOVA mit gepaarter t-Test Post-hoc - Analyse, gegebenenfalls N = 19; p <0,05). Die Werte sind mirein ± Standardfehler. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Figur 2

Abbildung 2:. Granulozyten Oxidative Burst - Aktivität wird Betroffen von Intensives Ausdauertraining Granulozyten oxidativen Burst - Aktivität verringerte sich sofort, 1,5 h und 21 h nach einer 75-km Radfahren Kampf bei 70% der VO2max. * zeigt sich von Vorübung (Wiederholte Messungen ANOVA mit gepaarter t-Test Post-hoc - Analyse, gegebenenfalls N = 19; p <0,05). Die Werte sind Mittelwert ± Standardabweichung. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

. Abbildung 3: Granulozyten Phagozytose ist mit systemischen Entzündung korrelierte bei übergewichtigen / adipösen Frauen Granulozyten Phagozytose wurde Serum - C-reaktives Protein korreliert, Korrelation eine allgemein akzeptierte Biomarker für systemische Entzündung (Pearson Produkt-Moment; N = 87; r = 0,44; P <0,01). Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

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Discussion

Diese Handschrift stellt eine Schritt-für-Schritt-Protokoll für die Bestimmung von zwei Indikatoren von Granulocyten und Monocyten-Funktion. Wir haben einige Schritte identifiziert, die für den Erfolg dieses Tests sind entscheidend. Ein solcher Schritt ist das Eisbad Inkubation, die Zugabe von Bakterien unmittelbar vor auftritt. Gründliches Kühlen aller Proben wird die Wirkung der Temperatur auf die Phagozytose und OB-Aktivität minimieren. Ein weiterer wichtiger Schritt ist die Zugabe von Bakterien zu jeder Probe. A 8: 1 Bakterien: Phagozyten Verhältnis erzeugt optimale Ergebnisse; jedoch andere Forscher kann feststellen, dass dieses Verhältnis geändert werden, müssen geeignete Ergebnisse zu erzielen. Ein weiterer wichtiger Schritt ist die Verwendung von RBC Lyse und WBC-Fixierungsmittel RBCs zu lysieren und zu beheben WBL. Die Verwendung dieser solcher Reagenzien gewährleistet eine vollständige Lyse der RBCs und ermöglicht Forscher sicher verarbeitet Proben bei 4 ° C über Nacht, und dann Zytometer den nächsten Tag durch den Strömungs auszuführen. Frühere Arbeiten (nicht veröffentlicht) indicates die RBC und WBC lysierenden Befestigung kann verwendet werden, um die Durchflußcytometrie von festen Proben, die durch so viele wie 12 Stunden zu verzögern, ohne die Datenintegrität zu beeinträchtigen.

Dieses Verfahren kann leicht die Fähigkeiten und Interessen des Forschers gerecht geändert werden, aber es sollte betont werden, dass eine Optimierung nötig ist, wenn Anpassungen vorgenommen werden. Einige der häufigsten Anpassungen, die auf die Zielbakterien berichtet wurde, das Etikett / Sonde und der Inkubationszeit. Die Forscher haben hervorragende Ergebnisse produziert , wenn Escherichia coli 7,8 anstelle von S. verwendet wird aureus als Ziel pathogen (beide in der 8: 1 - Verhältnis). Ein Pilz, wie Saccharomyces cerevisiae, kann auch als Ersatz für E. geeignet sein coli. Darüber hinaus verwenden Forscher häufig eine pH-empfindliche molekulare Sonde, 7,12 anstelle von FITC, als Sonde für die Phagozytose. Ebenso Sonden andere als HE üblicherweise zur Messung von OB-Aktivität verwendet werden, including dichlorofluorescin diacetat (DCF-DA) 10 und Dihydrorhodamin 123 (DHR). 13 Berichtet Inkubationszeiten variieren von 20 min bis 120 min, 12,14,15 mit McFarlin berichtet , dass die maximale Antwortzeit durch bakterielle Ziel variieren. Es sollte 7 auch darauf hingewiesen , dass die optimalen Inkubationszeiten zwischen den Phagozytose und OB Aspekte des Assays variieren. 7

Wie bei allen Labortests kann zur Fehlerbehebung notwendig sein, wenn diese Technik in einer neuen Forschungseinrichtung zu etablieren. Die Autoren raten, dass die Optimierung der Bakterien: Phagozyten Verhältnis der Schlüssel zum Erfolg für diesen Test ist. Die Autoren merken an, dass die Daten aus einer Probe von der Analyse sollte verworfen werden, wenn weniger als 80% der Zellen in der Granulozyten-Population von einem nicht-erkrankten Teilnehmer sind FITC positiv; in dieser Situation kann die Probe werden erneut gesammelt und erneut analysiert, falls möglich.

Es gibt einige Einschränkungen bei derPhagozytose und OB-Aktivitätstest Granulozyten und Monozyten beschrieben in diesem Manuskript. Eine solche Einschränkung ist die ausschließliche Verwendung von FSC und SSC die Zellpopulationen von Interesse zu identifizieren. Die Verwendung von Zelloberflächenmarkern würde es den Forschern ermöglichen , positiv Zellpopulationen zu identifizieren. 10 aber die Zugabe dieser Funktion Zytometer mehr als einem Strömungs erfordern würde, und ist deshalb über den Rahmen dieses Manuskripts. Eine weitere Einschränkung dieses Assays ist, dass es auf die Wirksamkeit von Trypanblau beruht die Fluoreszenz von Sonden zu quenchen, die nicht durch den Immunzellen von Interesse internalisiert. Eine pH-empfindliche molekulare Sonde 7,12 kann als Alternative verwendet werden in Situationen , wo FITC Internalisierung ist ein Anliegen. Da eine solche Sonde nur fluoreszierend in sauren Umgebungen, wie sie in endozytischen Vesikeln ist, stellt das akquirierte Fluoreszenz internalisierten Partikel nur. Darüber hinaus haben mehrere Forscher den aktuellen Test kritisiert, weil es zu tunes nicht einen parallelen Satz von Proben enthalten, die in Eiswasser inkubiert wird statt bei 37 ° C für die Aktivität von Immunzellen Basislinie zu steuern. Bei mehreren Gelegenheiten, enthalten wir diese "Eis Zustand", wenn die Granulozyten und Monozyten Phagozytose und OB-Aktivitätstest durchgeführt wird, und festgestellt, dass es nicht wesentlich auf die Qualität der Daten (nicht veröffentlicht) nicht verbessert.

Zusammengefasst beschreibt diese Handschrift eine Technik zur Messung der Phagozytose und OB-Aktivität in Granulozyten und Monozyten. Dies ist eine einfache, direkte Assays, die leicht modifiziert werden kann für Laborfähigkeiten und Forschungsinteressen zu berücksichtigen. In Übung wissenschafts- und Fettleibigkeit im Zusammenhang mit der Forschung, diese Maßnahme der angeborenen Immunfunktion ermöglicht es dem Prüfer, die Auswirkungen von vielen möglichen Gegenmaßnahmen zu erkunden, einschließlich Gewichtsverlust, Ergänzungsverbrauch, diätetische Maßnahmen und andere Veränderungen im Lebensstil. Bei dieser Technik zu meistern, können die Forscher akut zu überwachenund chronische Veränderungen der Immunzellfunktion in Reaktion auf Ernährung, Bewegung, und viele andere Reize.

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Acknowledgments

Die Autoren möchten sich Zack Shue, Casey John und Lynn Cialdella-Kam für ihre Unterstützung bei der Optimierung dieses Verfahrens zu bestätigen.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
12 x 75 mm tubes, with cap VWR 20170-579 You will need 2 tubes per sample ("H" and "F") plus 3 tubes per batch (for assay controls; "F", "H", and "Blood only").
PBS (10x), pH 7.4 Life Technologies 70011-044
Bottle top 0.2 µm cellulose acetate filter (500 ml capacity) Fisher Scientific 09-741-07 
Glucose, powder Life Technologies 15023-021
Citric acid (anhydrous, cell culture tested, plant cell culture tested) Sigma-Aldrich C2404-100G
Sodium citrate tribasic dihydrate Sigma-Aldrich S4641-25G
Dihydroethidium (Hydroethidine) (HE) Life Technologies D11347
Dimethyl sulfoxide (DMSO) Anhydrous Life Technologies D12345
Staphylococcus aureus (Wood strain without protein A) BioParticles, fluorescein conjugate (FITC) Life Technologies S2851
Staphylococcus aureus (Wood strain without protein A) BioParticles, unlabeled Life Technologies S-2859
Trypan Blue Solution, 0.4% Life Technologies 15250-061
4.0 ml vacutainer containing 7.2 mg K2EDTA, spray-dried VWR BD367861 You will need 1 K2EDTA blood collection tube per sample.
4.0 ml vacutainer containing 68 USP units Lithium Heparin, spray-coated VWR BD367884 You will need 1 Lithium Heparin blood collection tube per sample.
COULTER Ac·T 5diff CP Beckman Coulter 6605705 i.e., hematology analyzer
COULTER Ac·T 5diff Rinse Beckman Coulter 8547167
COULTER Ac·T 5diff Fix Beckman Coulter 8547171
COULTER Ac·T 5diff WBC Lyse Beckman Coulter 8547170
COULTER Ac·T 5diff Hgb Lyse Beckman Coulter 8547168
COULTER Ac·T 5diff Cal Calibrator Beckman Coulter 7547175
COULTER Ac·T 5diff Control Plus Beckman Coulter 7547198
AcT 5diff Diluent Beckman Coulter 8547169
200 µl extended-length pipette tips VWR 37001-526
Insulated ice pan VWR 89198-980 For ice water bath.
Open metal tube rack VWR 60916-702
Fetal Bovine Serum Life Technologies 26140-111
TQ-Prep Workstation Beckman Coulter 6605429 i.e., automated cell lyse preparation workstation
ImmunoPrep Reagent System Beckman Coulter 7546999 i.e., RBC lyse/WBC fix reagent system
Cytomics FC500 MCL Flow Cytometry System with CXP Software Beckman Coulter 626553
IsoFlow Sheath Fluid Beckman Coulter 8547008
COULTER CLENZ Beckman Coulter 8546929
Flow-Check Fluorospheres  Beckman Coulter 6605359 i.e., alignment and fluidics verification fluorospheres
FlowJo Software FlowJo FlowJo i.e., flow cytometry analysis software
Excel Software Microsoft Microsoft Excel i.e., electronic spreadsheet program

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References

  1. Nieman, D. C., et al. Influence of pistachios on performance and exercise-induced inflammation, oxidative stress, immune dysfunction, and metabolite shifts in cyclists: a randomized, crossover trial. PLoS One. 9, e113725 (2014).
  2. Knab, A. M., et al. Effects of a freeze-dried juice blend powder on exercise-induced inflammation, oxidative stress, and immune function in cyclists. Appl Physiol Nutr Metab. 39, 381-385 (2014).
  3. Konrad, M., et al. The acute effect of ingesting a quercetin-based supplement on exercise-induced inflammation and immune changes in runners. Int J Sport Nutr Exerc Metab. 21, 338-346 (2011).
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  7. McFarlin, B. K., Williams, R. R., Venable, A. S., Dwyer, K. C., Haviland, D. L. Image-based cytometry reveals three distinct subsets of activated granulocytes based on phagocytosis and oxidative burst. Cytometry A. 83, 745-751 (2013).
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  9. McFarlin, B. K., Venable, A. S., Prado, E. A., Henning, A. L., Williams, R. R. Image-based flow cytometry technique to evaluate changes in granulocyte function in vitro. J Vis Exp. , (2014).
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Immunologie Heft 115 Phagozytose oxidativen Burst Monozyten Granulozyten angeborene Immunität Durchflusszytometrie
Mess Granulozyten und Monozyten Phagozytose und oxidativer Burst-Aktivität im menschlichen Blut
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Meaney, M. P., Nieman, D. C., Henson, D. A., Jiang, Q., Wang, F. Z. Measuring Granulocyte and Monocyte Phagocytosis and Oxidative Burst Activity in Human Blood. J. Vis. Exp. (115), e54264, doi:10.3791/54264 (2016).

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