Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

מדידת פעילות פרץ גרנולוציט ו מונוציטים Phagocytosis חמצוני בדם אנושי

Published: September 12, 2016 doi: 10.3791/54264
Automatic Translation
1, 1, 2, 3, 3
1Human Performance Laboratory, North Carolina Research Campus, Appalachian State University, 2Department of Biology, Appalachian State University, 3David H. Murdock Research Institute

Introduction

Phagocytosis גרנולוציט ו מונוציטים / פרץ חמצוני (OB) assay פעילות היא טכניקה פשוטה, ישר קדימה אשר משמש לעתים קרובות כדי לאסוף מידע על תפקוד מערכת החיסון המולדת לאחר פעילות גופנית ממושכת ואינטנסיבית. 1-4 כאשר לומדים את התגובה של המערכת החיסונית גירוי, גרנולוציטים ומונוציטים הם בעלי העניין מיוחד משום שהם ממלאים תפקיד מרכזי בהגנת מארח הם תאי החיסון הראשונים לצבור באתר של זיהום. 5 נויטרופילים, סוג של גרנולוציט, הם התאים הראשונים כדי translocate לתוך שריר ניזוק רקמות לאחר פעילות גופנית אינטנסיבית. 6 Phagocytosis ופעילות OB הם האמצעים הנפוצים ביותר של פונקצית גרנולוציט ו מונוציטים, 7 והם העדיפו כאינדיקטורים תפקוד תא חיסון מולד בגלל תפקידם המרכזי בשניית תהליך ההדבקה ואת תהליך התיקון.

Assay המתואר ב utili כתב היד הזהzes זרימה בסיסית cytometer לספק קביעה כמותית של גרנולוציט ו phagocytosis מונוציטים ופעילות OB בדם כולו. השימוש של דם מלא בטכניקה זו יש יתרון משום שהוא מאפשר assay להתנהל ללא הליך טיהור גוזל זמן. assay זה יכול בקלות להיות שונה כדי להתאים מגוון של עיצובי מחקר ויכולות מעבדה. לדוגמה, ליאו et al. מנוצל בטכניקה דומה כדי להראות פעילות OB נויטרופילים הוא גדל phagocytosis נויטרופילים הוא ירד בעקבות פגיעה מוחית טראומטית. 8 בדוגמה נוספת, McFarlin et al. תיאר שינוי אלגנטי של טכניקה זו המשתמשת allophycocyanin (APC ), מצומדות CD66b וסימון CD45 APC מצומדות טנדם בעל ביצועים גבוהים עם cytometry זרימה מבוסס תמונה לסווג גרנולוציטים מבחינת פעילויות phagocytosis ו OB שלהם. 7,9

קבוצת המחקר שלנו השתמשה עיבודים שונים של טה זוchnique כאינדיקטור תפקוד מערכת החיסון המולדת באוכלוסיות משקל יתר, ואתלטי במשך כמעט 20 שנה. 10,11 הטקסט להלן יספק את הקורא עם הוראות צעד-אחר-צעד לביצוע assay זה ולהאיר אזורים שהקורא עשוי להתאים כדי לענות על הצרכים של המחקר שלהם.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

הערה: כל הנהלים איסוף דם נערכו בהתאם להנחיות שנקבעו על ידי אוניברסיטת מדינת האפלצ'ים (ASU) הדירקטוריון סקירה מוסדיים (IRB).

1. הכנת Assay

  1. לאסוף, להכין, ולארגן את החומרים שצוינו עבור ההליך (עיין טבלה של חומרים ספציפיים / ציוד).
    1. לייבל 12 x 75 מ"מ צינורות.
      1. לייבל שני צינורות לכל משתתף: שפופרת אחת עבור assay phagocytosis (תווית הצינור הזה עם דיו שחור ו "F" עבור isothiocyanate והעמסת [FITC]) צינור אחד עבור assay פעילות OB (תווית הצינור הזה עם דיו אדום ו " H "עבור dihydroethidium [HE]).
        הערה: שימוש צינורות סטרילית 12 x 75 מ"מ מומלץ להמעיט הפעלה סלולרית הבלתי מכוונת, העלייה מתמדת רעשי רקע.
      2. לייבל שלושה צינורות עבור הפקדים assay: שפופרת אחת עבור assay phagocytosis (שליטה FITC: תווית הצינור הזה עם Blacדיו k ו "F"), צינור אחד עבור assay פעילות OB (HE מלא: תווית הצינור הזה עם דיו אדום ו "H"), צינור אחד עבור הבקרה השלילית (דם בלבד: תווית הצינור הזה בדיו ירוק ו "דם רק").
    2. הכן פתרונות מניות לפחות יום אחד לפני היום של assay.
      1. הכן את תמיסת מלח סטרילית שנאגר-פוספט (PBS). לדלל 100 מ"ל של 10x PBS עם 900 מ"ל של 18.2 MΩ H 2 O. סנן לעקר עם מסנן 0.2 מיקרומטר. חנות ב 4 ° C עד השימוש.
      2. הכן את PBS-גלוקוז סטרילי. ממיסים 1.0 גרם של גלוקוז 100 מ"ל של PBS. סנן לעקר עם מסנן 0.2 מיקרומטר. חנות ב 4 ° C עד השימוש.
      3. הכן את החיץ 0.1 M ציטראט סטרילי. ממיסים 1.2 גרם של חומצת לימון ו -1.1 גרם של נתרן ציטרט ב 100 מ"ל של 18.2 MΩ H 2 O. התאם את ה- pH ל -4.0. סנן לעקר עם מסנן 0.2 מיקרומטר. חנות ב 4 ° C עד השימוש.
      4. כן פתרון מניות HE. Resuspend 1.0 מ"ג HE ב 1.0 מ"ל של sulfoxide דימתיל (DMSO). מערבבים בעדינות, aliquot, ולאחסן ב -20 ° C עד השימוש.
      5. הכן את aureus Staphylococcus FITC שכותרתו (S. aureus) פתרון המניות (2 x 10 9 חלקיקים / מ"ל). Resuspend 10 מ"ג של FITC שכותרתו ס aureus ב 1.5 מיליליטר (או כמות מתאימה) של PBS. מחלקים לשלושה 500 μl aliquots ו sonicate פי המלצת היצרן. Aliquot ולאחסן ב -20 ° C עד השימוש.
      6. הכן את ס ללא תווית פתרון המניות aureus (2 x 10 9 חלקיקים / מ"ל). Resuspend 100 מ"ג של תווית ס aureus ב 15 מ"ל (או הכמות המתאימה) של PBS. מחלקים ל שלושים 500 μl aliquots ו sonicate פי המלצת היצרן. Aliquot ולאחסן ב -20 ° C עד השימוש.
    3. הכינו פתרונות עבודה טריים ביום של assay.
      1. הכן את הפתרון עובד הוא. העבר 10 μl שלפתרון המניות מופשר HE עד 990 μl של גלוקוז PBS. להגן מפני אור ולשמור על הקרח עד לשימוש.
      2. הכן את FITC שכותרתו ס הפתרון עובד aureus (133,333 חלקיקים / μl). העברת 70 μl של FITC שכותרתו ס מופשר פתרון המניות aureus כדי 980 μl של PBS. להגן מפני אור ולשמור על הקרח עד לשימוש.
      3. הכן את ס ללא תווית הפתרון עובד aureus (133,333 חלקיקים / μl). העברת 70 μl של ס ללא תווית מופשר פתרון המניות aureus כדי 980 μl של PBS. להגן מפני אור ולשמור על הקרח עד לשימוש.
      4. הכן את הפתרון להרוות. הוסף 750 μl של פתרון כחול 0.4% trypan כדי 11.25 מ"ל של חיץ 0.1 M ציטראט סטרילי. שמור באמבט מי קרח עד לשימוש.
    4. שיהיה לך phlebotomist מוסמך להקיז דם על פי הנחיות של ארגון הבריאות העולמי עבור זוב דם.
      1. להקיז דם לתוך צינור איסוף דם אחד 4 מ"ל המכיל EDTA 2 K. באיסוף דם vert צינורית לפי הוראות היצרן. שמור צינור איסוף הדם בטמפרטורת החדר על כיסא נדנדה הספסל העליון עד השימוש. השתמש דם זה עבור ספירת דם מלאה (CBC) עם תאי דם לבנים (WBC) ניתוח ההפרש המתואר בשלב 1.2.1.
      2. להקיז דם לתוך צינור איסוף דם אחד 4 מ"ל המכילה הפרין ליתיום. היפוך צינור איסוף דם על פי הוראות היצרן. שמור צינור איסוף דם ב RT על כיסא נדנדה הספסל העליון עד השימוש. השתמש הדם הזה לפעילות מונוציטים ו phagocytosis גרנולוציט ו OB assay המתואר בשלב 2.
  2. לקבוע את כמות החיידקים (כלומר, S. aureus), כי יהיה צורך להשלים את assay עבור כל דגימה.
    1. השתמש מנתח המטולוגיה לבצע ספירת דם עם ניתוח הפרש WBC על הדם כמתואר הוראות היצרן. רשום לעצמך את ספירת WBC (בתאי / מ"ל),% נויטרופילים, ו%ערכים מונוציטים.
    2. השתמש המשוואות הבאות כדי לקבוע את ספירת נויטרופילים מונוציטים עבור כל דגימה.
      נויטרופילים ספירת (בתאים / מ"ל) =% נויטרופילים × WBC (בתאי / מ"ל)
      ספירת מונוציטים (ב תאים / מ"ל) =% מונוציטים × WBC (בתאי / מ"ל)
    3. השתמש המשוואות הבאות כדי לדעת את כמות תָא בַּלעָן עבור כל דגימה ומספר פגוציטים נוכחים 100 μl של מדגם.
      ספירת תָא בַּלעָן (ב תאים / מ"ל) = ספירת נויטרופילים (ב תאים / מ"ל) + ספירת מונוציטים (בתאים / מ"ל)
      מספר פגוציטים ב 100 μl = (ספירה תָא בַּלעָן (בתאים / מ"ל)) / 10
    4. השתמש המשוואה הבאה כדי לקבוע את מספר החיידקים (כלומר, aureus S.) הדרושים עבור כל דגימה וכמות FITC שכותרתו ס aureus או S. ללא תווית הפתרון עובד aureus (133,333 חלקיקים / מ"ל) כי יש להוסיף על צינור אחד.
      הערה: חיידקי היעד: יחס תָא בַּלעָן הוא 8: 1.
      מספר חיידקי צורך =מספר פגוציטים ב 100 μl × 8
      נפח של הפתרון עובד FITC או ללא תווית הצורך (ב μl) = (מספר החיידקים הצורך) / (133,333 חלקיקים / μl)

2. בצע Assay

  1. כן דם מלא עבור assay.
    1. עבור כל צינור משתתף ובקרה, להשתמש קצה פיפטה המורחבת באורך להעביר 100 μl של דם מלא מצינור איסוף דם הפרין ליתיום לתחתית של 12 שכותרתו כראוי x צינור 75 מ"מ. חלף כמוס.
      הערה: היזהר להימנע מקבלת דם בצדדים של 12 x 75 מ"מ צינורות.
    2. השתמש micropipette להוסיף 10 μl של אותו עובד פתרון הצינורות שכותרתו עם דיו אדום ו "H", כוללים הצינור מלא HE. חלף כובעים בקצרה מערבולת.
    3. דגירה כל הצינורות באמבט מים 37 מעלות צלזיוס במשך 15 דקות. לאחר מכן, מייד להעביר את כל הצינורות באמבט קרח-מים במשך 12 דקות.
      הערה: השתמש מתלה מתכת פתוחהובעדינות לנער את מתל כל 5 דקות על מנת להבטיח כי הצינורות הם באופן מהיר ונכון חממו או מצונן.
  2. הוספת חיידקים (כלומר, S. aureus) אל דוגמיות ושליטה.
    1. השתמש micropipette להוסיף את הכמות המתאימה (המחושב בשלב 1.2.4) של ס ללא תווית פתרון aureus פועל הצינורות שכותרתו עם דיו אדום ו "H", כוללים הצינור מלא HE. חלף כובעים בקצרה מערבולת.
    2. השתמש micropipette להוסיף את הכמות המתאימה (המחושב בשלב 1.2.4) של FITC שכותרתו ס פתרון עובד aureus אל הצינורות שכותרתו בדיו שחור "אפס", כוללים הצינור מלא FITC. חלף כובעים בקצרה מערבולת.
    3. וורטקס הצינור "דם רק" שליטה, אך לא להוסיף סוג אחד של חיידקים (כלומר, aureus S.) אליו.
    4. דגירה כל הצינורות באמבט מים 37 מעלות צלזיוס במשך 20 דקות. השתמש מתלה מתכת פתוחה בעדינות לנער את מתל כל 5 דקותעל מנת להבטיח כי הם באופן מהיר ונכון חממו את הצינורות. לאחר תקופת הדגירה, מייד להעביר את כל הצינורות באמבט קרח מים 1 דקות.
  3. שוטפים את התאים.
    1. השתמש פיפטה מהדר להוסיף 100 μl של פתרון להרוות קר כקרח לכל הצינורות. חלף כובעים, מערבולת בקצרה, ולאחר מכן דגירה כל הצינורות על קרח למשך 1 דקה.
    2. השתמש פיפטה מהדר להוסיף 1 מ"ל של PBS קר כקרח לכל הצינורות. וורטקס בקצרה, ולאחר מכן להוסיף 2 מ"ל נוספים של PBS קר כקרח לכל הצינורות ולהחליף כובעים. צנטריפוגה כל צינורות במשך 5 דקות ב 4 ° C ו 270 XG, ולאחר מכן לשאוב supernatant.
    3. חזור על שלב 2.3.2 פעם אחת (סה"כ 2 שוטפים).
  4. הכינו דגימות עבור cytometry הזרימה.
    1. השתמש פיפטה מהדר להוסיף 50 μl של בסרום שור עובר קר כקרח לכל הצינורות. בקצרה מערבולת כל הצינורות.
    2. להעביר את כל צינורות קרוסלה מתאימה והשתמש תחנת עבודה כנה lyse התא אוטומטית עם cel דם האדוםl (RBC) lysing ו WBC תיקון ריאגנטים lyse את RBCs ולתקן את WBCs כמתואר הוראות היצרן.
    3. לאחר ריצת עבודת הכנת התא lyse האוטומטית השלימה, לעטוף צינורות בנייר אלומיניום ולאחסן במקרר 4 ° C עד ניתוח התזרים cytometry יכול להתבצע.

3. רכישת cytometry זרימה

  1. הגדרת מערכת cytometry הזרימה.
    1. לחמם את זרימת cytometry מערכת כמצוין במדריך למשתמש המסופק על ידי היצרן. לאחר מכן, לבדוק את הרמות מגיבים ופסולת טנק. במידת הצורך, למלא את הטנקים מגיב ו / או לרוקן את המיכל פסולת.
    2. השתמש בתכונת "לוח נקי" כדי להפעיל את מערכת מחזור נקי. לאחר מכן, להפעיל את אימות יישור fluidics fluorospheres, ולהבטיח כי המקדם חצי השיא של השתנות (HPCV) עבור כל גלאי נמצא בטווח המוגדר מראש מתוארי בקרת האיכות (QC) פרוטוקולים שמספקים בייצורr.
  2. צור רכישת assay הספציפי ופרוטוקולי הגדרת מכשיר.
    1. צור פרוטוקולי רכישה ספציפי assay עבור מבחני phagocytosis ו OB פעילות.
      הערה: הפרוטוקולים הרכישה המתואר כאן יכול להיות מותאם לשימוש על כל cytometer זרימה עם לייזר כחול (488 ננומטר), מסנן (530/30) עבור FITC, ומסנן (575/26) כי הוא.
      1. פתח את זרימת cytometry תוכנת רכישת מערכת וליצור "פרוטוקול חדש".
      2. בחר את "פרמטר FL1" עבור assay phagocytosis (FITC) ואת "פרמטר FL2" עבור assay פעילות OB (HE).
      3. צור את המגרשים (כלומר, פיזור קדימה [FSC] לעומת פיזור צד [SSC] עלילת נקודה, היסטוגרמה FL1, היסטוגרמה FL2) דרושה לרכישה.
      4. צור אזורים מצולעים עבור WBC (תאי דם לבנים), אוכלוסיות גרנולוציט ו מונוציטים על המגרש FSC לעומת SSC וליצור אזורים ליניארי על היסטוגרמות FL1 ו FL2. a & # הגדר34; עצור רוזן "של 50,000 אירועי שער WBC.
      5. שמור את הפרוטוקולים עם שמות assay ספציפי.
    2. צור פרוטוקולי הגדרת מכשיר assay ספציפי עבור מבחני פעילות phagocytosis ו OB.
      1. גרור ושחרר את "הפרוטוקולים לרכישה מסוימת-assay" (שהוגדר בשלב 3.2.1) מן "אקספלורר משאבים" אל "מנהל הרכישה" על זרימת cytometry תוכנה רכישת המערכת.
        הערה: המידע הוסיף בדרך זו תמיד יופיע בסוף של worklist.
      2. הזן את המידע המדגם לתוך worklist, ולשמור את worklist.
      3. הסר את צינורות מדגם מלא ממקרר 4 ° C ולאפשר להם לאזן לטמפרטורת חדר במשך 15 דקות. ואז, בקצרה מערבולת כל צינור מלא מדגם.
      4. השתמש "פרוטוקולי הרכישה ספציפי assay" שהוגדרו בשלב 3.2.1 לרוץ מדגם הבקרה השלילי (כלומר, דם בלבד) ואת הבקרה החיוביתדגימות (כלומר, לו שליטה, בקרה FITC) דרך מערכת cytometry הזרימה. סקור את היסטוגרמות ולהתאים את הצינור המכפיל (PMT) מתח של FITC ו Phycoerythrin ערוצים (PE) לפי צורך.
      5. וורטקס דגימות בקרה ולהעבירם זרימת cytometry קרוסלה המערכת לפי הסדר על worklist. ואז, במקום קרוסלה בתא הדגימה ולחץ על כפתור Cytometer סרגל הכלים "התחל" כדי להשיג נתונים על דגימות שליטה. שמור את "xxx הגדרת Pro" פרוטוקול ההגדרה.
  3. רוכש דגימות מחקר על מערכת cytometry הזרימה.
    1. הסר את הצינורות מדגם המחקר מהמקרר 4 ° C. ולאפשר לאזן לטמפרטורת החדר למשך 15 דקות.
    2. בעוד הדגימות equilibrating, גרור את פרוטוקולי רכישה המוגדרים מראש ספציפי מחקר למרחב worklist לעשות worklist פרויקט.
    3. ודא "פרוטוקול ההגדרה" צמוד &# 34;. פרוטוקולי הגדרה ספציפית assay "שהוגדרו בשלב 3.2.2 לאחר מכן, הזן את הפרטים המזהים (למשל, שם מחקר, לצייר מספר, מספר ביקור, מזהה נושא) עבור כל צינור לתוך רשימת העבודה.
    4. לאחר תקופת איזון 15 דקות, דגימות מחקר מערבולת ולהעבירם הזרימה cytometry קרוסלת מערכת לפי ההסדר על worklist. ואז, במקום קרוסלה בתא הדגימה ולחץ על כפתור Cytometer סרגל הכלים "התחל" כדי להשיג נתונים על דגימות המחקר.
    5. סקור את איכות הנתונים על ידי בוחן את יעילות תמוגה RBC ועל החלוקה תת תא WBC, פרופורציות, ספירה מוחלטת, עוצמות קרינה בלוח הדו"ח של כל דגימה.
      הערה: איכות הנתונים נחשבת מקובל אם כל הקריטריונים הללו הם בתוך הגבולות המוגדרים מראש שלהם. אם כל הקריטריונים אינם מתקיימים, המדגם צריך להיות reprocessed.
    6. נקי לסגור את מערכת cytometry הזרימה. אחסן את cytometry הזרימהנתונים על שני כוננים במחשב אחרים כדי למנוע אובדן נתונים בשוגג.

ניתוח 4. נתונים

  1. לבצע את הניתוח phagocytosis.
    1. איחוד כל phagocytosis (כלומר, F שכותרתו) נתונים במצב מדגם ובקרה רשימה קובצי נתונים (LMD) לתוך תיקייה אחת. לאחר מכן, פתח את זרימת cytometry תוכנה לניתוח וגרור את הקבצים לתוך מרחב המדגם.
    2. הגדירו את WBC, גרנולוציט, מונוציטים, ו לימפוציטים שערים.
      1. לחץ פעמיים על שם הקובץ כדי לפתוח כל אחד "דגימות בקרה FITC". השתמש בתפריטים הנפתחים כדי להגדיר את ציר ה- x כדי "FSC" ו "ליניארי" ואת ציר y כדי "SSC" ו "ליניארי".
      2. השתמש "בורר שער פוליגון" להכין שער של אוכלוסיית WBC הכולל.
        הערה: הקפד לכלול את כל התאים בקצוות של התרשים. לייבל השער הזה "WBC".
      3. לחץ פעמיים על "שער WBC חדש" ולהשתמש drop-הנפתחים כדי להגדיר את ציר ה- x כדי "FSC" ו "ליניארי" ואת ציר y כדי "SSC" ו "ליניארי".
      4. השתמש "בורר שער פוליגון" כדי להגדיר את "שער גרנולוציט" והשער מונוציטים ", ולאחר מכן השתמש" בורר השער אליפטי "כדי להגדיר את" השער הלימפוציטים ". לייבל כל שער בהתאם. גרור את" נתוני שער (%) "בצד כך התאים נתפסים בקלות.
    3. בחר את "Phagocytosis חיובי השער" ואת "שער שלילי Phagocytosis" עבור האוכלוסיות גרנולוציט ו מונוציטים.
      1. לחץ פעמים על "המדגם מלא FITC" המשמש שלב 4.1.2.1. לאחר מכן, לחץ על "שער גרנולוציט" והשתמש בתפריטים הנפתחים כדי להגדיר את ציר ה- x כדי "FL1" ו- "היומן" ואת ציר y כדי "SSC" ו "ליניארי".
      2. השתמש "בורר השער מרובע" לקבוע "שער שלילי Phagocytosis" לבין "Phagocytosis פוסיטive שער ".
        הערה: מאז דגימות בקרת FITC לא קבלו בקטריאלי (כלומר, S. aureus) גירויים, כל התאים צריכים תיאורטית להיות phagocytosis שלילי. להפעיל שיקול דעת בעת הקמת הגבולות עבור אוכלוסיות אלו.
      3. חזור על שלב 4.1.3.1 ו 4.1.3.2 שלב לאוכלוסייה מונוציטים.
    4. להוסיף סטטיסטיקה עבור "% של WBC", "עוצמת קרינה", ו "תאים חיוביים phagocytosis%" עבור האוכלוסיות גרנולוציט ו מונוציטים.
      1. הקש על "המדגם מלא FITC" המשמש שלב 4.1.2.1. סמן את "שער גרנולוציט", ולאחר מכן לחץ על "סביבת עבודה" ו "להוסיף סטטיסטיקה". הדגש "גיאומטרי" ו "FL1 יומן" ולחץ על "הוסף". אז בחרתי את "תדר של ההורה" נתון ולחץ על "הוסף".
        הערה: זה ייתן את עוצמת הקרינה (ממוצע גיאומטרי) מאוכלוסיית גרנולוציט כולואחוז WBC (ההורה) כי הם גרנולוציטים.
      2. הקש על "המדגם מלא FITC" המשמש שלב 4.1.2.1. סמן את "שער חיובי Phagocytosis" של האוכלוסייה גרנולוציט, ולאחר מכן לחץ על "סביבת עבודה" ו "להוסיף סטטיסטיקה". הדגש "גיאומטרי" ו "FL1 יומן" ולחץ על "הוסף". לאחר מכן בחר את "תדר של הורה" נתון ולחץ על "הוסף".
        הערה: זה ייתן את עוצמת הקרינה (ממוצע גיאומטרי) של גרנולוציטים phagocytosis החיוביים ואחוז של גרנולוציטים (ההורה) כי הם phagocytosis חיובי.
      3. חזור על שלב 4.1.4.1 ו 4.1.4.2 שלב לאוכלוסייה מונוציטים.
      4. הקש על "המדגם מלא FITC" המשמש שלב 4.1.2.1. סמן את "השער לימפוציטים", ולאחר מכן לחץ על "סביבת עבודה" ו "להוסיף סטטיסטיקה". סמן את הנתון "תדר של הורה" ולחץ על "הוסף".
        הערה: זהייתן אחוז WBC (ההורה) כי הם לימפוציטים.
      5. סמן את כל השערים והסטטיסטיקות שנוצרו מדגם שליטת FITC המשמש שלב 4.1.2.1. גרור אותם לתוך "כל הדגימות" בחלונית "הקבוצה" בחלק העליון של המסך.
        הערה: זה יהיה להחיל הגדרות אלו על כל דגימות המחקר.
      6. שמור שם העבודה כקובץ .wsp באותה תיקייה שמכילה את התיקייה LMD.
    5. התאם שערי מדגם בודדים.
      1. הקש על "המדגם הראשון" בערכת הנתונים ולאשר ששער WBC כראוי מתאים חלוקת התא על המסך. אם זה לא, לחץ וגרור את הקצוות של השער להתאים את שער מדגם זה. הקישו על "חץ ימינה" (כלומר, "˃") כדי להתקדם המדגם הבא. חזור על פעולה זו עד שכל הדגימות נבדקו.
      2. הקש על "שער WBC" למדגם הראשון במערכת הנתונים ולאשר כי "גראןulocyte השער "," מונוציטים השער ", ו" הלימפוציטים השער "עבור כל דגימה כראוי להתאים את חלוקת התא על המסך. התאם לפי הצורך. לחץ על" חץ ימינה "(כלומר," ˃ ") כדי להתקדם המדגם הבא .
      3. חזור על שלב 4.1.5.2 עד שכל הדגימות נבדקו. לאחר מכן, לחץ על "שמור".
    6. להציג את הנתונים בתוכנית גיליון אלקטרוני.
      1. לחץ על הסמל "עורך הטבלה" בחלק העליון של המסך. לחץ על "ערוך", "מילות מפתח", ו 'DATE $ "כדי לכלול את התאריך הדגים על הגיליון האחרון. לאחר מכן, לחץ על "ערוך", "מילות מפתח", ו "@ SAMPLEID1" לכלול זיהוי הדגימה על הגיליון האחרון. חזור על הפעולה עבור "@ SAMPLEID2", "@ SAMPLEID3", ו "@ SAMPLEID4".
      2. התאם את המסך "לוח עורך" והמסך "מדגם", כך שניתן יהיה לצפות גם על מסך המחשב. Sele גודלct כל "מדגם" שבגיליון המדגם. לאחר מכן, גרור כל נתון המעניין את "עורך הטבלה".
        1. גרור את "תדר. של החברה האם" נתון מופיע תחת "שער גרנולוציט" אל "עורך טבלה". סוג "WBC% כמו גרנולוציטים" תחת עמודת "שם" של "עורך הטבלה".
        2. גרור את הנתון "הממוצע הגיאומטרי" מופיע תחת "שער גרנולוציט" אל "עורך הטבלה". הקלד "גיאומטרית קרינה, גרנולוציטים" תחת עמודת "שם" של "עורך הטבלה".
        3. גרור את "התדר. של חברה האם" הנתון מופיע תחת "שער גרנולוציט / Phagocytosis החיובי" ל "עורך הטבלה". סוג "% Phagocytosis חיוביים גרנולוציטים" תחת עמודת "שם" של "עורך הטבלה".
        4. גרור את נתון "ממוצע גיאומטרי" מופיע תחת "שער גרנולוציט / Phagocytosis חיובי" כדי the "עורך טבלה". הקלד "קרינה ממוצעת גיאומטרית, Phagocytosis חיובי גרנולוציטים" תחת עמודת "שם" של "עורך הטבלה".
        5. גרור את "התדר. של חברה האם" הנתון מופיע תחת "שער מונוציטים" אל "עורך הטבלה". סוג "WBC% כפי מונוציטים" תחת עמודת "שם" של "עורך הטבלה".
        6. גרור את הנתון "הממוצע הגיאומטרי" מופיע תחת "שער מונוציטים" אל "עורך הטבלה". הקלד "גיאומטרית קרינה, מונוציטים" תחת עמודת "שם" של "עורך הטבלה".
        7. גרור את "התדר. של חברה האם" הנתון מופיע תחת "שער מונוציטים / Phagocytosis החיובי" ל "עורך הטבלה". הקלד "% Phagocytosis חיובי מונוציטים" תחת עמודת "שם" של "עורך הטבלה".
        8. גרור את נתון "ממוצע גיאומטרי" מופיע תחת "מונוציטים / Phagocytosis חיובי שער "אל" עורך הטבלה ". הקלד" קרינה ממוצעת גיאומטרית, Phagocytosis חיובי מונוציטים "תחת" "הטור של" שם עורך הטבלה ".
        9. גרור את "תדר. של החברה האם" נתון מופיע תחת "השער הלימפוציטים" אל "עורך טבלה". סוג "WBC% כמו לימפוציטים" תחת עמודת "שם" של "עורך הטבלה".
      3. גרור ושחרר את הפרמטרים הגלויים "עורך הטבלה" עד שהם מסודרים לפי הסדר הרצוי.
      4. לחץ על "שמור". לאחר מכן, לחץ על "פתח שולחן" כדי להציג את הנתונים בפורמט גיליון אלקטרוני. לחץ על "שמור בשם" כדי לשמור שם עבודה .xlsx קובץ.
  2. חזור על שלב 4.1 עבור assay פעילות OB (כלומר, H שכותרתו) דגימות ולשלוט קבצי נתונים LMD.
    הערה: הקפד להחליף את כל אזכור של phagocytosis עם אזכור של פעילות OB.

    3. Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

יש תרגיל ממושך ואינטנסיבי השפעה עמוקה על תפקוד מערכת חיסון מולד, כולל תפקוד תא רוצח טבעי, בתגובה בתיווך ציטוקינים מקרופאג זיהום ויראלי, ו גרנולוציט ו phagocytosis מונוציטים ופעילות OB. מחקרים רבים מצביעים על כך מגביר phagocytosis גרנולוציט ו מונוציטים משמעותי שלאחר אימון, המשקף את הדלקת הנגרמת על ידי ניזק לשרירי דרישות מטבוליות. לעומת זאת, גרנולוציט ופעילות מונוציטים OB פוחתת שלאחר אימון ועלול להיות אינדיקטור אחד חיסוני של רגישות מוגברת לזיהום. לדוגמה, איור 1 מראה כי phagocytosis של ס aureus ידי גרנולוציטים הוא גדל באופן מיידי 1.5-שעות לאחר התקף אופניים 75 ק"מ (70% VO 2MAX), חוזרים לשגרה עד הבוקר הבא. Phagocytosis מונוציטים מושפע באופן דומה על ידי רמה זו של פעילות גופנית. איור 2 מראה כי פעילות OB גרנולוציט היא ירידהד עבור 21-hr לפחות לאחר 75 ק"מ רכיבה על אופניים. OB פעילות מונוציטים הוא ירד גם לאחר רכיבה על אופניים 75 ק"מ.

Phagocytosis גרנולוציט ו מונוציטים של ס aureus, אך לא פעילות OB גרנולוציט ו מונוציטים, אשר מתואמים סמנים דלקת מערכתית איור 3 מציג את המתאם צנוע בין phagocytosis גרנולוציט וחלבון סרום תגובתי C (CRP) רמות (קורלציה של פירסון;. r = 0.44; P <0.01 ) ב 106 נשים שסבלו מעודף משקל / השמנה. CRP הסרום גם מתואם phagocytosis מונוציטים של ס aureus (קורלציה של פירסון; r = 0.30; P <0.01). בנוסף, נויטרופילים בדם / ספירת לויקוציטים (פירסון המתאם של הרגע; r = 0.62 ו- R = 0.61, בהתאמה; P <0.001), אינדקס מסת הגוף (קורלציה של פירסון; r = 0.50 ו- R = 0.40, בהתאמה; P <0.001), רמות אינסולין בדם (r = 0.30 ו- R =0.23; P <0.03), ורמות דם A 1C (פירסון המתאם של הרגע; r = 0.28 ו- R = 0.21, בהתאמה; P <0.04) מתואמים phagocytosis גרנולוציט ו מונוציטים של ס aureus. באופן כללי, נתונים אלה מצביעים על כך גרנולוציט גבוהה phagocytosis מונוציטים במקצועות המנוחות מעידה על דלקת מערכתית.

איור 1
איור 1: גרנולוציט Phagocytosis מושפעת פעילות אירובית אינטנסיבית phagocytosis גרנולוציט עלה מיד ו -1.5-hr לאחר התקף אופניים 75 ק"מ ב 70% של VO 2MAX.. על ידי 21-hr שלאחר האימון, phagocytosis גרנולוציט חזר מעט מתחת לרמות לפני האימון. * מציין את ההבדל בין תרגיל מראש (חוזרות אמצעים ANOVA עם מבחן t מזווג פוסט הוק ניתוח, בעת הצורך; N = 19, p <0.05). ערכים הם ליסטיית התקן ±. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 2

איור 2:. פעילות פרץ חמצוני גרנולוציט מושפעת פעילות אירובית אינטנסיבית חמצוני גרנולוציט פעילות פרץ ירד מיד, 1.5-hr, ו -21-hr לאחר התקף אופניים 75 ק"מ ב 70% של VO 2MAX. * מציין את ההבדל בין תרגיל מראש (חוזרות אמצעים ANOVA עם מבחן t מזווג פוסט הוק ניתוח, בעת הצורך; N = 19, p <0.05). ערכים הם ממוצע ± סטיית התקן. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

. איור 3: גרנולוציט Phagocytosis מתואם עם מערכתי דלקת עודף משקל / נשים שמנות phagocytosis גרנולוציט היה מתואם לחלבון הסרום C-reactive, סמן ביולוגי מקובל של דלקת מערכתית (קורלציה של פירסון; N = 87; r = 0.44; P <0.01). נא ללחוץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

כתב יד זה מספק פרוטוקול צעד אחר צעד עבור קביעת שני אינדיקטורים של גרנולוציט ותפקוד מונוציטים. זיהינו כמה צעדים חיוניים להצלחת assay זה. צעד אחד כזה הוא הדגירה-באמבט קרח המתרחשת באופן מיידי לפני תוספת של חיידקים. קירור יסודי של כל הדגימות יהיה למזער את השפעת הטמפרטורה על פעילות phagocytosis ו OB. עוד צעד קריטי הוא התוספת של חיידקי מדגם זה. A 8: 1 חיידקים: יחס תָא בַּלעָן מייצר תוצאות אופטימליות; אולם חוקרים אחרים עשויים למצוא כי היחס הזה יצטרך להיות שונה כדי להפיק תוצאות מתאימות. שלב קריטי נוסף הוא השימוש של lysing RBC ריאגנטים תיקון WBC כדי lyse RBCs ולתקן WBCs. השימוש ריאגנטים כגון זה מבטיח תמוגה שלם של RBCs ומאפשר לחוקרים לאחסן דגימות מעובד בבטחה על 4 מעלות צלזיוס למשך הלילה, ולאחר מכן להפעיל אותם דרך זרימת cytometer למחרת. עבודות קודמות (לא פורסם) הודיאטס כי lysing RBC ותיקון WBC ניתן להשתמש כדי לעכב את cytometry זרימת דגימות קבוע על ידי רבים כמו 12 שעות מבלי לפגוע בשלמות הנתונים.

הליך זה ניתן לשנות בקלות כדי לענות על היכולות ואינטרסים של החוקר, אך יש להדגיש כי אופטימיזציה נחוץ כאשר עיבודים מבוצעים. כמה מן העיבודים הנפוצים ביותר שדווחו הם חיידקי היעד, התווית / הבדיקה, ואת זמן הדגירה. חוקרים יצרו תוצאות יוצאות דופן כאשר 7,8 coli Escherichia משמש במקום של ס aureus הפתוגן היעד (הן בבית 8: יחס 1). פטריה, כגון שמר האפייה, יכול להיות גם מתאים כתחליף E. coli. בנוסף, החוקרים לעתים קרובות להשתמש בדיקה מולקולרית pH רגיש, 7,12 במקום FITC, כמו החללית עבור phagocytosis. כמו כן, בדיקות אחרות ממה שהוא משמש למדידת פעילות OB, includindiacetate גרם dichlorofluorescin (DCF-DA) 10 ו dihydrorhodamine 123 (DHR). 13 פעמי דגירה מדווחות לנוע בין 20 דקות ל -120 דקות, 12,14,15 עם McFarlin דיווח כי זמן התגובה המקסימאלי עשוי להשתנות לפי יעד חיידקים. 7 זה צריך להטריד אותי גם לציין כי פעמי הדגירה האופטימליות עשויות להשתנות בין היבטי phagocytosis ו OB של assay. 7

כמו בכל מבחני מעבדה, פתרון בעיות ייתכן שיהיה צורך בעת הקמת טכניקה זו במסגרת מחקרית חדשה. המחברים ממליצים אופטימיזציה של חיידקים: יחס תָא בַּלעָן הוא המפתח להצלחה עבור assay זה. המחברים מציינים כי הנתונים ממדגמים אמורים להיות מושלך מניתוח אם יש פחות מ 80% מכלל התאים באוכלוסייה גרנולוציט ממשתתף שאינו חולה הם FITC החיוביים; במצב זה, המדגם יכול להיות מחדש נאסף מחדש ניתח, במידת האפשר.

ישנן מספר מגבלות עלphagocytosis גרנולוציט ו מונוציטים ו assay פעילות OB המתואר בכתב היד הזה. מגבלה אחת כזו היא השימוש הבלעדי של FSC ו SSC לזהות אוכלוסיות תאים של עניין. שימוש סמנים פני התא יאפשר לחוקרים לזהות אוכלוסיות תאים חיוביים. 10 עם זאת, התוספת של תכונה זו תדרוש יותר זרימה בסיסית cytometer, ולכן היא מעבר להיקף של כתב היד הזה. מגבלה נוספת של assay זה היא כי היא מסתמכת על היעילות של trypan כחול כדי להרוות את הקרינה של בדיקות כי לא הופנמו על ידי תאי מערכת החיסון של עניין. 7,12 בדיקה מולקולרית רגיש pH יכול לשמש כחלופה FITC במצבים בהם הפנמה היא דאגה. מאז בדיקה כזו היא פלורסנט רק בסביבה חומצית כגון אלה שלפוחית ​​endocytic, קרינת רכש מייצגת חלקיקים מופנמים בלבד. בנוסף, כמה חוקרים מתחו ביקורת על assay הנוכחי כי זה לעשותes לא לכלול סט מקביל של דגימות כי הוא מודגרות במי קרח במקום ב 37 ° C כדי לשלוט על פעילות תא בסיס חיסונית. בכמה הזדמנויות, כללנו "מצב הקרח" זה בעת ביצוע phagocytosis גרנולוציט ו מונוציטים ופעילות OB assay, ומצאתי שזה לא לשפר באופן משמעותי את איכות הנתונים (לא פורסם).

לסיכום, כתב היד הזה מתאר טכניקה למדידת פעילות phagocytosis ו OB ב גרנולוציטים ומונוציטים. זהו assay פשוטה וישירה כי ניתן לשנות בקלות לתת דין וחשבון על יכולות מעבדת תחומי מחקר. בתרגיל מדע ומחקר הקשורות להשמנה, מדד זה של תפקוד מערכת חיסון מולד יאפשר החוקר לחקור את ההשפעות של נגד פוטנציאלי רב, כוללים ירידה במשקל, שימוש תוספת, התערבויות תזונתיות, ושינויים באורח חיים. עם מאסטרינג טכניקה זו, חוקרים יוכלו לפקח חריףושינויים כרוניים בתפקוד תא חיסוני בתגובת דיאטה, פעילות גופניות, גירויים רבים אחרים.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Acknowledgments

המחברים מבקשים להודות זאק שו, קייסי ג'ון, ולין Cialdella-קם על סיועם במהלך אופטימיזציה של הליך זה.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
12 x 75 mm tubes, with cap VWR 20170-579 You will need 2 tubes per sample ("H" and "F") plus 3 tubes per batch (for assay controls; "F", "H", and "Blood only").
PBS (10x), pH 7.4 Life Technologies 70011-044
Bottle top 0.2 µm cellulose acetate filter (500 ml capacity) Fisher Scientific 09-741-07 
Glucose, powder Life Technologies 15023-021
Citric acid (anhydrous, cell culture tested, plant cell culture tested) Sigma-Aldrich C2404-100G
Sodium citrate tribasic dihydrate Sigma-Aldrich S4641-25G
Dihydroethidium (Hydroethidine) (HE) Life Technologies D11347
Dimethyl sulfoxide (DMSO) Anhydrous Life Technologies D12345
Staphylococcus aureus (Wood strain without protein A) BioParticles, fluorescein conjugate (FITC) Life Technologies S2851
Staphylococcus aureus (Wood strain without protein A) BioParticles, unlabeled Life Technologies S-2859
Trypan Blue Solution, 0.4% Life Technologies 15250-061
4.0 ml vacutainer containing 7.2 mg K2EDTA, spray-dried VWR BD367861 You will need 1 K2EDTA blood collection tube per sample.
4.0 ml vacutainer containing 68 USP units Lithium Heparin, spray-coated VWR BD367884 You will need 1 Lithium Heparin blood collection tube per sample.
COULTER Ac·T 5diff CP Beckman Coulter 6605705 i.e., hematology analyzer
COULTER Ac·T 5diff Rinse Beckman Coulter 8547167
COULTER Ac·T 5diff Fix Beckman Coulter 8547171
COULTER Ac·T 5diff WBC Lyse Beckman Coulter 8547170
COULTER Ac·T 5diff Hgb Lyse Beckman Coulter 8547168
COULTER Ac·T 5diff Cal Calibrator Beckman Coulter 7547175
COULTER Ac·T 5diff Control Plus Beckman Coulter 7547198
AcT 5diff Diluent Beckman Coulter 8547169
200 µl extended-length pipette tips VWR 37001-526
Insulated ice pan VWR 89198-980 For ice water bath.
Open metal tube rack VWR 60916-702
Fetal Bovine Serum Life Technologies 26140-111
TQ-Prep Workstation Beckman Coulter 6605429 i.e., automated cell lyse preparation workstation
ImmunoPrep Reagent System Beckman Coulter 7546999 i.e., RBC lyse/WBC fix reagent system
Cytomics FC500 MCL Flow Cytometry System with CXP Software Beckman Coulter 626553
IsoFlow Sheath Fluid Beckman Coulter 8547008
COULTER CLENZ Beckman Coulter 8546929
Flow-Check Fluorospheres  Beckman Coulter 6605359 i.e., alignment and fluidics verification fluorospheres
FlowJo Software FlowJo FlowJo i.e., flow cytometry analysis software
Excel Software Microsoft Microsoft Excel i.e., electronic spreadsheet program

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Nieman, D. C., et al. Influence of pistachios on performance and exercise-induced inflammation, oxidative stress, immune dysfunction, and metabolite shifts in cyclists: a randomized, crossover trial. PLoS One. 9, e113725 (2014).
  2. Knab, A. M., et al. Effects of a freeze-dried juice blend powder on exercise-induced inflammation, oxidative stress, and immune function in cyclists. Appl Physiol Nutr Metab. 39, 381-385 (2014).
  3. Konrad, M., et al. The acute effect of ingesting a quercetin-based supplement on exercise-induced inflammation and immune changes in runners. Int J Sport Nutr Exerc Metab. 21, 338-346 (2011).
  4. Nieman, D. C., et al. Immune and inflammation responses to a 3-day period of intensified running versus cycling. Brain Behav Immun. 39, 180-185 (2014).
  5. Nieman, D. C., et al. Carbohydrate supplementation affects blood granulocyte and monocyte trafficking but not function after 2.5 h of running. Am J Clin Nutr. 66, 153-159 (1997).
  6. Tidball, J. G. Inflammatory cell response to acute muscle injury. Med Sci Sports Exerc. 27, 1022-1032 (1995).
  7. McFarlin, B. K., Williams, R. R., Venable, A. S., Dwyer, K. C., Haviland, D. L. Image-based cytometry reveals three distinct subsets of activated granulocytes based on phagocytosis and oxidative burst. Cytometry A. 83, 745-751 (2013).
  8. Liao, Y., Liu, P., Guo, F., Zhang, Z. Y., Zhang, Z. Oxidative burst of circulating neutrophils following traumatic brain injury in human. PLoS One. 8, e68963 (2013).
  9. McFarlin, B. K., Venable, A. S., Prado, E. A., Henning, A. L., Williams, R. R. Image-based flow cytometry technique to evaluate changes in granulocyte function in vitro. J Vis Exp. , (2014).
  10. Nieman, D. C., et al. Immune response to obesity and moderate weight loss. Int J Obes Relat Metab Disord. 20, 353-360 (1996).
  11. Nieman, D. C., et al. Immune function in female elite rowers and non-athletes. Br J Sports Med. 34, 181-187 (2000).
  12. Ichii, H., et al. Iron sucrose impairs phagocytic function and promotes apoptosis in polymorphonuclear leukocytes. Am J Nephrol. 36, 50-57 (2012).
  13. Gomes, A., Fernandes, E., Lima, J. L. Fluorescence probes used for detection of reactive oxygen species. J Biochem Biophys Methods. 65, 45-80 (2005).
  14. Gruger, T., et al. Negative impact of linezolid on human neutrophil functions in vitro. Chemotherapy. 58, 206-211 (2012).
  15. Dementhon, K., El-Kirat-Chatel, S., Noel, T. Development of an in vitro model for the multi-parametric quantification of the cellular interactions between Candida yeasts and phagocytes. PLoS One. 7, e32621 (2012).

Tags

אימונולוגיה גיליון 115 phagocytosis פרץ חמצוני מונוציטים גרנולוציט חסינות מולדת cytometry זרימה
מדידת פעילות פרץ גרנולוציט ו מונוציטים Phagocytosis חמצוני בדם אנושי
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Meaney, M. P., Nieman, D. C.,… More

Meaney, M. P., Nieman, D. C., Henson, D. A., Jiang, Q., Wang, F. Z. Measuring Granulocyte and Monocyte Phagocytosis and Oxidative Burst Activity in Human Blood. J. Vis. Exp. (115), e54264, doi:10.3791/54264 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter