Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Måling granulocyt og monocyt Fagocytose og Oxidativ Burst Aktivitet i humant blod

Published: September 12, 2016 doi: 10.3791/54264
Automatic Translation
1, 1, 2, 3, 3
1Human Performance Laboratory, North Carolina Research Campus, Appalachian State University, 2Department of Biology, Appalachian State University, 3David H. Murdock Research Institute

Introduction

Den granulocyt og monocyt fagocytose / oxidative udbrud (OB) aktivitetsanalyse en enkel, ligetil teknik, der ofte anvendes til at indsamle oplysninger om medfødte immunfunktion efter længere tids og intensiv træning. 1-4 Når man undersøger reaktion af immunsystemet til en stimulus, granulocytter og monocytter er af særlig interesse, fordi de spiller en central rolle i værtsforsvar og er de første immunceller at akkumuleres ved infektionsstedet. 5 Neutrofiler, en type granulocyt, er de første celler til at translokere ind beskadigede muskel væv efter intensiv træning. 6 Fagocytose og OB aktivitet er de mest almindelige mål for granulocyt og monocyt funktion, 7 og foretrækkes som indikatorer for medfødte immunforsvar celle funktion på grund af deres centrale rolle i både infektionen proces og reparationsprocessen.

Den i dette manuskript Uti assayZES en grundlæggende flowcytometer at tilvejebringe en kvantitativ bestemmelse af granulocyt og monocyt fagocytose og OB-aktivitet i fuldblod. Anvendelsen af ​​helblod i denne teknik er fordelagtig, fordi den tillader assayet skal udføres uden tidskrævende oprensningsprocedure. Dette assay kan let modificeres til at rumme en række forskningsdesigns og lab kapaciteter. For eksempel, Liao et al. Anvendt en lignende teknik til at vise, at neutrofil OB aktivitet forøges, og neutrofil fagocytose formindskes efter traumatisk hjerneskade. 8 I et andet eksempel, McFarlin et al. Beskrev et elegant modifikation af denne teknik, der bruger allophycocyanin (APC ) -konjugeret CD66b og højtydende tandem APC-konjugeret CD45 mærkning med billedbaseret flowcytometri at klassificere granulocytter i form af deres fagocytose og OB aktiviteter. 7,9

Vores forskergruppe har brugt forskellige tilpasninger af denne technique som indikator for medfødt immunforsvar hos overvægtige, svært overvægtige, og atletisk befolkninger i næsten 20 år. 10,11 Teksten nedenfor vil give læseren trin-for-trin instruktioner til at udføre denne analyse og fremhæve områder, som læseren kan tilpasse at opfylde behovene i deres forskning.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

BEMÆRK: Alle procedurer indsamling blod blev gennemført i overensstemmelse med de retningslinjer fastsat af Appalachian State University (ASU) Institutional Review Board (IRB).

1. Assay Forberedelse

  1. Saml, forberede og organisere de materialer, der for proceduren (se Tabel over specifikke materialer / udstyr).
    1. Label 12 x 75 mm rør.
      1. Label to rør til hver deltager: et rør til fagocytose assay (mærke dette rør med sort blæk og et "F" for fluoresceinisothiocyanat [FITC]) og et rør til OB aktivitet assay (mærke dette rør med rødt blæk og en " H "for dihydroethidium [HE]).
        BEMÆRK: Brugen af ​​sterile 12 x 75 mm rør anbefales at minimere utilsigtet cellulær aktivering og tilhørende stigning i baggrundsstøj.
      2. Label tre rør til analysekontroller: et rør til fagocytose assay (FITC kontrol: mærke dette rør med black blæk og et "F"), et rør til OB aktivitet assay (HE kontrol: mærke dette rør med rødt blæk og et "H"), og et rør til den negative kontrol (Blood kun: mærke dette rør med grønt blæk og "kun blod").
    2. Forbered stamopløsninger mindst én dag før dagen for analysen.
      1. Forbered steril phosphatbufret saltvand (PBS). Fortynd 100 ml 10x PBS med 900 ml 18,2 MQ H 2 O. Filtersteriliser med et 0,2 um filter. Opbevares ved 4 ° C indtil anvendelse.
      2. Forbered sterilt PBS-glucose. Opløs 1,0 g glucose i 100 ml PBS. Filtersteriliser med et 0,2 um filter. Opbevares ved 4 ° C indtil anvendelse.
      3. Forbered sterile 0,1 M citratpuffer. Opløs 1,2 g citronsyre og 1,1 g natriumcitrat i 100 ml 18,2 MQ H 2 O. Justere pH til 4,0. Filtersteriliser med et 0,2 um filter. Opbevares ved 4 ° C indtil anvendelse.
      4. Forbered HE stamopløsning. Resuspend 1,0 mg HE i 1,0 ml dimethylsulfoxid (DMSO). Bland forsigtigt, portion, og opbevares ved -20 ° C indtil brug.
      5. Forbered FITC-mærket Staphylococcus aureus (S. aureus) stamopløsning (2 x 10 9 partikler / ml). Resuspender 10 mg FITC-mærket S. aureus i 1,5 ml (eller passende mængde) af PBS. Kløft i tre 500 pi alikvoter og soniker ifølge producentens anbefaling. Alikvot og opbevares ved -20 ° C indtil brug.
      6. Forbered umærkede S. aureus stamopløsning (2 x 10 9 partikler / ml). Resuspender 100 mg umærket S. aureus i 15 ml (eller passende mængde) af PBS. Opdele i tredive 500 pi alikvoter og soniker ifølge producentens anbefaling. Alikvot og opbevares ved -20 ° C indtil brug.
    3. Forbered friske arbejdsopløsningerne på dagen for assayet.
      1. Forbered HE brugsopløsning. Overfør 10 pioptøede HE stamopløsning til 990 pi PBS-glucose. Beskytte mod lys og holde på is indtil brug.
      2. Forbered FITC-mærkede S. aureus arbejdsopløsning (133,333 partikler / pl). Overfør 70 pi optøede FITC-mærket S. aureus stamopløsning til 980 pi PBS. Beskytte mod lys og holde på is indtil brug.
      3. Forbered umærkede S. aureus arbejdsopløsning (133,333 partikler / pl). Overførsel 70 pi optøet umærket S. aureus stamopløsning til 980 pi PBS. Beskytte mod lys og holde på is indtil brug.
      4. Forbered quench løsning. Med 750 pi 0,4% trypanblåt opløsning til 11,25 ml steril 0,1 M citratbuffer. Opbevares i et is-vandbad, indtil brug.
    4. Har en certificeret bioanalytikeren trække blod ifølge World Health Organization retningslinjer for udarbejdelse blod.
      1. Trække blod ind i en 4 ml blodopsamlingsrør indeholdende K2EDTA. Ivert blodopsamlingsrør ifølge producentens anvisninger. Hold blodopsamlingsrør ved stuetemperatur på en bench-top rocker indtil anvendelse. Brug denne blod for komplet blodtælling (CBC) med hvide blodlegemer (WBC) differential analyse beskrevet i trin 1.2.1.
      2. Trække blod ind i en 4 ml blodopsamlingsrør indeholdende lithium heparin. Invert blodopsamlingsrør ifølge producentens anvisninger. Hold blodopsamlingsrør ved stuetemperatur på en bænk-top rocker indtil anvendelse. Brug dette blod til monocyt og granulocyt fagocytose og OB aktivitetsassay beskrevet i trin 2.
  2. Bestem mængden af bakterier (dvs. S. aureus), som vil være nødvendige for at fuldføre analysen for hver prøve.
    1. Brug en hæmatologianalysator at udføre en CBC med WBC differential analyse af blod som beskrevet i producentens instruktioner. Notér den leukocyttal (i celler / ml),% Neutrofil, og%Monocyt værdier.
    2. Brug ligningerne nedenfor for at bestemme neutrofile og monocyttal for hver prøve.
      Neutrofiltal (i celler / ml) =% Neutrofil × WBC (i celler / ml)
      Monocyt count (i celler / ml) =% monocyt × WBC (i celler / ml)
    3. Brug ligningerne nedenfor for at bestemme fagocytten tæller for hver prøve, og antallet af fagocytter til stede i 100 pi prøve.
      Phagocyt count (i celler / ml) = neutrofiltal (i celler / ml) + Monocyt count (i celler / ml)
      Antal fagocytter i 100 pi = (phagocyt count (i celler / ml)) / 10
    4. Brug nedenstående ligning til at bestemme antallet af bakterier (dvs. S. aureus), der er nødvendige for hver prøve, og mængden af FITC-mærket S. aureus eller umærket S. aureus arbejdsopløsning (133,333 partikler / ml), der skal sættes til hvert rør.
      BEMÆRK: target bakterier: fagocyt forholdet er 8: 1.
      Antal bakterier nødvendige =Antal fagocytter i 100 pi × 8
      Volumen af FITC eller umærket arbejdsopløsning behov (i pi) = (antallet af bakterier, der er nødvendige) / (133,333 partikler / ul)

2. Udfør Assay

  1. Forbered fuldblod til assayet.
    1. For hver deltager og kontrol rør, bruge en udvidet længde pipettespidsen at overføre 100 pi helblod fra lithiumheparin blodopsamlingsrør til bunden af ​​en hensigtsmæssigt mærket 12 x 75 mm rør. Udskift caps.
      BEMÆRK: Vær omhyggelig med at undgå at få blod på siderne af mm rør 12 x 75.
    2. Brug en mikropipette at tilføje 10 pi af HE arbejder løsning på rørene mærket med rødt blæk og et "H", herunder HE kontrol røret. Udskift hætter og kortvarigt vortex.
    3. Inkubér alle rørene i et 37 ° C vandbad i 15 min. Derefter straks overføre alle rør til et is-vandbad i 12 min.
      BEMÆRK: Brug en åben metal rackog ryst forsigtigt stativet hver 5 min for at sikre, at rørene er hurtigt og tilstrækkeligt opvarmet eller kølet.
  2. Tilføj bakterier (dvs. S. aureus) til prøven og kontrol rør de.
    1. Brug en mikropipette at tilføje den passende mængde (beregnet i trin 1.2.4) af umærket S. aureus arbejdsopløsning til rørene mærket med rødt blæk og et "H", herunder HE kontrolrør. Udskift hætter og kortvarigt vortex.
    2. Brug en mikropipette at tilføje den passende mængde (beregnet i trin 1.2.4) af FITC-mærket S. aureus arbejder løsning på rørene mærket med sort blæk og et "F", herunder FITC kontrol røret. Udskift hætter og kortvarigt vortex.
    3. Vortex "blod kun" kontrolrør, men føjer ikke begge typer af bakterier (dvs. S. aureus) til den.
    4. Inkubér alle rørene i et 37 ° C vandbad i 20 min. Brug en åben metal rack og forsigtigt ryste stativet hver 5 minat sikre, at rørene hurtigt og tilstrækkeligt opvarmet. Efter inkubationsperioden straks overføre alle rør til et is-vand-bad i 1 min.
  3. Vask cellerne.
    1. Brug en repeater pipette til at tilføje 100 pi iskold quench løsning på alle rør. Udskift caps, vortex kortvarigt, og derefter inkuberes alle rør på is i 1 min.
    2. Brug en repeater pipette for at tilføje 1 ml iskold PBS til alle rør. Vortex kortvarigt, og derefter tilføje yderligere 2 ml iskold PBS til alle rør og erstatte hætter. Centrifuge alle rør i 5 minutter ved 4 ° C og 270 x g, og derefter aspireres supernatanten.
    3. Gentag trin 2.3.2 én gang (i alt 2 gange vask).
  4. Fremstille prøver til flowcytometri.
    1. Brug en repeater pipette til at tilføje 50 pi iskold kalvefosterserum til alle rør. Kort vortexes alle rør.
    2. Overfør alle rør til en passende karrusel og bruge en automatiseret celle lyse forberedelse arbejdsstation med rødt blod cell (RBC) lyse og WBC fastsættelse reagenser at lysere røde blodlegemer og løse WBCs som beskrevet i producentens anvisninger.
    3. Efter den automatiske celle lyse forberedelse arbejdsstation kørslen er færdig, wrap rør i aluminiumfolie og opbevares i et 4 ° C køleskab indtil kan udføres flowcytometri analyse.

3. flowcytometri Acquisition

  1. Opsætning af flowcytometri-systemet.
    1. Varm op flowcytometri systemet som instrueret i brugermanualen fra producenten. Derefter kontrollere reagenser og affald tankniveauer. Hvis det er nødvendigt, fylde reagens tanke og / eller tømme tanken affald.
    2. Brug "Clean Panel" funktion til at køre systemet rent cyklus. Derefter køre justering og fluidics verifikation fluorescerende, og sikre, at den halve peak variationskoefficient (HPCV) for hver detektor er inden for det foruddefinerede interval beskrevet i kvalitetskontrol (QC) protokoller fra fremstillingenr.
  2. Opret assay-specifikke køb og protokoller instrument indstilling.
    1. Opret assay-specifikke erhvervelse protokoller for fagocytose og OB aktivitet analyser.
      BEMÆRK: erhvervelse protokoller, der er beskrevet her, kan tilpasses til brug på ethvert flowcytometer med en blå laser (488 nm), et filter (530/30) for FITC, og et filter (575/26) for HE.
      1. Åbn flowcytometri systemet erhvervelse software og skabe en "ny protokol".
      2. Vælg "FL1 parameter" for fagocytose assay (FITC) og "FL2 parameter" for OB aktivitetsassay (HE).
      3. Opret parcellerne (dvs. forward scatter [FSC] vs. side scatter [SSC] dot plot, FL1 histogram, FL2 histogram), der kræves for erhvervelse.
      4. Opret polygonale regioner for WBC (hvide blodlegemer), granulocyt og monocyt populationer på FSC- versus SSC plot og skabe lineære regioner på FL1 og FL2 histogrammer. Set a & #34; Stop Count "på 50.000 begivenheder for WBC gate.
      5. Gem protokoller med assay-specifikke navne.
    2. Opret assay-specifikke instrument indstilling protokoller for fagocytose og OB aktivitet analyser.
      1. Træk og slip "assay-specifikke erhvervelse protokoller" (defineret i trin 3.2.1) fra "Resource Explorer" til "Acquisition Manager" på flowcytometri systemet erhvervelse software.
        BEMÆRK: Oplysninger tilføjet på denne måde vil altid blive vist i slutningen af ​​arbejdslisten.
      2. Indtast oplysningerne om prøverne i arbejdslisten, og gemme arbejdslisten.
      3. Fjern kontrol prøveglas de fra 4 ° C køleskab og give dem mulighed for at udligne til stuetemperatur i 15 min. Derefter kortvarigt vortex hver kontrolprøve rør.
      4. Bruge "assay-specifik erhvervelse protokoller" defineret i trin 3.2.1 at køre den negative kontrolprøve (dvs. blod kun) og den positive kontrolprøver (dvs. HE kontrol, FITC kontrol) gennem flowcytometri systemet. Gennemgå histogrammer og juster fotomultiplikatorrør (PMT) spændinger i FITC og phycoerythrin (PE) kanaler efter behov.
      5. Vortex kontrolprøverne og overføre dem til flowcytometri systemet karrusel i henhold til rækkefølgen på arbejdslisten. Derefter placere karrusellen i prøveudtagning kammer og klik på Toolbar knappen Cytometeret "Start" for at erhverve data for kontrolprøver. Gem "xxx Indstilling Pro" indstilling protokol.
  3. Erhverve undersøgelsesprøver på flowcytometri systemet.
    1. Fjern undersøgelse prøveglas fra 4 ° C køleskab de og tillade at ækvilibrere til stuetemperatur i 15 minutter.
    2. Mens prøverne ækvilibrering, skal du trække de foruddefinerede studie-specifikke erhvervelse protokoller til arbejdslisten plads til at gøre et projekt arbejdsliste.
    3. Bekræft, at "indstillingen protokol" er knyttet til &# 34;. Assay-specifik indstilling protokoller "defineret i trin 3.2.2 Indtast derefter identificere oplysninger (f.eks, studie navn, tegne nummer, besøg nummer, emne ID) for hvert rør til listen arbejde.
    4. Efter 15-min ligevægt periode, vortex undersøgelse prøver og overføre dem til flowcytometri systemet karrusel i henhold til rækkefølgen på arbejdslisten. Derefter placere karrusellen i prøveudtagning kammer og klik på Toolbar knappen Cytometeret "Start" for at indsamle oplysninger om undersøgelsens prøver.
    5. Gennemgå datakvaliteten ved at inspicere RBC lysis effektivitet og WBC celle undergruppe distribution, proportioner, absolutte tællinger, og fluorescensintensiteter på rapporten panel af hver prøve.
      BEMÆRK: Datakvaliteten anses for at være acceptabelt, hvis alle disse kriterier er i deres foruddefinerede grænser. Hvis alle kriterier ikke er opfyldt, bør prøve oparbejdes.
    6. Ren og lukke flowcytometri system. Opbevar flowcytometridata på to forskellige computersystemer drev for at forhindre utilsigtet tab af data.

4. Data Analysis

  1. Udfør fagocytose analyse.
    1. Konsolider alle af fagocytose (dvs. F-mærket) prøve og kontrol liste tilstand data (LMD) datafiler i en enkelt mappe. Åbn derefter flowcytometri analyse software og trække filerne ind udfaldsrummet.
    2. Indstil WBC, granulocyt, monocyt, og lymfocyt porte.
      1. Dobbeltklik på filnavnet for at åbne nogen af ​​"FITC kontrolprøver". Brug rullemenuerne til at indstille x-aksen til "FSC" og "lineære" og y-aksen til "SSC" og "lineære".
      2. Brug "polygon gate vælgeren" til at forberede en port af den samlede WBC befolkning.
        BEMÆRK: Sørg for at inkludere alle cellerne i kanterne af diagrammet. Mærk denne gate "WBC".
      3. Dobbeltklik på den "nye WBC gate" og bruge drop-ned menuer til at indstille x-aksen til "FSC" og "Linear", og y-aksen til "SSC" og "Linear".
      4. Brug "polygon gate selector" for at indstille "granulocyt gate" og Monocyt gate ", og derefter bruge" elliptiske gate selector "for at indstille" lymfocyt gate ". Mærk hver port i overensstemmelse hermed. Træk" gate data (%) "ud til den side, således at cellerne er let ses.
    3. Indstil "Fagocytose Positive gate" og "Fagocytose Negativ gate" for granulocyt- og monocyt populationer.
      1. Dobbeltklik på "FITC kontrolprøven" i trin 4.1.2.1. Klik derefter på "Granulocyt gate" og bruge rullemenuerne til at indstille x-aksen til "FL1" og "Log" og y-aksen til "SSC" og "Linear".
      2. Brug "firkantede gate selector" for at indstille en "Fagocytose Negative gate" og en "Fagocytose Positive gate ".
        BEMÆRK: Da FITC kontrolprøver de ikke modtog bakterielle (dvs. S. aureus) stimuli, bør alle cellerne teoretisk være fagocytose negativt. Brug skøn, når oprettelse grænserne for disse befolkningsgrupper.
      3. Gentag trin 4.1.3.1 og 4.1.3.2 Trin for monocyt befolkning.
    4. Tilføj statistik for "% af WBC", "fluorescensintensitet", og "% fagocytose positive celler" for granulocyt- og monocyt populationer.
      1. Klik på "FITC kontrolprøven" i trin 4.1.2.1. Fremhæv "granulocyt gate", og klik derefter på "Workspace" og "Føj Statistik". Fremhæv "Geometrisk Mean" og "FL1 Log" og klik på "Tilføj". Derefter valgte "Hyppigheden af ​​Parent" statistik og klik på "Tilføj".
        BEMÆRK: Dette vil give fluorescensintensiteten (geometrisk middelværdi) af hele granulocyt befolkning ogprocentdelen af ​​WBC (forælder), der er granulocytter.
      2. Klik på "FITC kontrolprøven" i trin 4.1.2.1. Fremhæv "Fagocytose Positive gate" af granulocyt befolkning, og klik derefter på "Workspace" og "Føj Statistik". Fremhæv "Geometrisk Mean" og "FL1 Log" og klik på "Tilføj". Vælg derefter "Frekvens af Parent" statistik og klik på "Tilføj".
        BEMÆRK: Dette vil give fluorescensintensiteten (geometrisk middelværdi) af fagocytose positive granulocytter og procentdelen af ​​granulocytter (forælder), som er fagocytose positive.
      3. Gentag trin 4.1.4.1 og 4.1.4.2 Trin for monocyt befolkning.
      4. Klik på "FITC kontrolprøven" i trin 4.1.2.1. Fremhæv "lymfocyt gate", og klik derefter på "Workspace" og "Føj Statistik". Fremhæv "Frekvens af Parent" statistik og klik på "Tilføj".
        BEMÆRK: Dennevil give procentdelen af ​​WBC (forælder), som er lymfocytter.
      5. Fremhæv alle porte og statistikker skabt i FITC kontrolprøven anvendt i trin 4.1.2.1. Træk dem i "Alle Samples" i "Gruppe" panel i toppen af ​​skærmen.
        BEMÆRK: Dette vil anvende disse indstillinger for alle undersøgelsens prøver.
      6. Gem og navn arbejde som .wsp fil i samme mappe, der indeholder LMD mappen.
    5. Juster individuelle prøve porte.
      1. Klik på "første prøve" i datasættet, og bekræfter, at WBC gate passende passer cellen fordeling på skærmen. Hvis den ikke gør, skal du klikke og trække kanterne af porten justere porten for at prøve. Klik på "højre pil" (dvs. "˃") for at gå videre til den næste prøve. Gentag dette trin, indtil alle prøver er blevet revideret.
      2. Klik på "WBC gate" for den første prøve i datasættet, og bekræfte, at "Granulocyte gate "," monocyt gate ", og" lymfocyt gate "for hver prøve passende passe cellen fordeling på skærmen. Juster efter behov. Klik på" højre pil "(dvs." ˃ ") for at gå videre til den næste prøve .
      3. Gentag trin 4.1.5.2, indtil alle prøver er blevet revideret. Klik derefter på "Gem".
    6. Vise data i en elektronisk regnearksprogram.
      1. Klik på "Table Editor" ikonet øverst på skærmen. Klik på "Rediger", "Nøgleord", og "$ DATE" til også at omfatte den dato, prøvetagning på den sidste regneark. Klik derefter på "Rediger", "Nøgleord", og "@ SAMPLEID1" til også at omfatte identifikation prøvetagning på den sidste regneark. Gentag for "@ SAMPLEID2", "@ SAMPLEID3", og "@ SAMPLEID4".
      2. Juster "Table Editor" skærm og "prøve" skærm, så de både kan ses på computerskærmen. Select enhver "prøve" på prøven ark. Træk derefter hver statistik af interesse for den "Table Editor".
        1. Træk "Freq. Af Parent" statistik anført under "Granulocyt gate" til "Table Editor". Skriv "% WBC som Granulocytter" under "Name" kolonnen af ​​"Table Editor".
        2. Træk "Geometric Mean" statistik anført under "Granulocyt gate" til "Table Editor". Skriv "Geometrisk Mean Fluorescens, Granulocytter" under "Name" kolonnen af ​​"Table Editor".
        3. Træk "Freq. Af Parent" statistik anført under "granulocyt / Fagocytose Positive gate" til "Table Editor". Skriv "% fagocytose Positive Granulocytter" under "Name" kolonnen af ​​"Table Editor".
        4. Træk "Geometric Mean" statistik anført under "granulocyt / Fagocytose Positive gate" til the "Table Editor". Skriv "Geometrisk Mean Fluorescens, fagocytose Positive Granulocytter" under "Name" kolonnen af ​​"Table Editor".
        5. Træk "Freq. Af Parent" statistik anført under "Monocyt gate" til "Table Editor". Skriv "% WBC som Monocytter" under "Name" kolonnen af ​​"Table Editor".
        6. Træk "Geometric Mean" statistik anført under "Monocyt gate" til "Table Editor". Skriv "Geometrisk Mean Fluorescens, Monocytter" under "Name" kolonnen af ​​"Table Editor".
        7. Træk "Freq. Af Parent" statistik anført under "Monocyt / Fagocytose Positive gate" til "Table Editor". Skriv "% fagocytose Positive Monocytter" under "Name" kolonnen af ​​"Table Editor".
        8. Træk "Geometric Mean" statistik anført under "Monocyt / Phagocytosis Positive gate "til" Table Editor ". Skriv" Geometrisk Mean Fluorescens, fagocytose Positive Monocytter "under" Name "kolonnen af" Table Editor ".
        9. Træk "Freq. Af Parent" statistik anført under "lymfocyt gate" til "Table Editor". Skriv "% WBC som lymfocytter" under "Name" kolonnen af ​​"Table Editor".
      3. Træk og slip de parametre, synlige i "Table Editor", indtil de er arrangeret i den foretrukne rækkefølge.
      4. Klik på "Gem". Klik derefter på "Opret tabel" for at vise data i et regneark format. Klik på "gem som" for at gemme og navngive arbejde som .xlsx-fil.
  2. Gentag trin 4.1 for OB aktivitet assay (dvs. H-mærket) prøver og kontrollere LMD datafiler.
    BEMÆRK: Sørg for at erstatte alle henvisninger til fagocytose med henvisninger til OB aktivitet.

    3. Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Langvarig og intensiv motion har dybtgående virkninger på medfødte immunforsvar, herunder naturlige dræberceller celle funktion, makrofag cytokin-medieret respons på virusinfektion, og granulocyt og monocyt fagocytose og OB aktivitet. Flere undersøgelser indikerer, at granulocyt- og monocyt fagocytose øges betydeligt post-øvelse, som afspejler inflammation induceret af muskelskader og metaboliske krav. I modsætning hertil granulocyt og monocyt OB aktivitet falder post-øvelse og kan være en immun indikator for forøget modtagelighed for infektion. For eksempel viser figur 1, at fagocytose af S. aureus ved granulocytter øges straks og 1,5-timer efter en 75-km cykling Bout (70% VO2max), vender tilbage til normal ved næste morgen. Monocyt fagocytose er tilsvarende påvirket af dette niveau af motion. Figur 2 viser, granulocyt OB aktivitet er faldetd i mindst 21 timers efter 75-km cykling. Monocyt OB aktivitet er også faldet efter 75-km cykling.

Granulocyt og monocyt fagocytose af S. aureus, men ikke granulocyt og monocyt OB aktivitet, er korreleret til systemisk inflammation biomarkører Figur 3 viser den beskedne korrelation mellem granulocyt fagocytose og serum C-reaktivt protein (CRP) niveauer (Pearsons korrelation;. r = 0,44; p <0,01 ) i 106 overvægtige / fede kvinder. Serum CRP er også korreleret til monocyt fagocytose af S. aureus (Pearsons korrelation; r = 0,30; p <0,01). Desuden blod neutrofil / leukocyttal (Pearsons korrelation, r = 0,62 og r = 0,61, henholdsvis; P <0,001), body mass index (Pearsons korrelation, r = 0,50 og r = 0,40, henholdsvis; P <0,001), seruminsulinniveauer (r = 0,30 og r =0,23; P <0,03), og blod- A 1C niveauer (Pearsons korrelation, r = 0,28 og r = 0,21, henholdsvis; p <0,04) er korreleret til granulocyt og monocyt fagocytose af S. aureus. Generelt indikerer disse data, at høje granulocyt og monocyt fagocytose i hvilende forsøgspersoner indikerer systemisk inflammation.

figur 1
Figur 1: granulocyt Fagocytose påvirkes af Intense udholdenhedstræning Granulocyt fagocytose steg straks og 1,5-timer efter en 75-km cykling Bout ved 70% af VO2max.. Ved 21-hr post-øvelse, granulocyt fagocytose returneres til lidt under præ-øvelse niveauer. * angiver forskellige fra præ-træning (Gentagne målinger ANOVA med parret t-test post-hoc-analyse, når det er hensigtsmæssigt, N = 19; P <0,05). Værdier er migen ± standard fejl. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 2

Figur 2:. Granulocyt Oxidativ Burst Aktivitet påvirkes af Intense udholdenhedstræning Granulocyt oxidative burst aktivitet faldt straks, 1,5-timers og 21-timer efter en 75-km cykling Bout ved 70% af VO2max. * angiver forskellige fra præ-træning (Gentagne målinger ANOVA med parret t-test post-hoc-analyse, når det er hensigtsmæssigt, N = 19; P <0,05). Værdierne er gennemsnit ± standardfejl. Klik her for at se en større version af dette tal.

. Figur 3: granulocyt Fagocytose er korreleret med systemisk inflammation i Overvægtige / overvægtige kvinder Granulocyt fagocytose var korreleret til serum C-reaktivt protein, en bredt accepteret biomarkør for systemisk inflammation (Pearsons korrelation, N = 87; r = 0,44; P <0,01). klik her for at se en større version af dette tal.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Dette håndskrift giver en trin-for-trin-protokol til bestemmelse af to indikatorer for granulocyt og monocyt funktion. Vi har identificeret et par trin, der er afgørende for succes i denne analyse. Et sådant trin er isbadet inkubation, der forekommer umiddelbart før tilsætningen af ​​bakterier. Grundig afkøling af alle prøverne vil minimere virkningen af ​​temperatur på fagocytose og OB-aktivitet. Et andet kritisk trin er tilsætning af bakterier til hver prøve. A 8: 1 bakterier: fagocyt forholdet producerer optimale resultater; men andre forskere kan opleve, at dette forhold vil skulle ændres for at producere egnede resultater. En anden afgørende skridt er brugen af ​​RBC lysering og WBC fastsættelse reagenser til at lysere røde blodlegemer og løse WBCs. Anvendelsen af ​​denne sådanne reagenser sikrer fuldstændig lyse af de røde blodlegemer og tillader forskerne at lagre behandlede prøver ved 4 ° C natten over, og derefter køre dem gennem flowcytometeret den næste dag. Tidligere arbejde (upubliceret) Indicates at RBC lysering og WBC fiksering kan anvendes til at forsinke flowcytometri af faste prøver med så mange som 12 timer uden at kompromittere dataintegritet.

Denne procedure kan let modificeres til at opfylde de evner og interesser forskeren, men det skal understreges, at optimering er nødvendig, når tilpasninger foretages. Et par af de mest almindelige tilpasninger der er blevet rapporteret, er til målet bakterier, etiketten / sonde, og inkubationstiden. Forskere har produceret enestående resultater, når Escherichia coli 7,8 anvendes i stedet for S. aureus som målpatogenet (både ved 8: 1-forhold). En svamp, såsom Saccharomyces cerevisiae, kan også være egnede som erstatning for E. coli. Derudover forskere ofte bruger en pH-følsom molekylær probe, 7,12 i stedet for FITC, som proben for fagocytose. Ligeledes prober bortset HE er almindeligt anvendt til måling af OB-aktivitet, including dichlorofluorescin diacetat (DCF-DA) 10 og dihydrorhodamin 123 (DHR). 13 Anmeldte inkubationstider variere fra 20 min til 120 min, 12,14,15 med McFarlin rapporterer, at den maksimale responstid kan variere fra bakteriel mål. 7 Det skal også bemærkes, at de optimale inkubationstider kan variere mellem fagocytose og OB aspekter af assayet. 7

Som med alle laboratorieanalyser, kan fejlfinding være nødvendigt, når oprettelse denne teknik i en ny forskning indstilling. Forfatterne anbefaler, at optimering af bakterierne: fagocyt-forholdet er nøglen til succes for dette assay. Forfatterne bemærker også, at data fra en prøve skal kasseres fra analyse, hvis færre end 80% af cellerne i granulocyt population fra en ikke-syg deltager er FITC positive; i denne situation, kan prøven blive indsamlet og re-analyseret, hvis muligt.

Der er nogle få begrænsninger forgranulocyt og monocyt fagocytose og OB aktivitet assay er beskrevet i dette manuskript. En sådan begrænsning er udelukkende til brug for FSC og SSC at identificere de cellepopulationer af interesse. Anvendelsen af celleoverflademarkører ville tillade forskerne at positivt identificere cellepopulationer. 10 ville imidlertid tilføjelsen af denne funktion kræver mere end en grundlæggende flowcytometer, og er således uden for rammerne af dette håndskrift. En anden begrænsning ved dette assay er, at det bygger på effektiviteten af ​​trypanblåt til at slukke fluorescensen af ​​prober, som ikke er internaliseret af immuncellerne af interesse. En pH-følsom molekylær probe 7,12 kan anvendes som et alternativ til FITC i situationer, hvor internalisering er et problem. Da en sådan sonde er kun fluorescerende i sure miljøer som dem i endocytiske vesikler, den erhvervede fluorescens repræsenterer kun internaliserede partikler. Desuden har adskillige forskere kritiseret den nuværende assay, fordi det gøres ikke omfatter et parallelt sæt prøver, der er inkuberet i isvand i stedet for ved 37 ° C for at kontrollere for basal immuncelle aktivitet. Ved flere lejligheder, vi medtaget denne "is tilstand", når du udfører granulocyt og monocyt fagocytose og OB aktivitet assay, og fandt, at det ikke i væsentlig grad forbedre kvaliteten af ​​de data, (upublicerede).

Sammenfattende dette håndskrift beskriver en teknik til måling fagocytose og OB-aktivitet i granulocytter og monocytter. Dette er en enkel, ligetil assay, som let kan modificeres til at tage højde for laboratorie kapaciteter og forskning interesser. I øvelse videnskabs- og fedmerelateret forskning, vil denne foranstaltning af medfødte immunforsvar tillader investigator at udforske virkningerne af mange potentielle modforanstaltninger, herunder vægttab, supplement brug, kosten interventioner og andre livsstilsændringer. Efter mastering denne teknik, vil forskerne kunne følge akutog kroniske forandringer i immuncellefunktion i diæt, motion og mange andre stimuli.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Acknowledgments

Forfatterne vil gerne anerkende Zack Shue, Casey John, og Lynn Cialdella-Kam for deres bistand i optimeringen af ​​denne procedure.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
12 x 75 mm tubes, with cap VWR 20170-579 You will need 2 tubes per sample ("H" and "F") plus 3 tubes per batch (for assay controls; "F", "H", and "Blood only").
PBS (10x), pH 7.4 Life Technologies 70011-044
Bottle top 0.2 µm cellulose acetate filter (500 ml capacity) Fisher Scientific 09-741-07 
Glucose, powder Life Technologies 15023-021
Citric acid (anhydrous, cell culture tested, plant cell culture tested) Sigma-Aldrich C2404-100G
Sodium citrate tribasic dihydrate Sigma-Aldrich S4641-25G
Dihydroethidium (Hydroethidine) (HE) Life Technologies D11347
Dimethyl sulfoxide (DMSO) Anhydrous Life Technologies D12345
Staphylococcus aureus (Wood strain without protein A) BioParticles, fluorescein conjugate (FITC) Life Technologies S2851
Staphylococcus aureus (Wood strain without protein A) BioParticles, unlabeled Life Technologies S-2859
Trypan Blue Solution, 0.4% Life Technologies 15250-061
4.0 ml vacutainer containing 7.2 mg K2EDTA, spray-dried VWR BD367861 You will need 1 K2EDTA blood collection tube per sample.
4.0 ml vacutainer containing 68 USP units Lithium Heparin, spray-coated VWR BD367884 You will need 1 Lithium Heparin blood collection tube per sample.
COULTER Ac·T 5diff CP Beckman Coulter 6605705 i.e., hematology analyzer
COULTER Ac·T 5diff Rinse Beckman Coulter 8547167
COULTER Ac·T 5diff Fix Beckman Coulter 8547171
COULTER Ac·T 5diff WBC Lyse Beckman Coulter 8547170
COULTER Ac·T 5diff Hgb Lyse Beckman Coulter 8547168
COULTER Ac·T 5diff Cal Calibrator Beckman Coulter 7547175
COULTER Ac·T 5diff Control Plus Beckman Coulter 7547198
AcT 5diff Diluent Beckman Coulter 8547169
200 µl extended-length pipette tips VWR 37001-526
Insulated ice pan VWR 89198-980 For ice water bath.
Open metal tube rack VWR 60916-702
Fetal Bovine Serum Life Technologies 26140-111
TQ-Prep Workstation Beckman Coulter 6605429 i.e., automated cell lyse preparation workstation
ImmunoPrep Reagent System Beckman Coulter 7546999 i.e., RBC lyse/WBC fix reagent system
Cytomics FC500 MCL Flow Cytometry System with CXP Software Beckman Coulter 626553
IsoFlow Sheath Fluid Beckman Coulter 8547008
COULTER CLENZ Beckman Coulter 8546929
Flow-Check Fluorospheres  Beckman Coulter 6605359 i.e., alignment and fluidics verification fluorospheres
FlowJo Software FlowJo FlowJo i.e., flow cytometry analysis software
Excel Software Microsoft Microsoft Excel i.e., electronic spreadsheet program

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Nieman, D. C., et al. Influence of pistachios on performance and exercise-induced inflammation, oxidative stress, immune dysfunction, and metabolite shifts in cyclists: a randomized, crossover trial. PLoS One. 9, e113725 (2014).
  2. Knab, A. M., et al. Effects of a freeze-dried juice blend powder on exercise-induced inflammation, oxidative stress, and immune function in cyclists. Appl Physiol Nutr Metab. 39, 381-385 (2014).
  3. Konrad, M., et al. The acute effect of ingesting a quercetin-based supplement on exercise-induced inflammation and immune changes in runners. Int J Sport Nutr Exerc Metab. 21, 338-346 (2011).
  4. Nieman, D. C., et al. Immune and inflammation responses to a 3-day period of intensified running versus cycling. Brain Behav Immun. 39, 180-185 (2014).
  5. Nieman, D. C., et al. Carbohydrate supplementation affects blood granulocyte and monocyte trafficking but not function after 2.5 h of running. Am J Clin Nutr. 66, 153-159 (1997).
  6. Tidball, J. G. Inflammatory cell response to acute muscle injury. Med Sci Sports Exerc. 27, 1022-1032 (1995).
  7. McFarlin, B. K., Williams, R. R., Venable, A. S., Dwyer, K. C., Haviland, D. L. Image-based cytometry reveals three distinct subsets of activated granulocytes based on phagocytosis and oxidative burst. Cytometry A. 83, 745-751 (2013).
  8. Liao, Y., Liu, P., Guo, F., Zhang, Z. Y., Zhang, Z. Oxidative burst of circulating neutrophils following traumatic brain injury in human. PLoS One. 8, e68963 (2013).
  9. McFarlin, B. K., Venable, A. S., Prado, E. A., Henning, A. L., Williams, R. R. Image-based flow cytometry technique to evaluate changes in granulocyte function in vitro. J Vis Exp. , (2014).
  10. Nieman, D. C., et al. Immune response to obesity and moderate weight loss. Int J Obes Relat Metab Disord. 20, 353-360 (1996).
  11. Nieman, D. C., et al. Immune function in female elite rowers and non-athletes. Br J Sports Med. 34, 181-187 (2000).
  12. Ichii, H., et al. Iron sucrose impairs phagocytic function and promotes apoptosis in polymorphonuclear leukocytes. Am J Nephrol. 36, 50-57 (2012).
  13. Gomes, A., Fernandes, E., Lima, J. L. Fluorescence probes used for detection of reactive oxygen species. J Biochem Biophys Methods. 65, 45-80 (2005).
  14. Gruger, T., et al. Negative impact of linezolid on human neutrophil functions in vitro. Chemotherapy. 58, 206-211 (2012).
  15. Dementhon, K., El-Kirat-Chatel, S., Noel, T. Development of an in vitro model for the multi-parametric quantification of the cellular interactions between Candida yeasts and phagocytes. PLoS One. 7, e32621 (2012).

Tags

Immunologi fagocytose oxidativ burst monocyt granulocyt medfødte immunitet flowcytometri
Måling granulocyt og monocyt Fagocytose og Oxidativ Burst Aktivitet i humant blod
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Meaney, M. P., Nieman, D. C.,… More

Meaney, M. P., Nieman, D. C., Henson, D. A., Jiang, Q., Wang, F. Z. Measuring Granulocyte and Monocyte Phagocytosis and Oxidative Burst Activity in Human Blood. J. Vis. Exp. (115), e54264, doi:10.3791/54264 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter