Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Mesure de granulocytes et de monocytes phagocytose et oxydative Activité Burst dans le sang humain

Published: September 12, 2016 doi: 10.3791/54264
Automatic Translation
1, 1, 2, 3, 3
1Human Performance Laboratory, North Carolina Research Campus, Appalachian State University, 2Department of Biology, Appalachian State University, 3David H. Murdock Research Institute

Introduction

Le granulocytes et des monocytes phagocytose / oxydatif (OB) dosage de l' activité est une technique simple, straight-forward qui est fréquemment utilisé pour recueillir des informations sur la fonction immunitaire innée après un exercice prolongé et intensif. 1-4 Lors de l' étude de la réponse du système immunitaire à un stimulus, les granulocytes et les monocytes sont d' un intérêt particulier parce qu'ils jouent un rôle central dans la défense de l' hôte et sont les premières cellules immunitaires à accumuler sur le site de l' infection. 5 neutrophiles, un type de granulocytes, sont les premières cellules à translocation dans le muscle endommagé tissus après un exercice intensif. 6 phagocytose et l' activité de l' OB sont les mesures les plus courantes de granulocytes et des monocytes fonction, 7 et sont préférés comme des indicateurs de la fonction immunitaire innée des cellules en raison de leur rôle central tant dans le processus d'infection et le processus de réparation.

L'essai décrit dans ce utili manuscritzes un flux de base cytomètre pour fournir une détermination quantitative des granulocytes et des monocytes phagocytose et l'activité OB dans le sang total. L'utilisation du sang entier dans cette technique est avantageuse car elle permet le dosage à effectuer, sans un procédé de purification du temps. Ce test peut être facilement modifié pour accueillir une variété de modèles de recherche et des capacités de laboratoire. Par exemple, Liao et al. A utilisé une technique similaire pour montrer que l' activité neutrophile OB est augmentée et neutrophiles phagocytose est diminué suite à une lésion cérébrale traumatique. 8 Dans un autre exemple, McFarlin et al. Décrit une modification élégante de cette technique qui utilise allophycocyanine (APC ) conjugué à CD66b et tandem haute performance APC conjugué étiquetage CD45 avec cytométrie en flux à base d'images pour classer les granulocytes en termes de leurs activités de phagocytose et OB. 7,9

Notre groupe de recherche a utilisé diverses adaptations de ce technique comme un indicateur de la fonction immunitaire innée chez les populations en surpoids, obèses, et athlétiques depuis près de 20 ans. 10,11 Le texte ci - dessous fournit au lecteur des instructions étape par étape pour effectuer ce test et mettre en évidence les zones que le lecteur peut adapter pour répondre aux besoins de leur recherche.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

NOTE: Toutes les procédures de collecte de sang ont été effectuées en conformité avec les lignes directrices énoncées par l'Appalachian State University Board Review (ASU) Institutionnel (CISR).

1. Assay Préparation

  1. Recueillir, préparer et organiser les matériaux spécifiés pour la procédure (s'il vous plaît se référer au tableau des matériaux spécifiques / Équipement).
    1. Étiquette 12 x 75 mm tubes.
      1. Étiquette deux tubes pour chaque participant: un tube pour l'essai de phagocytose (étiqueter ce tube avec de l'encre noire et un «F» pour l'isothiocyanate de fluorescéine [FITC]) et un tube pour le dosage de l'activité de l'OB (étiqueter ce tube avec de l'encre rouge et un " H "pour dihydroethidium [HE]).
        NOTE: L'utilisation de 12 x 75 tubes stériles mm est recommandé de réduire au minimum l'activation cellulaire involontaire et l'augmentation associée dans le bruit de fond.
      2. Etiqueter trois tubes pour les contrôles de dosage: un tube pour l'essai de phagocytose (contrôle FITC: étiquette de ce tube avec black encre et un «F»), un tube pour le dosage de l'activité de l'OB (HE contrôle: étiqueter ce tube avec de l'encre rouge et un «H»), et un tube pour le contrôle négatif (Blood seulement: étiqueter ce tube avec de l'encre verte et «sang seulement»).
    2. Préparer des solutions mères d'au moins un jour avant le jour de l'essai.
      1. Préparer la solution saline stérile tamponnée au phosphate (PBS). Diluer 100 ml de 10x PBS avec 900 ml de 18,2 MQ H 2 O. Stériliser par filtration avec un filtre de 0,2 um. Conserver à 4 ° C jusqu'à utilisation.
      2. Préparer le PBS-glucose stérile. Dissoudre 1,0 g de glucose dans 100 ml de PBS. Stériliser par filtration avec un filtre de 0,2 um. Conserver à 4 ° C jusqu'à utilisation.
      3. Préparer le tampon citrate 0,1 M stérile. Dissoudre 1,2 g d'acide citrique et 1,1 g de citrate de sodium dans 100 ml de H 2 18,2 MQ O. Ajuster le pH à 4,0. Stériliser par filtration avec un filtre de 0,2 um. Conserver à 4 ° C jusqu'à utilisation.
      4. Préparer la solution mère HE. Resuspend 1,0 mg de SE dans 1,0 ml de diméthylsulfoxyde (DMSO). Mélanger doucement, aliquote et conserver à -20 ° C jusqu'à utilisation.
      5. Préparer le FITC Staphylococcus aureus (S. aureus) solution mère (2 x 10 9 particules / ml). Resuspendre 10 mg de FITC S. aureus dans 1,5 ml (ou quantité appropriée) de PBS. Diviser en trois 500 aliquotes et sonication selon la recommandation du fabricant. Aliquoter et conserver à -20 ° C jusqu'à utilisation.
      6. Préparer le S. non marqué solution mère aureus (2 x 10 9 particules / ml). Resuspendre 100 mg de S. non marqué aureus dans 15 ml (ou quantité appropriée) de PBS. Diviser en trente 500 aliquotes et sonication selon la recommandation du fabricant. Aliquoter et conserver à -20 ° C jusqu'à utilisation.
    3. Préparer des solutions de travail fraîches le jour de l'essai.
      1. Préparer la solution de travail HE. Transférer 10 pl dedécongelé HE solution mère à 990 pi de PBS-glucose. Protéger de la lumière et de garder sur la glace jusqu'à utilisation.
      2. Préparer le S. FITC solution aureus travail (133.333 particules / ul). Transfert 70 pi de décongelé S. marqué au FITC aureus solution mère à 980 pi de PBS. Protéger de la lumière et de garder sur la glace jusqu'à utilisation.
      3. Préparer le S. non marqué solution aureus travail (133.333 particules / ul). 70 pl de transfert S. décongelé non marqué aureus solution mère à 980 pi de PBS. Protéger de la lumière et de garder sur la glace jusqu'à utilisation.
      4. Préparer la solution de trempe. Ajouter 750 ul d'une solution de bleu trypan à 0,4% de 11,25 ml de tampon citrate 0,1 M stérile. Conserver dans un bain d'eau glacée jusqu'à utilisation.
    4. Avoir un phlébotomiste certifié prélever du sang selon les directives de l'Organisation mondiale de la santé pour le prélèvement de sang.
      1. Prélever le sang dans un tube de 4 ml de collecte de sang contenant de l' EDTA K 2. DansTube de prélèvement de sang vert selon les instructions du fabricant. Gardez le tube de collecte de sang à la température ambiante sur une bascule paillasse jusqu'à utilisation. Utilisez ce sang pour la numération globulaire complète (CBC) avec l'analyse des globules blancs (WBC) différentiel décrit à l'étape 1.2.1.
      2. Prélever le sang dans le tube de collecte d'un 4 ml de sang contenant l'héparine de lithium. Invertir le tube de prélèvement de sang selon les instructions du fabricant. Gardez le tube de collecte de sang à la température ambiante sur une bascule paillasse jusqu'à utilisation. Utilisez ce sang pour le dosage des monocytes et des granulocytes phagocytose et l'activité OB décrit à l'étape 2.
  2. Déterminer la quantité de bactéries ( par exemple, S. aureus) qui seront nécessaires pour effectuer l'essai pour chaque échantillon.
    1. Utiliser un analyseur d'hématologie pour effectuer une analyse de SRC leucocytaire du sang, comme décrit dans les instructions du fabricant. Prenez note de la numération des globules blancs (dans les cellules / ml),% des neutrophiles, et%Les valeurs de monocyte.
    2. Utilisez les équations ci-dessous pour déterminer les neutrophiles et les monocytes compte pour chaque échantillon.
      Numération des neutrophiles (dans les cellules / ml) =% Neutrophiles x WBC (en cellules / ml)
      Numération des monocytes (en cellules / ml) =% Monocyte × WBC (en cellules / ml)
    3. Utiliser les équations ci-dessous pour déterminer le nombre de phagocytes pour chaque échantillon et le nombre de phagocytes présents dans 100 ul d'échantillon.
      Comptage des phagocytes (en cellules / ml) = nombre de neutrophiles (en cellules / ml) + nombre de monocytes (en cellules / ml)
      Nombre de phagocytes dans 100 pl = (nombre de phagocytes (en cellules / ml)) / 10
    4. Utiliser l'équation ci - dessous pour déterminer le nombre de bactéries ( par exemple, S. aureus) nécessaires pour chaque échantillon et la quantité de FITC S. aureus ou non marqué S. solution aureus travail (133.333 particules / ml) qui devrait être ajouté à chaque tube.
      NOTE: La bactérie cible: rapport phagocyte est de 8: 1.
      Nombre de bactéries nécessaires =Nombre de phagocytes dans 100 pi x 8
      Volume de la solution de travail non marqué au FITC ou au besoin (en ul) = (nombre de bactéries nécessaires) / (particules 133.333 / pl)

2. Effectuez Assay

  1. Préparer du sang entier pour le dosage.
    1. Pour chaque tube de participant et de contrôle, en utilisant une pointe de pipette longueur étendue pour transférer 100 pi de sang entier à partir du tube de collecte de sang héparine de lithium au fond d'un tube étiqueté de façon appropriée de 12 x 75 mm. Replacer les bouchons.
      NOTE: Soyez prudent pour éviter d'avoir du sang sur les côtés des 12 x 75 mm tubes.
    2. Utilisez un micropipette pour ajouter 10 ul de solution aux tubes marqués à l'encre rouge et un «H», y compris le tube de commande HE HE travail. Replacer les bouchons et brièvement vortex.
    3. Incuber tous les tubes dans un bain d'eau à 37 ° C pendant 15 min. Ensuite, transférer immédiatement tous les tubes dans un bain d'eau glacée pendant 12 min.
      REMARQUE: Utilisez un rack métallique ouvertet secouez doucement la crémaillère toutes les 5 minutes pour assurer que les tubes sont rapidement et adéquatement chauffés ou réfrigérés.
  2. Ajouter des bactéries ( par exemple, S. aureus) aux tubes d'échantillon et de contrôle.
    1. Utilisez un micropipette pour ajouter le montant approprié (calculé à l' étape 1.2.4) de S. non marqué la solution de travail aureus aux tubes marqués à l' encre rouge et un «H», y compris le tube de commande HE. Replacer les bouchons et brièvement vortex.
    2. Utilisez un micropipette pour ajouter le montant approprié (calculé à l' étape 1.2.4) de FITC S. la solution de travail aureus aux tubes marqués à l' encre noire et un «F», y compris le tube de commande FITC. Replacer les bouchons et brièvement vortex.
    3. Vortex le «sang seulement" tube de commande, mais ne pas ajouter les deux types de bactéries (ie, S. aureus) à elle.
    4. Incuber tous les tubes dans un bain d'eau à 37 ° C pendant 20 min. Utilisez un support en métal ouvert et secouez doucement la crémaillère toutes les 5 minfaire en sorte que les tubes sont réchauffés rapidement et de manière adéquate. Après la période d'incubation, transférer immédiatement les tubes dans un bain d'eau glacée pendant 1 min.
  3. Laver les cellules.
    1. Utiliser une pipette de répéteur pour ajouter 100 pi de solution de trempe glacée à tous les tubes. Replacer les bouchons, vortex brièvement, puis incuber tous les tubes sur la glace pendant 1 min.
    2. Utiliser une pipette à répétition pour ajouter 1 ml de PBS glacé à tous les tubes. Vortex brièvement, puis ajouter un 2 ml supplémentaires de PBS glacé à tous les tubes et remplacer bouchons. Centrifuger tous les tubes pendant 5 min à 4 ° C et 270 x g, puis aspirer le surnageant.
    3. Répétez l'étape 2.3.2 une fois (total de 2 lavages).
  4. Préparer les échantillons pour la cytométrie de flux.
    1. Utiliser une pipette à répétition pour ajouter 50 pi de sérum de veau fœtal glacé à tous les tubes. vortex brièvement tous les tubes.
    2. Transférer tous les tubes à un carrousel approprié et utiliser une lyse cellulaire préparation poste de travail automatisé avec le rouge de sang cell (RBC) et WBC des réactifs de lyse pour lyser les globules rouges et fixer des globules blancs comme décrit dans les instructions du fabricant de fixation.
    3. Après la lyse cellulaire préparation poste de travail exécution automatique est terminée, envelopper les tubes dans une feuille d'aluminium et conserver dans un 4 ° C jusqu'à ce que le réfrigérateur cytométrie analyse peut être effectuée.

3. Acquisition de cytométrie en flux

  1. Installer le système de cytométrie en flux.
    1. Réchauffez cytométrie de flux système comme indiqué dans le mode d'emploi fourni par le fabricant. Ensuite, vérifiez les niveaux de réactifs et de réservoirs de déchets. Si nécessaire, remplir les réservoirs de réactifs et / ou vider le réservoir de déchets.
    2. Utilisez la fonction "Panel Clean" pour exécuter le système cycle de nettoyage. Ensuite, lancez l'alignement et de vérification des fluidics fluorosphères, et veiller à ce que le coefficient demi-pic de variation (HPCV) pour chaque détecteur est dans la plage prédéfinie décrite dans le contrôle de la qualité (QC) protocoles fournis par la fabricationr.
  2. Créer acquisition spécifique à dosage et les protocoles de réglage de l'instrument.
    1. Créer des protocoles d'acquisition spécifiques à essai pour les phagocytose et l'activité OB essais.
      REMARQUE: Les protocoles d'acquisition décrits ici peuvent être adaptés pour une utilisation sur un cytomètre de flux avec un laser bleu (488 nm), un filtre (530/30) pour FITC, et un filtre (575/26) pour HE.
      1. Ouvrez cytométrie de flux logiciel d'acquisition de système et de créer un "nouveau protocole".
      2. Choisissez l'option "FL1 Paramètre" pour le dosage de la phagocytose (FITC) et le "FL2 Paramètre" pour le dosage de l'activité de l'OB (HE).
      3. Créer les parcelles (ie, diffusion vers l' avant [FSC] vs. diffusion latérale [SSC] tracé de points, FL1 histogramme, FL2 histogramme) nécessaire pour l' acquisition.
      4. Créer des régions polygonales pour le WBC (cellules de globules blancs), les populations de granulocytes et de monocytes sur le terrain SSC FSC vs et créer des régions linéaires sur les histogrammes FL1 et FL2. Set a & #34; empêchez le comte »de 50.000 événements pour la porte WBC.
      5. Enregistrer les protocoles avec des noms spécifiques à l'essai.
    2. Créer des protocoles fixant instruments spécifiques à essai pour les phagocytose et l'activité OB essais.
      1. Glissez et déposez les "protocoles spécifiques essai d'acquisition» (définies à l'étape 3.2.1) de la "Explorateur de ressources» à la «Acquisition Manager» à la cytométrie de flux logiciel d'acquisition du système.
        REMARQUE: Les informations ajoutées de cette façon apparaîtra toujours à la fin de la liste de travail.
      2. Entrez les informations échantillon dans la liste de travail, et enregistrez le worklist.
      3. Retirer les tubes échantillons de commande du réfrigérateur à 4 ° C et les laisser revenir à température ambiante pendant 15 min. Puis, vortex brièvement chaque tube d'échantillon témoin.
      4. Utilisez les «protocoles d'acquisition spécifiques à dosage" définis à l' étape 3.2.1 pour exécuter l'échantillon témoin négatif (c. -à- sang seulement) et le contrôle positiféchantillons (c. -à- HE contrôle, le contrôle FITC) à travers le système de cytométrie de flux. Examiner les histogrammes et régler le tube photomultiplicateur (PMT) tensions de la phycoérythrine (PE) canaux FITC et au besoin.
      5. Vortexer les échantillons témoins et les transférer vers le carrousel de cytométrie en flux système selon l'ordre de la liste de travail. Ensuite, placez le carrousel dans la chambre d'échantillonnage, puis cliquez sur la barre d'outils bouton cytomètre "Démarrer" pour acquérir des données pour les échantillons de contrôle. Enregistrez le "xxx Réglage Pro" protocole de réglage.
  3. Acquérir des échantillons d'étude sur le système de cytométrie de flux.
    1. Retirer l'échantillon à l'étude des tubes du réfrigérateur à 4 ° C et le laisser se stabiliser à température ambiante pendant 15 min.
    2. Bien que les échantillons sont équilibrant, faites glisser les protocoles d'acquisition spécifiques de l'étude prédéfinis à l'espace worklist de faire une liste de travail du projet.
    3. Vérifiez que le "protocole de réglage" est lié à la &# 34;. Protocoles de réglage spécifiques de dosage »définis à l' étape 3.2.2 Ensuite, entrez les informations d' identification (par exemple, le nom de l' étude, dessiner, numéro de visite, sous réserve ID) pour chaque tube dans la liste de travail.
    4. Après la période d'équilibration de 15 minutes, les échantillons d'étude de vortex et les transférer vers le carrousel de cytométrie en flux système selon l'ordre de la liste de travail. Ensuite, placez le carrousel dans la chambre d'échantillonnage, puis cliquez sur la barre d'outils bouton cytomètre "Démarrer" pour acquérir des données pour les échantillons de l'étude.
    5. Examiner la qualité des données en inspectant l'efficacité de lyse RBC et la distribution des sous-groupes de cellules WBC, des proportions, des valeurs absolues, et les intensités de fluorescence sur le panneau de chaque échantillon de rapport.
      NOTE: La qualité des données est considérée comme acceptable si tous ces critères sont dans leurs limites prédéfinies. Si tous les critères ne sont pas remplies, l'échantillon doit être retraité.
    6. Nettoyer et arrêter le système de cytométrie de flux. Rangez la cytométrie de fluxles données sur les deux disques informatiques différents pour prévenir la perte accidentelle de données.

Analyse 4. Données

  1. Effectuer l'analyse de phagocytose.
    1. Consolidez tous les phagocytose (ie, F-étiqueté) des données de mode d'échantillonnage et la liste de contrôle (LMD) des fichiers de données dans un seul dossier. Ensuite, ouvrez cytométrie de flux logiciel d'analyse et faites glisser les fichiers dans l'espace de l'échantillon.
    2. Réglez le WBC, granulocytes, monocytes et lymphocytes portes.
      1. Double-cliquez sur le nom du fichier à ouvrir l'un des "échantillons de contrôle FITC". Utilisez les menus déroulants pour définir l'axe x à "FSC" et "linéaire" et l'axe-y pour "SSC" et "linéaire".
      2. Utilisez le «sélecteur de grille de polygone" pour préparer une porte de la population totale WBC.
        REMARQUE: Assurez-vous d'inclure toutes les cellules sur les bords de la carte. Etiqueter cette porte "WBC".
      3. Double-cliquez sur la "nouvelle porte WBC" et utiliser la gouttemenus déroulants pour définir l'axe des x à "FSC" et "linéaire" et l'axe-y pour "SSC" et "linéaire".
      4. Utilisez le «sélecteur de grille de polygone" pour régler le "granulocytes porte" et monocytes porte ", et ensuite utiliser le" sélecteur de grille elliptique "pour régler le" Lymphocytes porte ". Etiqueter chaque porte en conséquence. Faites glisser les" données de grille (%) "sur le côté afin que les cellules sont facilement visualisables.
    3. Réglez le "phagocytose positive gate" et la "phagocytose porte négative" pour les populations de granulocytes et de monocytes.
      1. Double-cliquez sur le "échantillon témoin FITC" utilisé à l'étape 4.1.2.1. Ensuite, cliquez sur la "porte de granulocytes" et utilisez les menus déroulants pour définir l'axe x à "FL1" et "Connexion" et l'axe des y à "SSC" et "linéaire".
      2. Utilisez la «porte sélecteur carré" pour définir un "phagocytose porte négative" et un "phagocytose Positive gate ".
        NOTE: Étant donné que les échantillons de contrôle FITC n'a pas reçu bactériennes (c. -à S. aureus) stimuli, toutes les cellules doivent être théoriquement phagocytose négative. Faites preuve de discrétion lors de l'établissement des limites pour ces populations.
      3. Répétez l'étape 4.1.3.1 et 4.1.3.2 Étape pour la population de monocytes.
    4. Ajouter des statistiques pour "% de WBC", "intensité de fluorescence", et "% phagocytose cellules positives" pour les populations de granulocytes et de monocytes.
      1. Cliquez sur le "échantillon témoin FITC" utilisé à l'étape 4.1.2.1. Mettez en surbrillance le "granulocytes gate", puis cliquez sur "espace de travail" et "Ajouter statistique". Mettez en surbrillance "moyenne géométrique" et "FL1 Log" et cliquez sur "Ajouter". Ensuite, choisir la "Fréquence de Parent" statistique et cliquez sur "Ajouter".
        NOTE: Cela donnera l'intensité de fluorescence (moyenne géométrique) de l'ensemble de la population de granulocytes etle pourcentage de globules blancs (parent) qui sont granulocytes.
      2. Cliquez sur le "échantillon témoin FITC" utilisé à l'étape 4.1.2.1. Mettez en surbrillance le "phagocytose porte positive" de la population de granulocytes, puis cliquez sur "espace de travail" et "Ajouter statistique". Mettez en surbrillance "moyenne géométrique" et "FL1 Log" et cliquez sur "Ajouter". Ensuite, choisissez la "Fréquence de Parent" statistique et cliquez sur "Ajouter".
        NOTE: Cela donnera l'intensité de fluorescence (moyenne géométrique) des phagocytose granulocytes positifs et le pourcentage des granulocytes (parents) qui sont la phagocytose positive.
      3. Répétez l'étape 4.1.4.1 et 4.1.4.2 Étape pour la population de monocytes.
      4. Cliquez sur le "échantillon témoin FITC" utilisé à l'étape 4.1.2.1. Mettez en surbrillance le "Lymphocytes gate", puis cliquez sur "espace de travail" et "Ajouter statistique". Mettez en surbrillance le "Fréquence de Parent" statistique et cliquez sur "Ajouter".
        NOTE: Cedonnera le pourcentage de globules blancs (parent) qui sont des lymphocytes.
      5. Mettez en surbrillance toutes les portes et les statistiques créées dans l'échantillon témoin FITC utilisé dans l'étape 4.1.2.1. Faites-les glisser dans "Tous les échantillons" dans le panneau "groupe" en haut de l'écran.
        NOTE: Ce sera appliquer ces paramètres à tous les échantillons de l'étude.
      6. Enregistrer et nom travail en tant que fichier .wsp dans le même dossier qui contient le dossier LMD.
    5. Ajustez les portes individuelles de l'échantillon.
      1. Cliquez sur le "premier échantillon" dans l'ensemble de données et de confirmer que la porte WBC correspond de manière appropriée la distribution des cellules sur l'écran. Si elle n'a pas, cliquez et faites glisser les bords de la porte d'ajuster la porte pour cet échantillon. Cliquez sur la "flèche droite" (ie, "˃") pour passer à l'échantillon suivant. Répétez cette étape jusqu'à ce que tous les échantillons ont été examinés.
      2. Cliquez sur la "porte WBC" pour le premier échantillon dans l'ensemble de données et de confirmer que la "Granulocyte porte "," monocytes porte ", et" Lymphocytes porte "pour chaque échantillon correspond de façon appropriée la répartition des cellules sur l'écran. Ajustez au besoin. Cliquez sur la" flèche droite "(ie," ˃ ") pour passer à l'échantillon suivant .
      3. Répétez l'étape 4.1.5.2 jusqu'à ce que tous les échantillons ont été examinés. Ensuite, cliquez sur "Enregistrer".
    6. Afficher les données dans un tableur électronique.
      1. Cliquez sur l'icône "Table Editor" en haut de l'écran. Cliquez sur "Modifier", "Mots clés", et "$ DATE" pour inclure la date de prélèvement sur la feuille de calcul final. Ensuite, cliquez sur "Modifier", "Mots clés", et "@ SAMPLEID1" pour inclure l'identification d'échantillonnage sur la feuille de calcul final. Répétez l'opération pour "@ SAMPLEID2", "@ SAMPLEID3", et "@ SAMPLEID4".
      2. Réglez l'écran "Table Editor" et l'écran "échantillon" de sorte qu'ils peuvent tous deux être visualisées sur l'écran d'ordinateur. Select tout «échantillon» sur la feuille d'échantillon. Ensuite, faites glisser chaque statistique d'intérêt pour la "Table Editor".
        1. Faites glisser le "Fréq. De Parent" statistique figurant sous la «porte de granulocytes" à la "Table Editor". Tapez "% WBC comme granulocytes" dans la colonne "Nom" de la "Table Editor".
        2. Faites glisser la statistique "moyenne géométrique" figurant sous la «porte de granulocytes" à la "Table Editor". Tapez "Geometric Fluorescence moyenne, granulocytes" dans la colonne "Nom" de la "Table Editor".
        3. Faites glisser le "Fréq. De Parent" statistique énumérés sous la rubrique "granulocytes / phagocytose positive porte" à la "Table Editor". Tapez "% Phagocytose granulocytes positifs" dans la colonne "Nom" de la "Table Editor".
        4. Faites glisser la statistique "moyenne géométrique" figurant sous la rubrique "granulocytes / phagocytose positive porte" à the "Table Editor". Tapez "Geometric Fluorescence moyenne, Phagocytose granulocytes positifs" dans la colonne "Nom" de la "Table Editor".
        5. Faites glisser le "Fréq. De Parent" statistique figurant sous la «porte de monocytes" à la "Table Editor". Tapez "% WBC comme monocytes" dans la colonne "Nom" de la "Table Editor".
        6. Faites glisser la statistique "moyenne géométrique" figurant sous la «porte de monocytes" à la "Table Editor". Tapez "Geometric Fluorescence moyenne, monocytes" dans la colonne "Nom" de la "Table Editor".
        7. Faites glisser le "Fréq. De Parent" statistique énumérés sous la rubrique "monocytes / phagocytose positive porte" à la "Table Editor". Tapez "% Phagocytose monocytes positifs" dans la colonne "Nom" de la "Table Editor".
        8. Faites glisser la statistique "moyenne géométrique" figurant sous la rubrique "monocytes / Phagocycytose positive porte "à la" Table Editor ". Tapez" Geometric Fluorescence moyenne, Phagocytose monocytes positifs "sous la" "colonne du" Nom Table Editor ".
        9. Faites glisser le "Fréq. De Parent" statistique énumérés sous la rubrique "Lymphocytes porte" à la "Table Editor". Tapez "% WBC comme Lymphocytes" dans la colonne "Nom" de la "Table Editor".
      3. Glissez et déposez les paramètres visibles dans la "Table Editor" jusqu'à ce qu'ils soient disposés dans l'ordre préféré.
      4. Cliquez sur "Enregistrer". Ensuite, cliquez sur "Créer un tableau" pour afficher les données dans un format de feuille de calcul. Cliquez sur "Enregistrer sous" pour enregistrer et le nom travail .xlsx fichier.
  2. Répétez l' étape 4.1 pour le dosage de l' activité de l' OB (c. - H-marqué) des échantillons et de contrôle des fichiers de données DMT.
    REMARQUE: Assurez-vous de remplacer toutes les références à la phagocytose avec des références à l'activité de l'OB.

    3. Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Un exercice prolongé et intensif a des effets profonds sur la fonction immunitaire innée, y compris la fonction naturelle de tueur de cellules, la réponse de cytokine macrophage à une infection virale, et granulocytes et des monocytes phagocytose et l'activité de l'OB. Plusieurs études indiquent que la phagocytose des augmentations de granulocytes et de monocytes de manière significative après l'exercice, ce qui reflète l'inflammation induite par des lésions musculaires et les exigences métaboliques. En revanche, les granulocytes et des monocytes OB activité diminue après l'exercice et peut être un indicateur immunitaire d'une sensibilité accrue à l'infection. Par exemple, la figure 1 montre que la phagocytose de S. aureus par les granulocytes augmente immédiatement et 1,5 h après un vélo bout de 75 km (70% VO2max), retour à la normale le lendemain matin. Monocyte phagocytose est similaire affectée par ce niveau d'exercice. La figure 2 montre que l' activité granulocytes OB est baissed pendant au moins 21 heures après 75 km de vélo. activité Monocyte OB est également diminué après 75 km de vélo.

Granulocytes et monocytes phagocytose de S. aureus, mais pas de granulocytes et de l' activité de l' OB de monocytes, sont corrélés aux biomarqueurs systémiques de l' inflammation La figure 3 montre la corrélation modeste entre granulocytes phagocytose et le sérum de protéine C réactive (CRP) niveaux (Pearson corrélation produit-moment;. r = 0,44; P <0,01 ) dans 106 femmes en surpoids / obèses. Sérum CRP est également corrélée à monocytes phagocytose de S. aureus (corrélation de Pearson produit-moment; r = 0,30; P <0,01). En outre, les neutrophiles du sang / numération leucocytaire (Pearson corrélation produit-moment; r = 0,62 et r = 0,61, respectivement; P <0,001), l' indice de masse corporelle (Pearson corrélation produit-moment; r = 0,50 et r = 0,40, respectivement; P <0,001), les taux sériques d'insuline (r = 0,30 et r =0,23; P <0,03), et les taux sanguins A 1C (Pearson corrélation produit-moment; r = 0,28 et r = 0,21, respectivement; P <0,04) sont corrélées aux granulocytes et des monocytes phagocytose de S. aureus. En général, ces données indiquent que la forte granulocytes et des monocytes phagocytose chez les sujets de repos est indicative de l'inflammation systémique.

Figure 1
Figure 1: granulocytes phagocytose est affectée par Intense Endurance Exercice granulocytes phagocytose augmenté immédiatement et 1,5 h après un 75 km vélo combat à 70% du VO 2 max.. En 21 heures après l'exercice, granulocytes phagocytose est retourné à légèrement au-dessous des niveaux d'avant-exercice. * indique différent de pré-exercice (mesures répétées ANOVA avec l' analyse t apparié test post-hoc, le cas échéant; N = 19; P <0,05). Les valeurs sont-moiune erreur standard ±. S'il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 2

Figure 2:. Granulocytes oxydative Activité Burst est affectée par l' activité granulocyte oxydative Intense Endurance Exercice diminué immédiatement, 1,5 h et 21 h après un 75 km vélo combat à 70% du VO 2 max. * indique différent de pré-exercice (mesures répétées ANOVA avec l' analyse t apparié test post-hoc, le cas échéant; N = 19; P <0,05). Les valeurs sont la moyenne ± erreur standard. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

. Figure 3: granulocytes phagocytose est corrélée à l' inflammation systémique en surpoids femmes / obèses granulocytes phagocytose a été corrélée à la protéine sérique C-réactive, un biomarqueur largement acceptée de l' inflammation systémique (Pearson corrélation produit-moment; N = 87; r = 0,44; P <0,01). S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Ce manuscrit fournit un protocole étape par étape, pour la détermination des deux indicateurs de granulocytes et de la fonction des monocytes. Nous avons identifié quelques étapes qui sont essentielles à la réussite de cet essai. Une telle étape est l'incubation au bain de glace qui se produit immédiatement avant l'addition de bactéries. refroidissement approfondie de tous les échantillons permettra de minimiser l'effet de la température sur la phagocytose et OB activité. Une autre étape essentielle est l'addition de bactéries à chaque échantillon. A 8: 1 bactéries: rapport phagocyte produit des résultats optimaux; cependant, d'autres chercheurs peuvent trouver que ce rapport devra être modifié pour produire des résultats convenables. Une autre étape importante est l'utilisation de RBC lytique et des réactifs de fixation WBC pour lyser les globules rouges et fixer WBCs. L'utilisation de ce tels réactifs assure une lyse complète des hématies et permet aux chercheurs de stocker en toute sécurité des échantillons traités à 4 ° C pendant une nuit, puis les exécuter à travers le cytomètre le lendemain. Des travaux antérieurs (non publié) indicAtes que RBC lytique et la fixation WBC peuvent être utilisés pour retarder la cytométrie de flux d'échantillons fixés par autant que 12 heures sans compromettre l'intégrité des données.

Cette procédure peut être facilement modifié pour répondre aux capacités et aux intérêts du chercheur, mais il convient de souligner que l'optimisation est nécessaire lorsque des adaptations sont faites. Quelques-unes des adaptations les plus courantes qui ont été rapportés sont les bactéries cibles, l'étiquette / sonde, et le temps d'incubation. Les chercheurs ont produit des résultats exceptionnels lorsque Escherichia coli 7,8 est utilisé à la place de S. aureus pathogène cible ( à la fois au rapport 8: 1). Un champignon, telle que Saccharomyces cerevisiae, peut également convenir , comme un substitut à E. coli. En outre, les chercheurs utilisent fréquemment une sonde moléculaire sensible au pH, 7,12 au lieu de FITC, comme la sonde pour la phagocytose. De même, les sondes autres que HE sont couramment utilisés pour mesurer l'activité de l'OB, including dichlorofluorescin diacétate (DCF-DA) 10 et dihydrorhodamine 123 (DHR). 13 déclarés temps d'incubation varie de 20 min à 120 min, 12,14,15 avec McFarlin signalant que le temps de réponse maximal peut varier selon la cible bactérienne. 7 Il devrait également de noter que les temps d'incubation optimales peuvent varier entre les phagocytose et OB aspects de l'essai. 7

Comme avec tous les tests de laboratoire, le dépannage peut être nécessaire lors de l'établissement de cette technique dans un nouveau contexte de recherche. Les auteurs conseillent que l'optimisation des bactéries: rapport phagocyte est la clé du succès pour ce dosage. Les auteurs notent également que les données provenant d'un échantillon doivent être éliminés de l'analyse si moins de 80% des cellules dans la population de granulocytes d'un participant non-malades sont FITC positifs; dans cette situation, l'échantillon peut être re-collecté et analysé à nouveau, si possible.

Il y a quelques limitations à lagranulocytes et monocytes phagocytose et dosage de l'activité OB décrits dans ce manuscrit. Une telle limitation est l'usage exclusif du FSC et SSC pour identifier les populations de cellules d'intérêt. L'utilisation de marqueurs de surface cellulaire permettrait aux chercheurs d'identifier positivement les populations de cellules. 10 Cependant, l'ajout de cette fonctionnalité , il faudrait plus d'un flux de base cytomètre, et est donc au - delà de la portée de ce manuscrit. Une autre limitation de ce test est qu'il repose sur l'efficacité du bleu trypan pour étancher la fluorescence des sondes qui ne sont pas internalisées par les cellules immunitaires d'intérêt. Une sonde moléculaire 7,12 sensible au pH peut être utilisé comme une alternative à la FITC dans des situations où l' intériorisation est une préoccupation. Etant donné qu'une telle sonde est seulement fluorescente dans des environnements acides tels que ceux dans des vésicules d'endocytose, la fluorescence des particules internalisées acquise représente seulement. En outre, plusieurs chercheurs ont critiqué le test en cours, car il fairees ne comprend pas un ensemble parallèle d'échantillons est mis en incubation dans de l'eau glacée au lieu de 37 ° C, pour contrôler l'activité des cellules immunitaires de base. A plusieurs reprises, nous avons inclus cette «condition de la glace" lors de l'exécution du test de granulocytes et des monocytes phagocytose et l'activité OB, et a constaté que cela n'améliore pas significativement la qualité des données (non publiées).

En résumé, ce manuscrit décrit une technique de mesure de la phagocytose et OB activité dans les granulocytes et les monocytes. Ceci est un test simple, simple qui peut être facilement modifié pour tenir compte des capacités de laboratoire et les intérêts de recherche. Dans l'exercice science- et de la recherche liée à l'obésité, cette mesure de la fonction immunitaire innée permettra à l'enquêteur d'explorer les effets de nombreuses contre-mesures possibles, y compris la perte de poids, l'utilisation de supplément, les interventions alimentaires, et d'autres changements de style de vie. Lors de la maîtrise de cette technique, les chercheurs seront en mesure de surveiller aiguëet les changements chroniques dans la fonction des cellules immunitaires en réponse à l'alimentation, l'exercice, et de nombreux autres stimuli.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Acknowledgments

Les auteurs tiennent à remercier Zack Shue, Casey John et Lynn Cialdella-Kam pour leur aide lors de l'optimisation de cette procédure.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
12 x 75 mm tubes, with cap VWR 20170-579 You will need 2 tubes per sample ("H" and "F") plus 3 tubes per batch (for assay controls; "F", "H", and "Blood only").
PBS (10x), pH 7.4 Life Technologies 70011-044
Bottle top 0.2 µm cellulose acetate filter (500 ml capacity) Fisher Scientific 09-741-07 
Glucose, powder Life Technologies 15023-021
Citric acid (anhydrous, cell culture tested, plant cell culture tested) Sigma-Aldrich C2404-100G
Sodium citrate tribasic dihydrate Sigma-Aldrich S4641-25G
Dihydroethidium (Hydroethidine) (HE) Life Technologies D11347
Dimethyl sulfoxide (DMSO) Anhydrous Life Technologies D12345
Staphylococcus aureus (Wood strain without protein A) BioParticles, fluorescein conjugate (FITC) Life Technologies S2851
Staphylococcus aureus (Wood strain without protein A) BioParticles, unlabeled Life Technologies S-2859
Trypan Blue Solution, 0.4% Life Technologies 15250-061
4.0 ml vacutainer containing 7.2 mg K2EDTA, spray-dried VWR BD367861 You will need 1 K2EDTA blood collection tube per sample.
4.0 ml vacutainer containing 68 USP units Lithium Heparin, spray-coated VWR BD367884 You will need 1 Lithium Heparin blood collection tube per sample.
COULTER Ac·T 5diff CP Beckman Coulter 6605705 i.e., hematology analyzer
COULTER Ac·T 5diff Rinse Beckman Coulter 8547167
COULTER Ac·T 5diff Fix Beckman Coulter 8547171
COULTER Ac·T 5diff WBC Lyse Beckman Coulter 8547170
COULTER Ac·T 5diff Hgb Lyse Beckman Coulter 8547168
COULTER Ac·T 5diff Cal Calibrator Beckman Coulter 7547175
COULTER Ac·T 5diff Control Plus Beckman Coulter 7547198
AcT 5diff Diluent Beckman Coulter 8547169
200 µl extended-length pipette tips VWR 37001-526
Insulated ice pan VWR 89198-980 For ice water bath.
Open metal tube rack VWR 60916-702
Fetal Bovine Serum Life Technologies 26140-111
TQ-Prep Workstation Beckman Coulter 6605429 i.e., automated cell lyse preparation workstation
ImmunoPrep Reagent System Beckman Coulter 7546999 i.e., RBC lyse/WBC fix reagent system
Cytomics FC500 MCL Flow Cytometry System with CXP Software Beckman Coulter 626553
IsoFlow Sheath Fluid Beckman Coulter 8547008
COULTER CLENZ Beckman Coulter 8546929
Flow-Check Fluorospheres  Beckman Coulter 6605359 i.e., alignment and fluidics verification fluorospheres
FlowJo Software FlowJo FlowJo i.e., flow cytometry analysis software
Excel Software Microsoft Microsoft Excel i.e., electronic spreadsheet program

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Nieman, D. C., et al. Influence of pistachios on performance and exercise-induced inflammation, oxidative stress, immune dysfunction, and metabolite shifts in cyclists: a randomized, crossover trial. PLoS One. 9, e113725 (2014).
  2. Knab, A. M., et al. Effects of a freeze-dried juice blend powder on exercise-induced inflammation, oxidative stress, and immune function in cyclists. Appl Physiol Nutr Metab. 39, 381-385 (2014).
  3. Konrad, M., et al. The acute effect of ingesting a quercetin-based supplement on exercise-induced inflammation and immune changes in runners. Int J Sport Nutr Exerc Metab. 21, 338-346 (2011).
  4. Nieman, D. C., et al. Immune and inflammation responses to a 3-day period of intensified running versus cycling. Brain Behav Immun. 39, 180-185 (2014).
  5. Nieman, D. C., et al. Carbohydrate supplementation affects blood granulocyte and monocyte trafficking but not function after 2.5 h of running. Am J Clin Nutr. 66, 153-159 (1997).
  6. Tidball, J. G. Inflammatory cell response to acute muscle injury. Med Sci Sports Exerc. 27, 1022-1032 (1995).
  7. McFarlin, B. K., Williams, R. R., Venable, A. S., Dwyer, K. C., Haviland, D. L. Image-based cytometry reveals three distinct subsets of activated granulocytes based on phagocytosis and oxidative burst. Cytometry A. 83, 745-751 (2013).
  8. Liao, Y., Liu, P., Guo, F., Zhang, Z. Y., Zhang, Z. Oxidative burst of circulating neutrophils following traumatic brain injury in human. PLoS One. 8, e68963 (2013).
  9. McFarlin, B. K., Venable, A. S., Prado, E. A., Henning, A. L., Williams, R. R. Image-based flow cytometry technique to evaluate changes in granulocyte function in vitro. J Vis Exp. , (2014).
  10. Nieman, D. C., et al. Immune response to obesity and moderate weight loss. Int J Obes Relat Metab Disord. 20, 353-360 (1996).
  11. Nieman, D. C., et al. Immune function in female elite rowers and non-athletes. Br J Sports Med. 34, 181-187 (2000).
  12. Ichii, H., et al. Iron sucrose impairs phagocytic function and promotes apoptosis in polymorphonuclear leukocytes. Am J Nephrol. 36, 50-57 (2012).
  13. Gomes, A., Fernandes, E., Lima, J. L. Fluorescence probes used for detection of reactive oxygen species. J Biochem Biophys Methods. 65, 45-80 (2005).
  14. Gruger, T., et al. Negative impact of linezolid on human neutrophil functions in vitro. Chemotherapy. 58, 206-211 (2012).
  15. Dementhon, K., El-Kirat-Chatel, S., Noel, T. Development of an in vitro model for the multi-parametric quantification of the cellular interactions between Candida yeasts and phagocytes. PLoS One. 7, e32621 (2012).

Tags

Immunologie numéro 115 phagocytose oxydatif monocytes granulocytes l'immunité innée par cytométrie de flux
Mesure de granulocytes et de monocytes phagocytose et oxydative Activité Burst dans le sang humain
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Meaney, M. P., Nieman, D. C.,… More

Meaney, M. P., Nieman, D. C., Henson, D. A., Jiang, Q., Wang, F. Z. Measuring Granulocyte and Monocyte Phagocytosis and Oxidative Burst Activity in Human Blood. J. Vis. Exp. (115), e54264, doi:10.3791/54264 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter