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Immunology and Infection

La medición de granulocitos y de monocitos fagocitosis y la actividad de la explosión oxidativa en la sangre humana

Published: September 12, 2016 doi: 10.3791/54264
Automatic Translation
1, 1, 2, 3, 3
1Human Performance Laboratory, North Carolina Research Campus, Appalachian State University, 2Department of Biology, Appalachian State University, 3David H. Murdock Research Institute

Introduction

El granulocitos y monocitos fagocitosis / explosión oxidativa (OB) ensayo de actividad es una técnica simple y directa que se utiliza con frecuencia para reunir información acerca de la función inmune innata después de un ejercicio prolongado e intensivo. 1-4 Al estudiar la respuesta del sistema inmune a un estímulo, los granulocitos y los monocitos son de particular interés, ya que juegan un papel central en la defensa del huésped y son las primeras células inmunes a acumularse en el sitio de infección. 5 neutrófilos, un tipo de granulocitos, son las primeras células de translocación de en el músculo dañado de tejidos después de un ejercicio intenso. 6 la fagocitosis y la actividad de OB son las medidas más comunes de granulocitos y monocitos función, 7 y se prefieren como indicadores de la función celular inmune innato debido a su papel central tanto en el proceso de infección y el proceso de reparación.

El ensayo descrito en este manuscrito utilizes un flujo básico citómetro para proporcionar una determinación cuantitativa de granulocitos y la fagocitosis de monocitos y la actividad OB en la sangre entera. El uso de sangre total en esta técnica es ventajosa porque permite que el ensayo se lleva a cabo sin un procedimiento de purificación que consume tiempo. Este ensayo se puede modificar fácilmente para acomodar una variedad de diseños de investigación y capacidades de laboratorio. Por ejemplo, Liao et al. Utilizó una técnica similar para mostrar que la actividad de neutrófilos OB se incrementa y neutrófilos fagocitosis se disminuye después de una lesión cerebral traumática. 8 En otro ejemplo, McFarlin et al. Describe un elegante modificación de esta técnica que utiliza aloficocianina (APC ) conjugado con CD66b y CD45 etiquetado APC-conjugado tándem de alto rendimiento con la imagen basada en citometría de flujo para clasificar los granulocitos en términos de sus actividades fagocitosis y OB 7,9.

Nuestro grupo de investigación ha utilizado diversas adaptaciones de la presente technique como un indicador de la función inmune innata en poblaciones con sobrepeso, obesos, y atléticas durante casi 20 años. 10,11 El texto a continuación proporcionará al lector con instrucciones paso a paso para realizar este ensayo y destacar las áreas que el lector pueda adaptarse para satisfacer las necesidades de sus investigaciones.

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Protocol

NOTA: Todos los procedimientos de recolección de sangre se llevaron a cabo de acuerdo con las directrices establecidas por la Universidad Estatal de los Apalaches (ASU) Junta de Revisión Institucional (IRB).

1. Preparación Ensayo

  1. Reunir, preparar y organizar los materiales especificados para el procedimiento (por favor refiérase a la Tabla de materiales específicos / Equipo).
    1. Etiquetar los tubos de 12 x 75 mm.
      1. Etiqueta de dos tubos para cada participante: un tubo para el ensayo de fagocitosis (etiquetar este tubo con tinta negro y una "F" para isotiocianato de fluoresceína [FITC]) y un tubo para el ensayo de actividad de OB (etiqueta este tubo con tinta roja y un " H "para dihydroethidium [HE]).
        NOTA: El uso de tubos mm estériles de 12 x 75 se recomienda para minimizar la activación celular no deseado y aumento asociado en el ruido de fondo.
      2. Etiquetar tres tubos de ensayo para los controles: un tubo para el ensayo de fagocitosis (control FITC: etiquetar este tubo con black tinta y una "F"), un tubo para el ensayo de actividad de OB (HE de control: la etiqueta, este tubo con tinta roja y una "H"), y un tubo para el control negativo (Sangre solamente: etiquetar este tubo con tinta verde y "sólo la sangre").
    2. Preparar soluciones madre al menos un día antes del día del ensayo.
      1. Preparar la solución salina estéril tamponada con fosfato (PBS). Diluir 100 ml de 10x PBS con 900 ml de 18,2 mO H2O Filtrar esterilizar con un filtro de 0,2 micras. Almacenar a 4 ° C hasta su uso.
      2. Preparar la PBS-glucosa estéril. Disolver 1,0 g de glucosa en 100 ml de PBS. Filtrar esterilizar con un filtro de 0,2 micras. Almacenar a 4 ° C hasta su uso.
      3. Preparar el tampón de citrato 0,1 M estéril. Disolver 1,2 g de ácido cítrico y 1,1 g de citrato de sodio en 100 ml de 18,2 mO H 2 O. Ajustar el pH a 4,0. Filtrar esterilizar con un filtro de 0,2 micras. Almacenar a 4 ° C hasta su uso.
      4. Preparar la solución madre HE. Resuspend 1,0 mg de la ES en 1,0 ml de dimetilsulfóxido (DMSO). Mezclar suavemente, alícuota y se almacena a -20 ° C hasta su uso.
      5. Preparar la solución madre marcado con FITC Staphylococcus aureus (S. aureus) (2 x 10 9 partículas / ml). Resuspender 10 mg de S. marcado con FITC aureus en 1,5 ml (o cantidad apropiada de PBS). Se divide en tres alícuotas de 500 y se somete a ultrasonidos de acuerdo con las recomendaciones del fabricante. Alícuota y almacenar a -20 ° C hasta su uso.
      6. Preparar el no marcado S. aureus solución madre (2 x 10 9 partículas / ml). Resuspender 100 mg de no marcado S. aureus en 15 ml (o cantidad apropiada de PBS). Se divide en treinta y 500 ml de alícuotas y se somete a ultrasonidos de acuerdo con las recomendaciones del fabricante. Alícuota y almacenar a -20 ° C hasta su uso.
    3. Preparar soluciones de trabajo frescas en el día del ensayo.
      1. Preparar la solución de trabajo HE. Transferir 10 l dedescongelado HE solución madre a 990 l de PBS-glucosa. Proteger de la luz y mantener en hielo hasta su uso.
      2. Preparar el S. marcado con FITC solución de trabajo aureus (133.333 partículas / l). Transferencia de 70 l de descongelado S. marcado con FITC aureus solución madre a 980 l de PBS. Proteger de la luz y mantener en hielo hasta su uso.
      3. Preparar el no marcado S. solución de trabajo aureus (133.333 partículas / l). Transferencia de 70 l de descongelado S. no marcado aureus solución madre a 980 l de PBS. Proteger de la luz y mantener en hielo hasta su uso.
      4. Preparar la solución de enfriamiento. Añadir 750 l de solución de azul de tripano al 0,4% a 11,25 ml de tampón de citrato 0,1 M estéril. Mantenga en un baño de agua con hielo hasta su uso.
    4. Tiene un flebotomista certificado extraer la sangre según las directrices de la Organización Mundial de la Salud para la extracción de sangre.
      1. Extraer la sangre en un tubo de recogida de 4 ml de sangre que contiene K 2 EDTA. Entubo de recogida de sangre vert de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Mantenga el tubo de recogida de sangre a temperatura ambiente en un agitador de sobremesa hasta su uso. Utilice esta sangre para el recuento sanguíneo completo (CBC) con el análisis de glóbulos blancos diferencial (CMB) se describe en el paso 1.2.1.
      2. Extraer la sangre en el tubo de recogida de un 4 ml de sangre que contiene heparina de litio. Invertir tubo de recogida de sangre de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Mantenga el tubo de recogida de sangre a temperatura ambiente en un agitador de sobremesa hasta su uso. Utilice esta sangre para el ensayo de monocitos y granulocitos fagocitosis y la actividad OB se describe en el paso 2.
  2. Determinar la cantidad de bacterias (por ejemplo, S. aureus) que serán necesarios para completar el ensayo para cada muestra.
    1. Utilizar un analizador de hematología para llevar a cabo un hemograma completo con análisis diferencial WBC en la sangre como se describe en las instrucciones del fabricante. Anote el recuento de glóbulos blancos (en células / ml),% de neutrófilos, y el%los valores de los monocitos.
    2. Use las ecuaciones a continuación para determinar los recuentos de neutrófilos y monocitos para cada muestra.
      Recuento de neutrófilos (en células / ml) =% de neutrófilos × WBC (en células / ml)
      Recuento de monocitos (en células / ml) =% de monocitos × WBC (en células / ml)
    3. Use las ecuaciones siguientes para determinar el recuento de los fagocitos para cada muestra y el número de fagocitos presentes en 100 l de muestra.
      Recuento de fagocito (en células / ml) = recuento de neutrófilos (en células / ml) + recuento de monocitos (en células / ml)
      Número de fagocitos en 100 l = (recuento de fagocitos (en células / ml)) / 10
    4. Usar la ecuación siguiente para determinar el número de bacterias (es decir, S. aureus) necesarios para cada muestra y la cantidad de S. marcado con FITC aureus o no marcados S. aureus solución de trabajo (133.333 partículas / ml) que debe ser agregado a cada tubo.
      NOTA: La bacterias diana: relación de los fagocitos es de 8: 1.
      Número de bacterias necesarias =Número de fagocitos en 100 l × 8
      Volumen de solución de trabajo FITC o no marcado sea necesario (en l) = (número de bacterias necesarias) / (133.333 partículas / l)

2. Realizar Ensayo

  1. Preparar sangre completa para el ensayo.
    1. Para cada tubo de participante y control, utilizar una punta de pipeta de longitud extendida para transferir 100 l de sangre total desde el tubo de recogida de sangre con heparina de litio a la parte inferior de un tubo apropiadamente etiquetado 12 x 75 mm. Vuelva a colocar las tapas.
      NOTA: Tenga cuidado para evitar que la sangre en los lados de los tubos de 12 x 75 mm.
    2. Utilice una micropipeta añadir 10 l de SE solución a los tubos etiquetados con tinta roja y una "H", incluyendo el tubo de control HE trabajo. Vuelva a colocar las tapas y vórtice brevemente.
    3. Incubar todos los tubos en un baño de agua a 37 ° durante 15 min. A continuación, traslado inmediato a todos los tubos a un baño de agua helada durante 12 min.
      NOTA: Utilice un estante de metal abiertoy agitar suavemente el bastidor cada 5 minutos para asegurar que los tubos son de forma rápida y adecuadamente calentado o refrigerado.
  2. Añadir las bacterias (es decir, S. aureus) a los tubos de muestra y de control.
    1. Utilice una micropipeta para añadir la cantidad apropiada (calculado en el paso 1.2.4) y no marcado S. Solución de trabajo aureus a los tubos etiquetados con tinta roja y una "H", incluyendo el tubo de control HE. Vuelva a colocar las tapas y vórtice brevemente.
    2. Utilice una micropipeta para añadir la cantidad apropiada (calculado en el paso 1.2.4) de S. marcado con FITC Solución de trabajo aureus a los tubos etiquetados con tinta negro y una "F", incluyendo el tubo de control FITC. Vuelva a colocar las tapas y vórtice brevemente.
    3. Vortex la "sangre solamente" tubo de control, pero no añadir cualquiera de los tipos de bacterias (es decir, S. aureus) a la misma.
    4. Incubar todos los tubos en un baño de agua a 37 ° durante 20 min. Utilice una rejilla de metal abierta y agitar suavemente el estante cada 5 minutospara asegurar que los tubos se calientan de forma rápida y adecuada. Después del período de incubación, transferir inmediatamente a todos los tubos a un baño de agua helada durante 1 min.
  3. Se lavan las células.
    1. Usar una pipeta de repetidor para añadir 100 l de solución de enfriamiento enfriado en hielo a todos los tubos. Vuelva a colocar las tapas, vórtice brevemente y luego se incuban todos los tubos en hielo durante 1 min.
    2. Utilizar una pipeta repetidora para agregar 1 ml de PBS helado a todos los tubos. Vórtice brevemente y, a continuación, agregar un adicional de 2 ml de PBS helado a todos los tubos y vuelva a colocar las tapas. Centrifugar todos los tubos durante 5 min a 4 ° C y 270 xg, y luego aspirar el sobrenadante.
    3. Repita el paso 2.3.2 una vez (total de 2 lavados).
  4. Preparar muestras para citometría de flujo.
    1. Utilizar una pipeta repetidora añadir 50 l de suero bovino fetal enfriado en hielo a todos los tubos. Brevemente vórtex todos los tubos.
    2. Transferir todos los tubos a un carrusel adecuada y utilizar una estación de trabajo automatizado de preparación de lisar células rojas de la sangre con el cell (RBC) lisar y WBC fijación de reactivos para lisar los hematíes y fijar los glóbulos blancos como se describe en las instrucciones del fabricante.
    3. Después de la lisan células ejecutar la preparación del sitio de trabajo automatizado ha completado, envuelva los tubos en papel de aluminio y colocarlo en el refrigerador 4 ° C hasta que el análisis de citometría de flujo se puede realizar.

3. Adquisición de Citometría de Flujo

  1. Configuración del sistema de citometría de flujo.
    1. Calentar el sistema de flujo de citometría como se indica en el manual del usuario proporcionado por el fabricante. A continuación, comprobar los niveles de reactivos y el tanque de residuos. Si es necesario, llenar los depósitos de reactivos y / o vaciar el depósito de residuos.
    2. Utilice la función "Limpiar Panel" para ejecutar el sistema de ciclo de limpieza. A continuación, ejecute las fluoroesferas de alineación y verificación de fluidos, y asegúrese de que el coeficiente de la mitad de las horas punta de variación (HPCV) para cada detector está dentro del rango predefinido se describe en el control de calidad de los protocolos (QC) proporcionados por la fabricaciónr.
  2. Crear adquisición ensayo específico y el establecimiento de protocolos de instrumentos.
    1. Crear protocolos de adquisición-ensayo específico para los ensayos de actividad de fagocitosis y OB.
      NOTA: Los protocolos de adquisición que aquí se describen pueden ser adaptados para su uso en cualquier citómetro de flujo con un láser azul (488 nm), un filtro (530/30) para FITC, y un filtro (575/26) para HE.
      1. Abra la citometría de flujo software de adquisición de sistema y crear un "Nuevo Protocolo".
      2. Elija la opción "FL1 de parámetros" para el ensayo de fagocitosis (FITC) y el "FL2 de parámetros" para el ensayo de actividad de OB (HE).
      3. Crear las parcelas (es decir, dispersión hacia adelante [FSC] frente a la dispersión lateral [SSC] gráfico de puntos, FL1 histograma, histograma FL2) requerido para la adquisición.
      4. Crear regiones poligonales para el WBC (células blancas de la sangre), de granulocitos y monocitos poblaciones en la trama FSC frente a SSC y crear regiones lineales en los histogramas FL1 y FL2. Conjunto a & #34; Pare Count "de 50.000 eventos en la puerta del CMB.
      5. Guarde los protocolos de ensayo con nombres específicos.
    2. Crear protocolos de instalación de instrumentos-ensayo específico para los ensayos de actividad de fagocitosis y OB.
      1. Arrastrar y soltar "los protocolos de ensayo específico de adquisición" (definidos en el paso 3.2.1) desde el "Explorador de recursos" para la "Adquisición Manager" en la citometría de flujo software de adquisición de sistema.
        NOTA: La información añadida de esta manera aparecerá siempre al final de la lista de trabajo.
      2. Introduzca la información de la muestra en la lista de trabajo, y guardar la lista de trabajo.
      3. Retire los tubos de muestras de control de la nevera 4 ° C y dejar que se equilibren a temperatura ambiente durante 15 minutos. Entonces, vórtice brevemente cada tubo de muestra de control.
      4. Utilizar los "protocolos de adquisición-ensayo específico" definidos en el paso 3.2.1 para ejecutar la muestra de control negativo (es decir, sólo la sangre) y el control positivomuestras (es decir, HE control, control FITC) a través del sistema de citometría de flujo. Revisar los histogramas y ajustar el tubo fotomultiplicador (PMT) voltajes de los canales ficoeritrina (PE) y FITC según sea necesario.
      5. Vortex las muestras de control y transferirlos a la citometría de flujo carrusel sistema de acuerdo con el orden en la lista de trabajo. A continuación, colocar el carrusel en la cámara de muestreo y hacer clic en el botón de la barra de herramientas citómetro "Inicio" para adquirir datos de las muestras de control. Guarde el "xxx Configuración Pro" protocolo de ajuste.
  3. Adquirir muestras de estudio sobre el sistema de citometría de flujo.
    1. Retire los tubos de muestra de estudio de la nevera 4 ° C y permitir que se equilibre a temperatura ambiente durante 15 minutos.
    2. Mientras que las muestras están equilibrándose, arrastre los protocolos de adquisición específicos del estudio predefinidos para el espacio de lista de trabajo para hacer una lista de trabajo del proyecto.
    3. Confirmar que el "protocolo de ajuste" está vinculada a la Y# 34;. Los protocolos de instalación-ensayo específico "definidos en el paso 3.2.2 A continuación, introduzca la información de identificación (por ejemplo, nombre del estudio, dibujar número, número de visita, sujeta ID) para cada tubo en la lista de trabajo.
    4. Después del período de equilibrio de 15 min, las muestras de estudio de vórtice y las transfieren a la citometría de flujo carrusel sistema de acuerdo con el orden en la lista de trabajo. A continuación, colocar el carrusel en la cámara de muestreo y hacer clic en el botón de la barra de herramientas citómetro "Inicio" para adquirir datos de las muestras de estudio.
    5. Revisar la calidad de los datos mediante la inspección de la eficiencia de RBC lisis y la distribución de subgrupos de células WBC, proporciones, los recuentos absolutos, y la intensidad de fluorescencia en el panel de informes de cada muestra.
      NOTA: Se considera que la calidad de los datos para ser aceptable si todos estos criterios se encuentran dentro de sus límites predefinidos. Si no se cumplen todos los criterios, la muestra debe ser reprocesado.
    6. Limpia y apagar el sistema de citometría de flujo. Almacenar la citometría de flujodatos en dos diferentes unidades del ordenador para evitar la pérdida accidental de datos.

Análisis 4. Datos

  1. Realizar el análisis de la fagocitosis.
    1. Consolidar toda la fagocitosis (es decir, F-etiquetado) archivos de datos los datos del modo de ejemplo y la lista de control (LMD) en una sola carpeta. A continuación, abra la citometría de flujo software de análisis y arrastre los archivos en el espacio muestral.
    2. Ajuste el CMB, granulocitos, monocitos y linfocitos puertas.
      1. Haga doble clic en el nombre del archivo para abrir cualquiera de las "muestras de control FITC". Utilice los menús desplegables para establecer el eje x para "FSC" y "lineal" y el eje y para "SSC" y "lineal".
      2. Utilice el "selector de puerta de polígono" para preparar una puerta de la población total de glóbulos blancos.
        NOTA: Asegúrese de incluir todas las células en los bordes de la tabla. Etiquetar esta puerta "CMB".
      3. Haga doble clic en la "nueva puerta del CMB" y utilice el desplegablemenús desplegables para ajustar el eje x a "FSC" y "lineal" y el eje y a "SSC" y "lineal".
      4. Utilice el "selector de puerta de polígono" para establecer la "granulocitos puerta" y la puerta de monocitos "y, a continuación, utilizar el" selector de puerta elíptica "para establecer la" Linfocitos puerta ". Etiqueta de cada puerta en consecuencia. Arrastre los" datos de compuerta (%) "a un lado para que las células se ven fácilmente.
    3. Ajuste el "fagocitosis positiva puerta" y la "puerta de fagocitosis negativo" para las poblaciones de granulocitos y monocitos.
      1. Haga doble clic en la "muestra de control FITC" utilizado en el paso 4.1.2.1. A continuación, haga clic en la "puerta de granulocitos" y utilice los menús desplegables para establecer el eje X a "FL1" y "Registro" y el eje de "SSC" y "lineal".
      2. Utilice el "selector de puerta cuadrada" para establecer una "puerta de fagocitosis Negativo" y un "fagocitosis Positive puerta ".
        NOTA: Como las muestras de control FITC no recibieron (es decir, S. aureus) estímulos bacterianos, todas las células deberían ser teóricamente fagocitosis negativo. Sea prudente al establecer los límites para estas poblaciones.
      3. Repita el paso 4.1.3.1 y 4.1.3.2 Paso para la población de monocitos.
    4. Añadir las estadísticas para "% del CMB", "intensidad de la fluorescencia", y "células positivas% fagocitosis" para las poblaciones de granulocitos y monocitos.
      1. Haga clic en la "muestra de control FITC" utilizado en el paso 4.1.2.1. Resalte la "puerta de granulocitos" y, a continuación, haga clic en "espacio de trabajo" y "Añadir Estadística". Resaltar "media geométrica" ​​y "FL1 Log" y haga clic en "Añadir". Entonces optó por la estadística de "Frecuencia de los Padres" y haga clic en "Añadir".
        NOTA: Esto le dará a la intensidad de fluorescencia (media geométrica) de toda la población de granulocitos yel porcentaje de WBC (padre) que son granulocitos.
      2. Haga clic en la "muestra de control FITC" utilizado en el paso 4.1.2.1. Resalte la "puerta de fagocitosis positiva" de la población de granulocitos y, a continuación, haga clic en "espacio de trabajo" y "Añadir Estadística". Resaltar "media geométrica" ​​y "FL1 Log" y haga clic en "Añadir". A continuación, seleccione la estadística de "Frecuencia de los Padres" y haga clic en "Añadir".
        NOTA: Esto dará la intensidad de fluorescencia (media geométrica) de los granulocitos positivos fagocitosis y el porcentaje de los granulocitos (padres) que son la fagocitosis positivo.
      3. Repita el paso 4.1.4.1 y 4.1.4.2 Paso para la población de monocitos.
      4. Haga clic en la "muestra de control FITC" utilizado en el paso 4.1.2.1. Resalte la "puerta de Linfocitos" y, a continuación, haga clic en "espacio de trabajo" y "Añadir Estadística". Resaltar la estadística de "Frecuencia de los Padres" y haga clic en "Añadir".
        NOTA: Estedará el porcentaje de WBC (padre) que son los linfocitos.
      5. Resalte todas las puertas y las estadísticas creadas en la muestra de control FITC utilizado en el paso 4.1.2.1. Arrastrarlos a "Todas las muestras" en el panel de "Grupo" en la parte superior de la pantalla.
        NOTA: Esto se aplicará estos valores para todas las muestras de estudio.
      6. Guardar y el trabajo como un archivo de nombre .wsp en la misma carpeta que contiene la carpeta LMD.
    5. Ajuste puertas individuales de la muestra.
      1. Haga clic en la "primera muestra" en el conjunto de datos y confirme que la puerta del CMB se ajuste correctamente la distribución celular en la pantalla. Si no es así, haga clic y arrastre los bordes de la puerta de ajustar la puerta para esa muestra. Haga clic en la "flecha derecha" (es decir, "˃") para avanzar a la siguiente muestra. Repita este paso hasta que se hayan revisado todas las muestras.
      2. Haga clic en la "puerta del CMB" para la primera muestra en el conjunto de datos y confirmar que el "Granulocyte puerta "," de monocitos puerta ", y" Linfocitos puerta "para cada muestra se ajusta apropiadamente la distribución celular en la pantalla. Ajuste según sea necesario. Haga clic en la" flecha derecha "(es decir," ˃ ") para avanzar a la siguiente muestra .
      3. Repita el paso 4.1.5.2 hasta que todas las muestras han sido revisados. A continuación, haga clic en "Guardar".
    6. Mostrar los datos en un programa de hoja de cálculo electrónica.
      1. Haga clic en el icono "Editor de tabla" en la parte superior de la pantalla. Haga clic en "Editar", "Palabras clave", y "$ FECHA" para incluir la fecha de muestreo en la hoja de cálculo final. A continuación, haga clic en "Palabras clave" en "Editar" y "@ SAMPLEID1" para incluir la identificación de muestreo en la hoja de cálculo final. Repita para "@ SAMPLEID2", "@ SAMPLEID3", y "@ SAMPLEID4".
      2. Ajustar la pantalla "Editor de tabla" y la pantalla "muestra" para que puedan ser vistos tanto en la pantalla del ordenador. select cualquier "muestra" en la hoja de muestra. A continuación, arrastre cada estadística de interés para el "Editor de tabla".
        1. Arrastre el "Frec del padre." Estadística enumerados en la "puerta de granulocitos" al "Editor de tabla". Tipo "% CMB como granulocitos" en la columna "Nombre" del "Editor de tabla".
        2. Arrastre la estadística de "media geométrica" ​​que aparece debajo de la "puerta de granulocitos" al "Editor de tabla". Tipo "geométrica media de fluorescencia, granulocitos" en la columna "Nombre" del "Editor de tabla".
        3. Arrastre el "Frec del padre." Estadística incluidos en el grupo "granulocitos / fagocitosis positiva puerta" a la "Tabla Editor". Tipo "% Fagocitosis Los granulocitos positivos" en la columna "Nombre" del "Editor de tabla".
        4. Arrastre la estadística de "media geométrica" ​​que aparece bajo el "granulocitos / fagocitosis positiva puerta" a the "Editor de tabla". Tipo de "media geométrica de la fluorescencia, la fagocitosis granulocitos positivos" en la columna "Nombre" del "Editor de tabla".
        5. Arrastre el "Frec del padre." Estadística enumerados en la "puerta de monocitos" al "Editor de tabla". Tipo "% CMB como monocitos" en la columna "Nombre" del "Editor de tabla".
        6. Arrastre la estadística de "media geométrica" ​​que aparece debajo de la "puerta de monocitos" al "Editor de tabla". Tipo "geométrica media de fluorescencia, monocitos" en la columna "Nombre" del "Editor de tabla".
        7. Arrastre el "Frec del padre." Estadística incluidos en el grupo "de monocitos / fagocitosis positiva puerta" a la "Tabla Editor". Escriba "% Fagocitosis Los monocitos positivos" en la columna "Nombre" del "Editor de tabla".
        8. Arrastre la estadística de "Media Geométrica" ​​incluidos en el grupo "de monocitos / Phagocytosis positiva puerta "a la" Tabla Editor ". Tipo" media geométrica de la fluorescencia, la fagocitosis monocitos positivos "en la" columna "de la" Tabla de nombres Editor ".
        9. Arrastre el "Frec del padre." Estadística incluidos en el grupo "Linfocitos puerta" a la "Tabla Editor". Tipo "% CMB como linfocitos" en la columna "Nombre" del "Editor de tabla".
      3. Arrastrar y soltar los parámetros visibles en el "Editor de tabla" hasta que se disponen en el orden preferido.
      4. Clic en Guardar". A continuación, haga clic en "Crear tabla" para mostrar los datos en un formato de hoja de cálculo. Haga clic en "Guardar como" para guardar y trabajar nombre como .xlsx archivo.
  2. Repita el paso 4.1 para el ensayo de actividad de OB (es decir, H-etiquetados) muestras y controlar archivos de datos LMD.
    NOTA: Asegúrese de sustituir todas las referencias a la fagocitosis con referencias a la actividad OB.

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Representative Results

ejercicio prolongado e intensivo tiene profundos efectos en la función inmune innata, incluyendo función natural killer celular, la respuesta de macrófagos mediada por citoquinas a la infección viral, y de granulocitos y la fagocitosis de monocitos y la actividad OB. Múltiples estudios indican que los granulocitos y monocitos fagocitosis aumenta significativamente después del ejercicio, lo que refleja la inflamación inducida por el daño muscular y las demandas metabólicas. En contraste, la actividad de granulocitos y monocitos OB disminuye después del ejercicio y puede ser un indicador inmunológico de aumento de la susceptibilidad a la infección. Por ejemplo, la Figura 1 muestra que la fagocitosis de S. aureus por los granulocitos se incrementa de inmediato y 1,5 horas después de una serie de ciclismo de 75 km (70% VO 2 máx), volviendo a la normalidad por la mañana siguiente. La fagocitosis de monocitos se ve afectado de manera similar por este nivel de ejercicio. La figura 2 muestra que la actividad de granulocitos OB es disminuciónd durante al menos 21 horas después de 75 km en bicicleta. la actividad de los monocitos OB es también disminuyó después de 75 km en bicicleta.

Granulocitos y monocitos fagocitosis de S. aureus, pero no la actividad OB monocitos de granulocitos y, están correlacionados a los biomarcadores de inflamación sistémica figura 3 muestra la modesta correlación entre la fagocitosis de granulocitos y los niveles de proteína C reactiva en suero (PCR) (Pearson producto-momento de correlación;. r = 0,44; p <0,01 ) en 106 mujeres con sobrepeso / obesidad. CRP en suero también se correlaciona con la fagocitosis de monocitos de S. aureus (Pearson producto-momento de correlación; r = 0,30; p <0,01). Además, los neutrófilos de sangre / recuento de leucocitos (correlación de Pearson producto-momento; r = 0,62 yr = 0,61, respectivamente; p <0,001), el índice de masa corporal (correlación de Pearson producto-momento; r = 0,50 yr = 0,40, respectivamente; P <0,001), los niveles de insulina en suero (r = 0,30 yr =0,23; p <0,03), y los niveles sanguíneos A 1C (Pearson de correlación de r = 0,28; yr = 0,21, respectivamente; p <0,04) se correlacionan con granulocitos y monocitos fagocitosis de S. aureus. En general, estos datos indican que el alto de granulocitos y la fagocitosis de monocitos en sujetos en reposo es indicativo de inflamación sistémica.

Figura 1
Figura 1: La fagocitosis de granulocitos se ve afectado por el ejercicio de resistencia intenso fagocitosis de granulocitos aumentó inmediatamente y 1,5 horas después de una serie de ciclismo de 75 km a 70% del VO 2 máx.. Para el 21-hr después del ejercicio, la fagocitosis de granulocitos volvió a ligeramente por debajo de los niveles pre-ejercicio. * indica diferente de pre-ejercicio (ANOVA de medidas repetidas con el análisis de la prueba t post-hoc emparejado, cuando sea apropiado; N = 19; p <0,05). Los valores son miun error estándar de ±. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2

Figura 2:. Granulocitos oxidativo actividad de la explosión se ve afectada por la actividad de la explosión oxidativa de granulocitos intensa resistencia al ejercicio disminuyó inmediatamente, 1,5-hr y 21 hr después de una serie de ciclismo de 75 km a 70% del VO 2 máx. * indica diferente de pre-ejercicio (ANOVA de medidas repetidas con el análisis de la prueba t post-hoc emparejado, cuando sea apropiado; N = 19; p <0,05). Los valores son la media ± error estándar. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

. Figura 3: granulocitos La fagocitosis se correlaciona con la inflamación sistémica en mujeres con sobrepeso / obesidad fagocitosis de granulocitos se correlacionó con suero de proteína C-reactiva, un biomarcador ampliamente aceptada de la inflamación sistémica (correlación de Pearson producto-momento; N = 87; r = 0,44; P <0,01). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Discussion

Este manuscrito proporciona un protocolo paso a paso para la determinación de dos indicadores de granulocitos y la función de monocitos. Hemos identificado algunos pasos que son críticos para el éxito de este ensayo. Una de estas medidas es la incubación baño de hielo que se produce inmediatamente antes de la adición de bacterias. enfriamiento a fondo de todas las muestras minimizará el efecto de la temperatura sobre la actividad de fagocitosis y OB. Otro paso crítico es la adición de las bacterias a cada muestra. Un 8: 1 bacterias: relación de los fagocitos produce resultados óptimos; sin embargo, otros investigadores pueden descubrir que tendrá que ser modificado esta relación para producir resultados adecuados. Otro paso importante es el uso de RBC lisis y reactivos de fijación del CMB para la lisis de los glóbulos rojos y fijar los glóbulos blancos. El uso de este tipo de reactivos asegura la lisis completa de los glóbulos rojos y permite a los investigadores para almacenar de manera segura muestras procesadas a 4 ° C durante la noche, y luego pasarlas por el citómetro de flujo al día siguiente. El trabajo previo (no publicado) Indicates de que RBC de lisis y de fijación WBC se pueden utilizar para retrasar la citometría de flujo de muestras fijadas por tantos como 12 hr sin comprometer la integridad de los datos.

Este procedimiento puede ser fácilmente modificado para satisfacer las capacidades e intereses del investigador, pero debe hacerse hincapié en que la optimización es necesario cuando se hacen adaptaciones. Algunas de las adaptaciones más comunes que se han reportado son para las bacterias diana, la etiqueta / sonda, y el tiempo de incubación. Los investigadores han producido resultados excepcionales en Escherichia coli 7,8 se utiliza en lugar de S. aureus como el patógeno diana (tanto en la proporción de 8: 1). Un hongo, tal como Saccharomyces cerevisiae, también puede ser adecuado como un sustituto de la E. coli. Además, los investigadores utilizan con frecuencia una sonda molecular sensible al pH, 7,12 en lugar de FITC, como la sonda para la fagocitosis. Del mismo modo, las sondas que no sea HE se usan comúnmente para medir la actividad OB, including dichlorofluorescin diacetato (DCF-DA) 10 y dihidrorodamina 123 (DHR). 13 tiempos de incubación reportados varían de 20 min a 120 min, 12,14,15 con McFarlin informar que el tiempo de respuesta máxima puede variar según la diana bacteriana. 7 Debería se observará también que los tiempos óptimos de incubación puede variar entre los aspectos fagocitosis y OB del ensayo. 7

Al igual que con todos los ensayos de laboratorio, resolución de problemas puede ser necesario cuando se establece esta técnica en un nuevo entorno de investigación. Los autores recomiendan que la optimización de las bacterias: relación de los fagocitos es la clave del éxito para este ensayo. Los autores también señalan que los datos de una muestra deben ser descartados del análisis si menos del 80% de las células en la población de granulocitos de un participante no enfermas son FITC positivo; en esta situación, la muestra se puede volver a recoge y se volvió a analizar, si es posible.

Hay algunas limitaciones a lagranulocitos y monocitos fagocitosis y ensayo de actividad OB descritos en este manuscrito. Una de tales limitaciones es el uso exclusivo de FSC y SSC para identificar las poblaciones de células de interés. El uso de marcadores de superficie celular permitiría a los investigadores a identificar positivamente poblaciones celulares. 10 Sin embargo, la adición de esta característica requeriría más de un flujo básico citómetro, y es por lo tanto más allá del alcance de este manuscrito. Otra limitación de este ensayo es que se basa en la eficacia de azul de tripano para extinguir la fluorescencia de las sondas que no han sido internalizados por las células inmunes de interés. A 7,12 sonda molecular sensible al pH puede ser utilizado como una alternativa a FITC en situaciones en que la internalización es una preocupación. Dado que una sonda de este tipo sólo es fluorescente en ambientes ácidos como los de las vesículas de endocitosis, la fluorescencia adquirida representa sólo partículas internalizadas. Además, varios investigadores han criticado el ensayo actual, ya que haceres no incluir un conjunto paralelo de muestras que se incuba en agua de hielo en lugar de a 37 ° C para el control de la actividad de células inmunes línea de base. En varias ocasiones, hemos incluido esta "condición de hielo" cuando se realiza el ensayo de granulocitos y monocitos fagocitosis y la actividad OB, y encontramos que no mejora significativamente la calidad de los datos (no publicados).

En resumen, este manuscrito describe una técnica para medir la actividad de fagocitosis y OB en los granulocitos y monocitos. Este es un simple ensayo, sencilla que puede ser modificado fácilmente para tener en cuenta las capacidades de laboratorio e intereses de investigación. En la ciencia del ejercicio y la investigación relacionada con la obesidad, esta medida de la función inmune innata permitirá al investigador para explorar los efectos de muchos posibles contramedidas, incluyendo la pérdida de peso, uso del suplemento, las intervenciones dietéticas, y otros cambios de estilo de vida. Al dominar esta técnica, los investigadores serán capaces de controlar aguday los cambios crónicos en la función de las células inmunes en respuesta a la dieta, el ejercicio, y muchos otros estímulos.

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Acknowledgments

Los autores desean reconocer Zack Shue, Casey John y Lynn Cialdella-Kam por su ayuda durante la optimización de este procedimiento.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
12 x 75 mm tubes, with cap VWR 20170-579 You will need 2 tubes per sample ("H" and "F") plus 3 tubes per batch (for assay controls; "F", "H", and "Blood only").
PBS (10x), pH 7.4 Life Technologies 70011-044
Bottle top 0.2 µm cellulose acetate filter (500 ml capacity) Fisher Scientific 09-741-07 
Glucose, powder Life Technologies 15023-021
Citric acid (anhydrous, cell culture tested, plant cell culture tested) Sigma-Aldrich C2404-100G
Sodium citrate tribasic dihydrate Sigma-Aldrich S4641-25G
Dihydroethidium (Hydroethidine) (HE) Life Technologies D11347
Dimethyl sulfoxide (DMSO) Anhydrous Life Technologies D12345
Staphylococcus aureus (Wood strain without protein A) BioParticles, fluorescein conjugate (FITC) Life Technologies S2851
Staphylococcus aureus (Wood strain without protein A) BioParticles, unlabeled Life Technologies S-2859
Trypan Blue Solution, 0.4% Life Technologies 15250-061
4.0 ml vacutainer containing 7.2 mg K2EDTA, spray-dried VWR BD367861 You will need 1 K2EDTA blood collection tube per sample.
4.0 ml vacutainer containing 68 USP units Lithium Heparin, spray-coated VWR BD367884 You will need 1 Lithium Heparin blood collection tube per sample.
COULTER Ac·T 5diff CP Beckman Coulter 6605705 i.e., hematology analyzer
COULTER Ac·T 5diff Rinse Beckman Coulter 8547167
COULTER Ac·T 5diff Fix Beckman Coulter 8547171
COULTER Ac·T 5diff WBC Lyse Beckman Coulter 8547170
COULTER Ac·T 5diff Hgb Lyse Beckman Coulter 8547168
COULTER Ac·T 5diff Cal Calibrator Beckman Coulter 7547175
COULTER Ac·T 5diff Control Plus Beckman Coulter 7547198
AcT 5diff Diluent Beckman Coulter 8547169
200 µl extended-length pipette tips VWR 37001-526
Insulated ice pan VWR 89198-980 For ice water bath.
Open metal tube rack VWR 60916-702
Fetal Bovine Serum Life Technologies 26140-111
TQ-Prep Workstation Beckman Coulter 6605429 i.e., automated cell lyse preparation workstation
ImmunoPrep Reagent System Beckman Coulter 7546999 i.e., RBC lyse/WBC fix reagent system
Cytomics FC500 MCL Flow Cytometry System with CXP Software Beckman Coulter 626553
IsoFlow Sheath Fluid Beckman Coulter 8547008
COULTER CLENZ Beckman Coulter 8546929
Flow-Check Fluorospheres  Beckman Coulter 6605359 i.e., alignment and fluidics verification fluorospheres
FlowJo Software FlowJo FlowJo i.e., flow cytometry analysis software
Excel Software Microsoft Microsoft Excel i.e., electronic spreadsheet program

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References

  1. Nieman, D. C., et al. Influence of pistachios on performance and exercise-induced inflammation, oxidative stress, immune dysfunction, and metabolite shifts in cyclists: a randomized, crossover trial. PLoS One. 9, e113725 (2014).
  2. Knab, A. M., et al. Effects of a freeze-dried juice blend powder on exercise-induced inflammation, oxidative stress, and immune function in cyclists. Appl Physiol Nutr Metab. 39, 381-385 (2014).
  3. Konrad, M., et al. The acute effect of ingesting a quercetin-based supplement on exercise-induced inflammation and immune changes in runners. Int J Sport Nutr Exerc Metab. 21, 338-346 (2011).
  4. Nieman, D. C., et al. Immune and inflammation responses to a 3-day period of intensified running versus cycling. Brain Behav Immun. 39, 180-185 (2014).
  5. Nieman, D. C., et al. Carbohydrate supplementation affects blood granulocyte and monocyte trafficking but not function after 2.5 h of running. Am J Clin Nutr. 66, 153-159 (1997).
  6. Tidball, J. G. Inflammatory cell response to acute muscle injury. Med Sci Sports Exerc. 27, 1022-1032 (1995).
  7. McFarlin, B. K., Williams, R. R., Venable, A. S., Dwyer, K. C., Haviland, D. L. Image-based cytometry reveals three distinct subsets of activated granulocytes based on phagocytosis and oxidative burst. Cytometry A. 83, 745-751 (2013).
  8. Liao, Y., Liu, P., Guo, F., Zhang, Z. Y., Zhang, Z. Oxidative burst of circulating neutrophils following traumatic brain injury in human. PLoS One. 8, e68963 (2013).
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Inmunología No. 115 fagocitosis explosión oxidativa monocitos granulocitos la inmunidad innata citometría de flujo
La medición de granulocitos y de monocitos fagocitosis y la actividad de la explosión oxidativa en la sangre humana
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Meaney, M. P., Nieman, D. C., Henson, D. A., Jiang, Q., Wang, F. Z. Measuring Granulocyte and Monocyte Phagocytosis and Oxidative Burst Activity in Human Blood. J. Vis. Exp. (115), e54264, doi:10.3791/54264 (2016).

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