Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Het meten van granulocyten en monocyten fagocytose en oxidatieve Burst activiteit in menselijk bloed

Published: September 12, 2016 doi: 10.3791/54264
Automatic Translation
1, 1, 2, 3, 3
1Human Performance Laboratory, North Carolina Research Campus, Appalachian State University, 2Department of Biology, Appalachian State University, 3David H. Murdock Research Institute

Introduction

De granulocyten en monocyten fagocytose / oxidatieve burst (OB) activiteitstest is een eenvoudige, ongecompliceerde techniek die vaak wordt gebruikt om informatie over aangeboren immuunsysteem langdurige en intensieve inspanning verzamelen. 1-4 Bij de studie van de reactie van het immuunsysteem op een stimulus, granulocyten en monocyten zijn van bijzonder belang omdat ze een centrale rol in de afweer spelen en zijn de eerste immuuncellen te accumuleren op de plaats van infectie. 5 neutrofielen, een type granulocyt, zijn de eerste cellen te transloceren in beschadigde spieren weefsel na intensieve inspanning. 6 fagocytose en OB activiteit zijn de meest voorkomende maatregelen en granulocyt monocyt functie 7 en de voorkeur als indicatoren van innate immune celfunctie vanwege hun centrale rol in zowel het infectieproces en het herstelproces.

De test in dit manuscript utili beschrevenZes een basis flowcytometer om een ​​kwantitatieve bepaling van granulocyten en monocyten fagocytose en OB activiteit in volbloed te bieden. Het gebruik van volbloed, deze techniek is voordelig omdat het de bepaling worden uitgevoerd zonder tijdrovende zuiveringsprocedure. Deze test kan eenvoudig worden aangepast om verschillende onderzoeksopzet en lab oplossingen geschikt. Bijvoorbeeld, Liao et al. Gebruik gemaakt van een soortgelijke techniek die neutrofielen OB activiteit vertonen toeneemt en neutrofielen fagocytose verminderd na traumatisch hersenletsel. 8 In een ander voorbeeld, McFarlin et al. Beschreef een elegante modificatie van deze techniek die gebruikt allofycocyanine (APC ) geconjugeerd CD66b en high-performance tandem APC-geconjugeerde CD45 labeling met image-based flowcytometrie naar granulocyten te classificeren in termen van hun fagocytose en OB activiteiten. 7,9

Onze onderzoeksgroep heeft diverse aanpassingen van deze te gebruikenchnique als indicator van het aangeboren immuunsysteem van overgewicht, obesitas en atletische populaties bijna 20 jaar. 10,11 De onderstaande tekst zal de lezer stap-voor-stap instructies voor het uitvoeren van deze test en lichte delen die de lezer aanpassen aan de behoeften van hun onderzoek voldoen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

LET OP: Alle incassoprocedures bloed werden uitgevoerd in overeenstemming met de uiteengezet door de Appalachian State University (ASU) Institutional Review Board (IRB) richtlijnen.

1. Assay Voorbereiding

  1. Verzamel, voor te bereiden, en het organiseren van de voor de procedure materialen (zie Tabel van specifieke materialen / Equipment).
    1. Label 12 x 75 mm buizen.
      1. Label twee buizen voor elke deelnemer: één buis voor de fagocytose assay (labelen deze buis met zwarte inkt en een "F" voor fluoresceïne isothiocyanaat [FITC]) en een buis voor de OB-activiteit assay (labelen deze buis met rode inkt en een " H "voor dihydroethidium [HE]).
        Opmerking: Het gebruik van steriele 12 x 75 mm buisjes wordt aanbevolen om onbedoelde celactivering en bijbehorende verhoging van optimaal is.
      2. Label drie buizen voor de test controles: één buis voor de fagocytose assay (FITC controle: etiket deze buis met black inkt en een "F"), een buis voor de OB activiteitstest (HE control: Label deze buis met rode inkt en een "H") en een buis voor de negatieve controle (Blood slechts: Label deze buis met groene inkt en "alleen bloed").
    2. Bereid voorraad oplossingen ten minste een dag vóór de dag van de test.
      1. Bereid de steriele fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS). Verdun 100 ml van 10x PBS met 900 ml 18,2 MQ H 2 O. Filter gesteriliseerd met een 0,2 pm filter. Bewaren bij 4 ° C tot gebruik.
      2. Bereid de steriele PBS-glucose. Los op 1,0 g glucose in 100 ml PBS. Filter gesteriliseerd met een 0,2 pm filter. Bewaren bij 4 ° C tot gebruik.
      3. Bereid de steriele 0,1 M citraatbuffer. Los op 1,2 g citroenzuur en 1,1 g natriumcitraat in 100 ml 18,2 MQ H 2 O. Breng de pH op 4,0. Filter gesteriliseerd met een 0,2 pm filter. Bewaren bij 4 ° C tot gebruik.
      4. Bereid de HE voorraad oplossing. Resuspend 1,0 mg HE in 1,0 ml dimethylsulfoxide (DMSO). Meng voorzichtig, hoeveelheid en bewaar bij -20 ° C tot gebruik.
      5. Bereid de FITC-gemerkte Staphylococcus aureus (S. aureus) voorraadoplossing (2 x 10 9 deeltjes / ml). Resuspendeer 10 mg FITC-gemerkte S. aureus in 1,5 ml (of geschikte hoeveelheid) PBS. Verdelen in drie 500 ul aliquots en ultrasone trillingen volgens de aanbevelingen van de fabrikant. Aliquot en bewaar bij -20 ° C tot gebruik.
      6. Bereid de ongelabelde S. aureus voorraadoplossing (2 x 10 9 deeltjes / ml). Resuspendeer 100 mg ongelabeld S. aureus in 15 ml (of de juiste hoeveelheid) van PBS. Verdeel in 500 ui aliquots dertig en ultrasone trillingen volgens de aanbevelingen van de fabrikant. Aliquot en bewaar bij -20 ° C tot gebruik.
    3. Bereid verse werkende oplossingen op de dag van de test.
      1. Bereid de HE werkende oplossing. Transfer 10 piontdooide HE stockoplossing aan 990 ul van PBS-glucose. Beschermen tegen licht en blijf op ijs tot gebruik.
      2. Bereid de FITC-gemerkte S. aureus werkende oplossing (133.333 deeltjes / ul). Overdracht 70 ul van ontdooide FITC-gemerkte S. aureus stockoplossing aan 980 pl PBS. Beschermen tegen licht en blijf op ijs tot gebruik.
      3. Bereid de ongelabelde S. aureus werkende oplossing (133.333 deeltjes / ul). Overdracht 70 ul van ontdooide ongelabelde S. aureus stockoplossing aan 980 pl PBS. Beschermen tegen licht en blijf op ijs tot gebruik.
      4. Bereid de demping oplossing. Voeg 750 ul van 0,4% trypan blauwe oplossing 11,25 ml steriele 0,1 M citraatbuffer. Houd in een ijs-waterbad tot gebruik.
    4. Heeft u een gecertificeerde phlebotomist bloed te trekken volgens de richtlijnen van de World Health Organization voor het tekenen van bloed.
      1. Trekken bloed in een 4 ml bloedafname buis met K 2 EDTA. Invert bloedafname volgens de instructies van de fabrikant. Houd bloedafname bij kamertemperatuur op een bench-top rocker tot gebruik. Gebruik dit bloed voor het complete bloedbeeld (CBC) met witte bloedcellen (WBC) differentiële analyse in stap 1.2.1 beschreven.
      2. Trekken bloed in een 4 ml bloedafname buis met lithium heparine. Inverteer bloedafname volgens de instructies van de fabrikant. Houd bloedafname bij RT op een bankje-top rocker tot gebruik. Gebruik dit bloed voor de monocyten en granulocyten fagocytose en OB activiteit test in stap 2 beschreven.
  2. Bepaal de hoeveelheid bacteriën (bijvoorbeeld, S. aureus) die nodig zijn om de analyse voor elk monster voltooien.
    1. Gebruik een hematologie analyzer een CBC voeren met WBC differentiële analyse van bloed volgens de instructies van de fabrikant. Maak een notitie van de WBC count (in cellen / ml),% Neutrophil en%Monocyt waarden.
    2. Gebruik de onderstaande vergelijkingen om de neutrofielen en monocyten telt voor elk monster te bepalen.
      Neutrofielen (in cellen / ml) = x% neutrofielen WBC (in cellen / ml)
      Monocyten count (in cellen / ml) =% × monocyten WBC (in cellen / ml)
    3. Gebruik onderstaande vergelijkingen om de fagocyt telling voor elk monster en het aantal fagocyten aanwezig in 100 pl monster.
      Fagocyt count (in cellen / ml) = Neutrofielentelling (in cellen / ml) + monocyten count (in cellen / ml)
      Aantal fagocyten in 100 gl = (fagocyt count (in cellen / ml)) / 10
    4. Gebruik onderstaande vergelijking om het aantal bacteriën (bijvoorbeeld, S. aureus) nodig zijn voor elk monster en de hoeveelheid FITC-gemerkte S. bepalen aureus of ongelabelde S. aureus werkoplossing (133.333 deeltjes / ml) die aan elke buis worden toegevoegd.
      LET OP: Het doel bacteriën: fagocyt verhouding 8: 1.
      Aantal bacteriën nodig =Aantal fagocyten in 100 pi × 8
      Hoeveelheid FITC of ongelabelde werkoplossing nodig (in ui) = (aantal bacteriën nodig) / (133.333 deeltjes / ul)

2. Voer Assay

  1. Bereid volbloed voor de test.
    1. Voor iedere deelnemer en controlebuis Gebruik langere lengte pipettip 100 gl volbloed brengen van de lithium heparine bloedafnamebuis onderaan van een geschikt gemerkte 12 x 75 mm buis. Vervang caps.
      LET OP: Wees voorzichtig om te voorkomen dat het bloed aan de zijkanten van de 12 x 75 mm buizen.
    2. Met een micropipet om 10 ul toe van HE werkoplossing aan de buizen voorzien van rode inkt en een "H", met inbegrip van de HE controlebuis. Vervang caps en vortex kort.
    3. Incubeer alle buizen in een 37 ° C waterbad gedurende 15 minuten. Vervolgens onmiddellijk buizen dragen aan een ijs-waterbad gedurende 12 min.
      OPMERKING: Gebruik een open metalen reken schud het rek elke 5 minuten zodat de buizen snel en adequaat verwarmd of gekoeld.
  2. Bacteriën voegen (bijv S. aureus) aan het monster en controlebuizen.
    1. Met een micropipet om de juiste hoeveelheid toe te voegen (berekend in stap 1.2.4) ongelabelde S. aureus werkoplossing aan de buizen voorzien van rode inkt en een "H", met inbegrip van de HE controlebuis. Vervang caps en vortex kort.
    2. Met een micropipet om de juiste hoeveelheid toe te voegen (berekend in stap 1.2.4) van FITC-gemerkte S. aureus werkoplossing aan de buizen voorzien van zwarte inkt en een "F", waaronder FITC controlebuis. Vervang caps en vortex kort.
    3. Vortex het "bloed enige" control buis, maar niet beide soorten bacteriën (dat wil zeggen, S. aureus) toe te voegen.
    4. Incubeer alle buizen in een 37 ° C waterbad gedurende 20 min. Gebruik een open metalen rek en schud het rek om de 5 minzodat de buizen snel en adequaat worden opgewarmd. Na de incubatieperiode onmiddellijk buizen dragen aan een ijs-waterbad gedurende 1 min.
  3. Was de cellen.
    1. Gebruik een repeater pipet 100 ul ijskoude afschrikoplossing toevoegen aan alle buizen. Vervang caps, vortex kort en vervolgens incubeer alle buizen op ijs gedurende 1 minuut.
    2. Gebruik een repeater pipet 1 ml ijskoude PBS toe aan alle buizen. Vortex kort en voeg nog eens 2 ml ijskoude PBS om alle buizen en doppen vervangen. Centrifuge alle buizen gedurende 5 minuten bij 4 ° C en 270 x g, en het supernatans aspireren.
    3. Herhaal stap 2.3.2 één keer (in totaal 2 wasbeurten).
  4. Bereiden monsters voor flowcytometrie.
    1. Gebruik een repeater pipet 50 ul ijskoud foetaal runderserum toe te voegen aan alle buizen. Kort vortex alle buizen.
    2. Breng alle slangen om een ​​passend carrousel en het gebruik van een geautomatiseerde cel lyseren voorbereiding werkstation met rode bloed cell (RBC) lyseren en WBC vaststelling reagentia aan de RBC's lyseren en WBC vast volgens de instructies van de fabrikant.
    3. Na de geautomatiseerde cel Lyse voorbereiding werkstation run is voltooid, wikkel tubes in aluminiumfolie en bewaar in een 4 ° C koelkast totdat het flowcytometrie analyse kan worden uitgevoerd.

3. Flowcytometrie Acquisition

  1. Stel de flowcytometrie systeem.
    1. Warm de flowcytometrie systeem zoals aangegeven in de gebruiksaanwijzing van de fabrikant. Controleer vervolgens het reagens en vuilwatertank niveaus. Indien nodig, vul de reagens tanks en / of leeg de vuilwatertank.
    2. Gebruik de 'Clean Panel "functie om het systeem te draaien schoon cyclus. Ren dan de uitlijning en fluïdica verificatie FluoroSpheres, en ervoor zorgen dat de halve piek variatiecoëfficiënt (HPCV) voor elke detector is binnen de vooraf gedefinieerde bereik in de kwaliteitscontrole beschreven (QC) protocollen die door de vervaardigingr.
  2. Maak een test-specifieke aankoop en instrument tot oprichting protocollen.
    1. Maak een test-specifieke acquisitie protocollen voor de fagocytose en OB activiteit assays.
      OPMERKING: De acquisitieprotocollen beschreven kunnen worden aangepast voor gebruik op een flowcytometer met een blauwe laser (488 nm), een filter (530/30) voor FITC en een filter (575/26) voor HE.
      1. Open de flowcytometrie systeem acquisitie software en maak een "nieuwe protocol".
      2. Kies de "FL1 Parameter" voor de fagocytose assay (FITC) en de "FL2 Parameter" voor de OB-activiteit assay (HE).
      3. Maak de percelen (dat wil zeggen, voorwaartse verstrooiing [FSC] versus zijwaartse verstrooiing [SSC] puntdiagram, FL1-histogram, FL2 histogram) die nodig zijn voor overname.
      4. Maak veelhoekige regio's voor de WBC (witte bloedcellen), granulocyten en monocyten populatie op het FSC vs. SSC plot en het creëren van lineaire regio's op het FL1 en FL2 histogrammen. Set a & #34; Stop Count 'van 50.000 evenementen voor de WBC gate.
      5. Sla de protocollen met assay-specifieke namen.
    2. Maak een test-specifiek instrument instellen van protocollen voor de fagocytose en OB activiteit assays.
      1. Sleep de "test-specifieke acquisitie protocollen" (gedefinieerd in stap 3.2.1) van de "Resource Explorer" naar de "Acquisition Manager" op het flowcytometrie systeem acquisitie software.
        LET OP: Informatie toegevoegd op deze manier zullen altijd verschijnen aan het einde van de werklijst.
      2. Voer het monster informatie in de werklijst, en sla de werklijst.
      3. Verwijder de monsterbuizen van 4 ° C koelkast en laat ze op kamertemperatuur gedurende 15 minuten. Dan, kort vortex elk controlemonster buis.
      4. Gebruik de "test-specifieke acquisitieprotocollen" gedefinieerd in stap 3.2.1 met de negatieve controle monster draaien (dat wil zeggen, alleen bloed) en de positieve controlemonsters (dwz HE control, FITC controle) via flowcytometrie systeem. Bekijk de histogrammen en pas de fotomultiplicator buis (PMT) spanningen van de FITC en phycoerythrine (PE) kanalen als dat nodig is.
      5. Vortex de controlemonsters en overbrengen naar het flowcytometrie systeem carrousel volgens de volgorde op de werklijst. Vervolgens plaatst u de carrousel in de steekproef kamer en klik op de Cytometer Toolbar "Start" knop om gegevens voor de controlemonsters te verwerven. Sla de "xxx Pro instellen" instelling protocol.
  3. Verwerven proefmonsters op flowcytometrie systeem.
    1. Verwijder de studie monsterbuizen van 4 ° C koelkast en laat equilibreren tot kamertemperatuur gedurende 15 min.
    2. Terwijl de monsters worden in evenwicht brengen, sleept u de vooraf gedefinieerde studie-specifieke acquisitie protocollen bij de werklijst ruimte om een ​​project werklijst maken.
    3. Controleer of de instelling "protocol" is gekoppeld aan de &# 34;. Assay-specifieke instelling protocollen "gedefinieerd in stap 3.2.2 Voer vervolgens de identificatiegegevens (bijv studie naam, trek nummer, bezoek nummer, onderwerp ID) voor elke buis in de werklijst.
    4. Nadat de 15-min equilibratie periode vortex studie monsters en overbrengen naar het flowcytometrie systeem carrousel volgens de volgorde op de werklijst. Vervolgens plaatst u de carrousel in de steekproef kamer en klik op de Cytometer Toolbar knop "Start" om de gegevens voor de studie monsters te verwerven.
    5. Geef je mening over de kwaliteit van de gegevens die door de inspectie van de RBC lysis efficiëntie en de WBC cel subgroep distributie, verhoudingen, absolute tellingen en fluorescentie-intensiteiten op het rapport van het panel van elk monster.
      OPMERKING: De kwaliteit van de gegevens wordt beschouwd als aanvaardbaar als al deze criteria zijn in hun vooraf bepaalde grenzen te zijn. Indien aan alle criteria is voldaan, moet het monster worden opgewerkt.
    6. Schoon en het afsluiten van de flowcytometrie systeem. Bewaar de flowcytometriegegevens op twee verschillende computer schijven om per ongeluk verlies van gegevens te voorkomen.

4. Data Analysis

  1. Voer de fagocytose analyse.
    1. Consolideren alle fagocytose (dat wil zeggen F-label) monster en control list mode data (LMD) bestanden in één map. Open vervolgens de flowcytometrie analyse software en sleep de bestanden naar de sample ruimte.
    2. Stel de WBC, granulocyten, monocyten, en lymfocyt poorten.
      1. Dubbelklik op de bestandsnaam om een ​​van de "FITC controlemonsters" te openen. Gebruik de drop-down menu's om de x-as ingesteld op "FSC" en "lineaire" en de y-as naar "SSC" en "lineair".
      2. Gebruik de "veelhoek poort selector" naar een poort van de totale WBC bevolking te bereiden.
        LET OP: Zorg ervoor dat alle van de cellen onder meer aan de randen van de grafiek. Label deze poort "WBC".
      3. Dubbelklik op de "nieuwe WBC gate" en gebruik maken van de drop-'s om de x-as naar "FSC" en "Linear" en de y-as te "SSC" en "Linear" ingesteld.
      4. Gebruik de "veelhoek poort selector" om de "granulocyt gate" en de monocyten gate te stellen ", en gebruik vervolgens de" elliptische poort selector lymfocyten gate "om de set" ". Label elke poort dienovereenkomstig. Sleep de 'gate data (%) "aan de zijkant, zodat de cellen kunnen eenvoudig worden gelezen.
    3. Stel de "Phagocytosis Positive gate" en de "Phagocytosis Negatieve gate" voor de granulocyten en monocyten populaties.
      1. Dubbelklik op de "FITC-controle monster" wordt gebruikt in stap 4.1.2.1. Klik vervolgens op de "granulocyt gate" en gebruik maken van de drop-down menu's om de x-as naar "FL1" en "Log" en de y-as naar "SSC" en "Linear" in te stellen.
      2. Gebruik de "square poort selector" naar een "Phagocytosis Negatieve gate" en een "Phagocytosis Poneren setive gate ".
        LET OP: Aangezien de FITC controlemonsters niet bacteriële (dat wil zeggen, S. aureus) stimuli heeft ontvangen, moeten alle cellen theoretisch fagocytose negatief. Gebruik discretie bij de vaststelling van de grenzen voor deze populaties.
      3. Herhaal stap 4.1.3.1 en 4.1.3.2 Stap de monocyten populatie.
    4. statistieken toevoegen voor "% WBC", "fluorescentie intensiteit" en "% fagocytose positieve cellen" het aantal granulocyten en monocyten populaties.
      1. Klik op de "FITC-controle monster" wordt gebruikt in stap 4.1.2.1. Markeer de "granulocyt poort", en klik dan op "Workspace" en "toevoegen Statistiek". Highlight "Geometrische Mean" en "FL1 Log" en klik op "Add". Dan koos voor de "Frequentie van het moederbedrijf" statistiek en klik op "Add".
        LET OP: Dit zal de fluorescentie-intensiteit (meetkundig gemiddelde) van de gehele bevolking granulocyten geven enhet percentage van de WBC (ouder) die granulocyten.
      2. Klik op de "FITC-controle monster" wordt gebruikt in stap 4.1.2.1. Markeer de "Phagocytosis Positive gate" van de granulocyten bevolking, en klik vervolgens op "Workspace" en "toevoegen Statistiek". Highlight "Geometrische Mean" en "FL1 Log" en klik op "Add". kies dan de "Frequentie van het moederbedrijf" statistiek en klik op "Add".
        LET OP: Dit zal de fluorescentie-intensiteit (meetkundig gemiddelde) van de fagocytose positieve granulocyten en het percentage van de granulocyten (ouder) die fagocytose positief zijn te geven.
      3. Herhaal stap 4.1.4.1 en 4.1.4.2 Stap voor de monocyten populatie.
      4. Klik op de "FITC-controle monster" wordt gebruikt in stap 4.1.2.1. Markeer de "lymfocyt gate", en klik dan op "Workspace" en "Statistiek toevoegen". Markeer de "Frequency van het moederbedrijf" statistiek en klik op "Add".
        LET OP: Dezezal het percentage WBC (ouder) die lymfocyten geven.
      5. Markeer alle poorten en statistieken gemaakt in de FITC-controle monster gebruikt in stap 4.1.2.1. Sleep ze in "All Samples" in de "Groep" paneel aan de bovenkant van het scherm.
        OPMERKING: Dit zal deze instellingen van toepassing op alle van de studie monsters.
      6. Opslaan en naam werk als WSP bestand in dezelfde map die de map bevat LMD.
    5. Pas individueel monster poorten.
      1. Klik op de "eerste monster 'in de dataset en bevestigen dat de WBC poort adequaat past de verdeling cel op het scherm. Als dit niet gebeurt, klik en sleep de randen van de poort aan te passen aan de gate voor dat monster. Klik op de "pijl naar rechts" (dwz "˃") om door te gaan naar de volgende monster. Herhaal deze stap totdat alle monsters zijn beoordeeld.
      2. Klik op de "WBC gate" voor het eerste monster in de dataset en bevestigen dat de "Granulocyte gate "," monocyten gate "en" lymfocyt gate "voor elk monster op de juiste wijze passen bij de verdeling cel op het scherm. Pas als dat nodig is. Klik op de" pijl naar rechts "(dwz" ˃ ") om door te gaan naar de volgende steekproef .
      3. Herhaal stap 4.1.5.2 totdat alle monsters zijn beoordeeld. Klik vervolgens op "Opslaan".
    6. Toon de gegevens in een elektronische spreadsheet programma.
      1. Klik op het icoon "Table Editor" aan de bovenkant van het scherm. Klik op "Edit", "Trefwoorden" en "$ DATE" om de bemonstering datum op de uiteindelijke spreadsheet. Klik vervolgens op "Edit", "Trefwoorden" en "@ SAMPLEID1" om het sampling identificatie op de laatste spreadsheet. Herhaal voor "@ SAMPLEID2", "@ SAMPLEID3" en "@ SAMPLEID4".
      2. Pas het scherm "Table Editor" en het "monster", zodat ze kunnen zowel worden bekeken op het computerscherm. Select elke "sample" op de staalkaart. Sleep vervolgens elke statistiek van belang voor de "Table Editor".
        1. Sleep de "freq. Van het moederbedrijf" statistiek vermeld onder de "granulocyt gate" naar de "Table Editor". Typ "% WBC als granulocyten" onder de kolom "Name" van de "Table Editor".
        2. Sleep de "Geometrische Mean" statistiek vermeld onder de "granulocyt gate" naar de "Table Editor". Typ "Geometrische gemiddelde fluorescentie, granulocyten" onder de kolom "Name" van de "Table Editor".
        3. Sleep de "freq. Van het moederbedrijf" statistiek vermeld onder de "granulocyt / Phagocytosis Positieve gate" om de "Table Editor". Typ "% Phagocytosis Positive granulocyten" onder de kolom "Name" van de "Table Editor".
        4. Sleep de statistiek "Geometrische Mean" vermeld onder de "granulocyt / Phagocytosis Positieve gate" aan The "Table Editor". Typ "Geometrische gemiddelde fluorescentie, Phagocytosis Positieve granulocyten" onder de kolom "Name" van de "Table Editor".
        5. Sleep de "freq. Van het moederbedrijf" statistiek vermeld onder de "monocyten gate" naar de "Table Editor". Typ "% WBC als Monocyten" onder de kolom "Name" van de "Table Editor".
        6. Sleep de "Geometrische Mean" statistiek vermeld onder de "monocyten gate" naar de "Table Editor". Typ "Geometrische gemiddelde fluorescentie, monocyten" onder de kolom "Name" van de "Table Editor".
        7. Sleep de "freq. Van het moederbedrijf" statistiek vermeld onder de "monocyten / Phagocytosis Positieve gate" om de "Table Editor". Typ "% Phagocytosis Positive Monocyten" onder de kolom "Name" van de "Table Editor".
        8. Sleep de statistiek "Geometrische Mean" vermeld onder de "monocyten / Phagocytosis Positieve gate "naar de" Table Editor ". Type" Geometrische gemiddelde fluorescentie, Phagocytosis Positieve Monocyten "onder de" "kolom van de" Name Table Editor ".
        9. Sleep de "freq. Van het moederbedrijf" statistiek vermeld onder de "lymfocyt gate" naar de "Table Editor". Typ "% WBC als lymfocyten" onder de kolom "Name" van de "Table Editor".
      3. Sleep de parameters zichtbaar zijn in de "Table Editor" totdat ze zijn gerangschikt in de gewenste volgorde.
      4. Klik op 'Opslaan'. Klik vervolgens op "Create Table" om de gegevens in een spreadsheet-formaat weer te geven. Klik op "opslaan als" om op te slaan en de naam van het werk als .xlsx-bestand.
  2. Herhaal stap 4.1 voor de OB activiteit test (dwz, H-gelabelde) monsters en de controle van LMD gegevensbestanden.
    LET OP: Zorg ervoor dat alle verwijzingen vervangen om fagocytose met verwijzingen naar OB activiteit.

    3. Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Langdurige en intensieve lichaamsbeweging heeft ingrijpende gevolgen voor aangeboren immuunsysteem, met inbegrip van natuurlijke killer celfunctie, macrofaag-cytokine-gemedieerde reactie op virale infectie, en granulocyten en monocyten fagocytose en OB activiteit. Meerdere studies tonen aan dat granulocyten en monocyten fagocytose aanzienlijk toeneemt na het sporten, als gevolg van de ontsteking veroorzaakt door spierbeschadiging en metabole eisen. In contrast, granulocyten en monocyten OB activiteit vermindert na het sporten en kunnen een immune indicator van een verhoogde vatbaarheid voor infecties. Bijvoorbeeld toont figuur 1 dat fagocytose van S. aureus door granulocyten wordt onmiddellijk en 1,5 uur verhoogd na een 75-km fietsen bout (70% VO2max), terug te keren naar de normale door de volgende ochtend. Monocyt fagocytose wordt eveneens beïnvloed door deze mate van oefening. Figuur 2 laat zien dat granulocyten OB activiteit afnamed gedurende ten minste 21 uur na 75 km fietsen. Monocyt OB activiteit wordt eveneens verlaagd na 75 km fietsen.

En granulocyt monocyt fagocytose van S. aureus, maar niet granulocyt en monocyt OB activiteit gecorreleerd systemische ontsteking biomarkers Figuur 3 toont de geringe correlatie tussen granulocyten fagocytose en serum C-reactief proteïne (CRP) (Pearson productmoment correlatie;. r = 0,44; p <0,01 ) in 106 met overgewicht / zwaarlijvige vrouwen. Serum CRP is ook gecorreleerd monocyten fagocytose van S. aureus (Pearson product-moment correlatiecoëfficiënt van; r = 0,30; p <0,01). Bovendien, het bloed neutrofielen / leukocyten (Pearson product-moment correlatiecoëfficiënt van; r = 0,62 en r = 0,61, respectievelijk; p <0,001), body mass index (Pearson product-moment correlatiecoëfficiënt van; r = 0,50 en r = 0,40, respectievelijk; P <0,001), serum insulinespiegels (r = 0,30 en r =0,23; p <0,03), en het bloed A 1C niveaus (Pearson product-moment correlatiecoëfficiënt van; r = 0,28 en r = 0,21, respectievelijk; p <0,04) gecorreleerd zijn met granulocyten en monocyten fagocytose van S. aureus. In het algemeen geven deze gegevens aan dat hoge granulocyten en monocyten fagocytose in rust patiënten wijst op systemische ontsteking.

Figuur 1
Figuur 1: granulocyten Phagocytosis wordt beïnvloed door Intense Endurance Exercise Granulocyt fagocytose verhoogd onmiddellijk en 1,5 uur na een 75 km fietsen gevecht op 70% van de VO2max.. Met 21-uur na de oefening, granulocyten fagocytose terug tot iets onder de pre-oefening niveaus. * geeft verschillend van pre-training (herhaalde metingen ANOVA met gepaarde t-test post-hoc analyse, indien nodig; N = 19; p <0,05). Waarden zijn meeen ± standaard fout. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 2

Figuur 2:. Granulocyt Oxidatieve Burst activiteit wordt beïnvloed door Intense Endurance Exercise granulocyt oxidatieve burst activiteit af onmiddellijk, 1,5 uur en 21 uur na een 75 km fietsen gevecht op 70% van de VO2max. * geeft verschillend van pre-training (herhaalde metingen ANOVA met gepaarde t-test post-hoc analyse, indien nodig; N = 19; p <0,05). Waarden zijn gemiddelden ± standaard fout. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

. Figuur 3: granulocyten Phagocytosis is gecorreleerd met systemische ontsteking in overgewicht / zwaarlijvige vrouwen Granulocyt fagocytose werd gecorreleerd met serum C-reactive protein, een algemeen aanvaarde biomarker van systemische ontsteking (Pearson product-moment correlatiecoëfficiënt van; N = 87; r = 0,44; P <0,01). klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Dit manuscript wordt stap voor stap protocol voor de bepaling van twee indicatoren van granulocyt monocyt en functie. We hebben een aantal stappen die cruciaal zijn voor het succes van deze assay worden geïdentificeerd. Een dergelijke stap is het ijsbad incubatie die onmiddellijk voorafgaand aan de toevoeging van bacteriën plaatsvindt. Grondige koeling van alle monsters zal het effect van de temperatuur op fagocytose en OB-activiteit te minimaliseren. Een andere belangrijke stap is de toevoeging van bacteriën aan elk monster. A 8: 1 bacteriën: fagocyt verhouding levert een optimaal resultaat; maar andere onderzoekers vinden dat deze verhouding moet worden aangepast om geschikte resultaten. Een andere belangrijke stap is het gebruik van lyserende RBC en WBC vaststelling reagentia RBC's lyseren en oplossen WBC. Het gebruik van deze dergelijke reagentia zorgt voor volledige lysis van de erytrocyten en kunnen onderzoekers veilig verwerkte monsters opgeslagen bij 4 ° C geïncubeerd, en vervolgens ze door de flowcytometer de volgende dag. Vorige werk (niet gepubliceerd) indicates dat lyseren RBC en WBC vaststelling kan worden gebruikt om de stroom cytometrie van gefixeerde monsters langs wel 12 uur vertragen zonder dat de gegevensintegriteit.

Deze procedure kan gemakkelijk worden aangepast aan de mogelijkheden en belangen van de onderzoeker voldoen, maar moet worden benadrukt dat optimalisering is nodig wanneer aanpassingen worden gemaakt. Enkele van de meest voorkomende wijzigingen die zijn gemeld zullen de bacteriën op het etiket / probe, en de incubatietijd. Onderzoekers hebben uitzonderlijke resultaten geproduceerd wanneer Escherichia coli 7,8 wordt gebruikt in plaats van S. aureus als doelpathogeen (beide op 8: 1 verhouding). Een schimmel, zoals Saccharomyces cerevisiae, kunnen ook geschikt als vervanging voor E. zijn coli. Daarnaast onderzoekers vaak gebruik van een pH-gevoelige moleculaire probe, 7,12 plaats van FITC, als probe voor fagocytose. Evenzo sondes uitzondering HE gewoonlijk gebruikt voor het meten OB activiteit, including dichlorofluorescin diacetaat (DCF-DA) 10 en dihydrorhodamine 123 (DHR). 13 gerapporteerde incubatietijd varieert van 20 min tot 120 min, 12,14,15 met McFarlin melden dat de maximale respons kan variëren door bacteriële doelwit. 7 Het moet worden opgemerkt dat de optimale incubatietijd kan variëren tussen de fagocytose en OB aspecten van de assay. 7

Zoals met alle laboratorium testen, het oplossen van problemen kan het nodig zijn bij de vaststelling van deze techniek in een nieuw onderzoek instellen. De auteurs adviseren dat optimalisatie van de bacteriën: fagocyt ratio is de sleutel tot succes voor deze test. De auteurs stellen ook vast dat de gegevens van een monster moet worden verwijderd uit de analyse als minder dan 80% van de cellen in de populatie van granulocyten een niet zieke deelnemer FITC positief; in deze situatie kan het monster opnieuw worden verzameld en opnieuw geanalyseerd, indien mogelijk.

Er zijn weinig beperkingen aan degranulocyten en monocyten fagocytose en OB activiteit test beschreven in dit manuscript. Een dergelijke beperking is het exclusieve gebruik van FSC en SSC de celpopulaties van belang te identificeren. Het gebruik van celoppervlak markers zouden kunnen onderzoekers celpopulaties kunnen vaststellen. 10 De toevoeging van deze functie zou dan een eenvoudige flowcytometer vereisen en derhalve buiten het bestek van dit manuscript. Een andere beperking van deze test is doordat het op de werkzaamheid van trypan blauw naar de fluorescentie probes die niet zijn geïnternaliseerd door de immune cellen van belang te blussen. Een pH-gevoelige probe 7,12 moleculaire kan worden gebruikt als alternatief voor FITC in situaties waarin internalisatie is een zorg. Aangezien een dergelijke probe alleen fluorescent in zure omgevingen zoals in endocytische blaasjes, de verkregen fluorescentie vertegenwoordigt slechts geïnternaliseerde deeltjes. Bovendien, hebben verschillende onderzoekers de huidige assay bekritiseerd omdat het doenes exclusief een parallelle reeks monsters die geïncubeerd in ijs water in plaats van bij 37 ° C te regelen voor baseline immuuncel activiteit. Bij verschillende gelegenheden, we onder deze "ice voorwaarde" bij het uitvoeren van de granulocyten en monocyten fagocytose en OB activiteit test, en vond dat het geen aanzienlijke verbetering van de kwaliteit van de gegevens (niet gepubliceerd).

Kortom, dit manuscript beschrijft een techniek voor fagocytose en OB activiteit in granulocyten en monocyten. Dit is een eenvoudige, directe test die gemakkelijk kan worden aangepast om rekening te houden laboratorium mogelijkheden en onderzoekbelangen. In oefening op wetenschap en obesitas gerelateerde onderzoek, zal deze maatregel van het aangeboren immuunsysteem kan de onderzoeker om de effecten van vele mogelijke tegenmaatregelen, zoals gewichtsverlies, supplement gebruik, voedingsinterventies en andere veranderingen in levensstijl te verkennen. Bij het beheersen van deze techniek, zal de onderzoekers in staat om toezicht te houden acuut zijnen chronische veranderingen in immune celfunctie in reactie op dieet, lichaamsbeweging, en vele andere stimuli.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Acknowledgments

De auteurs willen graag Zack Shue, Casey John en Lynn Cialdella-Kam erkennen voor hun hulp bij het optimaliseren van deze procedure.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
12 x 75 mm tubes, with cap VWR 20170-579 You will need 2 tubes per sample ("H" and "F") plus 3 tubes per batch (for assay controls; "F", "H", and "Blood only").
PBS (10x), pH 7.4 Life Technologies 70011-044
Bottle top 0.2 µm cellulose acetate filter (500 ml capacity) Fisher Scientific 09-741-07 
Glucose, powder Life Technologies 15023-021
Citric acid (anhydrous, cell culture tested, plant cell culture tested) Sigma-Aldrich C2404-100G
Sodium citrate tribasic dihydrate Sigma-Aldrich S4641-25G
Dihydroethidium (Hydroethidine) (HE) Life Technologies D11347
Dimethyl sulfoxide (DMSO) Anhydrous Life Technologies D12345
Staphylococcus aureus (Wood strain without protein A) BioParticles, fluorescein conjugate (FITC) Life Technologies S2851
Staphylococcus aureus (Wood strain without protein A) BioParticles, unlabeled Life Technologies S-2859
Trypan Blue Solution, 0.4% Life Technologies 15250-061
4.0 ml vacutainer containing 7.2 mg K2EDTA, spray-dried VWR BD367861 You will need 1 K2EDTA blood collection tube per sample.
4.0 ml vacutainer containing 68 USP units Lithium Heparin, spray-coated VWR BD367884 You will need 1 Lithium Heparin blood collection tube per sample.
COULTER Ac·T 5diff CP Beckman Coulter 6605705 i.e., hematology analyzer
COULTER Ac·T 5diff Rinse Beckman Coulter 8547167
COULTER Ac·T 5diff Fix Beckman Coulter 8547171
COULTER Ac·T 5diff WBC Lyse Beckman Coulter 8547170
COULTER Ac·T 5diff Hgb Lyse Beckman Coulter 8547168
COULTER Ac·T 5diff Cal Calibrator Beckman Coulter 7547175
COULTER Ac·T 5diff Control Plus Beckman Coulter 7547198
AcT 5diff Diluent Beckman Coulter 8547169
200 µl extended-length pipette tips VWR 37001-526
Insulated ice pan VWR 89198-980 For ice water bath.
Open metal tube rack VWR 60916-702
Fetal Bovine Serum Life Technologies 26140-111
TQ-Prep Workstation Beckman Coulter 6605429 i.e., automated cell lyse preparation workstation
ImmunoPrep Reagent System Beckman Coulter 7546999 i.e., RBC lyse/WBC fix reagent system
Cytomics FC500 MCL Flow Cytometry System with CXP Software Beckman Coulter 626553
IsoFlow Sheath Fluid Beckman Coulter 8547008
COULTER CLENZ Beckman Coulter 8546929
Flow-Check Fluorospheres  Beckman Coulter 6605359 i.e., alignment and fluidics verification fluorospheres
FlowJo Software FlowJo FlowJo i.e., flow cytometry analysis software
Excel Software Microsoft Microsoft Excel i.e., electronic spreadsheet program

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Nieman, D. C., et al. Influence of pistachios on performance and exercise-induced inflammation, oxidative stress, immune dysfunction, and metabolite shifts in cyclists: a randomized, crossover trial. PLoS One. 9, e113725 (2014).
  2. Knab, A. M., et al. Effects of a freeze-dried juice blend powder on exercise-induced inflammation, oxidative stress, and immune function in cyclists. Appl Physiol Nutr Metab. 39, 381-385 (2014).
  3. Konrad, M., et al. The acute effect of ingesting a quercetin-based supplement on exercise-induced inflammation and immune changes in runners. Int J Sport Nutr Exerc Metab. 21, 338-346 (2011).
  4. Nieman, D. C., et al. Immune and inflammation responses to a 3-day period of intensified running versus cycling. Brain Behav Immun. 39, 180-185 (2014).
  5. Nieman, D. C., et al. Carbohydrate supplementation affects blood granulocyte and monocyte trafficking but not function after 2.5 h of running. Am J Clin Nutr. 66, 153-159 (1997).
  6. Tidball, J. G. Inflammatory cell response to acute muscle injury. Med Sci Sports Exerc. 27, 1022-1032 (1995).
  7. McFarlin, B. K., Williams, R. R., Venable, A. S., Dwyer, K. C., Haviland, D. L. Image-based cytometry reveals three distinct subsets of activated granulocytes based on phagocytosis and oxidative burst. Cytometry A. 83, 745-751 (2013).
  8. Liao, Y., Liu, P., Guo, F., Zhang, Z. Y., Zhang, Z. Oxidative burst of circulating neutrophils following traumatic brain injury in human. PLoS One. 8, e68963 (2013).
  9. McFarlin, B. K., Venable, A. S., Prado, E. A., Henning, A. L., Williams, R. R. Image-based flow cytometry technique to evaluate changes in granulocyte function in vitro. J Vis Exp. , (2014).
  10. Nieman, D. C., et al. Immune response to obesity and moderate weight loss. Int J Obes Relat Metab Disord. 20, 353-360 (1996).
  11. Nieman, D. C., et al. Immune function in female elite rowers and non-athletes. Br J Sports Med. 34, 181-187 (2000).
  12. Ichii, H., et al. Iron sucrose impairs phagocytic function and promotes apoptosis in polymorphonuclear leukocytes. Am J Nephrol. 36, 50-57 (2012).
  13. Gomes, A., Fernandes, E., Lima, J. L. Fluorescence probes used for detection of reactive oxygen species. J Biochem Biophys Methods. 65, 45-80 (2005).
  14. Gruger, T., et al. Negative impact of linezolid on human neutrophil functions in vitro. Chemotherapy. 58, 206-211 (2012).
  15. Dementhon, K., El-Kirat-Chatel, S., Noel, T. Development of an in vitro model for the multi-parametric quantification of the cellular interactions between Candida yeasts and phagocytes. PLoS One. 7, e32621 (2012).

Tags

Immunologie fagocytose oxidatieve uitbarsting monocyten granulocyten aangeboren immuniteit flowcytometrie
Het meten van granulocyten en monocyten fagocytose en oxidatieve Burst activiteit in menselijk bloed
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Meaney, M. P., Nieman, D. C.,… More

Meaney, M. P., Nieman, D. C., Henson, D. A., Jiang, Q., Wang, F. Z. Measuring Granulocyte and Monocyte Phagocytosis and Oxidative Burst Activity in Human Blood. J. Vis. Exp. (115), e54264, doi:10.3791/54264 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter