Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

İnsan Kanı Ölçüm Granülosit ve Monosit Fagositoz ve Oksidatif Burst Etkinlik

Published: September 12, 2016 doi: 10.3791/54264
Automatic Translation
1, 1, 2, 3, 3
1Human Performance Laboratory, North Carolina Research Campus, Appalachian State University, 2Department of Biology, Appalachian State University, 3David H. Murdock Research Institute

Introduction

Granülosit ve monosit fagositoz / oksidatif patlama (OB) aktivite deneyi sık sık uzun süreli ve yoğun egzersiz sonrası doğuştan gelen bağışıklık fonksiyonu hakkında bilgi toplamak için kullanılan basit ve düz ileri bir tekniktir. 1-4 bağışıklık sisteminin tepkisini için incelenirken onlar konak savunmasında önemli bir rol oynar ve enfeksiyon yerinde biriken ilk bağışıklık hücreleri, çünkü bir uyarıcı, granülositler ve monositler özel bir öneme sahiptir. 5 Nötrofiller, granülosit bir tür, hasarlı kas içine yerini değiştirmek için ilk hücrelerdir yoğun egzersiz sonrası doku. 6, fagositoz ve Ob faaliyetini granülosit ve monosit fonksiyonu 7 en yaygın önlem ve enfeksiyon nedeniyle işlemi ve onarım işlemi hem de kendi merkezi bir rol doğuştan gelen bağışıklık hücre fonksiyonunun bir göstergesi olarak tercih edilir.

Bu yazıda utili açıklanan tahlilzes bir temel akış sitometresi tam kanda granülosit ve monosit fagositozu ve OB aktivitesinin kantitatif bir belirlenmesine elde edildi. Bu deney, zaman alıcı bir saflaştırma işlemi olmadan yapılan sağlar, çünkü bu teknik tüm kanın kullanılması avantajlıdır. Bu tahlil, kolayca araştırma tasarımları ve laboratuar yetenekleri çeşitli karşılamak için değiştirilebilir. Örneğin, Liao ve ark. Nötrofil Ob faaliyetini göstermek için benzer bir teknik kullanılması, travmatik beyin hasarı aşağıdaki artar ve nötrofil fagositoz azaltılır. 8 Başka bir örnekte, McFarlin et al. Alofikosiyanin kullanan bu tekniğin zarif modifikasyonu (APC tarif ) fagositoz ve OB faaliyetleri açısından granülositler sınıflandırmak için görüntü tabanlı akış sitometri ile CD66b ve yüksek performanslı tandem APC-konjuge CD45 etiketleme konjüge edilmiş. 7,9

Araştırma grubumuz, bu te çeşitli uyarlamaları kullandıYaklaşık 20 yıldır, kilolu obez, ve atletik toplumlarda doğuştan gelen bağışıklık fonksiyonunun bir göstergesi olarak chnique. 10,11 Aşağıdaki metin, bu testte gerçekleştirmek için adım adım talimatlar ile okuyucuya sunmak ve okuyucu adapte olabilecek alanları vurgulamak olacaktır onların araştırma ihtiyaçlarını karşılamak için.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

NOT: Tüm kan toplama prosedürleri Appalachian State University (ASU) Kurumsal Değerlendirme Kurulu (KİK) tarafından belirlenen kurallara uygun olarak yapılmıştır.

1. Deney hazırlanması

  1. (Belirli Malzemeleri / Ekipman Tabloya bakınız), toplayın hazırlamak ve işlem için belirtilen malzemeleri düzenlemek.
    1. 12 x 75 mm tüpler Etiket.
      1. Etiket Her katılımcı için iki tüp: fagositoz testinde ve OB aktivite deneyi için bir tüp (siyah mürekkep ve floresein izotiyosiyanat için bir "F" [FITC] ile bu tüp etiketlemek) için bir tüp (kırmızı mürekkep ve bir bu tüp etiketlemek " dihydroethidium H "[HE]).
        NOT: Steril 12 x 75 mm tüpler kullanılması istenmeyen hücre aktivasyonu ve arka plan gürültüsü ilişkili artışı en aza indirmek için tavsiye edilir.
      2. (Fagositoz analizi için FITC kontrolü bir tüp: deney kontrol üç tüpler Etiket Blac bu tüp etiketindek mürekkep ve "F"), OB aktivite deneyi için bir tüp (HE kontrolü: yeşil mürekkep ile bu tüp etiketlemek: sadece kırmızı mürekkep ve bir "H"), ve negatif kontrol için bir tüp (Kan ile bu tüp etiketlemek ve "kan sadece").
    2. en az bir gün tahlil gününden önce stok çözümleri hazırlayın.
      1. Steril bir fosfat tamponlu salin (PBS) hazırlayın. 18.2 H2O 900 ml 10x PBS 100 ml seyreltik 0.2 mikron filtre ile sterilize Filtre. kullanılana kadar 4 ° C 'de muhafaza edin.
      2. Steril PBS-glikoz hazırlayın. PBS, 100 ml glukoz 1.0 g eritin. 0.2 mikron filtre ile sterilize Filtre. kullanılana kadar 4 ° C 'de muhafaza edin.
      3. Steril 0.1 M sitrat tamponu hazırlayın. Sitrik asit ve 1.2 g ve 18.2 H2O 100 ml sodyum sitrat ve 1.1 g çözülür PH değerini 4.0'a ayarlamak. 0.2 mikron filtre ile sterilize Filtre. kullanılana kadar 4 ° C 'de muhafaza edin.
      4. HE stok çözeltisi hazırlayın. Resuspend dimetil sülfoksit, 1.0 ml (DMSO) içinde HE 1,0 mg. kullanılana kadar -20 ° C'de yavaşça kısım ve depolamak karıştırın.
      5. FITC işaretli Staphylococcus aureus (S. aureus) stok çözeltisi (2 x 10 9 parçacıkları / ml) hazırlayın. FITC etiketli S. yeniden süspanse 10 mg PBS, 1.5 ml (veya uygun bir miktarda) aureus. üreticinin tavsiyesine göre üç 500 ul hacimde ve sonikasyon bölün. kullanılana kadar -20 ° C'de kısım ve mağaza.
      6. Etiketsiz S. hazırlayın aureus stok çözeltisi (2 x 10 9 parçacıkları / ml). Etiketsiz S. 100 mg yeniden süspanse 15 ml PBS (ya da uygun miktarda) aureus. üreticinin tavsiyesine göre otuz 500 ul hacimde ve sonikasyon bölün. kullanılana kadar -20 ° C'de kısım ve mağaza.
    3. Deney gününde, taze çalışma solüsyonları hazırlayın.
      1. HE çalışma çözeltisi hazırlayın. 10 ul aktarınPBS-glukoz 990 ul çözülmüş HE stok solüsyonu. Işıktan korumak ve kullanıma kadar buz üzerinde tutmak.
      2. FITC işaretli S. hazırlanması aureus çalışma çözeltisi (133.333 partikül / ul). Çözülmüş FITC etiketli S. Devri 70 ul PBS 980 ul aureus stok solüsyonu. Işıktan korumak ve kullanıma kadar buz üzerinde tutmak.
      3. Etiketsiz S. hazırlayın aureus çalışma çözeltisi (133.333 partikül / ul). Çözülmüş etiketsiz S. Devri 70 ul PBS 980 ul aureus stok solüsyonu. Işıktan korumak ve kullanıma kadar buz üzerinde tutmak.
      4. söndürme çözüm hazırlayın. Steril 0.1 M sitrat tamponu 11.25 ml% 0.4 tripan mavisi çözeltisi 750 ul ekle. bir buz-su banyosu içinde kullanıma kadar muhafaza edin.
    4. sertifikalı flebotomist kan çizim için Dünya Sağlık Örgütü kurallarına göre kanımı var.
      1. K 2 EDTA içeren bir 4 ml kan toplama tüpüne kan çizin. İçindeüreticinin talimatlarına göre vert kan toplama tüpü. kullanılana kadar bir tezgah üstü rocker oda sıcaklığında kan toplama tüpü bulundurun. Adım 1.2.1 açıklanan beyaz kan hücresi (WBC) diferansiyel analizi ile tam kan sayımı (CBC) için bu kanı kullanın.
      2. lityum heparin içeren bir 4 ml kan toplama tüpüne kan çizin. üreticinin talimatlarına göre kan toplama tüpü ters çevirin. kullanılana kadar bir tezgah üstü rocker oda sıcaklığında kan toplama tüpü bulundurun. Aşama 2'de tarif edilen monosit ve granülosit fagositoz ve OB aktivite deneyi için, bu kan kullanın.
  2. Her bir numune için tahlil tamamlamak için gerekli olacaktır (örn S. aureus) bakterilerin miktarını belirler.
    1. üreticinin talimatlarına açıklandığı gibi kan üzerindeki WBC diferansiyel analizi ile bir CBC gerçekleştirmek için bir hematoloji analizörü kullanın. Bir lökosit sayımı not (hücreler / ml),% Nötrofil ve% yapınMonosit değerleri.
    2. Her numune için nötrofil ve monosit sayılarını belirlemek için aşağıdaki denklemleri kullanın.
      (Hücre / ml) nötrofil sayımı (hücre / ml) =% Nötrofil x WBC
      (Hücre / ml), monosit sayımı (= hücre / ml) WBC x% Monosit
    3. Her bir numune için fagosit sayısı ve numune 100 ul içinde mevcut fagositler sayısını belirlemek için aşağıdaki denklemler kullanın.
      (Hücre / ml) phagocyte sayısı (hücre / ml) (hücre / ml) Nötrofil sayısı + Monosit sayısı =
      100 ul = fagositoz sayısı (hücrelerdeki phagocyte sayımı (/ ml)) / 10
    4. Her bir örnek için gerekli bakterilerin (örneğin, S. aureus) sayısını ve FITC-etiketli S. miktarını belirlemek için aşağıdaki denklemi kullanarak aureus veya etiketsiz S. her bir tüpe ilave edilmelidir aureus çalışma çözeltisi (133.333 partiküller / ml).
      NOT: Hedef bakteri: fagosit oranı 8: 1.
      Bakteri sayısı gerekli =100 ul x 8 fagositoz sayısı
      (Ul) ihtiyaç FITC veya işaretlenmemiş çalışma çözeltisinin hacmi = (gereken bakteri sayısı) / (133.333 parçacıkları / ml)

2. Deney gerçekleştirme

  1. Deney için tam kan hazırlayın.
    1. Her bir katılımcının ve kontrol tüpü, bir şekilde etiketlenmiş, 12 x 75 mm tüpün dibine lityum heparin, kan toplama tüpünden tam kan 100 ul aktarmak için uzun bir uzunlukta bir pipet kullanın. kapaklarını değiştirin.
      NOT: 12 x 75 mm tüpler tarafta kan önlemek için dikkatli olun.
    2. HE HE kontrol tüpüne de dahil olmak üzere kırmızı mürekkep ve "H" ile etiketlenmiş tüplere çözüm çalışma 10 ul eklemek için bir mikropipet kullanın. kapaklar ve vorteks kısaca değiştirin.
    3. 15 dakika boyunca 37 ° C su banyosu içinde tüm tüpler inkübe edin. Sonra hemen 12 dakika boyunca bir buz-su banyosuna tüm tüpler aktarın.
      NOT: açık bir metal raf kullanınve yavaşça tüpler hızlı ve yeterli ısındı veya soğutulmuş olduğundan emin olmak için raf her 5 dakikada sallayın.
  2. Numune ve kontrol tüpleri (yani S. aureus) bakterilerin ekleyin.
    1. Uygun miktarda eklemek için bir mikropipet kullanın etiketsiz S. (Adım 1.2.4 hesaplanan) HE kontrol tüpüne de dahil olmak üzere kırmızı mürekkep ve "H" ile etiketlenmiş tüplere aureus çalışma çözüm. kapaklar ve vorteks kısaca değiştirin.
    2. Uygun miktarda eklemek için bir mikropipet kullanın FITC işaretli S. (Adım 1.2.4 hesaplanan) FITC kontrol tüpüne de dahil olmak üzere siyah mürekkep ve "F" ile etiketlenmiş tüplere aureus çalışma çözüm. kapaklar ve vorteks kısaca değiştirin.
    3. Vortex "kan sadece" kontrol tüpü, ama buna bakteri ya tipini (yani, S. aureus) eklemeyin.
    4. 20 dakika boyunca 37 ° C su banyosu içinde tüm tüpler inkübe edin. açık bir metal raf kullanın ve yavaşça raf her 5 dk sallamakTüpler, hızlı ve yeterli ısıtıldı sağlamak için. Kuluçka döneminden sonra, hemen 1 dakika için bir buz-su banyosuna tüm tüpler aktarın.
  3. hücreleri yıkayın.
    1. tüm tüplere buz soğukluğunda söndürme çözeltisinin 100 ul bir aktarım pipet kullanın. kısaca kapaklar, vorteks değiştirin ve sonra 1 dakika süreyle buz üzerinde tüm tüpleri kuluçkaya yatmaktadır.
    2. tüm tüplere buz soğukluğunda PBS ile 1 ml eklemek için bir tekrarlayıcı pipet kullanın. Vortex kısa ve daha sonra tüm tüplere buz soğukluğunda PBS ilave 2 ml ilave edilir ve kapaklarını. Santrifüj daha sonra 4 ° C'de 5 dakika ve 270 x g ve seyahati borular süpernatan aspire.
    3. Adımı tekrarlayın 2.3.2 bir kez (2 yıkar toplam).
  4. flow sitometri örnekleri hazırlamak.
    1. tüm tüplere buz soğukluğunda fetal sığır serumu, 50 ul bir aktarım pipet kullanın. Kısaca tüm vorteks tüpleri.
    2. Uygun bir atlıkarınca tüm tüpleri aktarın ve kırmızı kan cel ile otomatik hücre lize hazırlama iş istasyonu kullanımıl (RBC) parçalanması ve lökosit eritrositlerde lyse ve üreticinin talimatlarına açıklandığı gibi lökosit düzeltmek için reaktif sabitleme.
    3. otomatik hücre lize hazırlık iş istasyonu çalıştırmak tamamlandıktan sonra sitometri analizi akış yapılabilir kadar 4 ° C buzdolabında alüminyum folyo ve mağaza tüpler sarın.

3. Akım Sitometri Edinme

  1. Kur akış sitometri sistemi.
    1. üretici tarafından sağlanan kılavuzdaki belirtildiği şekilde sisteme flow sitometri Isınma. Sonra, reaktif ve atık tankı düzeylerini kontrol. Gerekirse, reaktif tanklarını doldurmak ve / veya atık deposunu boşaltın.
    2. sistem temiz döngüsü çalıştırmak için "Temiz Paneli" özelliğini kullanın. Sonra, hizalama ve fluidik doğrulama florosferleri çalıştırın ve her dedektör için varyasyon yarım tepe katsayısı (HPCV) kalite kontrol açıklanan önceden tanımlanmış aralıkta olduğundan emin olun (QC) protokolleri üretim tarafından sağlananr.
  2. Tahlil özel satın alma ve enstrüman ayar protokolleri oluşturun.
    1. fagositoz ve OB aktivitesi deneyleri için deney özgü alıcı protokolleri oluşturun.
      Not: Burada tarif edilen toplama protokolleri sitometresi mavi lazer (488 nm) ile bir akış kullanılmak için adapte edilebilir, FITC için bir filtre (530/30) ve o için bir filtre (575/26).
      1. Sistem toplama yazılımı flow sitometri açın ve "Yeni Protokolü" yaratmak.
      2. fagositoz testinde (FITC) ve OB aktivite deneyi için "FL2 Parametre" (HE) için "FL1 Parametre" seçiniz.
      3. Araziler oluşturun (yani ileri saçılım [FSC] vs yan dağılım [SSC] nokta arsa, FL1 histogram, FL2 histogramı) kazanılması için gerekli.
      4. WBC (beyaz kan hücreleri) için poligonal bölgeler oluşturma, granülosit ve monosit FSC vs SSC arsa üzerinde nüfus ve FL1 ve FL2 histogramlar üzerinde doğrusal bölgeleri oluşturun. Set & #34; Dur WBC kapısı 50.000 olayları "Kont.
      5. Tahlil özgü adlarla protokolleri kaydedin.
    2. fagositoz ve OB etkinlik deneyleri için deney özgü alet ayar protokolleri oluşturun.
      1. Sürükle ve sistem toplama yazılımı flow sitometri üzerinde "Acquisition Yöneticisi" için "Kaynak Explorer" dan (Adım 3.2.1 tanımlanan) "tahlil özel satın alma protokolleri" bırakın.
        NOT: Bu şekilde eklenen bilgiler her zaman iş listesinin sonunda görünecektir.
      2. iş listesine içine numune bilgileri girin ve iş listesi kaydedin.
      3. 4 ° C buzdolabı kontrol numune tüpleri çıkarın ve 15 dakika boyunca oda sıcaklığında dengelenmeye bırakın. Ardından, kısaca her kontrol örneği tüpü vorteks.
      4. Negatif kontrol örneği çalıştırmak için Adım 3.2.1 tanımlanan "tahlil özel satın alma protokolleri" kullanın (örneğin, kan sadece) ve pozitif kontrolNumuneler (yani, HE kontrolü, FITC kontrolü) akış sitometri sistemi ile. histogramlar inceleyin ve gerektiği gibi photomultiplier tüp (PMT) FITC ve fikoeritrin (PE) kanal gerilimleri ayarlayın.
      5. Kontrol örnekleri Vortex ve iş listesine sırasına göre sistem atlıkarınca flow sitometri aktarabilirsiniz. Sonra, numune odasında atlıkarınca yerleştirin ve kontrol örnekleri için veri elde etmek Sitometre Araç Çubuğu "Başlat" düğmesine tıklayın. Ayar protokolü "Pro Ayar xxx" kaydedin.
  3. Akış sitometri sistemi üzerinde çalışma örnekleri edinin.
    1. 4 ° C buzdolabı çalışma numune tüpleri çıkarın ve 15 dakika boyunca oda sıcaklığında dengelenmeye bırakın.
    2. Numuneler dengeleme iken, proje iş listesi yapmak için iş listesi alana önceden tanımlanmış çalışma özgü edinme protokolleri sürükleyin.
    3. "Ayarı protokol" ve bağlantılı olduğundan emin olun# 34;. Adım 3.2.2 tanımlanan tahlil özel ayar protokolleri "Sonra kimlik bilgilerini girin (örneğin, çalışma adı, numarası, ziyaret numarasını, konu kimliği çizin) iş listesine her tüp için.
    4. ve 15 dakika dengeleme dönemi, girdap çalışma örneklerinin sonra iş listesine sırasına göre sistem atlıkarınca flow sitometri aktarabilirsiniz. Sonra, numune odasında atlıkarınca yerleştirin ve çalışma örnekleri için veri elde etmek Sitometre Araç Çubuğu "Başlat" düğmesine tıklayın.
    5. Her numunenin rapor panelinde RBC parçalama verimliliği ve WBC hücre alt grubu dağılımı, oranlar, mutlak sayımları ve floresan yoğunlukları inceleyerek verilerin kalitesini gözden geçirin.
      NOT: veri kalitesi, bu kriterlerin tümünü önceden tanımlanmış sınırlar içinde ise kabul edilebilir olarak kabul edilir. tüm kriterler yerine getirilmediği takdirde, numune reprocessed edilmelidir.
    6. Temiz ve akış sitometri sistemi kapattı. Akış sitometri Mağazaİki farklı bilgisayar sürücülerde verileri yanlışlıkla veri kaybını önlemek için.

4. Veri Analizi

  1. fagositoz analizi yapın.
    1. Tek bir klasöre fagositoz (yani, F-etiketli) numune ve kontrol listesi modu veri (LMD) veri dosyalarının tümünü birleştirin. Ardından, analiz yazılımı flow sitometri açın ve örnek uzaya dosyaları sürükleyin.
    2. WBC, Granülosit, Monosit ve Lenfosit kapıları ayarlayın.
      1. "FITC kontrol numunelerinin" herhangi açmak için dosya adını çift tıklayın. x eksenini ayarlamak için açılır menüleri kullanın "FSC" ve "doğrusal" ve y ekseni için "SSC" ve "doğrusal" için.
      2. toplam WBC nüfusun bir kapı hazırlamak için "poligon kapısı seçici" kullanın.
        NOT: Grafiğin kenarlarına hücrelerin tümü dahil ettiğinizden emin olun. Bu kapıyı "WBC" etiketleyin.
      3. "Yeni WBC kapısı" çift tıklayın ve düşmesini kullanınMenüler x eksenini için "FSC" ve "Doğrusal" ve y-ekseni için "SSC" ve "Doğrusal" ayarlamak için aşağı.
      4. ". Buna göre her kapıyı etiketleyin. Sürükleyin" "çokgen kapı seçici" Lenfosit kapısı "ayarlamak için" eliptik kapı seçme "kullanın, sonra ve" "granülosit kapısı" ve Monosit kapısı ayarlamak için kullanın (%) kapı verilerini "kapalı yanına hücreleri kolayca görüntülenebilir böylece.
    3. "Fagositoz Pozitif kapısı" ve granülosit ve monosit nüfus için "Fagositoz Negatif gate" olarak ayarlayın.
      1. Adım 4.1.2.1 kullanılan "FITC kontrol örneği" çift tıklayın. Ardından, "Granülosit kapısı" üzerine tıklayın ve x eksenini için "FL1" ve "Log" ve y-ekseni için "SSC" ve "Doğrusal" ayarlamak için açılır menüleri kullanın.
      2. Bir "Fagositoz Negatif gate" ve "Fagositoz Posit ayarlamak için" kare kapısı seçici "kullanınive kapısı ".
        NOT: FITC kontrol numuneleri bakteri (yani, S. aureus) uyaranlara almadı beri, hücrelerin tümü teorik fagositoz negatif olmalıdır. Bu nüfus için sınırları belirlenirken takdir kullanın.
      3. Tekrarlayın Adım 4.1.3.1 ve monosit nüfus için Adım 4.1.3.2.
    4. "WBC%", "floresan yoğunluğu" ve granülosit ve monosit nüfus için "% fagositoz pozitif hücrelerin" istatistiklerini ekleyin.
      1. Adım 4.1.2.1 kullanılan "FITC kontrol örneği" üzerine tıklayın. "Granülosit kapısı" vurgulayın ve sonra "İstatistikte Ekle" "Workspace" tıklayın ve. "Geometrik Mean" ve "FL1 Log" vurgulayın ve "Ekle" butonuna tıklayınız. Ardından, "Frekans Ana Ortaklık" istatistiğini seçti ve "Ekle" butonuna tıklayınız.
        NOT: Bu, tüm granülosit nüfusun floresan yoğunluğu (geometrik ortalama) verecek vegranülositler olan WBC (üst) yüzdesi.
      2. Adım 4.1.2.1 kullanılan "FITC kontrol örneği" üzerine tıklayın. granülosit nüfusun "Fagositoz Pozitif kapısı" vurgulayın ve sonra "İstatistikte Ekle" "Workspace" tıklayın ve. "Geometrik Mean" ve "FL1 Log" vurgulayın ve "Ekle" butonuna tıklayınız. Ardından, "Frekans Ana Ortaklık" istatistiğini seçin ve "Ekle" butonuna tıklayınız.
        NOT: Bu fagositoz olumlu granülositlerin floresan yoğunluğu (geometrik ortalama) ve fagositoz pozitif granülositler (üst) yüzdesini verecektir.
      3. Tekrarlayın Adım 4.1.4.1 ve monosit nüfus için Adım 4.1.4.2.
      4. Adım 4.1.2.1 kullanılan "FITC kontrol örneği" üzerine tıklayın. "Lenfosit kapısı" vurgulayın ve sonra "Çalışma Alanı" linkine tıklayın ve "İstatistikte Ekle". "Frekans Ana Ortaklık" istatistiğini vurgulayın ve "Ekle" butonuna tıklayınız.
        NOT: Bulenfositler olan WBC (üst) yüzdesini verecektir.
      5. Adım 4.1.2.1 kullanılan FITC kontrol örneğinde oluşturulan kapıları ve istatistiklerin her vurgulayın. Ekranın üst kısmındaki "Grup" panelinde "Tüm Örnekleri" sürüklemeniz yeterlidir.
        NOT: Bu çalışma örneklerinin tüm bu ayarları geçerli olacaktır.
      6. Kaydet ve LMD klasörünü içeren aynı klasörde bir .wsp dosyası olarak isim çalışması.
    5. Bireysel örnek kapıları ayarlayın.
      1. veri kümesindeki "ilk örnek" üzerine tıklayın ve WBC kapısı uygun ekranda hücre dağılımı oturduğundan emin olun. o, tıklayın ve sürükleyin etmezse kapının kenarları bu numune için kapıyı ayarlayın. "Sağ ok" üzerine tıklayın (yani, "˃") aşağıdaki örneğe ilerlemek için. Tüm örnekler gözden geçirilmiştir kadar bu adımı yineleyin.
      2. veri kümesindeki ilk örnek için "WBC kapısı" üzerine tıklayın ve "Gran teyit"Her numune uygun ekranda hücre dağılımı sığdırmak için. gerektiği gibi. ayarlayın üzerine tıklayın" sağ ok ulocyte gate "," Monosit gate "ve" Lenfosit gate "(yani," ˃ ") aşağıdaki örneğe ilerlemek için .
      3. Tüm örneklerde yineleyerek Adım 4.1.5.2 gözden geçirilmiştir. Ardından, "Kaydet" i tıklayın.
    6. Bir elektronik tablo programı verileri görüntüler.
      1. Ekranın üst kısmındaki "Tablo Editörü" ikonuna tıklayın. Nihai tablo üzerinde örnekleme tarihini içerecek şekilde "Düzenle", "Anahtar Kelimeler" ve "$ TARİHİ" tıklayın. Sonra, son tablo üzerinde örnekleme kimlik eklemek için "Düzenle", "Anahtar Kelimeler", ve "@ SAMPLEID1" tıklayın. "SAMPLEID2 @", "SAMPLEID3 @", ve "SAMPLEID4 @" için tekrarlayın.
      2. "Tablo Editörü" ekranı ve her ikisi de bilgisayar ekranında izlenebiliyor böylece "örnek" ekranı ayarlayın. Seleörnek kağıda herhangi bir "örnek" ct. Ardından, "Tablo Editörü" ilgi her istatistiğini sürükleyin.
        1. "Tablo Editörü" için "granülosit kapısı" altında listelenen "Frekans. Ana Ortaklık" istatistiğini sürükleyin. Tür "Tablo Editörü" "Ad" sütununda "granülositler,% WBC".
        2. "Tablo Editörü" için "granülosit kapısı" altında listelenen "geometrik ortalama" istatistiğini sürükleyin. "Tablo Editörü" nin "Ad" sütununda "Geometrik Ortalama Floresan, granülositler" yazın.
        3. "Tablo Editörü" ile "Granülosit / Fagositoz Pozitif kapısı" altında listelenen "Frekans. Ana Ortaklık" istatistiğini sürükleyin. "Tablo Editörü" "Ad" sütununda Tür "% Fagositoz Olumlu Granülositler".
        4. inci "Granülosit / Fagositoz Pozitif kapısı" altında listelenen "geometrik ortalama" istatistiğini sürükleyine "Tablo Editörü". "Tablo Editörü" nin "Ad" sütununda "Geometrik Ortalama Floresan, Fagositoz Olumlu granülositler" yazın.
        5. "Tablo Editörü" için "Monosit kapısı" altında listelenen "Frekans. Ana Ortaklık" istatistiğini sürükleyin. Tür "Tablo Editörü" nin "Ad" sütununda "Monositler olarak% WBC".
        6. "Tablo Editörü" için "Monosit kapısı" altında listelenen "geometrik ortalama" istatistiğini sürükleyin. "Tablo Editörü" nin "Ad" sütununda "Geometrik Ortalama Floresan, monositler" yazın.
        7. "Tablo Editörü" ile "Monosit / Fagositoz Pozitif kapısı" altında listelenen "Frekans. Ana Ortaklık" istatistiğini sürükleyin. "Tablo Editörü" nin "Ad" sütununda "% Fagositoz Olumlu monositler" yazın.
        8. "Monosit / Phagocy altında listelenen" geometrik ortalama "istatistiğini sürükleyinTablo Editörü "için" apoptosisi Pozitif kapısı Tablo Editörü "Ad" sütunundaki "" başlığı altında "Geometrik Ortalama Floresan, Fagositoz Olumlu monositler". Tip ".
        9. "Tablo Editörü" için "Lenfosit kapısı" altında listelenen "Frekans. Ana Ortaklık" istatistiğini sürükleyin. Tür "Tablo Editörü" nin "Ad" sütununda "Lenfositler olarak% WBC".
      3. Sürükle ve tercih sırasına göre düzenlenmiş kadar "Tablo Editörü" görünür parametreleri bırakın.
      4. "Kaydet" i tıklayın. Sonra, bir çizelge formatında verileri görüntülemek için "Create Table" a tıklayın. tıklayın kaydetmek ve .xlsx dosyası olarak adını çalışmalarına "farklı kaydet".
  2. Tekrarlama OB aktivite deneyi için Adım 4.1 (yani, H-etiketli) örnekleri ve LMD veri dosyalarını kontrol eder.
    NOT: OB aktivitesi referanslarla fagositozu yapılan tüm başvurular yerine emin olun.

    3. Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Uzun süreli yoğun bir egzersiz doğal öldürücü hücre fonksiyonu viral enfeksiyonlara makrofaj sitokin aracılı tepki ve granülosit ve monosit fagositozu ve OB aktivitesi de dahil olmak üzere doğal immün işlevi üzerinde önemli etkileri vardır. Birden fazla çalışmalar kas hasarı ve metabolik talepler tarafından uyarılan inflamasyonu yansıtan bu granülosit ve monosit fagositoz ölçüde artar sonrası egzersiz, gösterir. Buna karşılık, granülosit ve monosit OB aktivite sonrası egzersiz azaltır ve enfeksiyona artmış duyarlılık biri bağışıklık göstergesi olabilir. Örneğin, Şekil 1 S. bu fagositozu göstermektedir granülositler tarafından aureus tarafından ertesi sabah normale dönüyor, bir 75 kilometrelik bisiklet butik (% 70 VO 2MAX) hemen sonra ve 1.5 saat artar. Monosit fagositozu benzer egzersiz bu seviyede etkilenmektedir. 2 gösterileri Şekil granülosit OB aktivite azalması olduğunuEn az 21 saatlik 75-km sonra bisiklet d. Monosit OB aktivitesi 75 kilometrelik bisiklet sonra azalır.

S. granülosit ve monosit fagositoz aureus, ancak granülosit ve monosit OB aktivite, sistemik inflamasyon biyomarkerların ile ilişkilidir 3 granülosit fagositozu ve serum C-reaktif protein (CRP) düzeyleri (Pearson momentler çarpımı korelasyon arasındaki mütevazı bir korelasyon göstermektedir;. r = 0.44; p <0.01 ) 106 kilolu / obez kadınlarda. Serum CRP ayrıca S. monosit fagositoz ilişkilidir aureus (Pearson momentler çarpımı korelasyon, r = 0.30; p <0.01). Buna ek olarak, kan nötrofil / lökosit sayısı (Pearson momentler çarpımı korelasyon sırasıyla r = 0.62 ve r = 0.61, p <0.001), vücut kitle indeksi (Pearson momentler çarpımı korelasyon, r = 0.50 ve r = 0.40, sırasıyla; p <0.001), serum insülin seviyeleri (r = 0.30 ve r =0.23; p <0.03) ve kan A 1C düzeyleri (Pearson momentler çarpımı korelasyon sırasıyla r = 0.28 ve r = 0.21, p <0.04) S. granülosit ve monosit fagositozu ile ilişkilidir aureus. Genel olarak, bu veriler, dinlenme bireylerde yüksek granülosit ve monosit fagositoz sistemik enflamasyonun göstergesi olduğunu göstermektedir.

Şekil 1
Şekil 1:. Granülosit Fagositoz Yoğun Dayanıklılık Egzersiz etkilenen Granülosit fagositoz VO 2max% 70 bir 75 kilometrelik bisiklet maçın hemen sonra ve 1.5 saat artar. 21-saat sonrası egzersiz, granülosit fagositoz biraz egzersiz öncesi seviyelerinin altında geri döndü. * egzersiz öncesi farklı olduğunu gösterir (eşleştirilmiş t-testi post-hoc analizi ile tekrarlanan önlemler ANOVA, uygun olduğunda; N = 19; p <0.05). Değerler bensinBir ± standart hata. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

şekil 2

Şekil 2:. Granülosit Oksidatif Burst Etkinlik Yoğun Dayanıklılık Egzersiz Granülasit oksidatif patlama aktivitesi ile Etkilenen olan VO 2max% 70 bir 75 kilometrelik bisiklet nöbetinden sonra, hemen 1,5-hr ve 21-saat azalmıştır. * egzersiz öncesi farklı olduğunu gösterir (eşleştirilmiş t-testi post-hoc analizi ile tekrarlanan önlemler ANOVA, uygun olduğunda; N = 19; p <0.05). Değerler ortalama ± olan standart hata. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

. Şekil 3: Granülosit Fagositoz Overweight / Obez Kadınlarda Sistemik ile İnflamasyon olan Granülosit fagositoz serum C-reaktif protein, sistemik inflamasyon yaygın olarak kabul biyobelirtecin (Pearson çarpım-moment korelasyon korelasyon N = 87, r = 0.44; p <0.01). Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Bu yazıda, granülosit ve monosit fonksiyonun iki göstergelerin belirlenmesi için adım adım protokolü sağlar. Bu tahlilin başarısı için kritik olan, bir kaç adım belirledik. Böyle bir adım bakterilerin yanı sıra hemen önce meydana buz banyosu inkübasyon olduğunu. Bütün numuneler iyice soğutma fagositoz ve OB aktivitesi üzerinde sıcaklığın etkisini en aza indirir. Bir diğer önemli bir adım her bir örnek için bakteri eklenmesidir. A 8: 1 bakteri: fagosit oranı optimum sonuçlar üretir; Ancak diğer araştırmacılar bu oranın uygun sonuçlar üretmek için modifiye edilmesi gerektiğini bulabilirsiniz. Diğer önemli adım lökosit eritrositlerde lyse ve düzeltmek için RBC lizizi ve WBC sabitleme reaktif kullanılmasıdır. Bu tür reaktiflerin kullanılması eritrosit tam lizis sağlar ve güvenli bir şekilde gece boyunca 4 ° C'de işlenmiş örnekleri saklamak ve daha sonra ertesi gün akış sitometresi boyunca onları çalıştırmak için araştırmacılar sağlar. Önceki çalışma (yayınlanmamış) indicRBC parçalama ve WBC sabitleme veri bütünlüğünden ödün vermeden birçok 12 olarak saat sabit örneklerin akış sitometri geciktirmek için kullanılabilir ates.

Bu prosedür kolaylıkla araştırmacı yeteneklerini ve ilgilerini karşılamak için değiştirilebilir, ancak uyarlama yapıldığında optimizasyon gerekli olduğunu vurgulamak gerekir. bildirilmiştir en yaygın uyarlamaları birkaç hedef bakteri, etiket / probu ve kuluçkalama süresi için vardır. Escherichia coli 7,8 S. yerine kullanıldığında Araştırmacılar olağanüstü sonuçlar vermiştir aureus hedef patojen olarak (her ikisi de 8 de: 1 oranında). Saccharomyces cerevisiae gibi bir mantar, aynı zamanda E. için bir ikame olarak uygun E. coli. Buna ek olarak, araştırmacılar sıklıkla fagositosis için sonda olarak, bir pH duyarlı moleküler prob yerine FITC 7,12 kullanımı. O genel Ob faaliyetini ölçmek için kullanılan daha Aynı şekilde bu tedavi, diğer problarg dichlorofluorescin diasetat (DCF-DA) 10 ve 123 dihydrorhodamine (DHR). 13 Dolaylı inkübasyon süreleri 20 dakika 120 dakika, McFarlin maksimal tepki süresi bakteriyel hedefe göre değişebilir rapor etmiştir 12,14,15 arasında değişmektedir. 7 O gerektiği Ayrıca Optimal bekletme süreleri tahlilin fagositoz ve OB yönleri arasında değişebilir kaydedilmelidir. 7

yeni bir araştırma ortamında, bu teknik kurulurken tüm laboratuar deneylerinde olduğu gibi, sorun gerekli olabilir. Yazarlar bakteri bu optimizasyon tavsiye: fagosit oranı Bu deney için başarının anahtarıdır. Yazarlar ayrıca bir hastalık olmayan katılımcıdan granülosit popülasyonda hücrelerin az% 80'i pozitif FITC ise bir örnekten veri analizi atılmalıdır unutmayın; Bu durumda, numune yeniden alınabilir ve eğer mümkünse,-analiz yeniden.

birkaç sınırlamalar vardırgranülosit ve monosit fagositoz ve OB aktivite deneyi Bu yazıda anlatılan. Bu tür bir sınırlama ilgi hücre popülasyonlarının tanımlanması amacı FSC ve SSC etkin olarak kullanılmasıdır. Hücre yüzey belirteçleri kullanılması araştırmacılar olumlu hücre popülasyonu tespit etmek bakabilirsiniz. 10 Ancak, bu özelliğin eklenmesi sitometresinde temel akış daha gerektirecektir izin ve bu yazının kapsamı dışındadır böylece, olacaktır. Bu testin bir diğer kısıtlılığı da ilgi bağışıklık hücreleri tarafından içselleştirilmiş henüz prob floresan gidermek için tripan mavi etkinliği dayanıyor olmasıdır. Bir pH-duyarlı molekül prob 7,12 içselleştirme bir sorun olduğu durumlarda FITC alternatif olarak kullanılabilir. Böyle bir prob gibi endositik veziküllerinde gibi asidik ortamlarda tek flüoresan olduğu elde edilen floresans internalize edilmiş partiküller, sadece temsil eder. bunu yapmak için ek olarak, çeşitli araştırmacılar mevcut tahlil eleştirdiES temel bağışıklık hücresi aktivitesi için kontrol edilmesi için buz su içinde yerine 37 ° C de inkübe edilir örnekleri paralel bir dizi içermez. Pek çok kez, biz granülosit ve monosit fagositoz ve OB aktivite deneyi yaparken bu "buz koşulu" dahil, ve önemli ölçüde (yayımlanmamış) verilerin kalitesini artırmak olmadığını gördük.

Özet olarak, bu Eser granülosit ve monositlerde fagositoz ve OB aktivitesini ölçmek için bir yöntem açıklanır. Bu kolayca laboratuvar yetenekleri ve araştırma çıkarları hesaba modifiye edilebilir kolay ve basit bir testtir. Egzersiz bilime-ve obezite ile ilişkili araştırmada, doğuştan gelen bağışıklık fonksiyonunun bu tedbir araştırmacı kilo kaybı, ek kullanımı, diyet müdahaleler ve diğer yaşam tarzı değişiklikleri de dahil olmak üzere pek çok potansiyel önlemler, etkilerini araştırmak için izin verecektir. Bu tekniği mastering üzerine, araştırmacılar akut izlemek mümkün olacakdiyet, egzersiz ve diğer bir çok uyarıcıya tepki olarak bağışıklık hücresi işlevinde ve kronik değişir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Acknowledgments

Yazarlar, bu prosedürün optimizasyonu sırasında yardım için Zack Shue, Casey John ve Lynn Cialdella-Kam kabul etmek istiyorum.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
12 x 75 mm tubes, with cap VWR 20170-579 You will need 2 tubes per sample ("H" and "F") plus 3 tubes per batch (for assay controls; "F", "H", and "Blood only").
PBS (10x), pH 7.4 Life Technologies 70011-044
Bottle top 0.2 µm cellulose acetate filter (500 ml capacity) Fisher Scientific 09-741-07 
Glucose, powder Life Technologies 15023-021
Citric acid (anhydrous, cell culture tested, plant cell culture tested) Sigma-Aldrich C2404-100G
Sodium citrate tribasic dihydrate Sigma-Aldrich S4641-25G
Dihydroethidium (Hydroethidine) (HE) Life Technologies D11347
Dimethyl sulfoxide (DMSO) Anhydrous Life Technologies D12345
Staphylococcus aureus (Wood strain without protein A) BioParticles, fluorescein conjugate (FITC) Life Technologies S2851
Staphylococcus aureus (Wood strain without protein A) BioParticles, unlabeled Life Technologies S-2859
Trypan Blue Solution, 0.4% Life Technologies 15250-061
4.0 ml vacutainer containing 7.2 mg K2EDTA, spray-dried VWR BD367861 You will need 1 K2EDTA blood collection tube per sample.
4.0 ml vacutainer containing 68 USP units Lithium Heparin, spray-coated VWR BD367884 You will need 1 Lithium Heparin blood collection tube per sample.
COULTER Ac·T 5diff CP Beckman Coulter 6605705 i.e., hematology analyzer
COULTER Ac·T 5diff Rinse Beckman Coulter 8547167
COULTER Ac·T 5diff Fix Beckman Coulter 8547171
COULTER Ac·T 5diff WBC Lyse Beckman Coulter 8547170
COULTER Ac·T 5diff Hgb Lyse Beckman Coulter 8547168
COULTER Ac·T 5diff Cal Calibrator Beckman Coulter 7547175
COULTER Ac·T 5diff Control Plus Beckman Coulter 7547198
AcT 5diff Diluent Beckman Coulter 8547169
200 µl extended-length pipette tips VWR 37001-526
Insulated ice pan VWR 89198-980 For ice water bath.
Open metal tube rack VWR 60916-702
Fetal Bovine Serum Life Technologies 26140-111
TQ-Prep Workstation Beckman Coulter 6605429 i.e., automated cell lyse preparation workstation
ImmunoPrep Reagent System Beckman Coulter 7546999 i.e., RBC lyse/WBC fix reagent system
Cytomics FC500 MCL Flow Cytometry System with CXP Software Beckman Coulter 626553
IsoFlow Sheath Fluid Beckman Coulter 8547008
COULTER CLENZ Beckman Coulter 8546929
Flow-Check Fluorospheres  Beckman Coulter 6605359 i.e., alignment and fluidics verification fluorospheres
FlowJo Software FlowJo FlowJo i.e., flow cytometry analysis software
Excel Software Microsoft Microsoft Excel i.e., electronic spreadsheet program

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Nieman, D. C., et al. Influence of pistachios on performance and exercise-induced inflammation, oxidative stress, immune dysfunction, and metabolite shifts in cyclists: a randomized, crossover trial. PLoS One. 9, e113725 (2014).
  2. Knab, A. M., et al. Effects of a freeze-dried juice blend powder on exercise-induced inflammation, oxidative stress, and immune function in cyclists. Appl Physiol Nutr Metab. 39, 381-385 (2014).
  3. Konrad, M., et al. The acute effect of ingesting a quercetin-based supplement on exercise-induced inflammation and immune changes in runners. Int J Sport Nutr Exerc Metab. 21, 338-346 (2011).
  4. Nieman, D. C., et al. Immune and inflammation responses to a 3-day period of intensified running versus cycling. Brain Behav Immun. 39, 180-185 (2014).
  5. Nieman, D. C., et al. Carbohydrate supplementation affects blood granulocyte and monocyte trafficking but not function after 2.5 h of running. Am J Clin Nutr. 66, 153-159 (1997).
  6. Tidball, J. G. Inflammatory cell response to acute muscle injury. Med Sci Sports Exerc. 27, 1022-1032 (1995).
  7. McFarlin, B. K., Williams, R. R., Venable, A. S., Dwyer, K. C., Haviland, D. L. Image-based cytometry reveals three distinct subsets of activated granulocytes based on phagocytosis and oxidative burst. Cytometry A. 83, 745-751 (2013).
  8. Liao, Y., Liu, P., Guo, F., Zhang, Z. Y., Zhang, Z. Oxidative burst of circulating neutrophils following traumatic brain injury in human. PLoS One. 8, e68963 (2013).
  9. McFarlin, B. K., Venable, A. S., Prado, E. A., Henning, A. L., Williams, R. R. Image-based flow cytometry technique to evaluate changes in granulocyte function in vitro. J Vis Exp. , (2014).
  10. Nieman, D. C., et al. Immune response to obesity and moderate weight loss. Int J Obes Relat Metab Disord. 20, 353-360 (1996).
  11. Nieman, D. C., et al. Immune function in female elite rowers and non-athletes. Br J Sports Med. 34, 181-187 (2000).
  12. Ichii, H., et al. Iron sucrose impairs phagocytic function and promotes apoptosis in polymorphonuclear leukocytes. Am J Nephrol. 36, 50-57 (2012).
  13. Gomes, A., Fernandes, E., Lima, J. L. Fluorescence probes used for detection of reactive oxygen species. J Biochem Biophys Methods. 65, 45-80 (2005).
  14. Gruger, T., et al. Negative impact of linezolid on human neutrophil functions in vitro. Chemotherapy. 58, 206-211 (2012).
  15. Dementhon, K., El-Kirat-Chatel, S., Noel, T. Development of an in vitro model for the multi-parametric quantification of the cellular interactions between Candida yeasts and phagocytes. PLoS One. 7, e32621 (2012).

Tags

İmmünoloji Sayı 115 fagositoz oksidatif patlama monosit granülosit doğuştan gelen bağışıklık flow sitometri
İnsan Kanı Ölçüm Granülosit ve Monosit Fagositoz ve Oksidatif Burst Etkinlik
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Meaney, M. P., Nieman, D. C.,… More

Meaney, M. P., Nieman, D. C., Henson, D. A., Jiang, Q., Wang, F. Z. Measuring Granulocyte and Monocyte Phagocytosis and Oxidative Burst Activity in Human Blood. J. Vis. Exp. (115), e54264, doi:10.3791/54264 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter