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Immunology and Infection

Misurazione dei granulociti e dei monociti fagocitosi e ossidativo attività Burst nel sangue umano

Published: September 12, 2016 doi: 10.3791/54264
Automatic Translation
1, 1, 2, 3, 3
1Human Performance Laboratory, North Carolina Research Campus, Appalachian State University, 2Department of Biology, Appalachian State University, 3David H. Murdock Research Institute

Introduction

Il granulociti e monociti fagocitosi / burst ossidativo (OB) saggio di attività è una tecnica semplice, straight-forward che viene spesso utilizzato per raccogliere informazioni sui innato funzione immunitaria dopo l'attività fisica intensa e prolungata. 1-4 Quando si studia la risposta del sistema immunitario a uno stimolo, granulociti e monociti sono di particolare interesse perché giocano un ruolo centrale nella difesa ospite e sono le prime cellule immunitarie per accumulare nel sito di infezione. 5 neutrofili, un tipo di granulociti, sono le prime cellule di traslocare nel muscolo danneggiato tessuto dopo l'attività fisica intensa. 6 fagocitosi e l'attività OB sono le misure più comuni di granulociti e monociti funzione, 7 e sono preferiti come indicatori di funzione delle cellule immunitarie innate a causa del loro ruolo centrale sia nel processo di infezione e il processo di riparazione.

Il test descritto in questo Utili manoscrittozes un flusso base citometro a fornire una determinazione quantitativa di granulociti e monociti fagocitosi e l'attività OB nel sangue intero. L'uso di sangue intero in questa tecnica è vantaggiosa perché permette il test da condurre senza una procedura di purificazione tempo. Questo test può essere facilmente modificato per accogliere una varietà di disegni di ricerca e capacità di laboratorio. Ad esempio, Liao et al. Utilizzato una tecnica simile a dimostrare che l'attività dei neutrofili OB è aumentata e neutrofili fagocitosi è diminuita in seguito a lesione cerebrale traumatica. 8 In un altro esempio, McFarlin et al. Descrive un elegante modifica di questa tecnica che utilizza allophycocyanin (APC ) coniugata CD66b e ad alte prestazioni in tandem APC-coniugato etichettatura CD45 con image-based citometria a flusso per classificare i granulociti in termini di attività di fagocitosi e OB. 7,9

Il nostro gruppo di ricerca ha utilizzato vari adattamenti di questo TEchnique come un indicatore della funzione immunitaria innata nelle popolazioni in sovrappeso, obesi, e atletiche per quasi 20 anni. 10,11 Il testo qui di seguito vi fornire al lettore con le istruzioni passo-passo per l'esecuzione di questo test ed evidenziare le aree che il lettore può adattare per soddisfare le esigenze della loro ricerca.

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Protocol

NOTA: Tutte le procedure di raccolta del sangue sono state condotte in conformità con le linee guida stabilite dalla Appalachian State University (ASU) Institutional Review Board (IRB).

1. Preparazione Assay

  1. Raccogliere, preparare e organizzare i materiali specificati per la procedura (si prega di fare riferimento alla tabella di specifici materiali / attrezzature).
    1. Etichettare tubi 12 x 75 mm.
      1. Etichetta due tubi per ogni partecipante: un tubo per il saggio fagocitosi (etichettare questo tubo con inchiostro nero e una "F" per isotiocianato di fluorescina [FITC]) e un tubo per il saggio di attività OB (etichettare questo tubo con inchiostro rosso e una " H "per dihydroethidium [HE]).
        NOTA: L'uso di provette sterili 12 x 75 mm si consiglia di ridurre al minimo l'attivazione cellulare non intenzionale e associato aumento del rumore di fondo.
      2. Etichetta tre tubi per i controlli di analisi: un tubo per il saggio di fagocitosi (controllo FITC: etichettare questo tubo con black inchiostro e una "F"), un tubo per il saggio di attività OB (HE controllo: etichettare questo tubo con inchiostro rosso e una "H"), e una provetta per il controllo negativo (Blood solo: etichettare questo tubo con inchiostro verde e "solo sangue").
    2. Preparare soluzioni di almeno un giorno prima del giorno del test.
      1. Preparare la soluzione salina sterile tampone fosfato (PBS). Diluire 100 ml di PBS 10x con 900 ml di 18,2 MW H 2 O. Filtro sterilizzare con un filtro da 0,2 micron. Conservare a 4 ° C fino all'utilizzo.
      2. Preparare la PBS sterile-glucosio. Sciogliere 1.0 g di glucosio in 100 ml di PBS. Filtro sterilizzare con un filtro da 0,2 micron. Conservare a 4 ° C fino all'utilizzo.
      3. Preparare il tampone 0,1 M citrato sterile. Sciogliere 1.2 g di acido citrico e 1,1 g di citrato di sodio in 100 ml di 18,2 MW H 2 O. Regolare il pH a 4,0. Filtro sterilizzare con un filtro da 0,2 micron. Conservare a 4 ° C fino all'utilizzo.
      4. Preparare la soluzione madre HE. Resuspend 1,0 mg di HE in 1,0 ml di dimetilsolfossido (DMSO). Mescolare delicatamente, aliquota, e conservare a -20 ° C fino al momento dell'uso.
      5. Preparare la coniugati con fluoresceina Staphylococcus aureus (S. aureus) stock soluzione (2 x 10 9 particelle / ml). Risospendere 10 mg di FITC-marcato S. aureus in 1,5 ml (o quantità appropriata) di PBS. Dividere in tre aliquote di 500 microlitri e ultrasuoni in base alle raccomandazioni del produttore. Aliquotare e conservare a -20 ° C fino al momento dell'uso.
      6. Preparare il senza etichetta S. soluzione madre aureus (2 x 10 9 particelle / ml). Risospendere 100 mg di senza etichetta S. aureus in 15 ml (o quantità appropriata) di PBS. Dividere in una trentina di 500 aliquote microlitri e ultrasuoni in base alle raccomandazioni del produttore. Aliquotare e conservare a -20 ° C fino al momento dell'uso.
    3. Preparare soluzioni di lavoro fresco il giorno del test.
      1. Preparare la soluzione di lavoro HE. Trasferire 10 ml diSoluzione scongelati HE a 990 ml di PBS-glucosio. Esporre alla luce e tenere in ghiaccio fino al momento dell'uso.
      2. Preparare la S. coniugati con fluoresceina Soluzione di lavoro aureus (133,333 particelle / ml). Trasferire 70 ml di scongelato coniugati con fluoresceina S. Soluzione aureus a 980 ml ​​di PBS. Esporre alla luce e tenere in ghiaccio fino al momento dell'uso.
      3. Preparare il senza etichetta S. Soluzione di lavoro aureus (133,333 particelle / ml). Trasferimento 70 ml di scongelato senza etichetta S. Soluzione aureus a 980 ml ​​di PBS. Esporre alla luce e tenere in ghiaccio fino al momento dell'uso.
      4. Preparare la soluzione di raffreddamento. Aggiungere 750 ml di 0,4% trypan soluzione blu a 11,25 ml di sterile tampone 0,1 M citrato. Mantenere in un bagno di ghiaccio-acqua fino al momento dell'uso.
    4. Avere un flebotomo certificato prelevare il sangue secondo le linee guida dell'Organizzazione Mondiale della Sanità per un prelievo di sangue.
      1. Disegnare il sangue in un 4 ml di tubo di raccolta sangue contenente K 2 EDTA. Intubo vert raccolta del sangue secondo le istruzioni del produttore. Mantenere tubo di raccolta di sangue a temperatura ambiente su un agitatore meccanico banco fino al momento dell'uso. Utilizzare questo sangue per la completa emocromo (CBC) con l'analisi dei globuli bianchi (WBC) differenziale descritto al punto 1.2.1.
      2. Disegnare il sangue in provetta di raccolta un 4 ml di sangue contenente litio eparina. Capovolgere tubo di raccolta sangue secondo le istruzioni del produttore. Mantenere tubo di raccolta del sangue a temperatura ambiente su una sedia a dondolo da banco fino al momento dell'uso. Utilizzare questo sangue per il dosaggio dei monociti e granulociti fagocitosi e l'attività OB descritto al punto 2.
  2. Determinare la quantità di batteri (cioè, S. aureus) che sarà necessario per completare il saggio per ogni campione.
    1. Utilizzare un analizzatore ematologico per eseguire CBC con differenziale analisi WBC sul sangue come descritto nelle istruzioni del produttore. Prendere nota della conta leucocitaria (in cellule / ml),% neutrofili e%valori monociti.
    2. Utilizzare le equazioni di seguito per determinare le conta dei neutrofili e monociti per ogni campione.
      Conta dei neutrofili (in cellule / ml) =% × neutrofili WBC (in cellule / ml)
      Conteggio dei monociti (in cellule / ml) =% monociti × WBC (in cellule / ml)
    3. Utilizzare le equazioni di seguito per determinare il conteggio fagociti per ciascun campione e il numero dei fagociti presenti in 100 microlitri di campione.
      Count fagocita (in cellule / ml) = conta dei neutrofili (in cellule / ml) + conteggio dei monociti (in cellule / ml)
      Numero dei fagociti in 100 microlitri = (count Fagocita (in cellule / ml)) / 10
    4. Usare l'equazione seguente per determinare il numero di batteri (cioè, S. aureus) necessari per ciascun campione e la quantità di FITC-marcato S. aureus o senza etichetta S. soluzione aureus di lavoro (133,333 particelle / ml) che dovrebbe essere aggiunto ad ogni provetta.
      NOTA: I batteri bersaglio: il rapporto dei fagociti è di 8: 1.
      Numero di batteri necessaria =Numero dei fagociti in 100 ml × 8
      Volume di soluzione di lavoro FITC o senza etichetta necessario (in ml) = (numero di batteri necessari) / (133,333 particelle / ml)

2. Eseguire Assay

  1. Preparare sangue intero per il saggio.
    1. Per ogni provetta partecipante e controllo, utilizzare un puntale esteso lunghezza per trasferire 100 ml di sangue intero dalla provetta di raccolta del sangue litio eparina al fondo di una provetta 12 x 75 mm. Rimettere i tappi.
      NOTA: Fare attenzione per evitare di ottenere il sangue ai lati dei tubi 12 x 75 mm.
    2. Utilizzare una micropipetta di aggiungere 10 ml di soluzione HE ai tubi etichettati con inchiostro rosso e una "H", compresa la provetta di controllo HE lavorare. Rimettere i tappi e brevemente vortice.
    3. Incubare tutte le provette in un bagno d'acqua a 37 ° C per 15 min. Poi, trasferire immediatamente tutte le provette per un bagno di ghiaccio-acqua per 12 min.
      NOTA: utilizzare un rack metallo apertoe agitare delicatamente la rastrelliera ogni 5 minuti per assicurare che i tubi sono rapidamente e adeguatamente riscaldati o refrigerati.
  2. Aggiungere batteri (cioè, S. aureus) per le provette dei campioni e di controllo.
    1. Utilizzare una micropipetta per aggiungere la giusta quantità (calcolato al punto 1.2.4) di S. senza etichetta soluzione di lavoro aureus ai tubi etichettati con inchiostro rosso e una "H", compresa la provetta di controllo HE. Rimettere i tappi e brevemente vortice.
    2. Utilizzare una micropipetta per aggiungere la giusta quantità (calcolato al punto 1.2.4) del marcato con FITC S. soluzione di lavoro aureus ai tubi etichettati con inchiostro nero e una "F", compresa la provetta di controllo FITC. Rimettere i tappi e brevemente vortice.
    3. Vortex il "sangue solo" provetta di controllo, ma non aggiungere entrambi i tipi di batteri (ad esempio, S. aureus) ad esso.
    4. Incubare tutte le provette in un bagno d'acqua a 37 ° C per 20 min. Utilizzare un rack metallo aperto e scuotere delicatamente la rastrelliera ogni 5 minutiper assicurare che i tubi sono rapidamente e adeguatamente riscaldati. Dopo il periodo di incubazione, trasferire immediatamente tutte le provette per un bagno di ghiaccio-acqua per 1 min.
  3. Lavare le cellule.
    1. Utilizzare una pipetta ripetitore per aggiungere 100 ml di soluzione di tempra ghiacciata a tutte le provette. Rimettere i tappi, vortex brevemente, e poi incubare tutte le provette in ghiaccio per 1 min.
    2. Utilizzare una pipetta ripetitore di aggiungere 1 ml di PBS ghiacciato a tutte le provette. Vortex brevemente, e quindi aggiungere un ulteriore 2 ml di PBS ghiacciato a tutte le provette e sostituire tappi. Centrifugare tutte le provette per 5 minuti a 4 ° C e 270 xg, e quindi aspirare il surnatante.
    3. Ripetere il punto 2.3.2 una sola volta (per un totale di 2 lavaggi).
  4. Preparare i campioni per citometria a flusso.
    1. Utilizzare una pipetta ripetitore di aggiungere 50 ml di siero fetale bovino ghiacciata a tutte le provette. In breve vortice tutte le provette.
    2. Trasferire tutte le provette ad una giostra appropriata e utilizzare una stazione di lavoro di preparazione Lyse cella automatizzata con il rosso del sangue cell (RBC) lisi e WBC fissare i reagenti per la lisi dei globuli rossi e fissare i globuli bianchi come descritto nelle istruzioni del produttore.
    3. Dopo la Lyse cellule corsa automatizzata workstation preparazione è stata completata, avvolgere i tubi in un foglio di alluminio e conservare in frigorifero a 4 ° C fino a quando la citometria a flusso analisi può essere effettuata.

3. Citometria a Flusso di acquisizione

  1. Imposta il sistema di citometria a flusso.
    1. Riscaldare la citometria a flusso sistema come indicato nel manuale utente fornito dal produttore. Quindi, controllare i livelli del reagente e del serbatoio rifiuti. Se necessario, riempire i serbatoi di reagenti e / o svuotare il serbatoio di scarico.
    2. Utilizzare la funzione "Clean Panel" per eseguire il sistema ciclo di pulizia. Poi, eseguire le fluorosfere di allineamento e fluidica verifica, e assicurarsi che il coefficiente mezzo di picco di variazione (HPCV) per ogni rivelatore è compreso nell'intervallo predefinito descritto nel controllo di qualità (QC) protocolli forniti dal produttorer.
  2. Creare acquisizione specifico per il dosaggio e protocolli di impostazione dello strumento.
    1. Creare protocolli di acquisizione specifiche del dosaggio per i saggi di fagocitosi e di attività OB.
      NOTA: I protocolli di acquisizione qui descritti possono essere adattati per l'uso su qualsiasi citofluorimetro con un laser blu (488 nm), un filtro (530/30) per FITC, e un filtro (575/26) per HE.
      1. Aprire la citometria a flusso software di acquisizione del sistema e creare un "nuovo protocollo".
      2. Scegliere il "FL1 Parameter" per il saggio fagocitosi (FITC) e il "FL2 Parameter" per il saggio di attività OB (HE).
      3. Creare le trame (vale a dire, scatter in avanti [FSC] vs. lato scatter [SSC] dot plot, FL1 istogramma, FL2 istogramma) richiesto per l'acquisizione.
      4. Creare regioni poligonali per il WBC (globuli bianchi), dei granulociti e monociti popolazioni sulla trama SSC FSC e creare e regioni lineari sugli istogrammi FL1 e FL2. Impostare un & #34; Arresto Conte "di 50.000 eventi per il cancello WBC.
      5. Salvare i protocolli con nomi specifici test.
    2. Creare protocolli impostazione degli strumenti specifici del dosaggio per i saggi di fagocitosi e di attività OB.
      1. Trascinare i "protocolli specifici test di acquisizione" (definiti al punto 3.2.1) dal "Esplora risorse" al "Acquisition Manager" sulla citometria a flusso software di acquisizione del sistema.
        NOTA: Informazioni aggiunte in questo modo apparirà sempre alla fine della lista di lavoro.
      2. Inserire le informazioni campione nella lista di lavoro, e salvare la lista di lavoro.
      3. Rimuovere le provette dei campioni di controllo dal frigorifero 4 ° C e consentire loro di equilibrare a temperatura ambiente per 15 min. Poi, Vortice brevemente ogni provetta campione di controllo.
      4. Utilizzare i "protocolli di acquisizione specifici test" definiti al punto 3.2.1 per eseguire il campione di controllo negativo (vale a dire, il sangue solo) e il controllo positivocampioni (ad esempio, controllo che, di controllo CIC) attraverso il sistema di citometria a flusso. Esamina gli istogrammi e regolare il tubo fotomoltiplicatore (PMT) tensioni dei canali ficoeritrina (PE) FITC e come necessario.
      5. Agitare i campioni di controllo e trasferirli al flusso citometria giostra sistema secondo l'ordine sul lista di lavoro. Quindi, posizionare la giostra nella camera di campionamento e fare clic sul pulsante citometro Barra degli strumenti "Start" per acquisire i dati per i campioni di controllo. Salvare il "xxx Impostazione Pro" protocollo di impostazione.
  3. Acquisire campioni di studio sul sistema di citometria a flusso.
    1. Rimuovere le provette dei campioni di studio dal frigorifero a 4 ° C e lasciare equilibrare a temperatura ambiente per 15 min.
    2. Mentre i campioni vengono equilibrante, trascinare i protocolli di acquisizione specifiche di studio predefiniti allo spazio lista di lavoro per fare una lista di lavoro del progetto.
    3. Verificare che il "protocollo di impostazione" è legata alla &# 34;. L'impostazione dei protocolli specifici test "definiti al punto 3.2.2 Quindi, immettere le informazioni di identificazione (ad esempio, nome dello studio, disegnare il numero, il numero di visita, soggetto ID) per ogni tubo nella lista di lavoro.
    4. Dopo il periodo di equilibrazione di 15 min, campioni di studio vortice e trasferirli al flusso citometria giostra sistema secondo l'ordine sul lista di lavoro. Quindi, posizionare la giostra nella camera di campionamento e fare clic sul pulsante citometro Barra degli strumenti "Start" per acquisire i dati per i campioni di studio.
    5. Valuta la qualità dei dati controllando l'efficienza RBC lisi e la distribuzione sottogruppo di cellule WBC, proporzioni, conte assolute e intensità di fluorescenza sul pannello rapporto di ciascun campione.
      NOTA: La qualità dei dati è considerata accettabile se tutti questi criteri sono entro i limiti predefiniti. Se tutti i criteri non sono soddisfatti, campione deve essere ritrattato.
    6. Pulire e spegnere il sistema citometria a flusso. Conservare la citometria a flussoi dati sui due dischi diversi computer per prevenire la perdita accidentale dei dati.

Analisi 4. I dati

  1. Eseguire l'analisi fagocitosi.
    1. Consolidare tutti i fagocitosi (vale a dire, F-etichettato) file di dati dei dati in modalità di campionamento e la lista di controllo (LMD) in una singola cartella. Quindi, aprire la citometria a flusso software di analisi e trascinare i file nello spazio del campione.
    2. Impostare il WBC, granulociti, monociti, linfociti e cancelli.
      1. Fare doppio clic sul nome del file per aprire qualsiasi dei "campioni di controllo FITC". Utilizzare i menu a discesa per impostare l'asse x per "FSC" e "lineare" e l'asse y per "SSC" e "lineare".
      2. Utilizzare il "selettore di porta poligono" per preparare un cancello della popolazione totale WBC.
        NOTA: Assicuratevi di includere tutte le celle ai bordi del grafico. Etichettare questa porta "WBC".
      3. Fare doppio clic sulla "nuova porta WBC" e utilizzare il drop-down menu per impostare l'asse x per "FSC" e "lineare" e l'asse y per "SSC" e "lineare".
      4. Utilizzare il "selettore di porta poligono" per impostare la "granulociti gate" e il cancello Monocita ", e quindi utilizzare il" selettore di porta ellittica "per impostare la" linfociti porta ". Etichettare ogni porta di conseguenza. Trascinare i" Dati di gate (%) "di lato in modo che le cellule sono facilmente visualizzati.
    3. Impostare il "Fagocitosi positivo gate" e la "Fagocitosi porta negativo" per le popolazioni dei granulociti e monociti.
      1. Fare doppio clic sul "campione di controllo FITC" utilizzato nel passaggio 4.1.2.1. Quindi, fare clic sul "porta granulociti" e utilizzare i menu a discesa per impostare l'asse x per "FL1" e "Log" e l'asse y per "SSC" e "lineare".
      2. Utilizzare il "selettore di porta piazza" per impostare un "Fagocitosi porta negativo" e un "fagocitosi Positive gate ".
        NOTA: Poiché i campioni di controllo FITC non hanno ricevuto batteriche (ad esempio, S. aureus) stimoli, tutte le celle dovrebbe teoricamente fagocitosi negativo. Usare discrezione al momento di stabilire i confini di queste popolazioni.
      3. Ripetere il punto 4.1.3.1 e 4.1.3.2 passo per la popolazione dei monociti.
    4. Aggiungere statistiche per "% di WBC", "intensità di fluorescenza", e "cellule positive% fagocitosi" per le popolazioni dei granulociti e monociti.
      1. Clicca su "campione di controllo FITC" utilizzato nel passaggio 4.1.2.1. Evidenziare il "granulociti porta", e quindi cliccare su "Area di lavoro" e "Aggiungi Statistica". Evidenziare "media geometrica" ​​e "FL1 Log" e fare clic su "Aggiungi". Poi ha scelto la statistica "Frequenza di Parent" e cliccare su "Aggiungi".
        NOTA: Questo darà l'intensità di fluorescenza (media geometrica) di tutta la popolazione di granulociti ela percentuale di WBC (genitore) che sono granulociti.
      2. Clicca su "campione di controllo FITC" utilizzato nel passaggio 4.1.2.1. Evidenziare il "Fagocitosi porta positiva" della popolazione granulociti, e quindi fare clic su "Area di lavoro" e "Aggiungi Statistica". Evidenziare "media geometrica" ​​e "FL1 Log" e fare clic su "Aggiungi". Quindi scegliere la statistica "Frequenza di Parent" e cliccare su "Aggiungi".
        NOTA: Questo darà l'intensità di fluorescenza (media geometrica) dei granulociti fagocitosi positivi e la percentuale dei granulociti (genitore) che sono fagocitosi positive.
      3. Ripetere il punto 4.1.4.1 e 4.1.4.2 passo per la popolazione dei monociti.
      4. Clicca su "campione di controllo FITC" utilizzato nel passaggio 4.1.2.1. Evidenziare il "linfociti porta", e quindi cliccare su "Area di lavoro" e "Aggiungi Statistica". Evidenziare la statistica "Frequenza di Parent" e cliccare su "Aggiungi".
        NOTA: Questodarà la percentuale di WBC (genitore) che sono i linfociti.
      5. Evidenziare tutte le porte e le statistiche create nel campione di controllo FITC utilizzato nel passaggio 4.1.2.1. trascinarli in "Tutti Campioni" nel pannello "gruppo" nella parte superiore dello schermo.
        NOTA: Questo si applica queste impostazioni per tutti i campioni di studio.
      6. Salva e nome lavoro come un file con estensione wsp nella stessa cartella che contiene la cartella LMD.
    5. Regolare le singole porte di esempio.
      1. Fare clic sul "primo campione" nel set di dati e verificare che il cancello WBC si adatta in modo appropriato la distribuzione delle cellule sullo schermo. In caso contrario, fare clic e trascinare i bordi della porta regolare il cancello per quel campione. Clicca su "freccia destra" (vale a dire, "˃") per passare al campione successivo. Ripetere questa operazione fino a quando tutti i campioni sono stati esaminati.
      2. Fare clic sul "porta WBC" per il primo campione nel set di dati e confermare che il "Granulocyte cancello "," Monocita porta ", e" linfocitaria porta "per ogni campione opportunamente adattare la distribuzione delle cellule sullo schermo. Regolare, se necessario. Fare clic sulla" freccia destra "(vale a dire," ˃ ") per avanzare al campione successivo .
      3. Ripetere il punto 4.1.5.2 fino a quando tutti i campioni sono stati esaminati. Quindi, fai clic su "Salva".
    6. Visualizzare i dati in un foglio di calcolo elettronico.
      1. Fare clic sull'icona "Table Editor" nella parte superiore dello schermo. Fai clic su "Modifica", "Parole chiave", e "$ DATA" per includere la data di campionamento sul foglio di calcolo finale. Quindi, fai clic su "Modifica", "Parole chiave", e "@ SAMPLEID1" per includere l'identificazione di campionamento sul foglio di calcolo finale. Ripetere l'operazione per "@ SAMPLEID2", "@ SAMPLEID3", e "@ SAMPLEID4".
      2. Regolare lo schermo "Table Editor" e la schermata "campione" in modo che possano entrambi essere visualizzate sullo schermo del computer. Select qualsiasi "campione" sullo strato campione. Quindi, trascinare ogni statistica di interesse per la "Tabella Editor".
        1. Trascinare il ". Di Parent Freq" statistica elencati sotto la "porta di granulociti" al "Table Editor". Tipo "% WBC come granulociti" sotto la colonna "Nome" del "Table Editor".
        2. Trascinare la statistica "media geometrica" ​​elencati sotto la "porta di granulociti" al "Table Editor". Tipo "media geometrica fluorescenza, granulociti" sotto la colonna "Nome" del "Table Editor".
        3. Trascinare il ". Di Parent Freq" statistica elencati sotto la "granulociti / Fagocitosi positivo cancello" al "Table Editor". Tipo "% fagocitosi positivi granulociti" sotto la colonna "Nome" del "Table Editor".
        4. Trascinare la statistica "media geometrica" ​​elencati sotto la "granulociti / Fagocitosi positivo porta" a the "Table Editor". Tipo "media geometrica di fluorescenza, la fagocitosi Granulociti positivi" nella colonna "Nome" del "Table Editor".
        5. Trascinare il ". Di Parent Freq" statistica elencati sotto la "porta monociti" al "Table Editor". Tipo "% WBC come monociti" sotto la colonna "Nome" del "Table Editor".
        6. Trascinare la statistica "media geometrica" ​​elencati sotto la "porta monociti" al "Table Editor". Tipo "media geometrica di fluorescenza, monociti" sotto la colonna "Nome" del "Table Editor".
        7. Trascinare il ". Di Parent Freq" statistica elencati sotto la "monociti / Fagocitosi positivo cancello" al "Table Editor". Tipo "% fagocitosi Monociti positiva" nella colonna "Nome" del "Table Editor".
        8. Trascinare la statistica "media geometrica" ​​elencati sotto la "monociti / PhagocyTosis positivo porta "al" Table Editor ". TIPO" media geometrica di fluorescenza, la fagocitosi monociti positivi "sotto la" "colonna" Nome Table Editor ".
        9. Trascinare il ". Di Parent Freq" statistica elencati sotto la "linfociti porta" al "Table Editor". Tipo "% WBC come Linfociti" sotto la colonna "Nome" del "Table Editor".
      3. Trascinare i parametri visibili nella "Table Editor" fino a quando non sono disposte secondo l'ordine preferito.
      4. Fai clic su "Salva". Quindi, fai clic su "Crea tabella" per visualizzare i dati in un formato foglio di calcolo. Clicca su "salva con nome" per salvare e il nome del lavoro come .xlsx file.
  2. Ripetere il punto 4.1 per il saggio di attività OB (cioè, H-etichettato) campioni e controllare i file di dati LMD.
    NOTA: assicurarsi di sostituire tutti i riferimenti alla fagocitosi con riferimenti ad attività di OB.

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Representative Results

attività intensa e prolungata ha effetti profondi sulla funzione immunitaria innata, tra cui la funzione Natural Killer delle cellule, la risposta dei macrofagi citochina-mediata alle infezioni virali, e granulociti e monociti fagocitosi e l'attività OB. Diversi studi indicano che i granulociti e monociti fagocitosi aumenta in modo significativo post-esercizio, che riflettono l'infiammazione indotta da danno muscolare e richieste metaboliche. Al contrario, granulociti e monociti OB attività diminuisce post-esercizio e può essere un indicatore immunitario di una maggiore suscettibilità alle infezioni. Ad esempio, la Figura 1 mostra che fagocitosi di S. aureus da granulociti è aumentata immediatamente e 1,5 ore dopo un 75-km in bicicletta attacco (70% VO2max), tornando alla normalità entro la mattina successiva. Monociti fagocitosi è analogamente interessato da questo livello di esercizio. La Figura 2 mostra che l'attività granulociti OB è diminuzioned per almeno 21 ore dopo 75 km in bicicletta. l'attività dei monociti OB è anche diminuito dopo 75 km in bicicletta.

Granulociti e monociti fagocitosi di S. aureus, ma non granulociti e l'attività OB monociti, sono correlati ai biomarcatori dell'infiammazione sistemica figura 3 mostra la modesta correlazione tra granulociti fagocitosi e siero proteina C-reattiva (CRP) livelli (Pearson prodotto-momento di correlazione;. r = 0.44; P <0,01 ) in 106 donne in sovrappeso / obese. Siero CRP è anche correlata a monociti fagocitosi di S. aureus (Pearson prodotto-momento di correlazione; r = 0.30; P <0,01). Inoltre, neutrofili nel sangue / conta dei leucociti (Pearson prodotto-momento di correlazione; r = 0,62 er = 0,61, rispettivamente; p <0.001), indice di massa corporea (Pearson prodotto-momento di correlazione; r = 0,50 er = 0,40, rispettivamente; P <0.001), i livelli di insulina nel siero (r = 0,30 er =0,23; p <0,03), e nel sangue i livelli di A1c (Pearson prodotto-momento di correlazione; r = 0,28 er = 0,21, rispettivamente; p <0.04) sono correlati a granulociti e monociti fagocitosi di S. aureus. In generale, questi dati indicano che l'alta granulociti e monociti fagocitosi in soggetti riposo è indicativo di infiammazione sistemica.

Figura 1
Figura 1: granulociti fagocitosi è influenzato da esercizio di resistenza intenso granulociti fagocitosi aumentato immediatamente e 1,5 ore dopo un 75-km in bicicletta incontro al 70% del VO2max.. Con 21-ore post-esercizio, granulociti fagocitosi tornato leggermente al di sotto dei livelli pre-esercizio. * indica diverso dal pre-esercizio (misure ripetute ANOVA con l'analisi post-hoc abbinato t-test, se del caso; N = 19; p <0.05). I valori sono meun errore standard ±. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

figura 2

Figura 2:. Granulociti ossidativo Attività Burst è interessato da una intensa attività scoppio granulociti ossidativo Endurance esercizio è diminuito immediatamente, 1,5 ore, e 21-ore dopo un 75-km in bicicletta incontro al 70% del VO2max. * indica diverso dal pre-esercizio (misure ripetute ANOVA con l'analisi post-hoc abbinato t-test, se del caso; N = 19; p <0.05). I valori sono media ± errore standard. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.

. Figura 3: granulociti Fagocitosi è correlata con infiammazione sistemica in sovrappeso donne / obese granulociti fagocitosi è stata correlata alle proteine ​​del siero C-reattiva, un biomarker ampiamente accettata di infiammazione sistemica (Pearson prodotto-momento di correlazione; N = 87; r = 0.44; P <0.01). Fate clic qui per vedere una versione più grande di questa figura.

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Discussion

Questo manoscritto fornisce un protocollo passo-passo per la determinazione di due indicatori di granulociti e monociti funzione. Abbiamo identificato alcuni punti che sono fondamentali per il successo di questo test. Un tale passo è l'incubazione bagno di ghiaccio che si verifica immediatamente prima dell'aggiunta di batteri. raffreddamento completa di tutti i campioni minimizzerà l'effetto della temperatura sull'attività fagocitosi e OB. Un altro punto critico è l'aggiunta di batteri per ogni campione. A 8: 1 batteri: rapporto fagocita produce risultati ottimali; tuttavia altri ricercatori possono trovare che questo rapporto dovrà essere modificato per produrre risultati utili. Un altro passo importante è l'uso di RBC lisi e reagenti di fissaggio WBC per lisare i globuli rossi e globuli bianchi risolvere. L'uso di questo tali reagenti assicura la completa lisi dei globuli rossi e consente ai ricercatori di archiviare in modo sicuro i campioni trattati a 4 ° C per una notte, e poi correre attraverso il citofluorimetro il giorno successivo. lavoro precedente (inedito) indicAtes che RBC lisi e fissaggio WBC possono essere utilizzati per ritardare la citometria a flusso di campioni fissati da ben 12 ore senza compromettere l'integrità dei dati.

Questa procedura può essere facilmente modificato per soddisfare le capacità e interessi del ricercatore, ma va sottolineato che l'ottimizzazione è necessaria quando adattamenti sono fatti. Alcuni degli adattamenti più comuni che sono stati segnalati sono ai batteri bersaglio, l'etichetta / sonda, e il tempo di incubazione. I ricercatori hanno prodotto risultati eccezionali, quando Escherichia coli 7,8 viene utilizzato al posto di S. aureus come patogeno bersaglio (sia in rapporto 8: 1). Un fungo, come Saccharomyces cerevisiae, può anche essere indicato come sostituto per E. coli. Inoltre, i ricercatori spesso utilizzano una sonda molecolare pH-sensibile, 7,12 anziché FITC, come la sonda per la fagocitosi. Allo stesso modo, le sonde diverso da ciò che sono comunemente usati per misurare l'attività OB, sapg dichlorofluorescin diacetato (DCF-DA) e 10 diidrorodamina 123 (DHR). 13 i tempi di incubazione riportati variano da 20 min a 120 min, con 12,14,15 McFarlin segnalazione che il tempo di risposta massima può variare a seconda di destinazione batterica. 7 Dovrebbe anche notare che i tempi di incubazione ottimali possono variare tra gli aspetti fagocitosi e OB del test. 7

Come per tutti i test di laboratorio, la risoluzione dei problemi può essere necessario quando si stabilisce questa tecnica in un nuovo ambiente di ricerca. Gli autori suggeriscono che l'ottimizzazione dei batteri: rapporto fagocita è la chiave del successo per questo test. Gli autori fanno notare, inoltre, che i dati da un campione devono essere scartati dall'analisi se meno del 80% delle cellule nella popolazione granulociti da un partecipante non-malati sono FITC positivo; in questa situazione, il campione può essere ri-raccolto e rianalizzato, se possibile.

Ci sono alcune limitazioni algranulociti e monociti fagocitosi e saggio di attività OB descritte in questo manoscritto. Una tale limitazione è l'uso esclusivo di FSC e SSC di identificare le popolazioni di cellule di interesse. L'uso di marcatori di superficie cellulare consentirebbe ai ricercatori di identificare positivamente popolazioni cellulari. 10 Tuttavia, l'aggiunta di questa funzionalità richiederebbe più di un flusso base citometro, ed è quindi oltre la portata di questo manoscritto. Un'altra limitazione di questo saggio è che si basa sulla efficacia del trypan blu per estinguere la fluorescenza delle sonde che non sono stati internalizzati dalle cellule immunitarie di interesse. Una sonda molecolare 7,12 pH-sensibile può essere utilizzata come alternativa al FITC in situazioni in cui internalizzazione è una preoccupazione. Poiché tale sonda è solo fluorescente in ambienti acidi, come quelli in vescicole endocitiche, la fluorescenza realizzato rappresenta solo particelle internalizzate. Inoltre, diversi ricercatori hanno criticato il test corrente perché farees non includere una serie parallela di campioni che viene incubata in acqua ghiacciata invece che a 37 ° C per controllare per attività delle cellule immunitarie basale. In diverse occasioni, abbiamo incluso questa "condizione di ghiaccio" quando si esegue il test di granulociti e monociti fagocitosi e l'attività OB, e abbiamo trovato che non migliora in modo significativo la qualità dei dati (non pubblicati).

In sintesi, questo manoscritto descrive una tecnica per misurare la fagocitosi e OB attività nei granulociti e monociti. Questo è un semplice, test semplice che può essere facilmente modificato per tenere conto di capacità di laboratorio e interessi di ricerca. In esercizio sulla scienza e la ricerca di obesità legati, questa misura della funzione immunitaria innata permetterà al ricercatore di esplorare gli effetti di molti potenziali contromisure, tra cui la perdita di peso, l'uso di supplemento, interventi dietetici, e altri cambiamenti dello stile di vita. Su padronanza questa tecnica, i ricercatori saranno in grado di monitorare acutae cambiamenti cronici nella funzione delle cellule immunitarie in risposta alla dieta, esercizio fisico, e molti altri stimoli.

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Acknowledgments

Gli autori vorrebbero riconoscere Zack Shue, Casey John, e Lynn Cialdella-Kam per la loro assistenza durante l'ottimizzazione di questa procedura.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
12 x 75 mm tubes, with cap VWR 20170-579 You will need 2 tubes per sample ("H" and "F") plus 3 tubes per batch (for assay controls; "F", "H", and "Blood only").
PBS (10x), pH 7.4 Life Technologies 70011-044
Bottle top 0.2 µm cellulose acetate filter (500 ml capacity) Fisher Scientific 09-741-07 
Glucose, powder Life Technologies 15023-021
Citric acid (anhydrous, cell culture tested, plant cell culture tested) Sigma-Aldrich C2404-100G
Sodium citrate tribasic dihydrate Sigma-Aldrich S4641-25G
Dihydroethidium (Hydroethidine) (HE) Life Technologies D11347
Dimethyl sulfoxide (DMSO) Anhydrous Life Technologies D12345
Staphylococcus aureus (Wood strain without protein A) BioParticles, fluorescein conjugate (FITC) Life Technologies S2851
Staphylococcus aureus (Wood strain without protein A) BioParticles, unlabeled Life Technologies S-2859
Trypan Blue Solution, 0.4% Life Technologies 15250-061
4.0 ml vacutainer containing 7.2 mg K2EDTA, spray-dried VWR BD367861 You will need 1 K2EDTA blood collection tube per sample.
4.0 ml vacutainer containing 68 USP units Lithium Heparin, spray-coated VWR BD367884 You will need 1 Lithium Heparin blood collection tube per sample.
COULTER Ac·T 5diff CP Beckman Coulter 6605705 i.e., hematology analyzer
COULTER Ac·T 5diff Rinse Beckman Coulter 8547167
COULTER Ac·T 5diff Fix Beckman Coulter 8547171
COULTER Ac·T 5diff WBC Lyse Beckman Coulter 8547170
COULTER Ac·T 5diff Hgb Lyse Beckman Coulter 8547168
COULTER Ac·T 5diff Cal Calibrator Beckman Coulter 7547175
COULTER Ac·T 5diff Control Plus Beckman Coulter 7547198
AcT 5diff Diluent Beckman Coulter 8547169
200 µl extended-length pipette tips VWR 37001-526
Insulated ice pan VWR 89198-980 For ice water bath.
Open metal tube rack VWR 60916-702
Fetal Bovine Serum Life Technologies 26140-111
TQ-Prep Workstation Beckman Coulter 6605429 i.e., automated cell lyse preparation workstation
ImmunoPrep Reagent System Beckman Coulter 7546999 i.e., RBC lyse/WBC fix reagent system
Cytomics FC500 MCL Flow Cytometry System with CXP Software Beckman Coulter 626553
IsoFlow Sheath Fluid Beckman Coulter 8547008
COULTER CLENZ Beckman Coulter 8546929
Flow-Check Fluorospheres  Beckman Coulter 6605359 i.e., alignment and fluidics verification fluorospheres
FlowJo Software FlowJo FlowJo i.e., flow cytometry analysis software
Excel Software Microsoft Microsoft Excel i.e., electronic spreadsheet program

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References

  1. Nieman, D. C., et al. Influence of pistachios on performance and exercise-induced inflammation, oxidative stress, immune dysfunction, and metabolite shifts in cyclists: a randomized, crossover trial. PLoS One. 9, e113725 (2014).
  2. Knab, A. M., et al. Effects of a freeze-dried juice blend powder on exercise-induced inflammation, oxidative stress, and immune function in cyclists. Appl Physiol Nutr Metab. 39, 381-385 (2014).
  3. Konrad, M., et al. The acute effect of ingesting a quercetin-based supplement on exercise-induced inflammation and immune changes in runners. Int J Sport Nutr Exerc Metab. 21, 338-346 (2011).
  4. Nieman, D. C., et al. Immune and inflammation responses to a 3-day period of intensified running versus cycling. Brain Behav Immun. 39, 180-185 (2014).
  5. Nieman, D. C., et al. Carbohydrate supplementation affects blood granulocyte and monocyte trafficking but not function after 2.5 h of running. Am J Clin Nutr. 66, 153-159 (1997).
  6. Tidball, J. G. Inflammatory cell response to acute muscle injury. Med Sci Sports Exerc. 27, 1022-1032 (1995).
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Immunologia fagocitosi burst ossidativo monociti granulociti l'immunità innata citometria a flusso
Misurazione dei granulociti e dei monociti fagocitosi e ossidativo attività Burst nel sangue umano
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Meaney, M. P., Nieman, D. C.,… More

Meaney, M. P., Nieman, D. C., Henson, D. A., Jiang, Q., Wang, F. Z. Measuring Granulocyte and Monocyte Phagocytosis and Oxidative Burst Activity in Human Blood. J. Vis. Exp. (115), e54264, doi:10.3791/54264 (2016).

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