Introduction
De weerstand van het centrale zenuwstelsel (CNS) aandoeningen (bijv. Kanker, epilepsie, depressie, schizofrenie en HIV-geassocieerde neurologische aandoening) farmacologische therapieën door verschillende mechanismen, met inbegrip van zware geneesmiddelpermeatie over de bloed-hersenbarrière (BBB) . De BBB is de grens die hersenweefsel van de stoffen in het bloed isolaten. Binnen deze barrière, een laag brein microvasculaire endotheelcellen (BMECs), ondersteund door pericyten en astrocyten eindvoetjes van astrocyten, verantwoordelijk voor de hoge selectiviteit van de BBB die oplosbare geneesmiddelen met een molecuulgewicht hoger dan 400 Da 1. Andere drugsgebruik resistentiemechanisme is gekoppeld aan de aanwezigheid op BMECs geneesmiddel efflux transporters (P-glycoproteïne en multidrug resistentie eiwitten), die samenwerken om geneesmiddelpenetratie te reduceren tot het CNS en het vergemakkelijken van de extrusie hersenen 2.
In het laatste decenniumEen groot aantal nanotechnologische benaderingen ontwikkeld om de klinische en biologische uitdaging van het leveren van geneesmiddelen over de BBB 3-6 voldoen. In deze context, ferritine nanobolletjes (FNN) vertegenwoordigen een volledig innovatieve en veelbelovende oplossing. FNN zijn 12 nm bolletjes van 24 zelfassemblerende ferritine (Fn) monomeren, die zijn aangebracht in een holle sferische structuur van 8 nm binnendiameter. Ferritin subeenheden kan worden gedemonteerd bij zure pH en weer in elkaar gezet in een vorm-geheugen mode door aanpassing van de pH tot neutraal, waardoor verschillende organische moleculen in te kapselen. Daarom FNN vormen een interessant model voor de ontwikkeling van multifunctionele geneesmiddelafgiftesystemen 7,8. Bovendien kunnen FNN interageren met BMECs door de specifieke herkenning van transferrinereceptor (TfR) 1, die is uitgedrukt op het luminale membraan van deze cellen 9.
Tot dusver verschillende in vitro modellen van de BBB ontwikkeld in order om trans-BBB permeabiliteit toe te lichten om verschillende drugs, toxiciteit in de richting van de BBB of de interactie van moleculen met efflux transporters. Sterker nog, zijn deze modellen als geldig beschouwd in vitro benaderingen voor een snelle screening van actieve moleculen alvorens in vivo studies. Deze modellen bestaan uit één endotheliale laag BMECs of samen gekweekt BMECs en astrocyten (zeldzamer pericyten), verkregen uit dierlijke (rat, muis, varken en rund) of humane cellijnen 10,11,12. De transendotheliale elektrische weerstand (TEER) en de schijnbare permeabiliteit (P app) van tracers met een bepaald molecuulgewicht stellen twee belangrijke parameters die worden gebruikt om de kwaliteit van het in vitro model te bepalen. Hier beschrijven we de tewerkstelling van een BBB in vitro model, gebaseerd op een co-cultuur van rat BMECs (RBMECs) en rat corticale astrocyten (RCA) naar de trans-BBB doordringen van ferritine nanocages inkapselen fluoresceïne isothi bestuderenocyanate (FITC).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Vaststelling van de BBB Model
Opmerking: Voor de vaststelling van de BBB-model dat we raden u aan in de handel verkrijgbare primaire RBMECs en RCA. Alle stappen moeten worden uitgevoerd met steriele reagentia en disposables, behandeld in een laminaire stroming kap.
- Cel cultuur
- Coat celkweekkolven met poly-L-lysine 100 ug / ml (1 uur bij KT) of fibronectine 50 ug / ml (1 uur bij 37 ° C) naar de verbinding van RCA of RBMECs bevorderen, respectievelijk. Vervolgens dooi 1 x 10 6 RCA en 5 x 10 5 RBMECs in endotheelcellen Medium, aangevuld met 5% foetaal runderserum, 1% endothele celgroei toeslag en 1% penicilline / streptomycine (SECM). Zaad RCA in een T175 kolf in 20 ml SECM en RBMECs in een T75 kolf in 10 ml SECM.
Opmerking: Het ontdooien en zaaien passages van RCA en RBMECs moeten worden aangepast in termen van celdichtheid en tijd in kweek, volgens het aantal experimentele condities te testen met de BBB model. door starting met 1 flacon 1 x 10 6 RCA en 1 flesje van 5 x 10 5 RBMECs, kan men verkrijgen tot 20 BBB-dragende inserts. - Handhaaf de cellen bij 37 ° C en 5% CO2 in een vochtige atmosfeer gedurende ongeveer 6 dagen, tot ongeveer 80% confluentie voor RCA en meer dan 90% confluentie voor RBMECs. Los cellen met behulp van trypsine-EDTA-oplossing (trypsine 1: 250) gedurende 5 minuten (1 ml trypsine T75 flessen en 2 ml voor T175 kolven). Stop trypsine activiteit SECM (2: 1), centrifuge celsuspensies bij 750 xg gedurende 5 minuten en resuspendeer de pellets in 60 ml SECM.
- Splits de RBMECs in 3 T175 kolven en cultuur in SECM voor nog eens 3 dagen voor het zaaien op inserts. Tel het totale aantal levende RCA, door het observeren van een celsuspensie verdund 1: 1 met trypan blauw onder een optische microscoop in een Burker kamer.
- Coat celkweekkolven met poly-L-lysine 100 ug / ml (1 uur bij KT) of fibronectine 50 ug / ml (1 uur bij 37 ° C) naar de verbinding van RCA of RBMECs bevorderen, respectievelijk. Vervolgens dooi 1 x 10 6 RCA en 5 x 10 5 RBMECs in endotheelcellen Medium, aangevuld met 5% foetaal runderserum, 1% endothele celgroei toeslag en 1% penicilline / streptomycine (SECM). Zaad RCA in een T175 kolf in 20 ml SECM en RBMECs in een T75 kolf in 10 ml SECM.
- Cel zaaien op Inserts
- Behandel een zijde van de polyethyleen tereftalaat (PET) membraan van 6 multiwell-tranent inzetstukken met poly-L-lysine 100 ug / ml en de andere kant met fibronectine 50 ug / ml, bij bevestiging van RCA en BMECs mogelijk. Behandel de inzetstukken met een pincet om contact met de PET-membraan te voorkomen.
- Plaats de inserts in een plaat met 6 putjes en voeg fibronectine-oplossing (minimum 500 ui) in de bovenste kamer. Na 1 uur incubatie bij 37 ° C, verwijder de fibronectine oplossing, neemt de inzetstukken van de multiwell-plaat en zet ze ondersteboven op de bodem van een 150 cm2 petrischaal, die hier wordt gebruikt als een steriele drager voor de al gecoate wisselplaten.
- Voorzichtig voeg 800 pl poly-L-lysine op de onderzijde van het inzetstuk (zie figuur 1A, genoemd zaaien RCA), en houdt de oplossing op de inzetstukken voor 1 uur bij KT.
- Verstuif de oplossing en laat de inserts drogen bij kamertemperatuur gedurende 15-30 min. De inzetstukken zijn nu klaar voor zaaien van cellen, maar kan ook worden opgeslagen in de multi-well plaat een aantaldagen bij 4 ° C, alvorens de BBB-constructie.
Opmerking: Probeer tenminste 3 beklede inserts vrij te houden van cellen, worden gebruikt als controles om BBB inrichting valideren door FD40 fluxmetingen.
- Zaad RCA (35.000 / cm2) op de onderzijde van de poly-L-lysine beklede inserts, druppelsgewijs 800 gl celsuspensie op de omgekeerde insert (Figuur 1A). Laat de RCA vering van de inzetstukken voor 4 uur bij KT, om efficiënte hechting van de cellen aan het membraan mogelijk.
- Zuig de residuele oplossing, plaats de inserts in putjes die 2 ml SECM en onderhouden van de multiwell-plaat bij 37 ° C en 5% CO2 in een vochtige atmosfeer, verandert de SECM elke 2 dagen.
- Na 3 dagen, als de RCA hebben bekleed de onderkant van het inzetstuk, zaad RBMECs op de bovenzijde van het inzetstuk, de volgende stappen:
- Maak RBMECs van T175 kolven en tel hettotale levende cellen, zoals in stappen 1.1.2 en 1.1.3.
- Zaad RBMECs (60.000 / cm 2) op het bovenoppervlak van het inzetstuk in SECM (1000 pl) (Figuur 1B), waardoor 3 inzetstukken met alleen de astrocyten voor gebruik als TEER achtergrond. Plaats de plaat met meerdere holtes in standaard kweekomstandigheden. De systeem-cultuur gedurende ten minste 3 dagen, veranderen de SECM in de binnen en onderkamer elke 2 dagen.
- Behandel een zijde van de polyethyleen tereftalaat (PET) membraan van 6 multiwell-tranent inzetstukken met poly-L-lysine 100 ug / ml en de andere kant met fibronectine 50 ug / ml, bij bevestiging van RCA en BMECs mogelijk. Behandel de inzetstukken met een pincet om contact met de PET-membraan te voorkomen.
2. BBB Validation
- TEER Measurement
- Op de 3e dag van co-cultuur, check de TEER door het invoegen van de BBB-dragende inserts in een geschikte kamer (dat heeft een pet en waar zowel de kamer en de dop bevatten een paar voltage-sensing en stroomelektrodes), gevuld met 4 ml SECM. Verbinding maken met een epitheelweefsel volt / ohmmeter.
- Samen met de TEER afmetingen van de cel BBB-systemen, noteer de TEER waarden van de 3 inserts met het RCA thop zal worden afgetrokken van de waarden verkregen met de BBBs. Vermenigvuldig het resulterende TEER waarden door het oppervlak van het inzetstuk (4,2 cm2) om de resultaten Ω cm x 2 drukken.
- Vanuit de 3e dag van co-cultuur, het meten van de TEER elke dag. Opmerking: Na een eerste periode waarin de TEER toeneemt, moet de geregistreerde waarden stabiel gedurende ten minste twee opeenvolgende dagen (meestal tussen de 5e en de 7e dag van co-kweek). Op dat punt is de BBB is klaar voor de tweede stap van de validatie (paragraaf 2.2) en / of voor de trans-BBB experimenten.
Opmerking: de in paragraaf 2.1 beschreven procedure kan worden uitgevoerd op dezelfde BBB-systemen gewijd aan de volgende permeabiliteit experimenten (deel 3). Werken onder steriele omstandigheden.
- Trans-BBB Flux van FITC-dextran 40 (FD40)
- Meet de FD40 flux van de bovenste naar de onderste kamer van de BBB modellen vergeleken met die over 3 lege inserts(Zie de opmerking van paragraaf 1.2.1) volgens de volgende stappen:
- Voeg 1 mg / ml FD40 (verdund in SECM) in het bovenste compartiment van de BBBs, en na 1, 2 en 3 uur trekken 200 gl SECM van de onderste kamer en meet de fluorescentie-intensiteit van spectrofluorimeter (λ ex 488 nm, λ em 515 nm, spleet 5).
- Haal de waarden voor SECM achtergrond fluorescenceby van 500 ul maagd medium met dezelfde analytische parameters. Trek de SECM achtergrond fluorescentie van alle FD40 fluorescentie waarden.
- Bepaal de hoeveelheid doordrongen FD40 ten opzichte van de waargenomen fluorescentie waarden met een ijkkromme bereid met bekende concentraties (bijv. 0,312, 0,625, 1,25, 2,5 ug / ml) van de fluorescerende tracer opgelost in 500 pl SECM.
- Bereken de schijnbare permeabiliteit coëfficiënt (P app) vanaf het gemiddelde flux waarden op:
P app = J / AC
(cm2) en C is de concentratie van het molecuul in het bovenste compartiment (mol / cm 3).
Opmerking: Drie of meer BBB-systemen die geschikt zijn TEER waarden hebben bereikt, mogen uitsluitend worden besteed aan deze validatie procedure, en mag niet worden gebruikt voor de volgende permeabiliteit experimenten (deel 3). Steriliteit is niet verplicht.
- Meet de FD40 flux van de bovenste naar de onderste kamer van de BBB modellen vergeleken met die over 3 lege inserts(Zie de opmerking van paragraaf 1.2.1) volgens de volgende stappen:
3. Trans-BBB Permeatie van FITC-loaded Ferritins (FNN)
Opmerking: Een recombinant variant van humaan ferritine (Fn), geproduceerd in Escherichia coli en geassembleerd in nanocages (FNN) voor het inkapselen van verschillende fluorescerende moleculen, is verkrijgbaar bij de NanoBioLab van Prof. Prosperi (Universiteit van Milaan-Bicocca, Italië). FNN worden geladen met FITC volgens een eerder beschreven protocol 13 en de concentraties van zowel Fn en de geladen moleculen nauwkeurig determined.
- Trans-BBB Flux van FITC en FITC-FNN
- Meet de FITC-FNN flux van de bovenste naar de onderste kamer van gevalideerde BBB modellen (meestal op de 5e - 7e dag van co-kweek), vergeleken met die van de vrije kleurstof na 7 en 24 uur incubatie, volgens de volgende stappen:
- Add FITC-FNN (50 ug / ml FNN, 1,1 uM FITC) of een gelijke hoeveelheid vrije FITC in de bovenste kamer van ten minste 6 BBB systemen voor elke formulering, om 2 ml SECM oplossing onttrekken aan de onderste kamer van tenminste 3 inserts na 7 uur, en de onderste kamer van andere inzetstukken 3 na 24 uur.
- Meet de fluorescentie-intensiteit van 500 pl van de verzamelde monsters van spectrofluorimeter (λ ex 488 nm, em 515 nm λ, spleet 5).
- Het verkrijgen van de SECM achtergrond fluorescentie door het meten van 500 ul van medium met dezelfde analytische parameters. Trek de SECM achtergrond fluorescentieuit alle FITC of FITC-FNN fluorescentie waarden.
- Bepaal de concentratie van gepermeëerde of FITC FITC-FNN door vergelijking van de verkregen fluorescentiewaarden met twee verschillende kalibratiecurven gemaakt met bekende concentraties (bijv. 6,87, 13,75, 27,5, 55 nM) van de vrije of nanoformulated kleurstof opgelost in 500 pi SECM.
- Meet de FITC-FNN flux van de bovenste naar de onderste kamer van gevalideerde BBB modellen (meestal op de 5e - 7e dag van co-kweek), vergeleken met die van de vrije kleurstof na 7 en 24 uur incubatie, volgens de volgende stappen:
- FITC-FNN Localization in RBMECs
- Verwijderen SECM uit de bovenste kamer van de BBB systemen, was de inzetstukken met PBS en bevestig de RBMECs op tenminste twee inzetstukken per proefgroep door toevoeging van 500 pi paraformaldehyde (4% in fosfaatbuffer zoutoplossing-PBS) in het bovenste compartiment 10 min bij kamertemperatuur.
- Was de inzetstukken driemaal met PBS om resten te verwijderen paraformaldehyde.
Opmerking: Vanaf dit punt, steriliteit niet nodig. - Snij geschikte stukken van de PET-membraan, en ga verder met de immunodecoration van de cellen volgens de volgende stappen:
- Permeabilize RBMECs met 0,1% Triton X-100 in PBS gedurende 10 minuten. Voer een blokkeringsstap gedurende 1 uur bij kamertemperatuur met een oplossing die 2% runderserumalbumine (BSA), 2% geit serum in PBS. Incubeer de monsters met een anti-Von Willebrand factor (VWF) aan 1:20 verdunning gedurende 2 uur bij KT.
- Na driemaal wassen met PBS, blootstellen van de cellen gedurende 2 uur bij KT een 2% BSA, 2% geitenserum oplossing die een geschikt secundair antilichaam bij een 1: 300 verdunning om de anti-VWR en DAPI een onthullen 1: 1500 verdunning voor kernen detectie.
- Monteer de inzetstukken op microscoop dia's met behulp van een antifade montage-oplossing (een druppel per insert fragment), sluit het monster met een deksel slip. Analyseer door confocale microscopie met behulp van een olie-immersie lens op 40x vergroting, 1,5 zoom en 1024 x 1024 pixels resolutie.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Tijdens het opzetten van de BBB model, celhechting en groei op de inzetstukken kunnen worden geanalyseerd met een lichtmicroscoop door het transparante karakter van de PET membranen. RCA, geënt bij een dichtheid van 35.000 cellen / cm2, hechten efficiënt de onderzijde van het inzetstuk na 4 uur incubatie bij kamertemperatuur (Figuur 2A) en groeien aan het membraanoppervlak bedekken in 3 dagen, nemen een spoelvormige morfologie (Figuur 2B). RBMECs, geënt bij een dichtheid van 60.000 cellen / cm2, zijn zichtbaar bevestigd aan het bovenvlak van de PET membraan na ongeveer 3 uur incubatie bij 37 ° C (Figuur 2C). De ontwikkeling RBMEC laag kan moeilijk te visualiseren via volgende dagen met een optische microscoop, vanwege de overlap met de onderliggende laag RCA (figuur 2D).
Een correcte bevestiging van de BBB model vereist altijd TEER meten en dit kan worden bevestigd door de evaluatie van de trans-BBB P app van een lage doorlatendheid tracer, zoals FD40.
De TEER waarden, opgenomen over de co-cultuur periode, vormen de eerste duidelijke indicatie van de juiste vorming van de endotheliale barrière. Drie dagen na RBMEC zaaien, het opgenomen TEER, afgetrokken van de TEER van de astrocyten-dragende inserts, is vooral te danken aan de bijdrage van de niet-elektrogene laag van RCA en het ontwikkelen laag RBMECs. Op dit tijdstip, ons BBB geeft waarden variërend tussen 20 en 40 Ω cm x 2. Tijdens de volgende dagen, meestal tussen de 4 e en de 5 e dag van co-cultuur, de TEER waarden nemen door vorming van tight junctions tussen aangrenzende endotheelcellen 14 en bereikte waarden gewoonlijk tussen 55 en 110 Ω x cm 2, en in uitzonderlijke gevallen higher waarden 14. De waarden gemeten op de 4 e / 5 e dag van co-kweek stabiel blijven ten minste tot de 7e - 8e dag voordat ze beginnen te dalen; Daarom is er een zeer korte tijdspanne beschikbaar voor het uitvoeren van de trans-BBB flux experimenten.
Tussen de 5e en de 7e dag van co-cultuur, kan de integriteit van de experimentele modellen worden bevestigd door onderzoek van de FD40 trans-BBB permeabiliteit. Figuur 3 toont een voorbeeld van de trans-BBB flux van FD40 (1 mg / ml ), vergeleken met de flux over lege inserts gedurende 3 uur incubatie; de BBBs zijn op de 6e dag van co-cultuur en de opgenomen TEER is 55,6 ± 15,8 Ω cm 2 (gemiddelde ± SE, n = 3). De flux is lineair tussen 1 en 3 uur incubatie en de gemiddelde P app berekend tussen 1 en 2 uur en tussen 2 en 3 uur van incubatie0,12 ± 0,01 x 10-6 cm s - 1 (± SE, n = 6).
Zodra ten minste drie opeenvolgende succesvolle BBBs, in termen van TEER en FD40 P app, zijn verkregen in onafhankelijke experimenten het meten van de tracer permeabiliteit kan worden vermeden; De TEER moet altijd worden opgenomen voor elk experiment.
De trans-BBB permeabiliteit van fluorescerende moleculen en het effect van de Nanokompleks hun levering kan worden onderzocht met ratten BBB modellen beschreven. Figuur 4 toont de permeatie van het model kleurstof FITC na inkapseling in FNN over BBBs met TEER van 100,4 ± 3,5 Ω cm 2 (n = 16) en 7 e dag van co-cultuur. De histogrammen die FITC concentratie in de onderste kamer 7 en na 24 uur van de toevoeging van vrij of kleurstof nanoformulatedin het bovenste compartiment, aan dat Fnn kan significant de levering van FITC over de BBB.
Confocale microscoop foto van de bovenzijde van het inzetstuk na 7 en 24 uur incubatie met FITC-FNN (Figuur 5A, C) of FITC (Figuur 5B, D) blijkt dat hoewel vrij FITC niet wordt geïnternaliseerd door de RBMECs, het vullen van de FNN maakt het mogelijk om de cellen binnen te dringen.
Voordat het verwerken van de inzetstukken voor confocale microscopie, een extra controle van de TEER is noodzakelijk om ervoor te zorgen dat er geen FNN-gemedieerde effecten op BBB integriteit.
Figuur 1:. Cell Seeding op Inserts RCA (A) en RBMEC (B) plaatsingsprocedure op de twee tegenoverliggende zijden vande multi-well plaat inserts. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2:. Optische microscoop Beelden van RCA en RBMVECs op Inserts Inserts bezaaid met RCA en RBMECs worden waargenomen met een lichtmicroscoop (20x optische zoom). (A) Vier uur na enten rond en doorschijnend RCA zijn zichtbaar aan de onderkant van het inzetstuk; (B) spoelvormige RCA zijn zichtbaar op de 3e dag van de cultuur; (C) Rond en doorschijnend RBMECs zijn bevestigd aan de bovenzijde van het inzetstuk na 3 uur incubatie; (D) Op 4 dagen van co-kweek beide oppervlakken van het inzetstuk volledig bedekt met cellen, en de twee lageners zijn niet gemakkelijk te onderscheiden. Schaal bar = 100 micrometer. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3:. FD40 Flux over de BBB Flux van FD40 (1 mg / ml) vanaf de bovenste naar de onderzijde van de BBB in vitro systeem, vergeleken met die in de lege insert. De hoeveelheid FD40 in onderkamer is geschat op 60, 120 en 180 min na de toevoeging van de kleurstof aan de bovenste kamer. Gemiddelden ± SE; n ° voegt = 3. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4: Effect van Fnn Inkapseling op FITC permeatie door de BBB concentratie van FITC in de onderste kamer van de BBB in vitro systeem berekend 7 en 24 uur na toevoeging van FITC FITC-of FNN in de bovenste kamer.. De gemiddelde ± SE van 4-5 repliceert; **** P <0,0005, FITC-FNN vs. FITC (t-toets). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 5: Confocale microscopie van RBMECs op Inserts Confocale laser scanning microscopie microfoto (enkele optische delen) van RBMECs na 7 uur (A, B) of 24 uur (C, D) incubatie met vrije FITC (B, C) of FITC. -FnN (A,
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De in vitro werkwijze beschreven een nuttig gevalideerd benadering van de trans-BBB levering van fluorescerende moleculen bij nanoformulation met nanodeeltjes bestuderen. Hier gebruiken we FNN, die een goede kandidaat voor de translocatie van lading moleculen over de BBB bestuderen vertegenwoordigt. FNN wordt beschouwd als de gouden nanovector voor trans-BBB afgifte van geneesmiddel / agentia aangezien het betrekking heeft op de TfR1 receptor, die tot expressie wordt gebracht op het luminale membraan van BMECs en bemiddelt de nanodeeltjes opname met een receptor-bemiddelde route wordt herkend. Bovendien FNN is een natuurlijke nanodeeltjes en heeft daarom een goede biocompatibiliteit profiel. Tenslotte Fnn kan laag dimensie wateroplosbare moleculen inkapselen door een eenvoudige en efficiënte mechanisme. De trans-BBB permeatie andere verschillende soorten organische of anorganische nanodeeltjes kunnen ook worden uitgevoerd met dit protocol, volgens enkele overwegingen over nanodeeltjes functies. eerste prerequisite de permeatie van nanoformulated drugs / middelen studie is de veiligheid van de leegte nanodeeltjes. Een ander cruciaal punt is de interactie van de onderzochte nanodeeltjes met de PET-filter. Dit aspect moet voorlopig worden geëvalueerd om een significante retentie in het membraan poriën te sluiten en te voorkomen dat veranderingen van de permeatie door de BBB. Onze fractie heeft onlangs in dienst van de voorgestelde strategie om een polymeer gecoate ijzeroxide nanodeeltjes te bestuderen als een trans-BBB systeem voor de fluorescentie-gelabelde antiretrovirale geneesmiddelen 14. In dat geval verbonden we elektronenmicroscopie lokalisatie van nanoformulations in RBMECs de fluorescentiedetectie. Bovendien zijn andere zeer gevoelige diagnostische methoden, zoals inductief gekoppeld plasma (ICP) -MS kunnen worden toegepast om de trans-BBB levering van anorganische nanosystemen evalueren.
De BBB in vitro model gebruikt in dit protocol is gebaseerd op co-cultuur van de rat BMECs en astrocyten. In de brede scenario van de BBB 10,11,12 modellen, waarvan sommige nauwkeurig in de literatuur beschreven met een goed gedetailleerd protocol 15, ons model vertegenwoordigt een goede kwaliteit alternatief. Zelfs al is het opgenomen TEER beneden het beste standaarden voorgesteld in de literatuur (150-200 Ω cm 2) 10, het trans-BBB permeabiliteit van de hoge dimensie tracer Dextran 40 is geheel in overeenstemming met de vorming van een dichte barrière.
Dit in vitro model, verkrijgbaar in de handel verkrijgbaar rat BMECs en astrocyten, heeft een aantal voordelen: (1) een optimale groei efficiëntie van de endotheliale cellen, (2) een geschikte tijdsperiode voor de productie van de uiteindelijke BBB model (niet langer dan 13 dagen), (3) de naleving van ethische problemen, vermijden van het gebruik van cellen uit menselijk hersenweefsel (autopsie materiaal, chirurgische specimens, en foetale weefsels) en 4) besparing van tijd en kosten voor stallen, en primairecellen extractie. Toch is een beperking van het huidige model in verband met de hoge kosten van niet-geïmmortaliseerde primaire RBMECs, die moet worden gekocht (ingevroren bij één passage) voor elke experimentele opstelling. Inderdaad, onze inleidende studies van BBB productie hebben aangetoond dat het vermogen van endotheelcellen een strakke BBB produceren strikt geassocieerd met het aantal passages in kweek van de RBMECs na de eerste post-aankoop ontdooien. Verdere uitvoering van de BBB model hier beschreven endotheliale supplementen, zoals cAMP en hydrocortison, kan worden overwogen om endotheliale dichtheid te verbeteren en TEER waarden. 10,11,16
De onderhavige techniek is gerelateerd aan de mogelijkheid om gebruik te maken van een model voor BBB verschillende assays, waardoor verschillende gegevenssets uit elke experimentele opstelling. Met één BBB systeem waarvoor vrije of nanocomplexed fluorescerende moleculen, is het mogelijk: (1) tot e metene trans-barrière flux van het molecuul door het analyseren van de fluorescentie-intensiteit van SECM monsters verzameld uit de onderste kamer op verschillende tijdstippen incubatietijd; (2) aan de nano-gemedieerde internalisatie van de moleculen in RBMECs en hun intracellulair verkeer door confocale microscopie analyse van de cellen op inserts onderzocht; (3) een indicatie van de toestand van de BBB cellen na blootstelling aan de nanoformulations komen, door het meten TEER aan het eind van het experiment of door analyse van endotheel integriteit van elektronenmicroscopie.
Concluderend Hier beschrijven we een protocol voor de studie van de permeatie van nanocomplexed fluorescente moleculen door een hoogwaardige BBB in vitro model. Wij beschouwen deze methode een nuttig instrument voor het onderzoeken van het effect van nanoformulation bij de levering van geneesmiddelen over de BBB.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Rat Brain Microvascular Endothelial Cells | Innoprot | P10308 | isolated from Sprague Dawley rat brain tissue, cryopreserved at passage one and delivered frozen |
| Cortical Astrocytes | Innoprot | P10202 | isolated from 2 days rat brain tissue, cryopreserved at passage one and delivered frozen. |
| Endothelial Cell Medium kit | Innoprot | P60104 | ECM (500 ml) and fetal bovin serum (25 ml), endothelial cell growth supplement (5 ml) and penicillin/streptomycin (5 ml). Warm in 37 °C water bath before use and protect from light |
| Trypsin-EDTA without Phenol Red | EuroClone | ECM0920D | Warm in 37 °C water bath before use |
| Fluorescein isothiocyanate-dextran 40,000 | Sigma | FD40S | protect from light |
| paraformaldehyde | Sigma | 158127 | diluition in chemical hood |
| Dulbecco's phosphate buffer saline w/o Ca and Mg | EuroClone | ECB4004L | |
| Triton X-100 | Sigma | T8787 | |
| bovine serum albumin | Sigma | A7906 | |
| goat serum | EuroClone | ECS0200D | |
| mouse monoclonal anti-Von Willebrand Factor | Dako | M0616 | |
| AlexaFluor 546-conjugated antibody against mouse IgGs | ThermoFischer Scientific | A-11003 | protect from light |
| DAPI (4’ ,6-diamidino-2-phenylindole) | ThermoFischer Scientific | D1306 | protect from light |
| ProLong Gold Antifade Mountant | ThermoFischer Scientific | P36934 | |
| Poly-L-lysine Hydrobromide | Sigma | P1274 | the same solution can be used several times |
| fibronectin from bovine plasma | Sigma | F1141 | the same solution can be used several times |
| Polyethylene terephthalate (PET) inserts | Falcon | F3090 | Transparent Polyethylene terephthalate (PET) membranes; surface area: 4.2 cm2; pore size 0.4 µm/surface area |
| T75 Primo TC flask | EuroClone | ET7076 | |
| T175 Primo TC flask | EuroClone | ET7181 | |
| EVOM2 Epithelial Tissue Volt/Ohmmeter | World Precision Instruments Germany | EVOM2 | |
| Endohm- 24SNAP cup | World Precision Instruments Germany | ENDOHM-24SNAP | |
| Light/fluorescence microscope with camera | Leica Microsystems | DM IL LED Fluo/ ICC50 W Camera Module | inverted microscope for live cells with camera |
| Confocal Microscope | Leica Microsystems | TCS SPE | |
| Spectrofluorimeter | Jasco | FP-8000 |
References
- Banks, W. A. Characteristics of compounds that cross the blood-brain barrier. BMC Neurol. 9 (1), 3 (2009).
- Löscher, W., Potschka, H. Drug resistance in brain disease and the role of efflux transporters. Nat Rev Neurosci. 6, 591-602 (2005).
- Xu, G., Mahajan, S., Roy, I., Yong, K. -T. Theranostic quantum dots for crossing blood-brain barrier in vitro and providing therapy of HIV-associated encephalopathy. Front Pharmacol. 15 (4), 140 (2013).
- Masserini, M. Nanoparticles for Brain Drug Delivery. ISRN Biochem. , (2013).
- Sagar, V., Pilakka-Kanthikeel, S., Pottathil, R., Saxena, S. K., Nair, M. Towards nanomedicines for neuroAIDS. Rev. Med. Virol. 24 (2), 103-124 (2014).
- Kreuter, J. Drug delivery to the central nervous system by polymeric nanoparticles: What do we know. Adv. Drug Deliver. Rev. 71, 2-14 (2014).
- Arosio, P., Ingrassia, R., Cavadini, P. Ferritins: a family of molecules for iron storage, antioxidation and more. Biochim. Biophys. Acta. 1790 (7), 589-599 (2009).
- Jääskeläinen, A., Soukka, T., Lamminmäki, U., Korpimäki, T., Virta, M. Development of a denaturation/renaturation-based production process for ferritin nanoparticles. Biotechnol. Bioeng. 102 (4), 1012-1024 (2009).
- Jefferies, W. A., Brandon, M. R., Hunt, S. V., Williams, A. F., Gatter, K. C., Mason, D. Y. Transferrin receptor on endothelium of brain capillaries. Nature. 312, 162-163 (1984).
- Deli, M. A., Abraham, C. S., Kataoka, Y., Niwa, M. Permeability studies on in vitro blood-brain barrier models: physiology, pathology, and pharmacology. Cell. Mol. Neurobiol. 25 (1), 59-127 (2005).
- Wilhelm, I., Fazakas, C., Krizbai, I. A. In vitro models of the blood-brain barrier. Acta Neurobiol. Exp. (Wars). 71, 113-128 (2011).
- Wilhelm, I., Krizbai, I. A. In vitro models of the blood-brain barrier for the study of drug delivery to the brain. Mol Pharm. 11 (7), 1949-1963 (2014).
- Bellini, M., et al. Protein nanocages for self-triggered nuclear delivery of DNA-targeted chemotherapeutics in Cancer Cells. J. Control. Release. 196, 184-196 (2014).
- Fiandra, L., et al. Nanoformulation of antiretroviral drugs enhances their penetration across the blood brain barrier in mice. Nanomedicine. 11 (6), 1387-1397 (2015).
- Molino, Y., Jabès, F., Lacassagne, E., Gaudin, N., Khrestchatisky, M. Setting-up an in vitro model of rat blood-brain barrier (BBB): a focus on BBB impermeability and receptor-mediated transport. J. Vis. Exp. , e51278 (2014).
- Perrière, N., et al. A functional in vitro model of rat blood-brain barrier for molecular analysis of efflux transporters. Brain Res. 1150, 1-13 (2007).
