Introduction
Сопротивление центральной нервной системы (ЦНС) , заболевания (т.е.. Рак, эпилепсия, депрессия, шизофрения и ВИЧ-ассоциированные неврологические расстройства) к фармакологической терапии из - за различных различных механизмов, в том числе трудного проникание лекарственного средства через гематоэнцефалический барьер (ГЭБ) , ВВВ является границей, которая изолирует ткани мозга от веществ, циркулирующих в крови. В пределах этого барьера, слой мозга микрососудистых эндотелиальных клеток (BMECs), поддержанный перицитов и астроцитов endfeet, отвечает за высокой селективности ВВВ до тех водорастворимыми препаратами с молекулярной массой выше , чем 400 Да 1. Другой механизм сопротивления , связанное с наркотиками связано с наличием на BMECs истече- наркотиков транспортеров (Р-гликопротеина и множественной лекарственной устойчивости белков), которые сотрудничают с целью уменьшения проникновения наркотиков в ЦНС и облегчить их выдавливание из мозга 2.
В последнее десятилетие, Большое количество нанотехнологических подходов были разработаны для удовлетворения клинической и биологической проблемой доставки лекарств через ВВВ 3-6. В этом контексте, ферритин наносферы (БНС) представляют собой совершенно инновационное и перспективное решение. FNn 12 нм сферы 24 самосборки ферритина (Fn) мономеров, которые расположены в полой сферической структуре 8 нм внутреннего диаметра. Ферритина субъединиц могут быть разобраны при кислом рН и вновь в моде памяти формы путем доведения рН до нейтральности, позволяя различные органические молекулы быть воплощен. Поэтому БНС представляют собой интересную модель для развития многофункциональной системы доставки лекарственных средств 7,8. Кроме того, БНС может взаимодействовать с BMECs благодаря специфическим узнаванием рецептора трансферрина (TfR) 1, который экспрессируется на полостной мембране этих клеток 9.
До сих пор, по- разному в пробирке моделей ГЭБ были разработаны в Ordeг выяснить транс-ВВВ проницаемость для различных препаратов, токсичность по отношению к ВВВ, или взаимодействия молекул с эффлюксных транспортеров. Действительно, эти модели считаются действительными в пробирке подходы для быстрого скрининга активных молекул , прежде чем приступить к исследованиям в естественных условиях. Эти модели состоят из одного эндотелиального слоя BMECs или совместно культивировали BMECs и астроцитов (реже перицитов), полученные от животных (крысы, мыши, свиньи и бычий) или клеточные линии человека 10,11,12. Трансэндотелиальную Электрическое сопротивление (TEER) и кажущаяся проницаемость (P приложение) трассеров с определенной молекулярной массой представляют собой две критические параметры, которые используются для определения качества модели в пробирке. Здесь мы описываем занятость в ВВВ модели в пробирке, основанный на совместной культуре крысы BMECs (RBMECs) и коры головного мозга крыс астроциты (Rcas) для изучения транс-ВВВ проникания ферритина наноклеток заключающую флуоресцеина isothiocyanate (FITC).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Создание модели ВВВ
Примечание: Для создания модели ВВВ мы предлагаем использовать коммерчески доступные первичные RBMECs и Rcas. Все шаги должны быть выполнены стерильными реагентами и расходными материалами, обрабатываются в ламинарном потоке.
- Культура клеток
- Coat для культивирования клеток колбах с поли-L-лизин 100 мкг / мл (1 час при комнатной температуре) или фибронектина 50 мкг / мл (1 ч при 37 ° С), чтобы содействовать прикреплению RCAs или RBMECs, соответственно. Затем оттепели 1 х 10 6 RCAs и 5 х 10 5 RBMECs эндотелиальной клеточной среде, дополненной 5% фетальной бычьей сыворотки, 1% добавки роста эндотелиальных клеток и 1% пенициллина / стрептомицина (МЭСМ). Семенной RCAs в Т175 колбу в 20 мл МЭСМ и RBMECs в T75 колбу в 10 мл МЭСМ.
Примечание: оттаивание и посевные проходы RCAs и RBMECs должны быть скорректированы, с точки зрения плотности клеток и времени в культуре, в зависимости от числа экспериментальных условий тестируемой с моделью ВВВ. начинающимиING с 1 ампуле 1 × 10 6 RCAs и 1 флакон 5 × 10 5 RBMECs, можно получить до 20 ВВВ-подшипниковых вкладышей. - Поддерживать клетки при 37 ° С и 5% CO 2 в увлажненной атмосфере в течение приблизительно 6 дней, примерно до 80% слияния для RCAs и более 90% сплошности для RBMECs. Отделить клеток с использованием раствора трипсина-ЭДТА (трипсина 1: 250) в течение 5 мин (1 мл трипсина для Т75 колбы и 2 мл для T175 колбы). Прекратить активности трипсина с МЭСМ (2: 1), клеточные суспензии центрифуге при 750 × г в течение 5 мин и ресуспендируют гранул в 60 мл МЭСМ.
- Разделить RBMECs на 3 Т175 колб и культуры в МЭСМ в течение еще 3-х дней перед посевом на вставки. Подсчитать общее количество живых Rcas, наблюдая клеточную суспензию разводят в соотношении 1: 1 трипановым синим под оптическим микроскопом в камере Бюркера.
- Coat для культивирования клеток колбах с поли-L-лизин 100 мкг / мл (1 час при комнатной температуре) или фибронектина 50 мкг / мл (1 ч при 37 ° С), чтобы содействовать прикреплению RCAs или RBMECs, соответственно. Затем оттепели 1 х 10 6 RCAs и 5 х 10 5 RBMECs эндотелиальной клеточной среде, дополненной 5% фетальной бычьей сыворотки, 1% добавки роста эндотелиальных клеток и 1% пенициллина / стрептомицина (МЭСМ). Семенной RCAs в Т175 колбу в 20 мл МЭСМ и RBMECs в T75 колбу в 10 мл МЭСМ.
- Cell Посев на Вставки
- Рассматривать одну сторону Полиэтилентерефталат (ПЭТ) мембрана 6 многоскважинных transparлор вставки с поли-L-лизина, 100 мкг / мл, а с другой стороны с фибронектин 50 мкг / мл, чтобы позволить прикрепление RCAs и BMECs. Ручка вставок с помощью пинцета, чтобы избежать контакта с мембраной ПЭТ.
- Поместите вставки в 6-луночного планшета и добавляют в раствор фибронектина (не менее 500 мкл) в верхнюю камеру. После 1 часа инкубации при 37 ° С, удаления раствора фибронектина, принимают вкладыши Съезжаете с мульти-луночного планшета и поместить их вверх дном на дне 150 см 2 чашки Петри, который используется здесь в качестве стерильного также выражена поддержка уже покрытые вставки.
- Осторожно добавьте 800 мкл поли-L-лизина на нижней стороне режущей пластины (как показано на рисунке 1А; упоминается как Rcas высева), и держать решение на вставках в течение 1 часа при комнатной температуре.
- Аспирируйте решение и пусть вставки высохнуть при комнатной температуре в течение 15-30 мин. Вставки теперь готовы к посева клеток, но также могут быть сохранены в нескольких луночный планшет для несколькихдней при температуре 4 ° С, прежде чем приступить к строительству ВВВ.
Примечание: Не забудьте сохранить по крайней мере, 3 Вставки с износостойким покрытием свободного от клеток, которые будут использоваться в качестве контроля для проверки установления ВВВ путем FD40 измерения потоков.
- Семенной RCAs (35000 / см 2) на нижней стороне вставки поли-L-лизин-покрытием, понижая 800 мкл клеточной суспензии на перевернутой вставку (Рис . 1А) Оставьте подвеску RCA на вставках в течение 4 ч при комнатной температуре, для того, чтобы обеспечить эффективное присоединение клеток к мембране.
- Аспирируйте остаточного раствора, размещения вставок в лунки , содержащие 2 мл SecM и поддерживать мульти-луночный планшет при 37 ° С и 5% CO 2 в увлажненной атмосфере, изменяя МЭСМ каждые 2 дня.
- Через 3 дня, когда RCAs были покрыты нижней поверхностью вставки, семенные RBMECs на верхнюю сторону вставки, выполнив следующие действия:
- Отделить RBMECs от Т175 колбах и посчитайтеОбщее количество живых клеток, как сообщалось в пунктах 1.1.2 и 1.1.3.
- Семенной RBMECs (60000 / см 2) на верхней поверхности пластины в МЭСМ (1000 мкл) (Фигура 1В), оставляя 3 вставок с астроцитов, которые будут использоваться в качестве фона Тир. Поместите мульти-луночный планшет в стандартных условиях культивирования. Поддерживать систему в культуре в течение по крайней мере 3-х дней, изменяя SecM во внутренней и нижней камерой через каждые 2 дня.
- Рассматривать одну сторону Полиэтилентерефталат (ПЭТ) мембрана 6 многоскважинных transparлор вставки с поли-L-лизина, 100 мкг / мл, а с другой стороны с фибронектин 50 мкг / мл, чтобы позволить прикрепление RCAs и BMECs. Ручка вставок с помощью пинцета, чтобы избежать контакта с мембраной ПЭТ.
2. Проверка ВВВ
- Измерение TEER
- На 3 - й день совместного культивирования, проверьте TEER путем вставки ВВВ-несущие вставки в соответствующую камеру (которая имеет крышку и где обе камеры и крышка содержат пару напряжения зондирования и токовых электродов), заполненный 4 мл МЭСМ. Подключение к эпителиальной ткани вольт / омметром.
- Вместе с измерениями Teer клеточных ВВВ-систем, запишите значения Teer из 3-х вставок, несущих Rcas-йпри будет вычитаться из значений, полученных с БББС. Умножить полученные значения Teer поверхностью вставки (4,2 см 2), для того , чтобы выразить результаты в виде Ω х см 2.
- С 3 - го дня совместного культивирования, измеряют TEER каждый день. Примечание: После того, как первоначальный период , когда TEER увеличивается, записанные значения должны оставаться стабильными в течение по крайней мере двух последовательных дней (обычно между 5 - й и 7 - й день совместного культивирования). В этот момент ВВВ готов к второй стадии валидации (раздел 2.2) и / или для экспериментов транс-ВВВ.
Примечание: Процедура, описанная в разделе 2.1, могут быть выполнены на тех же самых БББ-систем, посвященных следующим экспериментам проницаемости (раздел 3). Эксплуатация в стерильных условиях.
- Транс-ВВВ Поток FITC-декстран 40 (FD40)
- Измерьте поток FD40 от верхней до нижней палаты моделей ВВВ по сравнению с через 3 пустых вставок(См ноту раздел 1.2.1), в соответствии со следующими этапами:
- Добавляют 1 мг / мл FD40 (разведенный в МЭСМ) в верхний отсек БББС, и после того, как 1, 2 и 3 ч вывести 200 мкл SecM из нижней камеры и измеряют интенсивность флуоресценции с помощью спектрофлуориметра (X Ex 488 нм, А ЕМ 515 нм, щель 5).
- Получить значения для SecM фоне fluorescenceby измерения 500 мкл девственной среды с использованием тех же аналитических параметров. Вычтите МЭСМ фоновой флуоресценции от всех значений флуоресценции FD40.
- Определить количество проникшего FD40 путем сравнения наблюдаемых значений флуоресценции с калибровочной кривой , полученного с известной концентрацией (т.е.. 0,312, 0,625, 1,25, 2,5 мкг / мл) флуоресцентного индикатора , растворенного в 500 мкл МЭСМ.
- Вычислить кажущуюся коэффициент проницаемости (P) приложение от средних значений потока в соответствии с:
P = приложение J / AC
2) и С обозначает концентрацию молекулы в верхнем отделении (моли / см 3).
Примечание: Три или более ВВВ-системы, которые достигли подходящие значения Тир, должны быть исключительно посвящены этой процедуре проверки, и не должны быть использованы для следующих экспериментов проницаемости (раздел 3). Стерильность не является обязательным.
- Измерьте поток FD40 от верхней до нижней палаты моделей ВВВ по сравнению с через 3 пустых вставок(См ноту раздел 1.2.1), в соответствии со следующими этапами:
3. Транс-ВВВ Проникновение ФИТЦ-нагруженной ферритинов (БНС)
Примечание: вариант рекомбинантного человеческого ферритина (Fn), произведенный в кишечной палочки и собраны в наноклеток (БНС) для инкапсулирования различных флуоресцентных молекул, можно получить у NanoBioLab профессора Prosperi (Университет Милан-Бикокка, Италия). FNn загружаются с FITC, в соответствии с описанным ранее протоколом 13 и концентрации обоих Fn и загруженных молекул точно determinредактор
- Транс-ВВВ Поток FITC и FITC-БНС
- Измерьте поток FITC-БНС от верхней до нижней палаты проверенных моделей ВВВ ( как правило , на 5 - й - 7 - й день совместного культивирования), по сравнению с свободного красителя после 7 и 24 ч инкубации, в соответствии с следующие шаги:
- Добавить ФИТЦ-БНС (50 мкг / мл БНС, 1,1 мкМ FITC) или равное количество свободного FITC в верхнюю часть камеры по меньшей мере 6 систем БББ для каждой композиции, для того, чтобы вывести 2 мл раствора SecM из нижней палаты по меньшей мере, 3 вкладыша после 7 часов, а из нижней палаты других 3-х вставок после 24 часов.
- Измерьте интенсивность флуоресценции 500 мкл собранных образцов спектрофлоуриметре (X ех 488 нм, λ ет 515 нм, щель 5).
- Получение фоновой флуоресценции SecM путем измерения 500 мкл среды с использованием тех же аналитических параметров. Вычтите фоновой флуоресценции МЭСМот всех FITC или FITC-БНС значений флуоресценции.
- Определить концентрацию FITC , прошедшая через мембрану или FITC-FNn путем сравнения полученных значений флуоресценции с двумя различными калибровочными кривыми , произведенных с известной концентрацией (т.е.. 6,87, 13,75, 27,5, 55 нм) или свободного nanoformulated красителя , растворенного в 500 мкл МЭСМ.
- Измерьте поток FITC-БНС от верхней до нижней палаты проверенных моделей ВВВ ( как правило , на 5 - й - 7 - й день совместного культивирования), по сравнению с свободного красителя после 7 и 24 ч инкубации, в соответствии с следующие шаги:
- FITC-БНС Локализация в RBMECs
- Удалить МЭСМ из верхней камеры систем ВВВ, мыть вставки с PBS и фиксируют RBMECs по меньшей мере, двух вставок для каждой экспериментальной группы путем добавления 500 мкл параформальдегида (4% в фосфатный буфер солевом-PBS) в верхнем отсеке для 10 мин при комнатной температуре.
- Промыть Вставки три раза PBS для удаления остаточного количества формальдегида.
Примечание: С этого момента, стерильность не нужно. - Вырезать подходящие куски мембраны ПЭТ, и приступить к immunodecoration клеток в соответствии следующие шаги:
- PermeabiLize RBMECs с 0,1% Тритон Х-100 в PBS в течение 10 минут. Выполнение стадии блокирования в течение 1 ч при комнатной температуре с раствором, содержащим 2% бычьего сывороточного альбумина (BSA), 2% козьей сыворотки в PBS. Инкубируйте образцы с анти-фактора Виллебранда (ФВ) при разбавлении 1:20, в течение 2 ч при комнатной температуре.
- После промывания три раза PBS, подвергать клетки в течение 2 ч при комнатной температуре на 2% БСА, 2% -ный раствор сыворотки козьего, содержащий подходящее вторичное антитело на 1 с: 300 разбавления для того, чтобы выявить анти-VWR и DAPI в точке а 1: 1500 разбавления для обнаружения ядер.
- Установите части вставки на предметные стекла микроскопа с использованием antifade монтажа раствора (одна капля на фрагменте вставки), затем закройте образец с крышкой скольжения. Анализ с помощью конфокальной микроскопии с использованием масляного иммерсионного объектива при 40-кратном увеличении, 1.5 зумом и 1024 х 1024 пикселей.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Во время создания модели ВВВ, прикрепление клеток и рост на вставках можно контролировать с помощью светового микроскопа, благодаря прозрачной природы ПЭТ-мембран. RCAs, высевали при плотности 35000 клеток / см 2, присоединять эффективно к нижней стороне вставки после 4 ч инкубации при комнатной температуре (фиг.2А) и расти , чтобы покрыть поверхность мембраны в течение 3 дней, принимая веретенообразную морфологию (Фигура 2В). RBMECs, высевали при плотности 60000 клеток / см 2, которые явно прикреплен к верхней стороне мембраны ПЭТ примерно через 3 ч инкубации при 37 ° С (фиг.2с). Складывающаяся слой RBMEC может быть трудно представить в течение последующих дней с помощью оптического микроскопа, из - за перекрывания с подстилающей RCA слоя (рис 2D).
Правильная проверка правильности BВВ модель всегда требует измерения Тир , и это может быть подтверждено путем оценки P приложение транс-ВВВ с низкой проницаемостью трассера, таких как FD40.
Значения Тир, записанные в течение периода совместного культивирования, представляют собой первое четкое указание правильного формирования эндотелиального барьера. Через три дня после того, как RBMEC высева, записанный TEER, вычитается из TEER астроцитов-несущих вставок, в основном за счет вклада без электрогенного слоя RCAs и развивающей слой RBMECs. В этот момент времени, наша ВВВ дает значения в диапазоне от 20 до 40 Ω х см 2. В последующие дни, как правило , между 4 - й и 5 - й день совместного культивирования TEER значения увеличиваются из - за образования плотных контактов между соседними эндотелиальными клетками 14, достигая значения , как правило , от 55 до 110 Ом х см 2, и в исключительных случаях приветGher значения 14. Значения , измеренные на 4 - й / 5 - й день совместного культивирования остаются стабильными по крайней мере до 7 - й - 8 - й день , прежде чем они начинают уменьшаться; Таким образом, есть очень узкое окно времени для проведения транс-ВВВ потока экспериментов.
Между 5 - й и 7 - й день совместной культуры, целостность экспериментальных моделей может быть подтверждена путем оценки проницаемости FD40 транс-ВВВ. На фиг.3 показан пример транс-ВВВ потока FD40 (1 мг / мл ), по сравнению с потоком через пустые вставки, в течение 3 ч инкубации; находятся подразделения BBB 6 - й день совместного культивирования и записанная TEER составляет 55,6 ± 15,8 Ω см 2 (среднее значение ± стандартное отклонение, n = 3). Поток линейна от 1 до 3 ч инкубации и среднее P приложение , рассчитанной от 1 до 2 ч, а между 2 и 3 ч инкубации0,12 ± 0,01 х 10 - 6 см сек - 1 (± SE, n = 6).
После того, как по крайней мере , три последовательных успеха подразделения BBB, с точки зрения TEER и FD40 P приложения, которые были получены в независимых экспериментах измерение проницаемости индикаторного можно избежать; Тем не менее, ТЭЭУ всегда должна быть записана для каждого эксперимента.
Транс-ВВВ проницаемость флуоресцентных молекул и влияние наноострия на их поставки могут быть исследованы с помощью крысу модели ВВВ , описанной выше. На рисунке 4 показано проникновение модели красителя FITC при инкапсуляции в БНС через БББС с TEER 100,4 ± 3,5 Ω см 2 (п = 16) на 7 - й день совместного культивирования. Гистограммы, представляющие концентрацию FITC в нижней камере через 7 и 24 ч с добавлением свободного или nanoformulated красителяв верхнем отделении, показывают, что БНС может значительно увеличить поставки FITC через ВВВ.
Конфокальный микроскоп изображения с верхней стороны режущей пластины после 7 и 24 ч инкубации с FITC-БНС (рис 5A, С) или FITC (Фиг.5В, D) , показывают , что в то время как свободный FITC , не усвоены RBMECs, его погрузка на БНС позволяет ему проникать в клетки.
Перед обработкой вставок для конфокальной микроскопии, дальнейшее проверка TEER необходимо обеспечить нет БНС-опосредованные эффекты на целостности ГЭБ.
Рисунок 1:. Посев на сотовый Вставки RCA (А) и RBMEC (В) процедура высева на двух противоположных сторонахВставки табличка многоскважинных. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рис . 2: Оптический микроскоп Изображения RCAs и RBMVECs на вставках Вставки затравку RCAs и RBMECs наблюдаются с помощью оптического микроскопа (20х оптический зум). (А) Четыре часа после высева, круглые и полупрозрачные RCAs будут заметно прикреплены к нижней поверхности вкладыша; (B) веретенообразных RCAs видны на 3 - й день культивирования; (С) Круглые и полупрозрачные RBMECs прикреплены на верхней стороне режущей пластины после 3 ч инкубации; (D) На 4 - й день совместного культивирования как поверхности вставки полностью покрыты клетками, а два лежалиERS не так легко различимы. Шкала бар = 100 мкм. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 3:. FD40 поток через ВВВ непостоянства FD40 (1 мг / мл) от верхней до нижней части ГЭБ системы в пробирке, по сравнению с по пустому вставки. Количество FD40 в нижней камере было измерено при 60, 120 и 180 мин после добавления красителя в верхнюю камеру. Средства ± SE; п ° вставляет = 3. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 4: Влияние БНС Encapsulation на FITC - проникающая через ВВВ Концентрация FITC в нижней палате ВВВ системы в пробирке , рассчитанной на 7 и 24 ч после добавления FITC или FITC-БНС в верхнюю палату.. Среднее ± SE 4-5 размножается; **** P <0,0005, FITC-БНС против. FITC (т-критерий Стьюдента). Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 5: конфокальной микроскопии из RBMECs на вставках Конфокальные лазерного сканирования микрофотографии (одиночные оптические разрезы) RBMECs после 7 ч (А, В) или 24 ч (C, D) инкубации со свободным FITC (B, C) или FITC. -FnN (A,
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Метод в пробирке , описанный здесь представляет собой полезный подтвержденный подход к изучению доставки транс-ВВВ флуоресцентных молекул при nanoformulation с наночастицами. Здесь мы используем БНС, который представляет собой хороший кандидат для изучения транслокации молекул грузов через ВВВ. FNn считается золотым nanovector для транс-ВВВ доставки лекарственных средств / агентов, так как он специфически распознаваемый рецептором TfR1, который экспрессируется на полостной мембране BMECs и опосредует взаимодействие наночастиц с использованием опосредованного рецептором интернализации пути. Кроме того, БНС является естественным наночастицами и поэтому имеет хороший профиль биосовместимости. И, наконец, БНС способен инкапсулировать малой размерности водорастворимых молекул с помощью простого и эффективного механизма. Транс-ВВВ-проникающая других различных типов органических или неорганических наночастиц могут быть также оценены с этим протоколом, в соответствии с несколько соображений относительно особенностей наночастиц. Во-первых рrerequisite изучить проникновение nanoformulated лекарств / агентов является безопасность пустот наночастицами. Другим важным вопросом является взаимодействие исследуемого наночастиц с ПЭТ-фильтром. Этот аспект, должен быть оценен предварительно, чтобы исключить значительную задержку в поры мембраны и избежать изменения их проникновения через ГЭБ. Наша группа недавно использовали предложенную стратегию для изучения с полимерным покрытием из оксида железа наночастицу как транс-ВВВ системы доставки для флуоресцентных-меченых антиретровирусных препаратов 14. В этом случае, мы сопоставили локализации микроскопии электрона nanoformulations в RBMECs к флуоресцентной детекции. Кроме того, другие высокочувствительные методы диагностики, такие как индуктивно-связанной плазмой (ICP) -MS могут быть использованы для оценки доставки транс-ВВВ неорганических наносистем.
ГЭБ модель в пробирке используется в данном протоколе основана на совместной культуре BMECs и астроцитов крыс, В широком сценарии моделей БББ 10,11,12, некоторые из которых были точно описаны в литературе , с хорошо подробный протокол 15, наша модель представляет собой хорошую альтернативу качества. В самом деле, даже несмотря на то, записанный ТЭЭУ был ниже лучших стандартов , предлагаемых в литературе (150-200 Ω см 2) 10, проницаемость транс-ВВВ высокой размерности трассера декстран 40 был в полном согласии с образованием плотного барьера.
Эта модель в пробирке, полученные с коммерчески доступными крысиного BMECs и астроцитов, не имеет несколько преимуществ: (1) оптимальная эффективность роста эндотелиальных клеток, (2) подходящий период времени для производства конечной модели ВВВ (не больше 13 дней), (3) соблюдение этических вопросов, избегая использования клеток из ткани головного мозга человека (патологоанатомических материалов, хирургических образцов и тканей плода) и 4) экономия времени и расходов, связанных с жильем животных и первичнойэкстракция клетки. Тем не менее, ограничение данной модели связано с высокими издержками, не иммортализованных первичных RBMECs, которые должны быть приобретены (застывание при прохождении одного) для каждой экспериментальной установке. Действительно, наши предварительные исследования производства ВВВ продемонстрировали, что способность эндотелиальных клеток продуцировать плотно ГЭБ жестко связано с числом пассажей в культуре RBMECs после первого после покупки оттаивании. Дальнейшая реализация модели ГЭБ , описанной здесь , с эндотелиальными добавками, такими как цАМФ и гидрокортизон, можно было бы рассматривать в целях улучшения эндотелиальной герметичности и увеличения значений Тир. 10,11,16
Настоящая методика связана с возможностью воспользоваться одной модели ВВВ для различных анализов, обеспечивая тем самым несколько наборов данных из каждой экспериментальной установке. С помощью одной системы ГЭБ воздействию свободных или nanocomplexed флуоресцентных молекул, можно: (1) для измерения юе транс-барьер потока молекулы путем анализа интенсивности флуоресценции SecM аликвот, собранных из нижней камеры в различные моменты времени инкубации; (2) исследовать нано-опосредованной интернализации молекул в RBMECs и их внутриклеточной торговли с помощью конфокальной микроскопии анализа клеток на вставок; (3), чтобы получить индикацию состояния клеток БББ при воздействии на nanoformulations, путем измерения TEER в конце эксперимента, или путем анализа целостности эндотелий с помощью электронной микроскопии.
В заключение, здесь мы описали протокол для изучения проникновением nanocomplexed флуоресцентных молекул через сортового ВВВ в пробирке модели. Мы считаем, эта методология является полезным инструментом для изучения влияния nanoformulation на поставки наркотиков через ВВВ.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Rat Brain Microvascular Endothelial Cells | Innoprot | P10308 | isolated from Sprague Dawley rat brain tissue, cryopreserved at passage one and delivered frozen |
| Cortical Astrocytes | Innoprot | P10202 | isolated from 2 days rat brain tissue, cryopreserved at passage one and delivered frozen. |
| Endothelial Cell Medium kit | Innoprot | P60104 | ECM (500 ml) and fetal bovin serum (25 ml), endothelial cell growth supplement (5 ml) and penicillin/streptomycin (5 ml). Warm in 37 °C water bath before use and protect from light |
| Trypsin-EDTA without Phenol Red | EuroClone | ECM0920D | Warm in 37 °C water bath before use |
| Fluorescein isothiocyanate-dextran 40,000 | Sigma | FD40S | protect from light |
| paraformaldehyde | Sigma | 158127 | diluition in chemical hood |
| Dulbecco's phosphate buffer saline w/o Ca and Mg | EuroClone | ECB4004L | |
| Triton X-100 | Sigma | T8787 | |
| bovine serum albumin | Sigma | A7906 | |
| goat serum | EuroClone | ECS0200D | |
| mouse monoclonal anti-Von Willebrand Factor | Dako | M0616 | |
| AlexaFluor 546-conjugated antibody against mouse IgGs | ThermoFischer Scientific | A-11003 | protect from light |
| DAPI (4’ ,6-diamidino-2-phenylindole) | ThermoFischer Scientific | D1306 | protect from light |
| ProLong Gold Antifade Mountant | ThermoFischer Scientific | P36934 | |
| Poly-L-lysine Hydrobromide | Sigma | P1274 | the same solution can be used several times |
| fibronectin from bovine plasma | Sigma | F1141 | the same solution can be used several times |
| Polyethylene terephthalate (PET) inserts | Falcon | F3090 | Transparent Polyethylene terephthalate (PET) membranes; surface area: 4.2 cm2; pore size 0.4 µm/surface area |
| T75 Primo TC flask | EuroClone | ET7076 | |
| T175 Primo TC flask | EuroClone | ET7181 | |
| EVOM2 Epithelial Tissue Volt/Ohmmeter | World Precision Instruments Germany | EVOM2 | |
| Endohm- 24SNAP cup | World Precision Instruments Germany | ENDOHM-24SNAP | |
| Light/fluorescence microscope with camera | Leica Microsystems | DM IL LED Fluo/ ICC50 W Camera Module | inverted microscope for live cells with camera |
| Confocal Microscope | Leica Microsystems | TCS SPE | |
| Spectrofluorimeter | Jasco | FP-8000 |
References
- Banks, W. A. Characteristics of compounds that cross the blood-brain barrier. BMC Neurol. 9 (1), 3 (2009).
- Löscher, W., Potschka, H. Drug resistance in brain disease and the role of efflux transporters. Nat Rev Neurosci. 6, 591-602 (2005).
- Xu, G., Mahajan, S., Roy, I., Yong, K. -T. Theranostic quantum dots for crossing blood-brain barrier in vitro and providing therapy of HIV-associated encephalopathy. Front Pharmacol. 15 (4), 140 (2013).
- Masserini, M. Nanoparticles for Brain Drug Delivery. ISRN Biochem. , (2013).
- Sagar, V., Pilakka-Kanthikeel, S., Pottathil, R., Saxena, S. K., Nair, M. Towards nanomedicines for neuroAIDS. Rev. Med. Virol. 24 (2), 103-124 (2014).
- Kreuter, J. Drug delivery to the central nervous system by polymeric nanoparticles: What do we know. Adv. Drug Deliver. Rev. 71, 2-14 (2014).
- Arosio, P., Ingrassia, R., Cavadini, P. Ferritins: a family of molecules for iron storage, antioxidation and more. Biochim. Biophys. Acta. 1790 (7), 589-599 (2009).
- Jääskeläinen, A., Soukka, T., Lamminmäki, U., Korpimäki, T., Virta, M. Development of a denaturation/renaturation-based production process for ferritin nanoparticles. Biotechnol. Bioeng. 102 (4), 1012-1024 (2009).
- Jefferies, W. A., Brandon, M. R., Hunt, S. V., Williams, A. F., Gatter, K. C., Mason, D. Y. Transferrin receptor on endothelium of brain capillaries. Nature. 312, 162-163 (1984).
- Deli, M. A., Abraham, C. S., Kataoka, Y., Niwa, M. Permeability studies on in vitro blood-brain barrier models: physiology, pathology, and pharmacology. Cell. Mol. Neurobiol. 25 (1), 59-127 (2005).
- Wilhelm, I., Fazakas, C., Krizbai, I. A. In vitro models of the blood-brain barrier. Acta Neurobiol. Exp. (Wars). 71, 113-128 (2011).
- Wilhelm, I., Krizbai, I. A. In vitro models of the blood-brain barrier for the study of drug delivery to the brain. Mol Pharm. 11 (7), 1949-1963 (2014).
- Bellini, M., et al. Protein nanocages for self-triggered nuclear delivery of DNA-targeted chemotherapeutics in Cancer Cells. J. Control. Release. 196, 184-196 (2014).
- Fiandra, L., et al. Nanoformulation of antiretroviral drugs enhances their penetration across the blood brain barrier in mice. Nanomedicine. 11 (6), 1387-1397 (2015).
- Molino, Y., Jabès, F., Lacassagne, E., Gaudin, N., Khrestchatisky, M. Setting-up an in vitro model of rat blood-brain barrier (BBB): a focus on BBB impermeability and receptor-mediated transport. J. Vis. Exp. , e51278 (2014).
- Perrière, N., et al. A functional in vitro model of rat blood-brain barrier for molecular analysis of efflux transporters. Brain Res. 1150, 1-13 (2007).
