Introduction
La resistencia del sistema nervioso central (SNC) enfermedades (es decir. El cáncer, la epilepsia, la depresión, la esquizofrenia y el trastorno neurológico asociado con el VIH) a las terapias farmacológicas se debe a varios mecanismos diferentes, incluyendo penetración de fármaco ardua través de la barrera hematoencefálica (BBB) . La BBB es la frontera que aísla los tejidos del cerebro de las sustancias que circulan en la sangre. Dentro de esta barrera, una capa de células microvasculares endoteliales del cerebro (BMECs), apoyado por pericitos y endfeet astrocitos, es responsable de la alta selectividad de la acreditación a esos medicamentos hidrosolubles con un peso molecular superior a 400 Da 1. Otro mecanismo de resistencia relacionada con la droga está vinculada a la presencia en BMECs de transportadores de flujo de salida de fármaco (P-glicoproteína y resistencia a múltiples fármacos, proteínas) que cooperan para reducir la penetración del fármaco en el SNC y facilitar su extrusión desde el cerebro 2.
En la ultima década, Un gran número de ámbito de las nanotecnologías se han desarrollado para hacer frente al desafío clínico y biológico de la administración de fármacos a través de la acreditación 3-6. En este contexto, nanoesferas de ferritina (Fnn) representan una solución totalmente innovadora y prometedora. Fnn son esferas 12 nm de 24 ferritina auto-montaje (Fn) monómeros, que están dispuestos en una estructura esférica hueca de 8 nm de diámetro interior. subunidades de ferritina se pueden desmontar a pH ácido y volver a montar de una manera con memoria de forma por lo que el pH a la neutralidad, lo que permite diversas moléculas orgánicas a encapsular. Por lo tanto, Fnn representan un modelo interesante para el desarrollo de múltiples funciones de administración de fármacos sistemas 7,8. Por otra parte, Fnn puede interactuar con BMECs gracias al reconocimiento específico de receptor de transferrina (TfR) 1, que se expresa en la membrana luminal de estas células 9.
Hasta el momento, diferentes modelos in vitro de la acreditación han sido desarrolladas en el order para dilucidar trans-BBB permeabilidad a los diversos fármacos, toxicidad hacia la BBB, o la interacción de las moléculas con transportadores de salida. De hecho, estos modelos se consideran válidas en vitro enfoques para un cribado rápido de moléculas activas antes de continuar con estudios in vivo. Estos modelos se componen de una sola capa endotelial de BMECs o BMECs y astrocitos co-cultivadas (más raramente pericitos), obtenido a partir de animales (rata, ratón, cerdo y bovino) o líneas celulares humanas 10,11,12. El transendotelial Resistencia Eléctrica (TEER) y la permeabilidad aparente (P app) de trazadores con un peso molecular definido representan dos parámetros críticos que se utilizan para determinar la calidad del modelo in vitro. Aquí se describe el empleo de un modelo de acreditación in vitro, basado en un co-cultivo de rata BMECs (RBMECs) y la rata astrocitos corticales (ARC) para estudiar la permeabilidad trans-acreditación de nano-cajas de ferritina encapsular isothi fluoresceínaocyanate (FITC).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Establecer el modelo de acreditación
Nota: Para establecer el modelo de acreditación sugerimos usar RBMECs primarias disponibles comercialmente y ARC. Todos los pasos deben realizarse con reactivos y material desechable estéril, que se manejan en una campana de flujo laminar.
- Cultivo de células
- Escudo frascos de cultivo celular con poli-L-lisina 100 mg / ml (1 hora a temperatura ambiente) o fibronectina 50 mg / ml (1 hora a 37 ° C) para promover la unión de las ARC o RBMECs, respectivamente. Entonces, deshielo 1 x 10 6 ARC y 5 x 10 5 RBMECs en medio de células endoteliales, suplementado con 5% de suero bovino fetal, 1% de suplemento de crecimiento de células endoteliales y 1% de penicilina / estreptomicina (SECM). RCA de semillas en un matraz T175 en 20 ml SecM y RBMECs en un matraz T75 en 10 ml SecM.
Nota: La descongelación y pasajes de siembra de ARC y RBMECs deben ajustarse, en términos de densidad de células y el tiempo en cultivo, de acuerdo con el número de condiciones experimentales para ensayar con el modelo de BBB. por inicioing con 1 vial de 1 x 10 6 ARC y 1 vial de 5 x 10 5 RBMECs, es posible obtener hasta 20 insertos BBB-cojinete. - Mantener las células a 37 ° C y 5% de CO 2 en una atmósfera humidificada durante aproximadamente 6 días, hasta alrededor de 80% de confluencia para ARC y más de 90% de confluencia para RBMECs. Separar las células usando solución de tripsina-EDTA (tripsina 1: 250) durante 5 min (1 ml de tripsina para matraces T75 y 2 ml para matraces T175). Deja de actividad de la tripsina con SECM (2: 1), suspensiones de células de centrifugación a 750 xg durante 5 min y volver a suspender los pelets en 60 ml SECM.
- Dividir los RBMECs en 3 matraces T175 y la cultura en SecM por otros 3 días antes de la siembra en los insertos. Contar el número total de vida ARC, mediante la observación de una suspensión celular diluida 1: 1 con azul de tripano con un microscopio óptico en una cámara Burker.
- Escudo frascos de cultivo celular con poli-L-lisina 100 mg / ml (1 hora a temperatura ambiente) o fibronectina 50 mg / ml (1 hora a 37 ° C) para promover la unión de las ARC o RBMECs, respectivamente. Entonces, deshielo 1 x 10 6 ARC y 5 x 10 5 RBMECs en medio de células endoteliales, suplementado con 5% de suero bovino fetal, 1% de suplemento de crecimiento de células endoteliales y 1% de penicilina / estreptomicina (SECM). RCA de semillas en un matraz T175 en 20 ml SecM y RBMECs en un matraz T75 en 10 ml SecM.
- La siembra de células en insertos
- Tratar a un lado del tereftalato de polietileno (PET) de la membrana de transpa 6 pocillos múltiplesinserciones ORL con poli-L-lisina 100 mg / ml y el otro lado con fibronectina 50 g / ml, para permitir la fijación de RCA y BMECs. Manejar los insertos con pinzas con el fin de evitar el contacto con la membrana de PET.
- Coloque los insertos en una placa de 6 pocillos y añadir solución de fibronectina (mínimo 500 l) en la cámara superior. Después de 1 h de incubación a 37 ° C, se retira la solución de fibronectina, tome las inserciones de la placa de múltiples pocillos y ponerlos boca abajo en el fondo de un 150 cm plato 2 Petri, que se utiliza aquí como un soporte estéril para el ya recubiertos insertos.
- Añadir con cuidado 800 l de poli-L-lisina en el lado inferior de la pieza de inserción (como se muestra en la Figura 1A; se hace referencia como la siembra ARC), y mantener la solución en los insertos durante 1 hora a RT.
- Aspirar la solución y dejar que los insertos se secan a temperatura ambiente durante 15-30 min. Los insertos están ahora listos para la siembra de células, pero también se pueden almacenar en la placa de múltiples pocillos para variosdías a 4 ° C, antes de proceder a la construcción de la acreditación.
Nota: Recuerde que debe mantener al menos 3 insertos recubiertos libres de células, para ser utilizados como controles para validar la acreditación establecimiento por FD40 mediciones de flujo.
- ARC semillas (35.000 / cm 2) en el lado inferior de los insertos de poli-L-lisina, dejando caer 800 l de suspensión de células en el revés de inserción (Figura 1A). Dejar la suspensión RCA en los insertos durante 4 horas a RT, con el fin de permitir la fijación eficiente de las células a la membrana.
- Aspirar la solución residual, colocar los insertos en los pocillos que contenían 2 ml de SECM y mantener la placa de múltiples pocillos a 37 ° C y 5% de CO 2 en una atmósfera humidificada, cambiando el SECM cada 2 días.
- Después de 3 días, cuando las ARC han revestido la cara inferior de la inserción, RBMECs de semillas sobre el lado superior del inserto, siguiendo estos pasos:
- Separar RBMECs de los matraces T175 y contar ellas células vivas totales, como se informó en los pasos 1.1.2 y 1.1.3.
- RBMECs semillas (60.000 / cm 2) sobre la superficie superior del inserto en SECM (1000 l) (Figura 1B), dejando 3 insertos con sólo los astrocitos, que se utilizarán como fondo TEER. Colocar la placa de múltiples pocillos en condiciones de cultivo estándar. Mantener el sistema de cultivo durante al menos 3 días, cambiando el SecM en la cámara interior e inferior cada 2 días.
- Tratar a un lado del tereftalato de polietileno (PET) de la membrana de transpa 6 pocillos múltiplesinserciones ORL con poli-L-lisina 100 mg / ml y el otro lado con fibronectina 50 g / ml, para permitir la fijación de RCA y BMECs. Manejar los insertos con pinzas con el fin de evitar el contacto con la membrana de PET.
2. Validación de la acreditación
- Medición TEER
- En el 3er día de co-cultivo, compruebe la TEER mediante la inserción de los insertos que portan la acreditación en una cámara apropiada (que tiene una tapa y donde tanto la cámara y la tapa contienen un par de detección de voltaje y los electrodos de corriente), lleno de 4 ml de SECM. Conectarse a una epiteliales del tejido voltios / ohmímetro.
- Junto con las mediciones de TEER de las células BBB-sistemas, registrar los valores de TEER de los 3 Casquillos de cojinetes de las ARC thWill restarse de los valores obtenidos con el BBBs. Multiplicar los valores de TEER resultantes por la superficie de la pieza de inserción (4,2 cm 2) a fin de expresar los resultados como Ω x cm 2.
- A partir de los 3 días de co-cultivo, medir la TEER todos los días. Nota: Después de un período inicial en el que el TEER aumenta, los valores registrados deben permanecer estables durante al menos dos días consecutivos (por lo general entre el 5º y el 7º día de co-cultivo). En ese punto la BBB está listo para la segunda etapa de validación (sección 2.2) y / o para los experimentos de trans-BBB.
Nota: El procedimiento descrito en la sección 2.1 se puede realizar en las mismas BBB-sistemas dedicados a los siguientes experimentos de permeabilidad (sección 3). Operar bajo condiciones estériles.
- Trans-Flux acreditación de FITC-dextrano 40 (FD40)
- Medir el flujo FD40 desde la parte superior a la cámara inferior de los modelos de BBB en comparación con los que a través de 3 insertos vacíos(Véase la nota de la sección 1.2.1) de acuerdo con los siguientes pasos:
- Añadir 1 mg / ml FD40 (diluido en SECM) en el compartimiento superior de la BBBs, y después de 1, 2 y 3 hr retirar 200 SECM l de la cámara inferior y medir la intensidad de fluorescencia por espectrofluorímetro (λ ex 488 nm, λ em 515 nm, de hendidura 5).
- Obtener los valores para el fondo SECM fluorescenceby medición de 500 l de medio de virgen utilizando los mismos parámetros analíticos. Restar la fluorescencia de fondo SecM de todos los valores de fluorescencia FD40.
- Determinar la cantidad de FD40 permeado mediante la comparación de los valores de fluorescencia observados con una curva de calibración producida con concentraciones conocidas (es decir. 0.312, 0.625, 1.25, 2.5 mg / ml) del trazador fluorescente disuelto en 500 l de SECM.
- Calcular el coeficiente de permeabilidad aparente (P app) a partir de los valores de flujo de medios de acuerdo con:
P app = J / AC
2) y C es la concentración de la molécula en el compartimiento superior (moles / cm 3).
Nota: Tres o más BBB-sistemas que han alcanzado valores de TEER adecuados, deben estar dedicados exclusivamente a este procedimiento de validación, y no deben emplearse para los siguientes experimentos de permeabilidad (sección 3). La esterilidad no es obligatorio.
- Medir el flujo FD40 desde la parte superior a la cámara inferior de los modelos de BBB en comparación con los que a través de 3 insertos vacíos(Véase la nota de la sección 1.2.1) de acuerdo con los siguientes pasos:
3. Trans-acreditación Penetración de la ferritinas cargado con FITC (FNN)
Nota: Una variante recombinante de la ferritina humana (Fn), producida en Escherichia coli y se reunieron en nano-cajas (FNN) para la encapsulación de diferentes moléculas fluorescentes, está disponible en el NanoBioLab del Prof. Prosperi (Universidad de Milán-Bicocca, Italia). Fnn se cargan con FITC, de acuerdo con un protocolo previamente descrito 13 y las concentraciones de ambos Fn y las moléculas cargadas se determin precisióned.
- Trans-Flux acreditación de FITC y FITC-Fnn
- Medir el flujo de FITC-Fnn desde la parte superior a la cámara inferior de los modelos de BBB validados (por lo general en el 5º - 7º día de co-cultivo), en comparación con la del colorante libre después de las 7 y 24 horas de incubación, según los pasos siguientes:
- Añadir FITC Fnn (50 mg / ml Fnn, 1,1 M FITC) o una cantidad igual de libre FITC en la cámara superior de al menos 6 sistemas de BBB para cada formulación, con el fin de retirar 2 ml de solución SecM de la cámara inferior de al menos 3 insertos después de las 7 horas, y desde la cámara inferior de otros 3 insertos después de 24 horas.
- Medir la intensidad de fluorescencia de 500 l de las muestras recogidas por espectrofluorímetro (λ ex 488 nm, λ em 515 nm, hendidura 5).
- Obtener la fluorescencia de fondo SECM mediante la medición de 500 l de medio utilizando los mismos parámetros analíticos. Restar la fluorescencia de fondo SecMde todos los valores de fluorescencia FITC o FITC-Fnn.
- Determinar la concentración de FITC por permeabilidad o FITC-Fnn mediante la comparación de los valores de fluorescencia obtenidos con dos curvas de calibración diferentes producidos con concentraciones conocidas (es decir. 6,87, 13,75, 27,5, 55 nM) del colorante libre o nanoformulated disuelto en 500 l SECM.
- Medir el flujo de FITC-Fnn desde la parte superior a la cámara inferior de los modelos de BBB validados (por lo general en el 5º - 7º día de co-cultivo), en comparación con la del colorante libre después de las 7 y 24 horas de incubación, según los pasos siguientes:
- FITC-Fnn Localización en RBMECs
- Eliminar SECM de la cámara superior de los sistemas de BBB, lavar los insertos con PBS y fijar los RBMECs en al menos dos piezas de inserción para cada grupo experimental mediante la adición de 500 paraformaldehído l (4% en tampón fosfato salino-PBS) en el compartimiento superior para 10 min a TA.
- Lavar los insertos de tres veces con PBS para eliminar el paraformaldehído residual.
Nota: A partir de ahora, la esterilidad no es necesario. - Cortar trozos adecuados de la membrana de PET, y proceder con la immunodecoration de las células según los siguientes pasos:
- permeabilize RBMECs con 0,1% Triton X-100 en PBS durante 10 minutos. Realizar una etapa de bloqueo durante 1 hora a RT con una solución que contiene 2% de albúmina de suero bovino (BSA), 2% de suero de cabra en PBS. Se incuban las muestras con un Willebrand Factor anti-Von (VWF) a una dilución de 1:20, durante 2 horas a RT.
- Después de lavar tres veces con PBS, exponer las células durante 2 horas a TA a una BSA 2%, una solución de suero de cabra 2% que contiene un anticuerpo secundario adecuado a una dilución 1: 300 con el fin de revelar la anti-VWR, y DAPI a una dilución 1: 1500 para la detección de núcleos.
- Montar las piezas de inserción en portaobjetos de microscopio utilizando una solución de montaje antifade (una gota por fragmento de inserción), a continuación, cierre la muestra con un cubreobjetos. Analizar mediante microscopía confocal usando un lente de inmersión en aceite a 40 aumentos, zoom de 1,5 y 1.024 x 1.024 píxeles de resolución.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Durante el establecimiento de la BBB modelo, la unión celular y el crecimiento en las piezas de inserción se puede controlar usando un microscopio de luz gracias a la naturaleza transparente de las membranas de PET. ARC, sembradas a una densidad de 35.000 células / cm 2, conecte de manera eficiente a la parte inferior de la pieza de inserción después de 4 h de incubación a RT (Figura 2A) y crecer para cubrir la superficie de la membrana en 3 días, teniendo una morfología en forma de huso (Figura 2B). RBMECs, se sembraron a una densidad de 60.000 células / cm2, se unen de forma visible en la cara superior de la membrana de PET después de aproximadamente 3 horas de incubación a 37 ° C (Figura 2C). La capa RBMEC en desarrollo puede ser difícil de visualizar en los siguientes días con un microscopio óptico, debido a la superposición con la capa subyacente RCA (Figura 2D).
Una validación correcta de la BModelo BB siempre requiere de medición TEER y esto puede ser confirmada mediante la evaluación de la aplicación P trans-BBB de un trazador de baja permeabilidad, tal como FD40.
Los valores de TEER, registrados durante el período de cultivo conjunto, representan la primera indicación clara de la correcta formación de la barrera endotelial. Tres días después de la siembra RBMEC, la TEER grabada, restada de la TEER de los insertos de soporte de astrocitos, se debe principalmente a la contribución de la capa no electrogénico de ARC y la capa de desarrollo de RBMECs. En este punto del tiempo, nuestra acreditación da valores que oscilan entre 20 y 40 Ω x cm 2. Durante los siguientes días, por lo general entre el 4º y el 5º día de co-cultivo, la TEER valores aumentan debido a la formación de uniones estrechas entre las células endoteliales adyacentes 14, alcanzando valores por lo general entre 55 y 110 Ω x cm 2, y en casos excepcionales higher valora 14. Los valores medidos en el 4º / 5º día de co-cultivo se mantienen estables al menos hasta el 7º - 8º día antes de que comiencen a disminuir; Por lo tanto, hay una ventana de tiempo muy estrecha disponible para la realización de los experimentos trans-BBB flujo.
Entre el 5 y el 7 ° día de co-cultivo, la integridad de los modelos experimentales puede ser confirmada mediante la evaluación de la permeabilidad FD40 trans-BBB. Figura 3 muestra un ejemplo del flujo trans-BBB de FD40 (1 mg / ml ), en comparación con el flujo a través de inserciones en vacío, a 3 h de incubación; la BBBs están en el 6º día de co-cultivo y la TEER registrada es de 55,6 ± 15,8 Ω cm 2 (media ± SE, n = 3). El flujo es lineal entre 1 y 3 h de incubación y de la aplicación media P calculada entre 1 y 2 horas, y entre 2 y 3 horas de incubación es0,12 ± 0,01 x 10 - 6 cm seg - 1 (± SE, n = 6).
Una vez, al menos, tres años consecutivos de éxito BBBs, en términos de TEER y FD40 P aplicación, se han obtenido en experimentos independientes la medición de la permeabilidad del trazador se puede evitar; Sin embargo, la TEER siempre tiene que ser registrado para cada experimento.
La permeabilidad trans-BBB de moléculas fluorescentes y el efecto de la Nanocomplejo en su entrega pueden ser investigados utilizando la rata modelos de BBB descrito anteriormente. La Figura 4 muestra la penetración del modelo de tinte FITC a la encapsulación en Fnn través BBBs con TEER de 100,4 ± 3,5 Ω cm 2 (n = 16) en el 7º día de co-cultivo. Los histogramas, lo que representa la concentración de FITC en la cámara baja después de las 7 y las 24 horas desde la adición de colorante libre o nanoformulateden el compartimiento superior, indican que Fnn es capaz de aumentar significativamente la entrega de FITC a través de la BBB.
Imágenes de microscopía confocal de la cara superior de la pieza de inserción después de 7 y 24 horas de incubación con FITC-Fnn (Figura 5A, C) o FITC (Figura 5B, D) muestran que mientras libre FITC no es internalizado por la RBMECs, su carga en la Fnn le permite entrar en las células.
Antes de procesar los insertos para microscopía confocal, una comprobación adicional de la TEER es necesario para asegurar que no hay efectos mediados por Fnn sobre la integridad BBB.
Figura 1:. Siembra de células en insertos RCA (A) y RBMEC (B) Procedimiento de siembra en los dos lados opuestos delos accesorios para placas de múltiples pocillos. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2:. Microscopio Óptico de Imágenes ARC y RBMVECs sobre Insertos Insertos sembraron con ARC y RBMECs se observan con un microscopio de luz (20X de zoom óptico). (A) Cuatro horas después de la siembra, redondo y ARC translúcidos están unidos de forma visible a la superficie inferior de la inserción; ARC en forma de huso (B) son visibles en el 3er día de la cultura; (C) Ronda y RBMECs translúcidos están pegadas en la parte superior del inserto después de 3 horas de incubación; (D) En el 4º día de co-cultivo, tanto las superficies del inserto están completamente cubiertas de células, y los dos laicores no son fácilmente distinguibles. Barra de escala = 100 micras. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3:. FD40 Flux través de la BBB Flux de FD40 (1 mg / ml) a partir de la parte superior a la parte inferior del sistema de BBB in vitro, en comparación con el que a través de la pieza de inserción vacía. La cantidad de FD40 en la cámara inferior se ha medido a 60, 120 y 180 min después de la adición del colorante a la cámara superior. Medias ± SE; n ° inserta = 3. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: Efecto de Fnn encapsulación de FITC de permeación a través del BBB concentración de FITC en la cámara inferior del sistema de acreditación in vitro calculada a las 7 y 24 horas después de la adición de FITC o con FITC Fnn en la cámara superior.. La media ± SE de 4-5 repeticiones; **** P <0,0005, FITC-Fnn vs. FITC (prueba t de Student). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 5: Microscopía Confocal de RBMECs en la Insertos Confocal micrografías de escaneo láser (secciones ópticas individuales) de RBMECs después de 7 horas (A, B) o 24 horas (C, D) de la incubación con conexión FITC (B, C) o FITC. -FnN (A,
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
El método in vitro descrito aquí representa un enfoque validado útil para estudiar la entrega trans-BBB de moléculas fluorescentes sobre nanoformulation con nanopartículas. Aquí utilizamos Fnn, lo que representa un buen candidato para estudiar la translocación de moléculas de carga a través de la BBB. Fnn se considera el nanovector oro para la entrega trans-BBB de drogas / agentes, ya que está específicamente reconocido por el receptor de TfR1, que se expresa en la membrana luminal de BMECs y media en la captación de nanopartículas utilizando una vía de la internalización mediada por receptor. Por otra parte, Fnn es una nanopartícula natural y, por tanto, tiene un buen perfil de biocompatibilidad. Finalmente, Fnn es capaz de encapsular moléculas hidrosolubles de baja dimensión por un mecanismo simple y eficiente. La penetración trans-acreditación de otros tipos de nanopartículas orgánicas o inorgánicas podría ser también evaluada con este protocolo, de acuerdo con ciertas consideraciones sobre nanopartículas características. En primer lugar prerequisite para estudiar la penetración de fármacos / agentes nanoformulated es la seguridad del vacío de nanopartículas. Otra cuestión crucial es la interacción de la nanopartícula investigado con el filtro de PET. Este aspecto, tiene que ser evaluado de forma preliminar con el fin de excluir una retención significativa en los poros de la membrana y evitar alteraciones de su permeación a través de la BBB. Nuestro grupo ha empleado recientemente la estrategia propuesta para estudiar una nanopartícula de óxido de hierro recubierto con polímero como un sistema de suministro de trans-BBB para medicamentos antirretrovirales marcados con fluorescencia 14. En ese caso, asociados Microscopía Electrónica de localización de nanoformulations en RBMECs a la detección de fluorescencia. Por otra parte, otros métodos de diagnóstico altamente sensibles, tales como plasma de acoplamiento inductivo (ICP) -MS podría ser empleado para evaluar la entrega trans-acreditación de nanosistemas inorgánicos.
El modelo de acreditación in vitro utilizado en este protocolo se basa en el co-cultivo de BMECs rata y astrocitos. En el amplio escenario de los modelos de BBB 10,11,12, algunas de las cuales han sido descritas con precisión en la literatura con un protocolo bien detallado 15, nuestro modelo representa una alternativa de buena calidad. De hecho, a pesar de que la TEER registrado fue por debajo de los mejores estándares sugerido en la literatura (150-200 Ω cm 2) 10, la permeabilidad trans-BBB de la alta trazador dimensión Dextran 40 estaba en total acuerdo con la formación de una barrera apretado.
Este modelo in vitro, obtenidos con disponible comercialmente rata BMECs y astrocitos, tiene algunas ventajas: (1) la eficiencia óptima de crecimiento de las células endoteliales, (2) un periodo de tiempo adecuado para la producción del modelo final BBB (no más de 13 días), (3) el cumplimiento de los aspectos éticos, evitando el uso de células de tejido cerebral humano (materiales de autopsia, piezas quirúrgicas, y tejido fetal) y 4) ahorro de tiempo y costes relacionados con el alojamiento de los animales, y primariaextracción de células. Sin embargo, una limitación del modelo actual está relacionada con los altos costos de RBMECs primarias no inmortalizado, que deben ser compradas (congelados en el paso uno) para cada ajuste experimental. De hecho, nuestros estudios preliminares de producción BBB han demostrado que la capacidad de las células endoteliales para producir un BBB apretado está estrictamente asociada con el número de pases en cultivo de las RBMECs después de la primera descongelación posterior a la compra. Además implementación del modelo de acreditación se ha descrito aquí con suplementos endoteliales, tales como cAMP e hidrocortisona, podría considerarse el fin de mejorar la estanqueidad endotelial y aumentar los valores de TEER. 10,11,16
La presente técnica está relacionada con la posibilidad de aprovechar de un único modelo de acreditación para ensayos diferentes, proporcionando de este modo varios conjuntos de datos de cada ajuste experimental. Con un solo sistema de acreditación expuesto a moléculas fluorescentes libres o nanocomplexed, es posible: (1) para medir THe flujo trans-barrera de la molécula mediante el análisis de la intensidad de fluorescencia de alícuotas SECM recogidos de la cámara inferior en diferentes puntos de tiempo de incubación; (2) para investigar la internalización nano-mediada de las moléculas en RBMECs y su tráfico intracelular por análisis de microscopía confocal de las células en insertos; (3) para obtener una indicación de la situación de las células de BBB tras la exposición a los nanoformulations, mediante la medición de TEER al final del experimento o mediante el análisis de la integridad del endotelio por microscopía electrónica.
En conclusión, aquí se describe un protocolo para el estudio de la permeación de moléculas fluorescentes nanocomplexed a través de una alta calidad BBB modelo in vitro. Consideramos que esta metodología una herramienta útil para investigar el efecto de nanoformulation en la administración de fármacos a través de la acreditación.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Rat Brain Microvascular Endothelial Cells | Innoprot | P10308 | isolated from Sprague Dawley rat brain tissue, cryopreserved at passage one and delivered frozen |
| Cortical Astrocytes | Innoprot | P10202 | isolated from 2 days rat brain tissue, cryopreserved at passage one and delivered frozen. |
| Endothelial Cell Medium kit | Innoprot | P60104 | ECM (500 ml) and fetal bovin serum (25 ml), endothelial cell growth supplement (5 ml) and penicillin/streptomycin (5 ml). Warm in 37 °C water bath before use and protect from light |
| Trypsin-EDTA without Phenol Red | EuroClone | ECM0920D | Warm in 37 °C water bath before use |
| Fluorescein isothiocyanate-dextran 40,000 | Sigma | FD40S | protect from light |
| paraformaldehyde | Sigma | 158127 | diluition in chemical hood |
| Dulbecco's phosphate buffer saline w/o Ca and Mg | EuroClone | ECB4004L | |
| Triton X-100 | Sigma | T8787 | |
| bovine serum albumin | Sigma | A7906 | |
| goat serum | EuroClone | ECS0200D | |
| mouse monoclonal anti-Von Willebrand Factor | Dako | M0616 | |
| AlexaFluor 546-conjugated antibody against mouse IgGs | ThermoFischer Scientific | A-11003 | protect from light |
| DAPI (4’ ,6-diamidino-2-phenylindole) | ThermoFischer Scientific | D1306 | protect from light |
| ProLong Gold Antifade Mountant | ThermoFischer Scientific | P36934 | |
| Poly-L-lysine Hydrobromide | Sigma | P1274 | the same solution can be used several times |
| fibronectin from bovine plasma | Sigma | F1141 | the same solution can be used several times |
| Polyethylene terephthalate (PET) inserts | Falcon | F3090 | Transparent Polyethylene terephthalate (PET) membranes; surface area: 4.2 cm2; pore size 0.4 µm/surface area |
| T75 Primo TC flask | EuroClone | ET7076 | |
| T175 Primo TC flask | EuroClone | ET7181 | |
| EVOM2 Epithelial Tissue Volt/Ohmmeter | World Precision Instruments Germany | EVOM2 | |
| Endohm- 24SNAP cup | World Precision Instruments Germany | ENDOHM-24SNAP | |
| Light/fluorescence microscope with camera | Leica Microsystems | DM IL LED Fluo/ ICC50 W Camera Module | inverted microscope for live cells with camera |
| Confocal Microscope | Leica Microsystems | TCS SPE | |
| Spectrofluorimeter | Jasco | FP-8000 |
References
- Banks, W. A. Characteristics of compounds that cross the blood-brain barrier. BMC Neurol. 9 (1), 3 (2009).
- Löscher, W., Potschka, H. Drug resistance in brain disease and the role of efflux transporters. Nat Rev Neurosci. 6, 591-602 (2005).
- Xu, G., Mahajan, S., Roy, I., Yong, K. -T. Theranostic quantum dots for crossing blood-brain barrier in vitro and providing therapy of HIV-associated encephalopathy. Front Pharmacol. 15 (4), 140 (2013).
- Masserini, M. Nanoparticles for Brain Drug Delivery. ISRN Biochem. , (2013).
- Sagar, V., Pilakka-Kanthikeel, S., Pottathil, R., Saxena, S. K., Nair, M. Towards nanomedicines for neuroAIDS. Rev. Med. Virol. 24 (2), 103-124 (2014).
- Kreuter, J. Drug delivery to the central nervous system by polymeric nanoparticles: What do we know. Adv. Drug Deliver. Rev. 71, 2-14 (2014).
- Arosio, P., Ingrassia, R., Cavadini, P. Ferritins: a family of molecules for iron storage, antioxidation and more. Biochim. Biophys. Acta. 1790 (7), 589-599 (2009).
- Jääskeläinen, A., Soukka, T., Lamminmäki, U., Korpimäki, T., Virta, M. Development of a denaturation/renaturation-based production process for ferritin nanoparticles. Biotechnol. Bioeng. 102 (4), 1012-1024 (2009).
- Jefferies, W. A., Brandon, M. R., Hunt, S. V., Williams, A. F., Gatter, K. C., Mason, D. Y. Transferrin receptor on endothelium of brain capillaries. Nature. 312, 162-163 (1984).
- Deli, M. A., Abraham, C. S., Kataoka, Y., Niwa, M. Permeability studies on in vitro blood-brain barrier models: physiology, pathology, and pharmacology. Cell. Mol. Neurobiol. 25 (1), 59-127 (2005).
- Wilhelm, I., Fazakas, C., Krizbai, I. A. In vitro models of the blood-brain barrier. Acta Neurobiol. Exp. (Wars). 71, 113-128 (2011).
- Wilhelm, I., Krizbai, I. A. In vitro models of the blood-brain barrier for the study of drug delivery to the brain. Mol Pharm. 11 (7), 1949-1963 (2014).
- Bellini, M., et al. Protein nanocages for self-triggered nuclear delivery of DNA-targeted chemotherapeutics in Cancer Cells. J. Control. Release. 196, 184-196 (2014).
- Fiandra, L., et al. Nanoformulation of antiretroviral drugs enhances their penetration across the blood brain barrier in mice. Nanomedicine. 11 (6), 1387-1397 (2015).
- Molino, Y., Jabès, F., Lacassagne, E., Gaudin, N., Khrestchatisky, M. Setting-up an in vitro model of rat blood-brain barrier (BBB): a focus on BBB impermeability and receptor-mediated transport. J. Vis. Exp. , e51278 (2014).
- Perrière, N., et al. A functional in vitro model of rat blood-brain barrier for molecular analysis of efflux transporters. Brain Res. 1150, 1-13 (2007).
