Introduction
Der Widerstand des Zentralnervensystems (ZNS) Erkrankungen (dh. Krebs, Epilepsie, Depression, Schizophrenie und HIV-assoziierte neurologische Störung) auf pharmakologische Therapien aufgrund der verschiedenen Mechanismen, einschließlich beschwerliche Arzneimittelpermeation über die Blut-Hirn - Schranke (BBB) . Die BBB ist die Grenze, die Gehirngewebe von den Substanzen isoliert im Blut zirkulieren. Innerhalb dieser Barriere eine Schicht aus Gehirn mikrovaskuläre Endothelzellen (BMECs), von Perizyten und Astrozyten Endfüßen unterstützt wird , ist verantwortlich für die hohe Selektivität der BBB zu diesen wasserlöslichen Arzneimittel mit einem Molekulargewicht von mehr als 400 Da 1. Eine andere drogenbedingten Widerstandsmechanismus ist mit dem Vorhandensein auf BMECs von Arzneimitteltransportern Efflux (P-Glykoprotein und multidrug resistance Proteine) verbunden, die zusammenwirken , um Arzneimittelpenetration in das ZNS zu reduzieren und erleichtern deren Extrusion aus dem Gehirn 2.
Im letzten JahrzehntEine Vielzahl von nanotechnologische Ansätze entwickelt wurden , um die klinische und biologische Herausforderung der Bereitstellung von Arzneimitteln über die BBB 3-6 zu erfüllen. In diesem Zusammenhang stellen Ferritin-Nanokugeln (FNN) eine völlig innovative und vielversprechende Lösung. Fnn sind 12 nm Sphären 24 selbstorganisierende Ferritin (Fn) Monomeren, die in einer Hohlkugelstruktur von 8 nm Innendurchmesser angeordnet sind. Ferritin-Untereinheiten können, indem der pH-Wert auf Neutralität, so dass verschiedene organische Moleküle zu verkapselnden bei saurem pH und wieder zusammengebaut in einem Formgedächtnis-Mode demontiert werden. Daher stellen fnn ein interessantes Modell für die Entwicklung von multifunktionalen Wirkstoffabgabesysteme 7,8. Außerdem kann fnn mit BMECs dank der spezifischen Erkennung von Transferrin - Rezeptor (TfR) 1, zu interagieren , die auf der luminalen Membran dieser Zellen 9 exprimiert wird.
Bisher verschiedenen in vitro - Modelle der BBB wurden in orde entwickeltr trans-BBB Permeabilität für verschiedene Arzneimittel, die Toxizität gegen die BBB, oder die Wechselwirkung von Molekülen mit Efflux-Transporter zu erläutern. Tatsächlich werden diese Modelle als in vitro gültigen Ansätze für ein schnelles Screening von aktiven Molekülen , bevor sie mit in - vivo - Studien fortfahren. Diese Modelle bestehen aus einer einzigen Endothelschicht BMECs oder co-kultiviert BMECs und Astrozyten (seltener pericytes), erhalten von Tier (Ratte, Maus, Schwein und Rind) oder menschlichen Zelllinien 10,11,12. Die transendotheliale Elektrischer Widerstand (TEER) und die scheinbare Permeabilität (P app) von Tracern mit definiertem Molekulargewicht sind zwei kritische Parameter, die die Qualität der in - vitro - Modell werden verwendet , zu bestimmen. Hier beschreiben wir die Verwendung eines BBB in - vitro - Modell, basierend auf einer Co-Kultur von Ratten - BMECs (RBMECs) und Ratten - kortikalen Astrozyten (RCAs) zur Untersuchung der trans-BBB Permeation von Ferritin - Nanokäfige Einkapseln Fluorescein isothiocyanate (FITC).
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Protocol
1. Festlegung der BBB-Modell
Hinweis: Für die BHS-Modell schaffen wir schlagen vor, im Handel erhältliche primäre RBMECs und RCAs verwenden. Alle Schritte müssen mit sterilen Reagenzien und Disposables durchgeführt werden, in einer Laminarströmungsabzug behandelt.
- Zellkultur
- Coat Zellkulturflaschen mit Poly-L-lysin 100 ug / ml (1 h bei RT) oder Fibronektin 50 ug / ml (1 h bei 37 ° C) die Anlagerung von RCAs oder RBMECs zu fördern, respectively. Dann thaw 1 x 10 6 RCAs und 5 x 10 5 RBMECs in Endothelzell-Medium, ergänzt mit 5% fötalem Rinderserum, 1% endothelialen Zellwachstumsergänzungsmittel und 1% Penicillin / Streptomycin (SECM). Seed RCAs in einem T175-Kolben in 20 ml SECM und RBMECs in einem T75-Kolben in 10 ml SECM.
Hinweis: Das Auftauen und Aussäen Passagen RCAs und RBMECs müssen angepasst werden, in Bezug auf die Zelldichte und der Zeit in Kultur, entsprechend der Anzahl der Versuchsbedingungen mit der BBB-Modell getestet werden. Mit dem Starting mit 1 Flasche mit 1 x 10 6 RCAs und 1 Flasche mit 5 x 10 5 RBMECs ist es möglich , bis 20 BBB-Lagerschalen erhalten werden. - Pflegen der Zellen bei 37 ° C und 5% CO 2 in einer befeuchteten Atmosphäre für etwa 6 Tage, bis etwa 80% Konfluenz für RCAs und über 90% Konfluenz für RBMECs. Abzulösen Zellen unter Verwendung von Trypsin-EDTA-Lösung (Trypsin 1: 250) für 5 min (1 ml Trypsin für T75-Kolben und 2 ml für T175-Kolben). Stop Trypsin-Aktivität mit SECM (2: 1) Zentrifugenzellsuspensionen bei 750 × g für 5 Minuten und Resuspendieren der Pellets in 60 ml SECM.
- Teilen Sie die RBMECs in 3 T175-Flaschen und Kultur in SECM für weitere 3 Tage, bevor sie auf Einsätze Aussaat. Zählen Sie die Gesamtzahl der RCAs leben, durch eine Zellsuspension beobachtet 1: 1 verdünnt mit Trypanblau unter einem optischen Mikroskop in einer Burker Kammer.
- Coat Zellkulturflaschen mit Poly-L-lysin 100 ug / ml (1 h bei RT) oder Fibronektin 50 ug / ml (1 h bei 37 ° C) die Anlagerung von RCAs oder RBMECs zu fördern, respectively. Dann thaw 1 x 10 6 RCAs und 5 x 10 5 RBMECs in Endothelzell-Medium, ergänzt mit 5% fötalem Rinderserum, 1% endothelialen Zellwachstumsergänzungsmittel und 1% Penicillin / Streptomycin (SECM). Seed RCAs in einem T175-Kolben in 20 ml SECM und RBMECs in einem T75-Kolben in 10 ml SECM.
- Zellaussaat auf Einsätze
- Behandlung einer Seite der Polyethylen-Terephthalat (PET) -Membran von 6 Multi-Well transpaent Einsätze mit Poly-L-lysin 100 ug / ml und die andere Seite mit Fibronectin 50 ug / ml, Anhaftung von RCAs und BMECs zu ermöglichen. Behandeln Sie die Einsätze mit einer Pinzette, um den Kontakt mit der PET-Membran zu vermeiden.
- Legen Sie die Einsätze in einer 6-Well-Platte und fügen Fibronektin-Lösung (mindestens 500 & mgr; l) in die obere Kammer. Nach 1 Stunde Inkubation bei 37 ° C, entfernen Sie die Fibronektin - Lösung, nehmen die Einsätze aus dem Multi-Well - Platte und legte sie den Kopf auf den Boden einer 150 cm 2 Petrischale, die hier als sterile Unterstützung für die verwendet wird , bereits Einsätze beschichtet.
- Hinzufügen sanft 800 ul Poly-L-Lysin auf die Unterseite des Einsatzes (wie in 1A gezeigt, als RCAs seeding bezeichnet) und Halten der Lösung auf den Einsätzen für 1 h bei RT.
- Absaugen die Lösung und lassen Sie die Einsätze für 15-30 min bei RT trocknen. Die Einsätze sind nun bereit für die Zellaussaat, kann aber auch für mehrere in der Multi-Well-Platte gespeichert werdenTage bei 4 ° C, bevor sie mit dem BBB Konstruktion fortfahren.
Hinweis: Denken Sie daran, mindestens 3 beschichteten Einsätze frei von Zellen zu halten, als Kontrollen verwendet werden, um BBB-Einrichtung von FD40 Flussmessungen zu validieren.
- Seed RCAs (35.000 / cm 2) auf die Unterseite der Poly-L-Lysin-beschichtete Einsätze, durch Eintropfen 800 & mgr; l der Zellsuspension auf den Kopf Einsatz (1A). Verlassen das RCA-Suspension auf die Einsätze 4 h bei RT, um eine effiziente Bindung der Zellen an die Membran zu ermöglichen.
- Saugen Sie das restliche Lösung, legen Sie die Einsätze in Vertiefungen , die 2 ml SECM und halten die Multi-Well - Platte bei 37 ° C und 5% CO 2 in einer feuchten Atmosphäre, die SECM alle 2 Tage zu ändern.
- Nach 3 Tagen, wenn die RCAs haben die untere Fläche des Einsatzes, Samen RBMECs auf die obere Seite des Einsatzes, diesen Schritten folgt beschichtet:
- Nehmen Sie RBMECs aus T175-Flaschen und zählen dieInsgesamt lebenden Zellen, wie 1.1.2 und 1.1.3 in den Schritten berichtet.
- Seed RBMECs (60.000 / cm 2) auf die obere Oberfläche des Einsatzes in SECM (1000 & mgr; l) (1B), so dass 3 - Einsätze mit den Astrozyten nur als TEER Hintergrund verwendet werden. Legen Sie die Multi-Well-Platte in Standardkulturbedingungen. Pflegen Sie das System zur Kultur für mindestens 3 Tage, alle 2 Tage, um die SECM in der inneren und der unteren Kammer zu verändern.
- Behandlung einer Seite der Polyethylen-Terephthalat (PET) -Membran von 6 Multi-Well transpaent Einsätze mit Poly-L-lysin 100 ug / ml und die andere Seite mit Fibronectin 50 ug / ml, Anhaftung von RCAs und BMECs zu ermöglichen. Behandeln Sie die Einsätze mit einer Pinzette, um den Kontakt mit der PET-Membran zu vermeiden.
2. BBB Validation
- TEER Mess
- Am 3. Tag der Co-Kultur, die TEER überprüfen , indem Sie die BBB-Lagerschalen in eine geeignete Kammer eingefügt (das hat eine Kappe und wo beide Kammer und Kappe enthalten ein Paar spannungs Erfassungs- und Stromelektroden), gefüllt mit 4 ml SECM. Eine Verbindung mit einem Epithelgewebe Volt / Ohmmeter.
- Zusammen mit den TEER-Messungen der Zell BBB-Systeme, die TEER-Werte der drei Einsätze notieren Sie die RCAs Lager that wird von den Werten der BBBs erhaltenen abgezogen werden. Multiplizieren die resultierenden TEER - Werte durch die Oberfläche des Einsatzes (4.2 cm 2), um die Ergebnisse als 2 Ω x cm auszudrücken.
- Vom 3. Tag der Co-Kultur, jeden Tag die TEER messen. Anmerkung: Nach einer anfänglichen Periode , wo der TEER zunimmt, sollten die aufgezeichneten Werte für mindestens zwei aufeinanderfolgende Tage ( in der Regel zwischen dem 5. und 7. Tag Kokultur) stabil bleiben. An diesem Punkt ist die BBB bereit für den zweiten Schritt der Validierung (Abschnitt 2.2) und / oder für die trans BBB Experimente.
Hinweis: Die Vorgehensweise in Abschnitt 2.1 kann auf die folgenden Permeabilität Experimente (Abschnitt 3) gewidmet auf den gleichen BBB-Systeme durchgeführt werden. Betreiben Sie unter sterilen Bedingungen.
- Trans-BBB Flux von FITC-Dextran 40 (FD40)
- Messen Sie den FD40 Fluss von der oberen in die untere Kammer der BBB-Modelle im Vergleich zu über 3 leere Einsätze(Siehe Hinweis in Abschnitt 1.2.1) nach den folgenden Schritten:
- 1 mg / ml FD40 (verdünnt in SECM) in die obere Kammer des BBBs, und nach 1, 2 und 3 Stunden zurückziehen 200 ul SECM aus der unteren Kammer und messen die Fluoreszenzintensität durch Spektralfluorimeters (λ ex 488 nm, λ em 515 nm, Schlitz 5).
- Besorgen Sie sich die Werte für die SECM Hintergrund fluorescenceby 500 ul virgin Medium Messung der gleichen analytischen Parametern. Ziehen Sie die SECM Hintergrundfluoreszenz von allen FD40 Fluoreszenzwerte.
- Bestimmung der Menge des durch FD40 durch Vergleich der beobachteten Fluoreszenzwerte mit einer Eichkurve mit bekannten Konzentrationen hergestellt (d. 0,312, 0,625, 1,25, 2,5 ug / ml) des fluoreszierenden Tracers in 500 ul SECM gelöst.
- Berechnen der scheinbaren Permeabilitätskoeffizienten (P app) aus den Mittelflusswerte gemäß:
P app = J / AC
2) und C die Konzentration des Moleküls in der oberen Kammer (Mol / cm 3) ist.
Hinweis: Drei oder mehr BBB-Systeme, die geeignete TEER-Werte erreicht haben, müssen gewidmet werden ausschließlich zu diesem Validierungsverfahren und sollten nicht für die folgenden Permeabilität Experimente (Abschnitt 3) eingesetzt werden. Sterility ist nicht zwingend.
- Messen Sie den FD40 Fluss von der oberen in die untere Kammer der BBB-Modelle im Vergleich zu über 3 leere Einsätze(Siehe Hinweis in Abschnitt 1.2.1) nach den folgenden Schritten:
3. Trans BBB Permeation von FITC-geladen Ferritine (FNN)
Hinweis: Eine rekombinante Variante von humanem Ferritin (Fn), hergestellt in Escherichia coli und montiert in Nanokäfige (FNn) zur Verkapselung von verschiedenen fluoreszierenden Molekülen, aus dem NanoBioLab von Prof. Prosperi (Universität Mailand-Bicocca, Italien) erhältlich ist. Fnn mit FITC geladen, entsprechend einem zuvor beschriebenen Protokoll 13 und den Konzentrationen sowohl von Fn und die geladenen Moleküle genau determined.
- Trans-BBB Flux von FITC und FITC-FNN
- Messen Sie die FITC-fnn Fluss von der oberen zur unteren Kammer validierter BBB Modelle (üblicherweise am 5. - 7. Tag der Co-Kultur), im Vergleich zu dem des freien Farbstoffes nach 7 und 24 Stunden der Inkubation gemäß die folgenden Schritte:
- In FITC-FNN (50 ug / ml FNN, 1,1 uM FITC) oder eine gleiche Menge an freiem FITC in die obere Kammer von mindestens 6 BBB-Systeme für jede Formulierung, um 2 ml SECM Lösung aus der unteren Kammer zurückzuziehen von mindestens 3 Einsätze nach 7 h, und von der unteren Kammer von anderen 3 Einsätze nach 24 Stunden.
- Messen der Fluoreszenzintensität von 500 & mgr; l der gesammelten Proben durch Spektrofluorimeter (λ ex 488 nm, λ em 515 nm, Schlitz 5).
- Beziehen Sie die SECM-Hintergrundfluoreszenz von 500 ul Medium Messung der gleichen analytischen Parametern. Ziehen Sie die SECM Hintergrundfluoreszenzvon allen FITC oder FITC-FNN Fluoreszenzwerte.
- Bestimmung der Konzentration des permeierten FITC oder FITC-fnn durch die erhaltenen Fluoreszenzwerte mit zwei verschiedenen Kalibrierungskurven erzeugt mit bekannten Konzentrationen zu vergleichen (d. 6,87, 13,75, 27,5, 55 nM) des freien oder nanoformulated Farbstoff in 500 ul SECM gelöst.
- Messen Sie die FITC-fnn Fluss von der oberen zur unteren Kammer validierter BBB Modelle (üblicherweise am 5. - 7. Tag der Co-Kultur), im Vergleich zu dem des freien Farbstoffes nach 7 und 24 Stunden der Inkubation gemäß die folgenden Schritte:
- FITC-FNN Lokalisierung in RBMECs
- Entfernen SECM aus der oberen Kammer der BBB-Systeme, waschen Sie die Einsätze mit PBS und fixieren die RBMECs auf mindestens zwei Einsätze für jede Versuchsgruppe durch Zugabe von 500 ul Paraformaldehyd (4% in Phosphatpuffer Saline-PBS) in der oberen Kammer 10 min bei RT.
- Waschen Sie die Einsätze dreimal mit PBS Restparaformaldehyd zu entfernen.
Anmerkung: Von diesem Punkt an die Sterilität nicht notwendig ist. - Schneiden Sie geeignete Stücke der PET-Membran, und fahren Sie mit der immunodecoration der Zellen gemäß den folgenden Schritten:
- Permeabilize RBMECs mit 0,1% Triton X-100 in PBS für 10 Minuten. Durchführen eines Blockierungsschritt für 1 h bei RT mit einer Lösung, die 2% Rinderserumalbumin (BSA), 2% Ziegenserum in PBS. Inkubieren der Proben mit einem anti-von Willebrand Faktor (VWF) bei einer Verdünnung von 1:20, für 2 h bei RT.
- Nach dreimaligem Waschen mit PBS, setzen die Zellen für 2 h bei RT zu einer 2% BSA, 2% Ziegenserum-Lösung mit einer geeigneten sekundären Antikörper bei einer 1 enthält: 300 Verdünnung, um zu offenbaren, die anti-VWR und DAPI bei a 1: 1500 Verdünnung für Kerne Erkennung.
- Montieren Sie die Einsatzstücke auf Objektträger unter Verwendung einer verblassungshemmenden Montagelösung (ein Tropfen pro Insert-Fragment), dann schließen Sie die Probe mit einem Deckglas. Analysieren durch konfokale Mikroskopie eine Öltauchlinse bei 40-facher Vergrößerung unter Verwendung von 1,5-Zoom und 1.024 x 1.024 Pixel Auflösung.
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Representative Results
Während der Einrichtung der BBB-Modell, die Zellanheftung und Wachstum auf der Einsätze können mit einem Lichtmikroskop durch die transparente Natur der PET-Membranen werden überwacht. RCAs, bei einer Dichte von 35.000 Zellen / cm 2, befestigen effizient an der Unterseite des Einsatzes nach 4 h Inkubation bei RT (2A) und wachsen , um die Membranoberfläche in 3 Tagen zu bedecken, eine spindelförmige Morphologie wobei (2B). RBMECs, bei einer Dichte von 60.000 Zellen / cm 2, sichtbar an der oberen Fläche der Membran befestigt PET nach etwa 3 h Inkubation bei 37 ° C (2C). Die Entwicklung RBMEC Schicht kann schwierig sein , in den nächsten Tagen mit einem optischen Mikroskop sichtbar zu machen, wegen der Überlappung mit der darunterliegenden Schicht RCA (2D).
Eine korrekte Validierung des BBB Modell erfordert immer TEER Messung und dies kann durch die Auswertung der trans-BBB P app einer geringen Durchlässigkeit Tracers wie FD40 bestätigt werden.
Die TEER-Werte, über die Cokulturzeit aufgenommen, stellen die erste klare Hinweis auf die korrekte Bildung der endothelialen Barriere. Drei Tage nach der Aussaat RBMEC, die aufgezeichnete TEER, subtrahiert von der TEER der Astrozyten tragenden Einsätze, ist im Wesentlichen auf den Beitrag der nicht-elektro Schicht RCAs und die Entwicklungsschicht RBMECs. Zu diesem Zeitpunkt haben unsere BBB gibt Werte zwischen 20 und 40 Ω x cm 2. In den folgenden Tagen, in der Regel zwischen dem 4. und dem 5. Tag der Co-Kultur, Werte der TEER Anstieg wegen der Bildung von tight junctions zwischen benachbarten Endothelzellen 14 Werte in der Regel zwischen 55 und 110 Ω x cm 2 erreicht, und in Ausnahmefällen hallogher Werte 14. Die gemessenen Werte am 4. / 5 - ten Tag Kokultur stabil bleiben , zumindest bis zum 7. - 8. Tag , bevor sie abzunehmen beginnen; Daher ist es ein sehr enges Zeitfenster zur Verfügung für die Durchführung der trans BBB Fluss Experimente.
Zwischen dem 5. und 7. Tag Kokultur, die Integrität der experimentellen Modelle können durch Auswertung der FD40 trans-BHS - Permeabilität bestätigt werden. Abbildung 3 zeigt ein Beispiel des trans-BBB Fluss von FD40 (1 mg / ml ), durch den leeren Einsätze an den Fluss verglichen, über 3 Stunden Inkubation; die BBBs sind am 6. Tag der Co-Kultur und die aufgezeichnete TEER beträgt 55,6 ± 15,8 Ω cm 2 (Mittelwert ± SE, n = 3). Das Flussmittel ist linear zwischen 1 und 3 h Inkubation und dem Mittelwert P app berechnet zwischen 1 und 2 h und zwischen 2 und 3 Stunden der Inkubation ist0,12 ± 0,01 x 10-6 cm sec - 1 (± SE, n = 6).
Sobald mindestens drei aufeinander folgenden erfolgreichen BBBs, in Bezug auf den TEER und FD40 P app wurden in unabhängigen Experimenten erhalten worden , um die Messung der Tracer - Permeabilität vermieden werden kann; jedoch muss der TEER immer für jedes Experiment aufgezeichnet.
Die trans-BHS - Permeabilität von fluoreszierenden Molekülen und der Effekt der Nanokomplexe auf ihre Abgabe kann unter Verwendung des Ratten - BBB - Modelle oben beschrieben untersucht werden. Figur 4 zeigt die Permeation des Modells Farbstoff FITC auf Verkapselung in fnn über BBBs mit TEER von 100,4 ± 3,5 Ω cm 2 (n = 16) am 7. Tag der Co-Kultur. Die Histogramme, darstellt FITC-Konzentration in der unteren Kammer nach 7 und 24 Stunden von der Zugabe von Farbstoff frei oder nanoformulatedin der oberen Kammer, zeigen an, dass fnn Lage ist, die Lieferung von FITC über die BBB deutlich zu erhöhen.
Konfokale Mikroskopbilder von der oberen Seite des Einsatzes nach 7 und 24 Stunden der Inkubation mit FITC-fnn (5A, C) oder FITC (5B, D) zeigen , dass , während freie FITC nicht durch die RBMECs internalisiert, dessen Laden in FNN ermöglicht es, die Zellen eindringen können.
Vor der Verarbeitung der Einsätze für die konfokale Mikroskopie, eine weitere Überprüfung des TEER ist notwendig, um sicherzustellen, dass keine fnn vermittelten Wirkungen auf Integrität BBB.
Abb . 1: Zellaussaat auf Einsätze RCA (A) und RBMEC (B) Impfvorgangs auf die beiden gegenüberliegenden Seitendie Multi-Well - Platte Einsätze. Bitte hier klicken , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 2:. Optisches Mikroskop Bilder von RCAs und RBMVECs auf Einsätze Einsätze ausgesät mit Cinch - Buchsen und RBMECs sind mit einem Lichtmikroskop beobachtet (20fach optischen Zoom). (A) Vier Stunden nach dem Aussäen, rund und durchscheinend RCAs werden sichtbar an der Bodenfläche des Einsatzes; (B) Spindelförmige RCAs sichtbar am 3. Tag der Kultur; (C) Round und transluzente RBMECs sind auf der oberen Seite des Einsatzes befestigt ist nach 3 h Inkubation; (D) Am 4. Tag Kokultur beiden Oberflächen des Einsatzes sind mit Zellen vollständig bedeckt, und die beiden layers sind nicht leicht zu unterscheiden. Maßstabsbalken = 100 & mgr; m. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abb . 3: FD40 Flux über die BBB Flux von FD40 (1 mg / ml) von der oberen zur unteren Seite der BBB in vitro - System im Vergleich zu dem über den leeren Einsatz. Die Menge des in FD40 unteren Kammer gemessen wurde bei 60, 120 und 180 min die Zugabe des Farbstoffs zu der oberen Kammer schreiben. Mittel ± SE; n ° Einsätze = 3. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 4: Wirkung der fnn Encapsulation auf FITC Permeation über die BBB Konzentration von FITC in der unteren Kammer der BBB in vitro System bei 7 und 24 Stunden nach der Zugabe von FITC oder FITC-fnn in die obere Kammer berechnet.. Mittelwert ± SE von 4-5 Wiederholungen; **** P <0,0005, FITC-FNN vs. FITC (t-Test nach Student). Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 5: konfokale Mikroskopie von RBMECs auf Inserts konfokalen Laser-Scanning - Mikroskopaufnahmen (Einzel optische Schnitte) von RBMECs nach 7 h (A, B) oder 24 Stunden (C, D) von der Inkubation mit freiem FITC (B, C) oder FITC. -FnN (A,
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Discussion
Die in vitro hier beschriebene Verfahren stellt einen nützlichen Ansatz validierten die trans-BBB Lieferung von fluoreszierenden Molekülen auf Nanoformulierung mit Nanopartikeln zu studieren. Hier verwenden wir FNN, die einen guten Kandidaten stellt die Verlagerung von Fracht-Moleküle über die BBB zu studieren. Fnn ist das Gold nanovector für trans-BBB Lieferung von Arzneimittel / Mittel angesehen, da sie spezifisch durch die TfR1 Rezeptor erkannt wird, die auf der luminalen Membran BMECs exprimiert und vermittelt die Nanopartikel Aufnahme einen Rezeptor-vermittelten Internalisierung Weg verwendet wird. Darüber hinaus ist FNN eine natürliche Nanopartikel und es hat daher eine gute Biokompatibilität Profil. Schließlich ist fnn können geringe Dimension wasserlöslichem Moleküle durch einen einfachen und effizienten Mechanismus zu verkapseln. Die trans-BBB Permeation von anderen verschiedenen Arten von organischen oder anorganischen Nanopartikel auch mit diesem Protokoll untersucht werden konnten, nach wenigen Überlegungen hinsichtlich Nanoteilchen Funktionen. erste prerequisite die Permeation von nanoformulated Drogen / Agenten zu studieren ist die Sicherheit der Leere Nanopartikel. Ein weiteres wichtiges Thema ist die Interaktion der untersuchten Nanopartikel mit dem PET-Filter. Dieser Aspekt hat, ausgewertet werden vorbereitend um eine signifikante Retention in den Membranporen auszuschließen und über die BBB Veränderungen ihrer Permeation zu vermeiden. Unsere Gruppe hat die geplante Strategie vor kurzem eingesetzt , um eine Polymer-beschichteten Eisenoxid - Nanopartikel als trans-BBB - Abgabesystem für die Fluoreszenz-markierten antiretrovirale Medikamente 14 zu studieren. In diesem Fall wir Elektronenmikroskopie Lokalisierung von Nanoformulierungen in RBMECs zur Fluoreszenzdetektion zugeordnet ist. Darüber hinaus können andere hochempfindlichen diagnostischen Verfahren, wie induktiv gekoppeltem Plasma (ICP) -MS könnte die trans-BBB Lieferung von anorganischen Nanosysteme zu bewerten eingesetzt werden.
Die BBB in - vitro - Modell in diesem Protokoll verwendet wird , basiert auf Co-Kultur von Ratten - BMECs und Astrozyten. Im breiten Szenario der BBB - Modelle 10,11,12, von denen einige in der Literatur mit einem gut detailliertes Protokoll genau beschrieben worden ist 15, steht für unser Modell eine gute Qualität Alternative. In der Tat, auch wenn die aufgezeichnete TEER unter den besten Standards wurde vorgeschlagen , in der Literatur (150-200 Ω cm 2) 10, das trans-BHS - Permeabilität der hohen Dimensions tracer 40 Dextran unter Bildung einer dichten Barriere in völlige Übereinstimmung war.
Dieses in vitro - Modell, erhalten mit handelsüblichen Ratte BMECs und Astrozyten, hat einige Vorteile: (1) eine optimale Wachstumseffizienz der Endothelzellen, (2) eine geeignete Zeitdauer für die Herstellung des endgültigen BBB - Modell (nicht mehr als 13 Tage), (3) die Einhaltung der ethischen Fragen, die Vermeidung der Verwendung von Zellen aus menschlichem Gehirngewebe (Autopsie Materialien, chirurgischen Proben und fötalen Gewebe) und 4) Einsparung von Zeit und Kosten zur Unterbringung der Tiere im Zusammenhang und primäreZellen-Extraktion. Dennoch ist eine Beschränkung des vorliegenden Modells auf die hohen Kosten für das nicht-immortalisierte primäre RBMECs bezogen, die (gefroren bei Durchgang eins) für jede experimentelle Einstellung erworben werden muss. Tatsächlich haben unsere vorläufigen Studien von BBB Produktion gezeigt, dass die Fähigkeit von Endothelzellen eine enge BBB herzustellen streng mit der Anzahl der Passagen in Kultur der RBMECs nach dem ersten nach dem Kauf Auftauen zugeordnet ist. Die weitere Umsetzung des Modells BBB beschrieben hier mit endothelialen Ergänzungen, wie cAMP und Hydrocortison, könnte erwogen werden , um endotheliale Dichtigkeit zu verbessern und TEER - Werte erhöhen. 10,11,16
Die vorliegende Technik wird auf die Möglichkeit im Zusammenhang mit für verschiedene Assays Vorteil eines einzigen BBB-Modell zu nehmen, also mehrere Datensätze von jeder experimentellen Rahmen. Mit einem einzigen System BBB ausgesetzt fluoreszierende Moleküle frei oder nanocomplexed ist es möglich: (1) zu messen the trans-Barriereflusses des Moleküls durch die Fluoreszenzintensität von SECM Aliquots aus der unteren Kammer zu verschiedenen Zeitpunkten der Inkubation gesammelt, analysiert; (2) die Nano-vermittelte Internalisierung der Moleküle in RBMECs und ihre intrazellulären Transport durch konfokale Mikroskopie-Analyse der Zellen auf Inserts zu untersuchen; (3) eine Anzeige des Status der BBB-Zellen nach Exposition gegenüber den Nanoformulierungen zu erhalten, die von TEER Messung am Ende des Experiments oder durch Endothel Integrität durch Elektronenmikroskopie analysiert.
Abschließend hier beschrieben wir ein Protokoll für die Untersuchung der Permeation von nanocomplexed fluoreszierenden Molekülen über einen hochwertigen BBB in vitro - Modell. Wir betrachten diese Methode ein nützliches Instrument, um die Wirkung von Nanoformulierung auf Arzneimittelabgabe über die BBB für die Untersuchung.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Rat Brain Microvascular Endothelial Cells | Innoprot | P10308 | isolated from Sprague Dawley rat brain tissue, cryopreserved at passage one and delivered frozen |
| Cortical Astrocytes | Innoprot | P10202 | isolated from 2 days rat brain tissue, cryopreserved at passage one and delivered frozen. |
| Endothelial Cell Medium kit | Innoprot | P60104 | ECM (500 ml) and fetal bovin serum (25 ml), endothelial cell growth supplement (5 ml) and penicillin/streptomycin (5 ml). Warm in 37 °C water bath before use and protect from light |
| Trypsin-EDTA without Phenol Red | EuroClone | ECM0920D | Warm in 37 °C water bath before use |
| Fluorescein isothiocyanate-dextran 40,000 | Sigma | FD40S | protect from light |
| paraformaldehyde | Sigma | 158127 | diluition in chemical hood |
| Dulbecco's phosphate buffer saline w/o Ca and Mg | EuroClone | ECB4004L | |
| Triton X-100 | Sigma | T8787 | |
| bovine serum albumin | Sigma | A7906 | |
| goat serum | EuroClone | ECS0200D | |
| mouse monoclonal anti-Von Willebrand Factor | Dako | M0616 | |
| AlexaFluor 546-conjugated antibody against mouse IgGs | ThermoFischer Scientific | A-11003 | protect from light |
| DAPI (4’ ,6-diamidino-2-phenylindole) | ThermoFischer Scientific | D1306 | protect from light |
| ProLong Gold Antifade Mountant | ThermoFischer Scientific | P36934 | |
| Poly-L-lysine Hydrobromide | Sigma | P1274 | the same solution can be used several times |
| fibronectin from bovine plasma | Sigma | F1141 | the same solution can be used several times |
| Polyethylene terephthalate (PET) inserts | Falcon | F3090 | Transparent Polyethylene terephthalate (PET) membranes; surface area: 4.2 cm2; pore size 0.4 µm/surface area |
| T75 Primo TC flask | EuroClone | ET7076 | |
| T175 Primo TC flask | EuroClone | ET7181 | |
| EVOM2 Epithelial Tissue Volt/Ohmmeter | World Precision Instruments Germany | EVOM2 | |
| Endohm- 24SNAP cup | World Precision Instruments Germany | ENDOHM-24SNAP | |
| Light/fluorescence microscope with camera | Leica Microsystems | DM IL LED Fluo/ ICC50 W Camera Module | inverted microscope for live cells with camera |
| Confocal Microscope | Leica Microsystems | TCS SPE | |
| Spectrofluorimeter | Jasco | FP-8000 |
References
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