Introduction
Farmakolojik tedavilere merkezi sinir sistemi direnci (merkezi sinir sistemi) hastalıkları (örn., Kanser, epilepsi, depresyon, şizofreni, HIV ile ilişkili nörolojik bir bozukluk) nedeniyle, kan-beyin bariyeri boyunca zorlu ilaç nüfuz dahil olmak üzere çeşitli farklı mekanizmalarla için (BBB) . BBB kanda dolaşan maddelerden beyin dokuları izole eder sınırıdır. Bu bariyer içinde, perisitler ve astrositler endfeet tarafından desteklenen beyin mikrovasküler endotelyal hücreler (BMECs) 'in bir tabakası, bir molekül ağırlığı daha yüksek 400 da 1 olan suda çözülebilen ilaçlara BBB yüksek seçicilik sorumludur. Başka bir ilaç ile ilişkili dirençli mekanizması CNS'ye madde girişini engellemek ve beyin 2 ekstrüzyonu kolaylaştırmak için işbirliği ilaç akış taşıyıcı (P-glikoprotein ve çoklu ilaç direnci proteini), bir BMECs ilgili varlığı ile bağlantılıdır.
Son on yılda, Nanoteknolojik yaklaşımlar çok sayıda BBB 3-6 genelinde uyuşturucu teslim klinik ve biyolojik zorluğu aşmak için geliştirilmiştir. Bu bağlamda, ferritin nanosferler (FNN) tamamen yenilikçi ve gelecek vaat eden bir çözüm oluşturmaktadır. FNN 8 mil iç çapa sahip olan bir içi boş bir küre yapısında düzenlenmiş 24 kendinden montaj ferritin (FN) monomerler, 12 mil kürelerdir. Ferritin alt-birimleri, asidik pH değerinde demonte ve çeşitli organik moleküller kapsüllenecek sağlayan nötr pH getirerek şekil hafızalı bir şekilde kurulabilir. Bu nedenle, FNN çok fonksiyonlu bir ilaç verme sistemleri 7,8 geliştirilmesi için ilginç bir modeli temsil eder. Ayrıca, FNN bu hücrelerin 9 lüminal zarı üzerinde ifade edilen transferin reseptörü (TfR), 1, spesifik tanıma BMECs teşekkür ile etkileşime girebilir.
Şimdiye kadar, BBB in vitro modellerde farklı accueillante geliştirilmiştirr çeşitli ilaçlar, BBB doğru toksisite, ya da akış nakliyeci ile moleküllerin etkileşimi trans-BBB geçirgenliği aydınlatmak için. Gerçekten de, bu modelleri, in vivo çalışmalar ile devam etmeden önce, aktif moleküllerin hızlı taranması için yaklaşımlar, in vitro olarak geçerli kabul edilir. Bu modeller, hayvan (fare, fare, domuz ve dana) veya insan hücre çizgileri 10,11,12 elde BMECs ya da ko-kültür BMECs ve astrositler (nadiren perisitler) tek bir endotel tabaka oluşur. Transendotelyal elektrik direnç (TEER) ve belli bir molekül ağırlığına sahip izleyicilerin belirgin geçirgenlik (Papp) in vitro modelin kalitesini belirlemek için kullanılan iki önemli parametreler temsil etmektedir. Burada sıçan BMECs (RBMECs) bir ko-kültür dayalı bir BBB in vitro modelin istihdam, açıklamak ve sıçan kortikal astrositler (RCAs) floresein isothi encapsulating ferritin nanocages trans-BBB nüfuz incelemek içinocyanate (FITC).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. BBB Modeli Kurulması
Not: piyasada mevcut birincil RBMECs ve RCAS kullanmanızı öneririz BBB modeli oluşturmak için. Tüm adımlar, bir laminar akış başlığı içinde ele steril reaktifler ve tek kullanımlık ile gerçekleştirilmelidir.
- Hücre kültürü
- poli-L-lisin, 100 ug / ml (1 saat oda sıcaklığında) veya fibronektin 50 ug / ml (37 ° C de 1 saat) ile kaplayın hücre kültürü şişeleri sırasıyla RCAS veya RBMECs yapışmasını teşvik etmek. Daha sonra,% 5 fetal sığır serumu,% 1 endotel hücre büyüme takviyesi ve% 1 penisilin / streptomisin (SECM) ile desteklenmiş 1 x 10 6 RCA'ların ve endotel hücre ortamında 5 x 10 5 RBMECs, çözülme. 10 mi SECM bir T75 şişesi içinde 20 mL SECM ve RBMECs bir T175 şişesi içinde tohum RCAs.
Not: çözülme ve RCA'ların ve RBMECs tohumlama geçitleri kültüründe, hücre yoğunluğu ve zaman açısından ayarlanması gerekir BBB modeli ile test edilecek olan deneysel koşullar sayısına göre yöntem. başlangıç tarafından1 x 10 6 RCA'ların 1 flakon ve 5 x 10 5 RBMECs 1 flakon ile ing, 20 BBB taşıyan ekler kadar elde etmek mümkündür. - RCA'ların için yaklaşık% 80 konflüense kadar 37 ° C'de ve% 5, yaklaşık 6 gün boyunca nemli bir atmosferde CO2 hücreleri korumak ve RBMECs için% 90 üzerinde birleşir. 5 dakika (T75 balonlarına 1 mi tripsin ve T175 şişelerinden 2 mi): Tripsin-EDTA çözeltisi (250 tripsin 1) kullanarak hücreleri ayırın. SECM tripsin aktivitesi durdurun (2: 1), 5 dakika boyunca 750 x g'de santrifüj hücre süspansiyonları, 60 mi SECM pelet tekrar süspansiyon.
- ekler üzerine ekim önce başka bir 3 gün SECM 3 T175 şişeler ve kültürün içine RBMECs Böl. bir Bürker odasında bir optik mikroskop altında tripan mavisi ile 1: 1 seyreltilmiş, bir hücre süspansiyonu gözlemleyerek, RCAS yaşam sayısı.
- poli-L-lisin, 100 ug / ml (1 saat oda sıcaklığında) veya fibronektin 50 ug / ml (37 ° C de 1 saat) ile kaplayın hücre kültürü şişeleri sırasıyla RCAS veya RBMECs yapışmasını teşvik etmek. Daha sonra,% 5 fetal sığır serumu,% 1 endotel hücre büyüme takviyesi ve% 1 penisilin / streptomisin (SECM) ile desteklenmiş 1 x 10 6 RCA'ların ve endotel hücre ortamında 5 x 10 5 RBMECs, çözülme. 10 mi SECM bir T75 şişesi içinde 20 mL SECM ve RBMECs bir T175 şişesi içinde tohum RCAs.
- Eklemeler üzerine Hücre Yayımlama
- 6 çoklu-çukurlu transpar polietilen tereftalatın bir tarafına işlenir (PET) membran100 ug / ml poli-L-lisin ve fibronektin 50 ug / ml diğer tarafta, KBB uçlar RCA'ların ve BMECs bağlanmasına izin vermek. PET membranı ile temasını engellemek için cımbız ile ekler anlaştım.
- Üst bölme içine fibronektin çözeltisi (en az 500 ul), bir 6 yuvalı plaka içine giren yerleştirin ve ekleyin. 37 ° C'de inkübasyondan 1 saat sonra, fibronektin çözüm kaldırmak çok kuyucuklu plaka kapalı uçlar bir sürede ve steril bir destek olarak kullanılır 150 cm2 Petri kabı alt ters koydu zaten ekler kaplı.
- Yavaşça (Şekil 1A 'de gösterildiği gibi, RCAs tohumlama olarak anılacaktır) parçanın alt tarafına poli-L-lisin, 800 ul, ve oda sıcaklığında 1 saat süre ile ekler üzerinde çözüm tutmak.
- solüsyonu aspire ve ek 15-30 dakika boyunca oda sıcaklığında kurumaya bırakın. uçlar artık hücre tohumlama hazır değil, aynı zamanda birden fazla çoklu plaka saklanabilirBBB yapı ile devam etmeden önce, 4 ° C 'de gün.
Not: FD40 akı ölçümü ile BBB kuruluş doğrulamak için kontrol olarak kullanılmak üzere, hücreler serbest en az 3 kaplı insertler tutmak için unutmayın.
- Tohum RCAs uç (Şekil 1A) baş aşağı üzerine hücre süspansiyonu 800 ul bırakarak poli-L-lizin kaplı insertler alt tarafına (35.000 / cm2). zara hücrelerin etkin bağlanmasına olanak sağlamak üzere, oda sıcaklığında 4 saat için ekler RCA süspansiyon bırakın.
- Geri kalan solüsyon aspire SECM 2 ml içeren kuyu içine ekler yerleştirin ve her 2 günde bir SECM değişen nemli bir atmosferde 37 ° C'de ve% 5 CO2 seviyesinde, çok oyuklu plaka muhafaza.
- 3 gün sonra, ne zaman RCAs ucun alt yüzeyi kaplanmış olan, aşağıdaki adımları ucun üst tarafına tohum RBMECs:
- T175 şişelerinden RBMECs ayırın ve saymaktoplam canlı hücreler, adım 1.1.2 ve 1.1.3 bildirildiği gibi.
- Astrositler, sadece 3 uçlar bırakarak SECM (1.000 ul) (Şekil 1B) ekin üst yüzeyi üzerine Tohum RBMECs (60,000 / cm2), TEER arka planı olarak kullanılır. standart kültür koşullarında çok oyuklu plaka koyun. her 2 günde bir, iç ve alt bölmede ise SECM değişen en az 3 gün süre ile kültüre sistemi korumak.
- 6 çoklu-çukurlu transpar polietilen tereftalatın bir tarafına işlenir (PET) membran100 ug / ml poli-L-lisin ve fibronektin 50 ug / ml diğer tarafta, KBB uçlar RCA'ların ve BMECs bağlanmasına izin vermek. PET membranı ile temasını engellemek için cımbız ile ekler anlaştım.
2. BBB Doğrulama
- TEER Ölçümü
- Eş-kültür 3. günde, uygun bir bölme içine BBB taşıyan insertler sokulmasıyla TEER kontrol (yani, bir kap ve haznesi ve kapak hem voltaj algılama ve akım elektrotları, bir çift içeren yerde) 4 dolu SECM ml. Bir epitel doku volt / ohmmetre bağlayın.
- Birlikte hücre BBB-sistemleri TEER ölçümleri ile, RCAS inci taşıyan 3 ekler TEER değerleri kaydetmekEn BBBs ile elde edilen değerlerden düşülür. Ω x cm 2 gibi sonuçları ifade etmek için insert (4.2 cm 2) yüzeyi tarafından ortaya çıkan TEER değerleri çarpın.
- Ko-kültür 3. gününden itibaren, her gün teer ölçün. Not: TEER artıran bir başlangıç döneminden sonra, kayıtlı değerlerinin (genellikle 5. ve ko-kültür 7. gününde arasında) en az iki gün üst üste istikrarlı kalmalıdır. Bu noktada BBB doğrulama (Bölüm 2.2) ve / veya trans-BBB deneyler için ikinci aşama için hazır hale gelir.
Not: Bölüm 2.1'de açıklanan prosedür aşağıdaki geçirgenlik deneyleri (bölüm 3) ayrılmış, aynı BBB-sistemler üzerinde yapılabilir. steril koşullar altında çalışırlar.
- Trans-BBB Flux FITC-dekstran 40 (FD40)
- 3 boş ekler arasında karşılaştırıldığında BBB modellerinin alt haznesine üst dan FD40 akı ölçünAşağıdaki adımlara göre (bölüm 1.2.1 nota bakınız):
- 1 mg ekleme / ml FD40 BBBs üst bölmesine (SECM içinde seyreltilmiş) ve N-, em 1, 2 ve 3 saat sonra alt bölme 200 ul SECM çekme ve λ ex (spektroflorimetre ile 488 nm fluoresans şiddetini ölçmek 515 nm) 5 yarık.
- Aynı analitik parametreleri kullanarak bakire orta 500 ul ölçme fluorescenceby SECM arka plan için değerler elde. Tüm FD40 floresans değerlerinden SECM arka floresan çıkarın.
- Bilinen konsantrasyonda (yani. 0.312, 0.625, 1.25, 2.5 ug / ml) SECM 500 ul içinde çözülmüş flüoresan tracer üretilen bir kalibrasyon eğrisi ile, gözlenen floresans değerlerinden karşılaştırılması ile nüfuz FD40 miktarını belirler.
- Göre ortalama akı değerlerden belirgin geçirgenlik katsayısı (P uygulaması) hesaplayın:
P app = J / AC(cm2) ve Cı üst bölmeye (mol / cm3) molekülün konsantrasyonudur.
Not: Uygun TEER değerlere ulaşmıştır Üç veya daha fazla BBB-sistemleri, münhasıran bu doğrulama prosedürüne tahsis edilmeli ve aşağıdaki geçirgenlik deneyleri (bölüm 3) için kullanılan edilmemelidir. Sterilite zorunlu değildir.
- 3 boş ekler arasında karşılaştırıldığında BBB modellerinin alt haznesine üst dan FD40 akı ölçünAşağıdaki adımlara göre (bölüm 1.2.1 nota bakınız):
3. trans-BBB FITC yüklü ferritinin nüfuz (FNN)
Not: farklı floresan moleküller kapsüllenmesi için nanocages (FNN) Escherichia coli içinde üretilen ve monte insan ferritin bir rekombinant varyantı (FN), Prof. Prosperi bölgesinin NanoBioLab (University of Milan-Bicocca, İtalya) elde edilebilir. FNN, FITC ile yüklenir, daha önce tanımlanmış olan protokole 13 ve hem de Fn ve yüklenmiş moleküllerin konsantrasyonları uygun doğru determin areEd.
- FITC Trans-BBB Akı ve FITC FNN
- Göre inkübasyon 7 ve 24 saat sonra serbest boya ile karşılaştırıldığında, - (CO-kültür 7. gün, genellikle 5 inci) doğrulanmış BBB modelleri alt bölmeye yukardakine FITC FNN akının ölçülmesi aşağıdaki adımlar:
- FITC FNN (50 ug / ml FNN, 1.1 uM FITC) için ya da her bir formülasyon için en az 6 BBB sistemleri üst bölme içine serbest FITC eşit miktarda, alt bölmeden SECM çözeltisi 2 mi geri ekle 7 saat sonra ve 24 saat sonra, diğer 3 uçlar alt bölmeden en az 3 ekler.
- Spektrofluorimetresi ile toplanan numunelerin 500 ul fluoresans şiddetini ölçmek (λ ex 488 nm, λ em 515 nm, 5 yarık).
- aynı analitik parametreleri kullanarak ortam 500 ul ölçülerek SECM arka floresan elde edilir. SECM arka plan floresan çıkarmaTüm FITC ya da FITC-FNN floresans değerlerinden.
- 500 ul SECM içinde çözülmüş serbest veya nanoformulated boyanın bilinen konsantrasyonlarda (yani. 6.87, 13.75, 27.5, 55 nM) ile üretilen iki farklı kalibrasyon eğrileri elde edilen floresan değerleri karşılaştırarak nüfuz eden FITC veya FITC FNN konsantrasyonunu belirleyin.
- Göre inkübasyon 7 ve 24 saat sonra serbest boya ile karşılaştırıldığında, - (CO-kültür 7. gün, genellikle 5 inci) doğrulanmış BBB modelleri alt bölmeye yukardakine FITC FNN akının ölçülmesi aşağıdaki adımlar:
- RBMECs FITC-FNN Lokalizasyon
- BBB sistemleri üst bölmeden SECM kaldırma PBS ile uçlar yıkayın ve 10 için üst bölmeye 500 ul paraformaldehid (fosfat tamponlu salin-PBS içinde% 4) ilave edilerek her bir deney grubu için en az iki ekin üzerine RBMECs tamir oda sıcaklığında min.
- artık paraformaldehid çıkarmak için PBS uçlar üç kez yıkayın.
Not: Bu noktadan itibaren, kısırlık gerekli değildir. - PET membran uygun parçalar kesin ve aşağıdaki adımları göre hücrelerin immündekorasyon ile devam edin:
- permeabi10 dakika boyunca PBS içinde% 0.1 Triton X-100 ile lize RBMECs. PBS içinde% 2 sığır serum albümini (BSA),% 2 keçi serumu ihtiva eden bir çözelti ile oda sıcaklığında 1 saat için bloke aşamasını gerçekleştirir. Oda sıcaklığında 2 saat süre ile, 1:20 seyreltide bir anti-Von Willebrand Faktörü (vWF) ile inkübe edin.
- PBS ile üç kez yıkandıktan sonra,% 2 BSA için oda sıcaklığında 2 saat boyunca hücrelerin maruz, 1 uygun bir ikincil antikor ihtiva eden% 2 keçi serumu çözeltisi: sırayla 300 seyreltme anti-VWR ve DAPI ortaya çıkarmak için 1: çekirdek tespiti için 1500 dilüsyon.
- Bir antifade montaj çözümü (insert fragmanı başına bir damla) kullanarak mikroskop lamı üzerine ekleme parçaları monte sonra bir kapak kayma ile örnek kapatın. 40X büyütme, 1.5 zoom ve 1024 x 1024 piksel çözünürlükte bir immersiyon yağı lens kullanarak konfokal mikroskobu ile analiz edin.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
ekler üzerinde bbb modeli, hücre yapışmasında ve büyüme kurulması sırasında PET membran saydam yapısı bir ışık mikroskobu sayesinde kullanılarak izlenebilir. 35.000 hücre / cm2, oda sıcaklığında (Şekil 2A) inkübasyon 4 saat sonra parçanın alt tarafına etkin bir şekilde eklemek yoğunluğunda tohumlanır RCAs ve bir mil şeklinde bir yapıya alma 3 gün zar yüzeyini kaplamak için büyümeye (Şekil 2B). 60.000 hücre / cm2 'lik bir yoğunlukta ekildi RBMECs, gözle görülür bir şekilde 37 ° C (Şekil 2C) inkübe yaklaşık 3 saat sonra, PET zarın üst yüzeyine bağlıdır. Gelişmekte olan RBMEC tabakası altta yatan RCA katman (Şekil 2D) ile üst üste binme, bir optik mikroskop aşağıdaki gün boyunca görselleştirmek için zor olabilir.
B doğru bir doğrulamaBB modeli her zaman TEER ölçümünü gerektirir ve bu gibi FD40 gibi düşük geçirgenlik izleyici, trans-BBB P uygulaması değerlendirilerek teyit edilebilir.
ko-kültür periyodu boyunca kaydedilir TEER değerleri, endotelyal engeli doğru oluşturulması ilk açık bir göstergesi gösterir. Üç gün RBMEC tohumlama sonra, astrositler taşıyan ekler TEER çıkarılır kaydedildi TEER, RCA'ların olmayan electrogenic tabaka ve RBMECs hazırlaması tabakasının katkısı kaynaklanmaktadır. Bu zaman noktasında, bizim BBB Ω 20 ila 40 x cm 2 arasında değişen değerler vermektedir. Takip eden günlerde, genellikle 4. ve ko-kültür 5. gününde arasında, TEER genellikle 55 ve 110 Ω x cm 2 arasında değerlere ulaşmaktadır, çünkü komşu endotel hücreleri 14 arasındaki sıkı kavşaklar oluşması artışı değerleri ve istisnai durumlarda merhabaGher 14 değer verir. Ko-kültür 4. / 5. gün ölçülen değerler en az 7 inci kadar stabil kalır - onlar azalmaya başlamadan önce 8 günde; Bu nedenle, trans-BBB akı deneyler yapılması için mevcut bir çok dar bir zaman penceresi vardır.
5. ve ko-kültür 7. gün arasında, deneysel modellerde bütünlüğü FD40 trans-BBB permeabilitenin değerlendirilmesi ile doğrulanabilir. Şekil 3 FD40 trans-BBB akışının bir örneğini göstermektedir (1 mg / ml ), inkübasyon 3 saat boyunca boş uçlar arasında akı ile karşılaştırıldığında; BBBs ko-kültür 6. gününde ve kaydedilen TEER 55.6 ± 15.8 Ω cm2'dir (ortalama ± SE, n = 3). Akı 1 ve 3 inkübasyon saat ve 1 ila 2 saat arasında hesaplanan ortalama P uygulama arasındaki doğrusal ve inkübasyon 2 ila 3 saattir0.12 ± 0.01 x 10-6 cm sn - 1 (± SE, n = 6).
Bir kez en az üç ardışık başarılı BBBs, TEER ve FD40 Papp açısından, iz geçirgenliği ölçümü önlenebilir bağımsız deneyde de elde edilmiştir; Bununla birlikte, TEER zaman her bir deney için kaydedilmesi gerekir.
Floresan moleküllerin trans-BBB geçirgenliği ve teslimat nano etkisi Şekil 4. BBB modelleri yukarıda açıklanan sıçan kullanılarak incelenmiştir 100.4 ± 3.5 TEER ile BBBs karşısında FNN kapsülleme üzerine modeli boya FITC nüfuz gösterir edilebilir eş-kültür 7. günde Ω cm2 (n = 16). serbest ya da nanoformulated boya ilavesi ile ilgili 7 ve 24 saat sonra alt bölme FITC konsantrasyonunu temsil eden histogram,Üst bölmeye, FNN anlamlı BBB boyunca FITC teslim artırmak mümkün olduğunu göstermektedir.
FITC FNN (Şekil 5A, C) ya da FITC inkübasyonu 7 ve 24 saat sonra insertin üst taraf konfokal mikroskop görüntüleri (Şekil 5B, D) göstermektedir serbest FITC RBMECs olarak, yükleme halinde tarafından içselleştirilir değilken FNN bu hücrelere girmek için izin verir.
konfokal mikroskopi için ekler işleme önce TEER bir başka onay BBB bütünlüğü üzerinde herhangi bir FNN dolayımlı etkileri sağlamak için gereklidir.
Şekil 1:. Karşılıklı iki kenarı üzerine Eklemeler üzerine Hücre Serpilmesi RCA (A) ve RBMEC (B) Tohum prosedürÇok iyi plaka ekler. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 2:. Eklemeler Optik Mikroskop RCA'ların görüntüleri ve RBMVECs Uçlar RCAs ve RBMECs bir ışık mikroskobu (20X optik zoom) ile gözlenir ile ekildi. (A), tohumlama, yuvarlak ve yarı saydam RCAs görünür parçanın alt yüzeyine bağlı sonra dört saat; (B) Mili şeklindeki RCAs kültür 3. gününde görünür; (C), yuvarlak ve yarı saydam RBMECs inkübasyon 3 saat sonra insertin üst tarafına monte edilmiştir; Eş-kültür, her iki ucun yüzeylerinin 4. günde (D) tam hücreleri ile kaplı ve iki gönüllü olaners kolayca ayırt edilemez. Ölçek çubuğu = 100 mikron. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 3:. BBB in vitro sistemde alt tarafına yukardakine FD40 BBB Flux (1 mg / ml) arasında FD40 Akı boş ucun karşısındaki göre. 60, 120 ve 180 dakika, üst bölmeye boyanın ilave sonrası en alt bölmede FD40 miktarı ölçülmüştür. ± SE anlamına gelir; n ° = 3. ekler bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 4:., Üst bölme içine FITC ya da FITC-FNN ilavesinden sonra 7 ve 24 saat sonra hesaplanmıştır BBB in vitro sistemde alt bölmesinde FITC BBB Konsantrasyon karşısında FITC permeabilitesi FNN kapsülleme etkisi. 4-5 çoğaltır ve ortalama ± SE; **** Vs p <0.0005, FITC FNN. FITC (Student t-testi). Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 5: ekler üzerinde RBMECs mikroskopisi 7 saat sonra, RBMECs Konfokal lazer tarama mikrograflan (tekli optik kesitler) (A, B) ya da 24 saat serbest FITC inkübasyonu (C, D) (B, C) ya da FITC. -FnN (A,
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Burada tarif edilen in vitro yöntem, nanopartiküller ile nanoformulation girdiğinde flüoresan moleküllerinin trans-BBB teslim incelemek için yararlı bir geçerli bir yaklaşım sunmaktadır. Burada BBB genelinde kargo moleküllerin translokasyon incelemek için iyi bir aday temsil FNN kullanın. Özellikle BMECs lüminal zarı üzerinde ifade edilen ve burada bir reseptör aracılı içselleştirme yolu kullanan nano partıkuler alımını aracılık eder TfR1 reseptör tarafından tanınır çünkü FNN ilaç / maddeleri trans-BBB teslimat altın nanovector olarak kabul edilir. Ayrıca, FNN doğal nanoparçacık ve bu yüzden iyi biyolojik uyumluluk profili vardır. Son olarak, FNN basit ve etkili bir mekanizma ile düşük boyut suda çözülebilen molekülleri barındırabilir yapabiliyor. organik veya inorganik nanopartiküllerin diğer farklı türde trans-BBB geçirgenlik da nanopartiküller özellikleri ile ilgili birkaç değerlendirmelere göre, bu protokol ile değerlendirilebilir. ilk pnanoformulated ilaçlar / ajanların nüfuz incelemek için ön koşulu geçersiz nanoparçacık güvenliğidir. Bir başka önemli konu PET filtresi ile araştırılmıştır Nanopartikülün etkileşimdir. Bu husus, membran gözenekleri içine önemli bir tutma dahil değildir ve BBB genelinde nüfuz etme değişiklikleri önlemek amacıyla, ön değerlendirilmelidir. Grubumuz yakın zamanda floresan etiketli antiretroviral ilaçlarla 14 için trans-BBB dağıtım sistemi gibi bir polimer kaplı demir oksit nanoparçacık incelemek için önerilen stratejiyi uyguluyor. Bu durumda, floresans algılama RBMECs içinde nanoformulations elektron mikroskobu lokalizasyonu ilişkili. Ayrıca, bu gibi Inductively Coupled Plasma (ICP) gibi diğer yüksek hassasiyetli tanı yöntemleri, -MS inorganik nano trans-BBB teslim değerlendirmek için kullanılabilecektir.
Bu protokolde kullanılan BBB in vitro model sıçan BMECs ve astrositlerin ko-kültür dayanmaktadır. Doğru iyi ayrıntılı bir protokol 15 literatürde tarif edilmiş olan BBB modelleri 10,11,12, geniş senaryo olarak, model, iyi kalitede bir alternatiftir. Nitekim, kaydedilen TEER iyi standartların altında olmasına rağmen literatürde (150-200 Ω cm 2) 10, Dextran 40 sıkı bir bariyer oluşumu ile toplam anlaşma oldu yüksek boyut izleyici trans-BBB geçirgenliği de önerdi.
Ticari olarak temin edilebilen, sıçan BMECs ve astrositler ile elde edilen bu in vitro model, birkaç avantaja sahiptir: Artık daha endotel hücrelerinin (1) uygun bir büyüme etkinliği, son BBB modelinde (üretimi için zaman (2) uygun bir süre 13 gün), (3) etik konular ile uyum, insan beyin dokusunun (otopsi malzemeler, cerrahi örneklerin ve fetal doku hücreleri) ve 4) zaman tasarrufu ve hayvan barınağı ile ilgili maliyetler ve birincil kullanımı kaçınarakHücreler çıkarma. Bununla birlikte, bu modelin bir sınırlama her bir deney ayarı için (geçit bir C'de dondurulmuştur) satın alınması gerekmektedir ölümsüzleştirilmemiş primer RBMECs yüksek maliyetler ile ilgilidir. Gerçekten de, BBB üretim Ön incelemelerimiz sıkı BBB üretmek üzere endotel hücrelerinin yeteneği katı sonrası ilk satın Çözündükten sonra RBMECs kültüründe geçitlerinin sayısı ile ilişkili olduğunu göstermiştir. Böyle cAMP ve hidrokortizon gibi endotel takviyeleri, burada açıklanan BBB modelinin uygulanması bu endotel sıkılığı artırmak ve TEER değerlerini arttırmak amacıyla düşünülebilir. 10,11,16
Mevcut teknik bu şekilde her bir deneysel ortamda birkaç veri setleri sağlayan farklı deney için tek BBB modelinden yararlanmak olanağı ile ilgilidir. ücretsiz ya da nanocomplexed floresan moleküller maruz kalan tek BBB sistemi sayesinde, bu mümkün: (1) inci ölçmek içinİnkübasyonun farklı zaman noktalarında alt bölme toplanan SECM alikotları floresans yoğunluğu analiz molekülün E, trans-engelleyici akışı; (2) RBMECs moleküllerin ve ekler üzerinde hücrelerin konfokal mikroskopi analizi ile kendi hücre içi ticareti nano aracılı içselleştirilmesi araştırmak için; (3) deney sonunda TEER ölçülmesiyle ya da elektron mikroskobu ile endotel bütünlüğü analiz ederek, nanoformulations maruz kalması üzerine BBB hücrelerinin durumunun bir göstergesi alır.
Sonuç olarak, burada yüksek kaliteli BBB in vitro model üzerinde nanocomplexed floresan moleküllerin nüfuz çalışma için bir protokol nitelendirdi. Biz bu metodoloji BBB genelinde uyuşturucu teslim nanoformulation etkisini araştırmak için yararlı bir araç düşünün.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Rat Brain Microvascular Endothelial Cells | Innoprot | P10308 | isolated from Sprague Dawley rat brain tissue, cryopreserved at passage one and delivered frozen |
| Cortical Astrocytes | Innoprot | P10202 | isolated from 2 days rat brain tissue, cryopreserved at passage one and delivered frozen. |
| Endothelial Cell Medium kit | Innoprot | P60104 | ECM (500 ml) and fetal bovin serum (25 ml), endothelial cell growth supplement (5 ml) and penicillin/streptomycin (5 ml). Warm in 37 °C water bath before use and protect from light |
| Trypsin-EDTA without Phenol Red | EuroClone | ECM0920D | Warm in 37 °C water bath before use |
| Fluorescein isothiocyanate-dextran 40,000 | Sigma | FD40S | protect from light |
| paraformaldehyde | Sigma | 158127 | diluition in chemical hood |
| Dulbecco's phosphate buffer saline w/o Ca and Mg | EuroClone | ECB4004L | |
| Triton X-100 | Sigma | T8787 | |
| bovine serum albumin | Sigma | A7906 | |
| goat serum | EuroClone | ECS0200D | |
| mouse monoclonal anti-Von Willebrand Factor | Dako | M0616 | |
| AlexaFluor 546-conjugated antibody against mouse IgGs | ThermoFischer Scientific | A-11003 | protect from light |
| DAPI (4’ ,6-diamidino-2-phenylindole) | ThermoFischer Scientific | D1306 | protect from light |
| ProLong Gold Antifade Mountant | ThermoFischer Scientific | P36934 | |
| Poly-L-lysine Hydrobromide | Sigma | P1274 | the same solution can be used several times |
| fibronectin from bovine plasma | Sigma | F1141 | the same solution can be used several times |
| Polyethylene terephthalate (PET) inserts | Falcon | F3090 | Transparent Polyethylene terephthalate (PET) membranes; surface area: 4.2 cm2; pore size 0.4 µm/surface area |
| T75 Primo TC flask | EuroClone | ET7076 | |
| T175 Primo TC flask | EuroClone | ET7181 | |
| EVOM2 Epithelial Tissue Volt/Ohmmeter | World Precision Instruments Germany | EVOM2 | |
| Endohm- 24SNAP cup | World Precision Instruments Germany | ENDOHM-24SNAP | |
| Light/fluorescence microscope with camera | Leica Microsystems | DM IL LED Fluo/ ICC50 W Camera Module | inverted microscope for live cells with camera |
| Confocal Microscope | Leica Microsystems | TCS SPE | |
| Spectrofluorimeter | Jasco | FP-8000 |
References
- Banks, W. A. Characteristics of compounds that cross the blood-brain barrier. BMC Neurol. 9 (1), 3 (2009).
- Löscher, W., Potschka, H. Drug resistance in brain disease and the role of efflux transporters. Nat Rev Neurosci. 6, 591-602 (2005).
- Xu, G., Mahajan, S., Roy, I., Yong, K. -T. Theranostic quantum dots for crossing blood-brain barrier in vitro and providing therapy of HIV-associated encephalopathy. Front Pharmacol. 15 (4), 140 (2013).
- Masserini, M. Nanoparticles for Brain Drug Delivery. ISRN Biochem. , (2013).
- Sagar, V., Pilakka-Kanthikeel, S., Pottathil, R., Saxena, S. K., Nair, M. Towards nanomedicines for neuroAIDS. Rev. Med. Virol. 24 (2), 103-124 (2014).
- Kreuter, J. Drug delivery to the central nervous system by polymeric nanoparticles: What do we know. Adv. Drug Deliver. Rev. 71, 2-14 (2014).
- Arosio, P., Ingrassia, R., Cavadini, P. Ferritins: a family of molecules for iron storage, antioxidation and more. Biochim. Biophys. Acta. 1790 (7), 589-599 (2009).
- Jääskeläinen, A., Soukka, T., Lamminmäki, U., Korpimäki, T., Virta, M. Development of a denaturation/renaturation-based production process for ferritin nanoparticles. Biotechnol. Bioeng. 102 (4), 1012-1024 (2009).
- Jefferies, W. A., Brandon, M. R., Hunt, S. V., Williams, A. F., Gatter, K. C., Mason, D. Y. Transferrin receptor on endothelium of brain capillaries. Nature. 312, 162-163 (1984).
- Deli, M. A., Abraham, C. S., Kataoka, Y., Niwa, M. Permeability studies on in vitro blood-brain barrier models: physiology, pathology, and pharmacology. Cell. Mol. Neurobiol. 25 (1), 59-127 (2005).
- Wilhelm, I., Fazakas, C., Krizbai, I. A. In vitro models of the blood-brain barrier. Acta Neurobiol. Exp. (Wars). 71, 113-128 (2011).
- Wilhelm, I., Krizbai, I. A. In vitro models of the blood-brain barrier for the study of drug delivery to the brain. Mol Pharm. 11 (7), 1949-1963 (2014).
- Bellini, M., et al. Protein nanocages for self-triggered nuclear delivery of DNA-targeted chemotherapeutics in Cancer Cells. J. Control. Release. 196, 184-196 (2014).
- Fiandra, L., et al. Nanoformulation of antiretroviral drugs enhances their penetration across the blood brain barrier in mice. Nanomedicine. 11 (6), 1387-1397 (2015).
- Molino, Y., Jabès, F., Lacassagne, E., Gaudin, N., Khrestchatisky, M. Setting-up an in vitro model of rat blood-brain barrier (BBB): a focus on BBB impermeability and receptor-mediated transport. J. Vis. Exp. , e51278 (2014).
- Perrière, N., et al. A functional in vitro model of rat blood-brain barrier for molecular analysis of efflux transporters. Brain Res. 1150, 1-13 (2007).
