Introduction
Modstanden i centralnervesystemet (CNS) sygdomme (dvs.. Kræft, epilepsi, depression, skizofreni og HIV-associeret neurologisk lidelse) til farmakologiske behandlinger skyldes forskellige mekanismer, herunder besværlig lægemiddel gennemtrængning af blod-hjerne-barrieren (BBB) . BBB er grænsen, som isolerer hjernevæv fra stofferne cirkulerer i blodet. Inden for denne barriere, et lag af hjerne mikrovaskulære endotelceller (BMECs), støttet af pericytter og astrocytter endfeet, er ansvarlig for den høje selektivitet af BBB til disse vandopløselige lægemidler med en molekylvægt højere end 400 Da 1. En anden narkotikarelaterede modstand mekanisme er forbundet med tilstedeværelsen på BMECs af narkotika effluxtransportører (P-glycoprotein og multiresistens proteiner), som co-driver for at reducere indtrængning lægemiddel i CNS og lette deres ekstrudering fra hjernen 2.
I det sidste årti, Et stort antal nanoteknologiske fremgangsmåder er blevet udviklet til at opfylde den kliniske og biologiske udfordring at levere lægemidler over BBB 3-6. I denne sammenhæng, ferritin nanosfærer (Fnn) repræsenterer en helt nyskabende og lovende løsning. Fnn er 12 nm kugler af 24 selvsamlende ferritin (Fn) monomerer, som er anbragt i en hul sfærisk struktur 8 nm indre diameter. Ferritin subunits kan skilles ad ved sur pH og samles igen i et SME-mode ved at bringe pH-værdien til neutralitet, hvilket giver forskellige organiske molekyler, der skal indkapsles. Derfor Fnn repræsenterer en interessant model for udvikling af multifunktionelle lægemiddelafgivelsessystemer 7,8. Endvidere kan Fnn interagere med BMECs takket være specifik genkendelse af transferrinreceptoren (TfR) 1, som udtrykkes på den luminale membran af disse celler 9.
Hidtil anderledes in vitro modeller af BBB er udviklet in order for at belyse trans-BBB gennemtrængelighed for forskellige stoffer, toksicitet mod BBB, eller interaktionen af molekyler med effluxtransportører. Faktisk er disse modeller anses for gyldig i vitro tilgange til en hurtig screening af aktive molekyler, før du fortsætter med in vivo studier. Disse modeller består af et enkelt endotel lag BMECs eller co-dyrkede BMECs og astrocytter (mere sjældent pericytes), fremstillet af dyr (rotte, mus, svin og kvæg) eller humane cellelinjer 10,11,12. Den transendotelial elektrisk modstand (TEER) og den tilsyneladende permeabilitet (Papp) af sporstoffer med en defineret molekylvægt repræsenterer to kritiske parametre, der anvendes til at bestemme kvaliteten af den in vitro model. Her beskriver vi ansættelse af en BBB in vitro-model, der bygger på en co-kultur af rotte BMECs (RBMECs) og rotte kortikale astrocytter (RCAS) at undersøge den trans-BBB gennemtrængning af ferritin nanocages indkapsle fluorescein isothiocyanate (FITC).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Etablering BBB Model
Bemærk: oprettelse af BBB model, vi foreslår at bruge kommercielt tilgængelige primære RBMECs og RCAS. Alle trin skal udføres med sterile reagenser og engangsartikler, der håndteres i en laminar flow hætte.
- celledyrkning
- Coat celle kultur flasker med poly-L-lysin 100 ug / ml (1 time ved stuetemperatur) eller fibronectin 50 ug / ml (1 time ved 37 ° C) for at fremme fastgørelsen af RCAS eller RBMECs hhv. Derefter tø 1 x 10 6 RCAS og 5 x 10 5 RBMECs i endotelcelle Medium suppleret med 5% føtalt bovint serum, 1% endotelcellevækst supplement og 1% penicillin / streptomycin (SECM). Seed RCAS i en T175 kolbe i 20 ml SECM og RBMECs i en T75 kolbe i 10 ml SECM.
Bemærk: optøning og såning passager i RCAS og RBMECs skal justeres, i form af celletæthed og tid i kultur, i forhold til antallet af eksperimentelle betingelser, der skal testes med BBB model. ved startenArbejde med 1 hætteglas med 1 x 10 6 RCAS og 1 hætteglas med 5 x 10 5 RBMECs, er det muligt at opnå op til 20 BBB-bærende skær. - Opretholde cellerne ved 37 ° C og 5% CO2 i en fugtig atmosfære i ca. 6 dage indtil ca. 80% konfluens for RCAS og over 90% konfluens for RBMECs. Frigør celler under anvendelse af trypsin-EDTA-opløsning (trypsin 1: 250) i 5 minutter (1 ml trypsin i T75-kolber og 2 ml for T175 kolber). Stop trypsinaktivitet med SECM (2: 1), centrifugeres cellesuspensioner ved 750 x g i 5 min og resuspenderes pelletene i 60 ml SECM.
- Split RBMECs i 3 T175 kolber og kultur i SECM for yderligere 3 dage før såning på skær. Tæl totale antal levende RCAS, ved at observere en cellesuspension fortyndet 1: 1 med trypanblåt under et optisk mikroskop i et Burker kammer.
- Coat celle kultur flasker med poly-L-lysin 100 ug / ml (1 time ved stuetemperatur) eller fibronectin 50 ug / ml (1 time ved 37 ° C) for at fremme fastgørelsen af RCAS eller RBMECs hhv. Derefter tø 1 x 10 6 RCAS og 5 x 10 5 RBMECs i endotelcelle Medium suppleret med 5% føtalt bovint serum, 1% endotelcellevækst supplement og 1% penicillin / streptomycin (SECM). Seed RCAS i en T175 kolbe i 20 ml SECM og RBMECs i en T75 kolbe i 10 ml SECM.
- Cell Såning på Indsætter
- Behandle den ene side af polyethylenterephthalat (PET) membran af 6 multi-brønd genneent skær med poly-L-lysin 100 ug / ml og den anden side med fibronectin 50 ug / ml, for at tillade binding af RCAS og BMECs. Håndtag indsatserne med pincet for at undgå kontakt med PET-membran.
- Placer indsatserne i en 6-brønds plade og tilsæt fibronectin opløsning (minimum 500 pi) ind i det øvre kammer. Efter 1 times inkubation ved 37 ° C, fjerne fibronectin løsning, tage indsatserne off multi-brønds plade og sætte dem op og ned på bunden af en 150 cm2 petriskål, der anvendes her som en steril støtte til allerede belagte skær.
- Forsigtigt tilsættes 800 pi af poly-L-lysin på undersiden af indsatsen (som vist i figur 1A; benævnt RCAS såning), og opløsningen opbevares på indsatserne i 1 time ved stuetemperatur.
- Aspirer opløsningen og lad indsatserne tørre ved stuetemperatur i 15-30 min. Skærene er nu klar til cellepodning, men kan også opbevares i multi-brønds plade i fleredage ved 4 ° C, før du fortsætter med BBB konstruktion.
Bemærk: Husk at holde mindst 3 belagte skær fri fra celler, der skal anvendes som kontroller til at validere BBB etablering af FD40 flux målinger.
- Seed RCAS (35.000 / cm2) på undersiden af poly-L-lysin-coatede inserter, ved at droppe 800 pi cellesuspension på hovedet indsatsen (figur 1A). Lad RCA suspensions skær i 4 timer ved stuetemperatur, for at tillade effektiv binding af cellerne til membranen.
- Aspirere den resterende opløsning og indsatserne i brøndene indeholdende 2 ml SECM og opretholde multi-brønds plade ved 37 ° C og 5% CO2 i en fugtig atmosfære, ændre SECM hver 2 dage.
- Efter 3 dage, når RCAS har beklædt den nedre flade af indsatsen, frø RBMECs på den øverste side af indsatsen, efter disse trin:
- Frigør RBMECs fra T175 kolber og tællesamlede levende celler, som rapporteret i trin 1.1.2 og 1.1.3.
- Seed RBMECs (60.000 / cm2) på den øvre overflade af indsatsen i SECM (1.000 pi) (figur 1B), hvilket efterlader 3 skær med kun de astrocytter, der skal bruges som TEER baggrund. Placer multi-brønds plade i standard dyrkningsbetingelser. Opretholde systemet til kultur i mindst 3 dage, ændre SECM i det indre og nedre kammer hver 2 dage.
- Behandle den ene side af polyethylenterephthalat (PET) membran af 6 multi-brønd genneent skær med poly-L-lysin 100 ug / ml og den anden side med fibronectin 50 ug / ml, for at tillade binding af RCAS og BMECs. Håndtag indsatserne med pincet for at undgå kontakt med PET-membran.
2. BBB Validering
- TEER Måling
- På den 3. dag af co-kultur, markere TEER ved at indsætte BBB-bærende indsatser i en passende kammer (som har en hætte, og hvor både kammer og hætte indeholder et par af spænding-sensing og aktuelle elektroder), fyldt med 4 ml SECM. Tilslut til en epitelvæv volt / ohmmeter.
- Sammen med TEER målinger af celle BBB-systemer, registrere TEER værdierne af de 3 skær bærer RCAS thpå vil blive fratrukket værdierne opnået med BBBs. Formere de resulterende TEER-værdier ved overfladen af indsatsen (4,2 cm2) for at udtrykke resultaterne som Ω x cm2.
- Fra 3. dag af co-kultur, måle TEER hver dag. Bemærk: Efter en indledende periode, hvor TEER stiger, bør de registrerede værdier forblive stabile i mindst to på hinanden følgende dage (normalt mellem 5. og den 7. dag i co-kultur). På det tidspunkt BBB er klar til det andet trin af validering (afsnit 2.2), og / eller for de trans-BBB eksperimenter.
Bemærk: Det er beskrevet i afsnit 2.1 procedure kan udføres på de samme BBB-systemer, der afsættes til følgende permeabilitet eksperimenter (afsnit 3). Operere under sterile betingelser.
- Trans-BBB Flux af FITC-dextran 40 (FD40)
- Mål FD40 flux fra den øvre til det nedre kammer af BBB-modeller sammenlignet på tværs af 3 tomme indsatser(Se notat af afsnit 1.2.1) i henhold til de følgende trin:
- Tilsæt 1 mg / ml FD40 (fortyndet i SECM) ind i det øvre kammer i BBBs, og efter 1, 2 og 3 timer trække 200 pi SECM fra det nedre kammer og måle fluorescensintensiteten ved spektrofluorimeter (λ ex 488 nm, λ em 515 nm, spalte 5).
- Anskaf værdierne for SECM baggrund fluorescenceby måle 500 pi virgin medium ved hjælp af de samme analytiske parametre. Fratræk SECM baggrundsfluorescens fra alle FD40 fluorescensværdier.
- Bestem mængden af gennemtrængt FD40 ved sammenligning af de observerede fluorescensværdierne med en kalibreringskurve fremstillet med kendte koncentrationer (dvs.. 0,312, 0,625, 1,25, 2,5 ug / ml) af det fluorescerende sporstof opløst i 500 pi SECM.
- Beregn den tilsyneladende permeabilitetskoefficient (Papp) fra gennemsnitlige gennemstrømning værdier ifølge:
P app = J / AC
(cm2) og C er koncentrationen af molekylet i det øvre rum (mol / cm3).
Bemærk: Tre eller flere BBB-systemer, der har nået egnede TEER værdier, skal udelukkende anvendes til denne valideringsproceduren, og bør ikke anvendes til følgende permeabilitet eksperimenter (afsnit 3). Sterilitet er ikke obligatorisk.
- Mål FD40 flux fra den øvre til det nedre kammer af BBB-modeller sammenlignet på tværs af 3 tomme indsatser(Se notat af afsnit 1.2.1) i henhold til de følgende trin:
3. Trans-BBB gennemtrængning af FITC-loaded Ferritins (Fnn)
Bemærk: En rekombinant variant af human ferritin (Fn), produceret i Escherichia coli og samles i nanocages (Fnn) til indkapsling af forskellige fluorescerende molekyler, er tilgængelig fra NanoBioLab af Prof. Prosperi (University of Milano-Bicocca, Italien). Fnn er fyldt med FITC, ifølge en tidligere beskrevet protokol 13, og koncentrationerne af både Fn og de fyldte molekyler er nøjagtigt determined.
- Trans-BBB Flux af FITC og FITC-Fnn
- Mål FITC-Fnn flux fra den øvre til det nedre kammer af validerede BBB modeller (sædvanligvis ved 5 th - 7 th dag i co-kultur), sammenlignet med den af det frie farvestof efter 7 og 24 timer af inkubation ifølge de følgende trin:
- Tilføj FITC-Fnn (50 ug / ml Fnn, 1,1 uM FITC) eller en tilsvarende mængde af frit FITC i det øverste kammer på mindst 6 BBB-systemer til hver formulering, for at trække 2 ml SECM løsning fra det nederste kammer mindst 3 skær efter 7 timer, og fra det nederste kammer af andre 3 indsatser efter 24 timer.
- Måle fluorescensintensiteten af 500 pi de indsamlede prøver ved spektrofluorimeter (λ ex 488 nm, λ em 515 nm, spalte 5).
- Anskaf SECM baggrundsfluorescens ved at måle 500 pi medium ved hjælp af de samme analytiske parametre. Træk den SECM baggrund fluorescensfra alle FITC eller FITC-Fnn fluorescensværdier.
- Bestemme koncentrationen af gennemtrængt FITC eller FITC-Fnn ved at sammenligne de opnåede fluorescensværdierne med to forskellige kalibreringskurver fremstillet med kendte koncentrationer (dvs.. 6,87, 13,75, 27,5, 55 nM) af den frie eller nanoformulated farvestof opløst i 500 pi SECM.
- Mål FITC-Fnn flux fra den øvre til det nedre kammer af validerede BBB modeller (sædvanligvis ved 5 th - 7 th dag i co-kultur), sammenlignet med den af det frie farvestof efter 7 og 24 timer af inkubation ifølge de følgende trin:
- FITC-Fnn Lokalisering i RBMECs
- Fjern SECM fra det øvre kammer af BBB-systemer, vaske skær med PBS og fastsætte RBMECs på mindst to skær til hver forsøgsgruppe udvidelse på 500 pi paraformaldehyd (4% i phosphatpuffer saltvand-PBS) i det øvre rum i 10 minutter ved stuetemperatur.
- Vask indsatsene tre gange med PBS for at fjerne resterende paraformaldehyd.
Bemærk: Fra dette punkt, sterilitet er ikke nødvendig. - Skær passende stykker af PET-membran, og fortsætte med immuno- af cellerne efter følgende trin:
- PermeabiLize RBMECs med 0,1% Triton X-100 i PBS i 10 minutter. Udfør en blokerende trin i 1 time ved stuetemperatur med en opløsning indeholdende 2% bovint serumalbumin (BSA), 2% gedeserum i PBS. Inkuber prøverne med et anti-Von Willebrand Faktor (VWF) ved fortyndet 1:20, i 2 timer ved stuetemperatur.
- Efter vask tre gange med PBS, eksponere cellerne i 2 timer ved stuetemperatur til en 2% BSA, 2% gedeserum opløsning indeholdende et egnet sekundært antistof ved en 1: 300 fortynding for afsløre anti-VWR, og DAPI ved en 1: 1.500 fortynding af kerner detektion.
- Monter indsætte stykker onto objektglas ved hjælp af en antifade monteringsløsning (én dråbe pr insert fragment), og luk derefter prøve med en dækning slip. Analyser ved konfokal mikroskopi under anvendelse af en olie nedsænkning linsen på 40X forstørrelse, 1,5 zoom og 1.024 x 1.024 pixel opløsning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Under etableringen af BBB-modellen, cellebinding og vækst på indsatsene kan overvåges ved hjælp af et lysmikroskop takket være den åbne karakter PET membraner. RCAS, podet med en tæthed på 35.000 celler / cm2, vedhæfte effektivt til undersiden af indsatsen efter 4 timer inkubation ved RT (figur 2A) og vokse til at dække membranoverfladen i 3 dage under en spindel-formet morfologi (Figur 2B). RBMECs, podet ved en densitet på 60.000 celler / cm2, er synligt fastgjort til den øvre flade af PET membranen efter ca. 3 timer inkubation ved 37 ° C (figur 2C). Udviklingslandene RBMEC lag kan være vanskeligt at visualisere de følgende dage med et optisk mikroskop, på grund af overlapning med den underliggende RCA lag (figur 2D).
En korrekt validering af BBB model kræver altid TEER måling og dette kan bekræftes ved at evaluere det transeuropæiske BBB P app af en lav permeabilitet sporstof, såsom FD40.
De TEER værdier, konstateret i co-kultur periode, udgør den første klar indikation af den korrekte dannelsen af endotel barriere. Tre dage efter RBMEC såning, den indspillede TEER, trækkes fra TEER af astrocytter-bærende skær, er primært på grund af bidraget fra ikke-elektrogen lag RCAS og laget af RBMECs udvikle. På dette tidspunkt, vores BBB giver værdier i området mellem 20 og 40 Ω x cm 2. I de følgende dage, sædvanligvis mellem 4. og den 5. dag af co-kultur, TEER værdier stiger på grund af dannelsen af tætte forbindelser mellem tilstødende endotelceller 14 og nåede værdier normalt mellem 55 og 110 Ω x cm2, og i undtagelsestilfælde higher værdier 14. Værdierne målt på 4 th / 5. dag af co-kultur forblive stabil i det mindste indtil den 7. - 8. dag, før de begynder at falde; derfor er der en meget smal tidsvindue til rådighed for udførelsen af de trans-BBB flux eksperimenter.
Mellem 5. og den 7. dag i co-kultur, kan integriteten af de eksperimentelle modeller bekræftes ved at evaluere FD40 trans-BBB-permeabilitet. Figur 3 viser et eksempel på trans-BBB flux af FD40 (1 mg / ml ), sammenlignet med strømningen over tomme skær over 3 timer inkubation; den BBBs er på den 6. dag i co-kultur og den optagne TEER er 55,6 ± 15,8 Ω cm2 (middel ± SE, n = 3). Flux er lineær mellem 1 og 3 timer inkubation, og den gennemsnitlige P app beregnet mellem 1 og 2 timer, og mellem 2 og 3 timer inkubation er0,12 ± 0,01 x 10 - 6 cm sek - 1 (± SE, n = 6).
Når mindst tre på hinanden følgende succesfulde BBBs, i form af TEER og FD40 P app, er blevet opnået i uafhængige forsøg kan undgås måling af sporstof permeabilitet; dog TEER behov altid skal registreres for hvert forsøg.
Den trans-BBB-permeabilitet af fluorescerende molekyler og virkningen af nanocomplex på deres levering kan undersøges ved hjælp af rotte BBB modeller beskrevet ovenfor. Figur 4 viser gennemtrængningen af modellen farvestof FITC ved indkapsling i Fnn tværs BBBs med TEER på 100,4 ± 3,5 Ω cm2 (n = 16) ved det 7. dag i co-kultur. Histogrammerne, der repræsenterer FITC koncentration i det nedre kammer efter 7 og 24 timer fra tilsætning af gratis eller nanoformulated farvestofi det øvre rum, indikerer, at Fnn er i stand til at øge leveringen af FITC over BBB.
Konfokalt mikroskop billeder af den øvre side af indsatsen efter 7 og 24 timer af inkubation med FITC-Fnn (figur 5A, C) eller FITC (figur 5B, D) viser, at mens frit FITC ikke er internaliseret af RBMECs, dens pålæsset den Fnn gør det muligt at komme ind i cellerne.
Før behandling af skær til konfokal mikroskopi, er det nødvendigt med en yderligere kontrol af TEER at sikre, at der ikke er nogen Fnn-medierede virkninger på BBB integritet.
Figur 1:. Cellepodning onto Indsatse RCA (A) og RBMEC (B) seeding procedure på de to modstående sider afmulti-brønds plade skær. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2:. Optisk mikroskop Billeder af RCAS og RBMVECs på Indsætter Indsatser podes med RCAS og RBMECs observeres med et lysmikroskop (20X optisk zoom). (A) Fire timer efter podning, runde og gennemskinnelige RCAS synligt fastgjort til bundfladen af indsatsen; (B) Spindel-formede RCAS er synlige på den 3. dag af kultur; (C) runde og gennemskinnelige RBMECs er fastgjort på oversiden af indsatsen efter 3 hr inkubation; (D) Den 4. dag i co-kultur såvel overfladerne af indsatsen er helt dækket med celler, og de to layter er ikke let at skelne. Scale bar = 100 um. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3:. FD40 Flux over BBB Flux of FD40 (1 mg / ml) fra den øvre til den nedre side af BBB in vitro-system, sammenlignet med på tværs af tomme insert. Mængden af FD40 i nedre kammer er blevet målt ved 60, 120 og 180 minutter efter tilsætningen af farvestoffet til det øvre kammer. Betyder ± SE; n ° indsætter = 3. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4: Virkning af Fnn Indkapsling på FITC gennemtrængning af BBB Koncentration af FITC i det nedre kammer i BBB in vitro-system opgjort til 7 og 24 timer efter tilsætning af FITC eller FITC-Fnn ind i det øvre kammer.. Middelværdi ± SE for 4-5 replikater; **** P <0,0005, FITC-Fnn vs. FITC (t-test). Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5: konfokalmikroskopi af RBMECs om Inserts Konfokal laser-scanning mikrofotografier (enkelt optiske dele) af RBMECs efter 7 timer (A, B) eller 24 timer (C, D) inkubation med gratis FITC (B, C) eller FITC. -FnN (A,
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
In vitro-metoden beskrevet her repræsenterer en nyttig valideret metode til at studere trans-BBB levering af fluorescerende molekyler ved nanoformulation med nanopartikler. Her bruger vi Fnn, som repræsenterer en god kandidat til at studere translokationen af last molekyler over BBB. Fnn anses guld nanovector for trans-BBB levering af narkotika / agenter, da det specifikt er anerkendt af TfR1 receptoren, som udtrykkes på den luminale membran af BMECs og medierer nanopartikel optagelse ved hjælp af en receptor-medieret internalisering vej. Desuden Fnn er en naturlig nanopartikel, og det har derfor en god biokompatibilitet profil. Endelig Fnn er i stand til at indkapsle lav dimension vandopløselige molekyler ved en enkel og effektiv mekanisme. Trans-BBB gennemtrængning af andre forskellige typer af organiske eller uorganiske nanopartikler kan også vurderes med denne protokol, efter nogle overvejelser om nanopartikler funktioner. Første prerequisite at studere gennemtrængning af nanoformulated lægemidler / midler er sikkerheden af hulrummet nanopartikel. Et andet afgørende spørgsmål er samspillet af den undersøgte nanopartikel med PET filter. Dette aspekt skal vurderes forudgående, for at udelukke en væsentlig tilbageholdelse i membranens porer og undgå ændringer af deres gennemtrængning over BBB. Vores gruppe har for nylig ansat den foreslåede strategi for at studere en polymer-belagt jernoxid nanopartikler som en trans-BBB levering system til fluorescens-mærkede antiretrovirale lægemidler 14. I så fald, vi tilknyttet elektronmikroskopi lokalisering af nanoformulations i RBMECs til fluorescens detektion. Desuden andre særdeles følsomme diagnostiske metoder, såsom induktivt koblet plasma (ICP) -MS kunne anvendes til at vurdere trans-BBB levering af uorganiske nanosystemer.
BBB in vitro model, der anvendes i denne protokol er baseret på co-kultur af rotte BMECs og astrocytter. I det brede scenario af BBB-modeller 10,11,12, hvoraf nogle er blevet korrekt beskrevet i litteraturen med et godt detaljeret protokol 15, vores model er et godt alternativ kvalitet. Selv om det optagede TEER var under de bedste standarder foreslået i litteraturen (150-200 Ω cm 2) 10, trans-BBB permeabilitet af den høje dimension tracer Dextran 40 var i total enighed med dannelsen af en stram barriere.
Denne in vitro model, opnået med kommercielt tilgængelige rotte BMECs og astrocytter, har et par fordele: (1) optimal vækst effektiviteten af endotelceller, (2) en passende tidsperiode til fremstilling af den endelige BBB model (ikke længere end 13 dage), (3) overholdelse af etiske spørgsmål, undgå brug af celler fra humant hjernevæv (obduktion materialer, kirurgiske prøver, og føtalt væv) og 4) besparelse af tid og omkostninger i forbindelse med stalde, og primærceller ekstraktion. Ikke desto mindre er en begrænsning af den nuværende model relateret til de høje omkostninger ved ikke-udødeliggjorte primære RBMECs, som skal købes (fastfrosset på passage én) for hver eksperimentel indstilling. Faktisk har vores foreløbige undersøgelser af BBB produktion viste, at evnen hos endothelceller til at producere en stram BBB strengt forbundet med antallet af passager i kultur af RBMECs efter den første post-køb optøning. Yderligere gennemførelse af BBB-modellen beskrevet her med endotel kosttilskud, såsom cAMP og hydrocortison, kunne anses for at forbedre endotel tæthed og øge TEER værdier. 10,11,16
Den foreliggende teknik er relateret til muligheden for at drage fordel af en enkelt BBB model for forskellige assays, hvilket giver flere datasæt fra hver forsøgsgruppe indstilling. Med et enkelt BBB-system udsættes for frie eller nanocomplexed fluorescerende molekyler, er det muligt: (1) at måle the trans-barriere flux af molekylet ved at analysere fluorescensintensiteten af SECM alikvoter indsamlet fra det nedre kammer til forskellige tidspunkter inkubation; (2) at undersøge nano-medieret internalisering af molekylerne i RBMECs og deres intracellulær transport ved konfokal mikroskopi-analyse af cellerne på skær; (3) for at få en indikation af status for BBB-celler efter udsættelse for de nanoformulations, ved måling TEER i slutningen af eksperimentet eller ved analyse endotel integritet ved elektronmikroskopi.
Afslutningsvis her beskrev vi en protokol til undersøgelse af permeationen af nanocomplexed fluorescerende molekyler på tværs af en høj kvalitet BBB in vitro model. Vi anser denne metode et nyttigt værktøj til at undersøge effekten af nanoformulation på drug delivery over BBB.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Rat Brain Microvascular Endothelial Cells | Innoprot | P10308 | isolated from Sprague Dawley rat brain tissue, cryopreserved at passage one and delivered frozen |
| Cortical Astrocytes | Innoprot | P10202 | isolated from 2 days rat brain tissue, cryopreserved at passage one and delivered frozen. |
| Endothelial Cell Medium kit | Innoprot | P60104 | ECM (500 ml) and fetal bovin serum (25 ml), endothelial cell growth supplement (5 ml) and penicillin/streptomycin (5 ml). Warm in 37 °C water bath before use and protect from light |
| Trypsin-EDTA without Phenol Red | EuroClone | ECM0920D | Warm in 37 °C water bath before use |
| Fluorescein isothiocyanate-dextran 40,000 | Sigma | FD40S | protect from light |
| paraformaldehyde | Sigma | 158127 | diluition in chemical hood |
| Dulbecco's phosphate buffer saline w/o Ca and Mg | EuroClone | ECB4004L | |
| Triton X-100 | Sigma | T8787 | |
| bovine serum albumin | Sigma | A7906 | |
| goat serum | EuroClone | ECS0200D | |
| mouse monoclonal anti-Von Willebrand Factor | Dako | M0616 | |
| AlexaFluor 546-conjugated antibody against mouse IgGs | ThermoFischer Scientific | A-11003 | protect from light |
| DAPI (4’ ,6-diamidino-2-phenylindole) | ThermoFischer Scientific | D1306 | protect from light |
| ProLong Gold Antifade Mountant | ThermoFischer Scientific | P36934 | |
| Poly-L-lysine Hydrobromide | Sigma | P1274 | the same solution can be used several times |
| fibronectin from bovine plasma | Sigma | F1141 | the same solution can be used several times |
| Polyethylene terephthalate (PET) inserts | Falcon | F3090 | Transparent Polyethylene terephthalate (PET) membranes; surface area: 4.2 cm2; pore size 0.4 µm/surface area |
| T75 Primo TC flask | EuroClone | ET7076 | |
| T175 Primo TC flask | EuroClone | ET7181 | |
| EVOM2 Epithelial Tissue Volt/Ohmmeter | World Precision Instruments Germany | EVOM2 | |
| Endohm- 24SNAP cup | World Precision Instruments Germany | ENDOHM-24SNAP | |
| Light/fluorescence microscope with camera | Leica Microsystems | DM IL LED Fluo/ ICC50 W Camera Module | inverted microscope for live cells with camera |
| Confocal Microscope | Leica Microsystems | TCS SPE | |
| Spectrofluorimeter | Jasco | FP-8000 |
References
- Banks, W. A. Characteristics of compounds that cross the blood-brain barrier. BMC Neurol. 9 (1), 3 (2009).
- Löscher, W., Potschka, H. Drug resistance in brain disease and the role of efflux transporters. Nat Rev Neurosci. 6, 591-602 (2005).
- Xu, G., Mahajan, S., Roy, I., Yong, K. -T. Theranostic quantum dots for crossing blood-brain barrier in vitro and providing therapy of HIV-associated encephalopathy. Front Pharmacol. 15 (4), 140 (2013).
- Masserini, M. Nanoparticles for Brain Drug Delivery. ISRN Biochem. , (2013).
- Sagar, V., Pilakka-Kanthikeel, S., Pottathil, R., Saxena, S. K., Nair, M. Towards nanomedicines for neuroAIDS. Rev. Med. Virol. 24 (2), 103-124 (2014).
- Kreuter, J. Drug delivery to the central nervous system by polymeric nanoparticles: What do we know. Adv. Drug Deliver. Rev. 71, 2-14 (2014).
- Arosio, P., Ingrassia, R., Cavadini, P. Ferritins: a family of molecules for iron storage, antioxidation and more. Biochim. Biophys. Acta. 1790 (7), 589-599 (2009).
- Jääskeläinen, A., Soukka, T., Lamminmäki, U., Korpimäki, T., Virta, M. Development of a denaturation/renaturation-based production process for ferritin nanoparticles. Biotechnol. Bioeng. 102 (4), 1012-1024 (2009).
- Jefferies, W. A., Brandon, M. R., Hunt, S. V., Williams, A. F., Gatter, K. C., Mason, D. Y. Transferrin receptor on endothelium of brain capillaries. Nature. 312, 162-163 (1984).
- Deli, M. A., Abraham, C. S., Kataoka, Y., Niwa, M. Permeability studies on in vitro blood-brain barrier models: physiology, pathology, and pharmacology. Cell. Mol. Neurobiol. 25 (1), 59-127 (2005).
- Wilhelm, I., Fazakas, C., Krizbai, I. A. In vitro models of the blood-brain barrier. Acta Neurobiol. Exp. (Wars). 71, 113-128 (2011).
- Wilhelm, I., Krizbai, I. A. In vitro models of the blood-brain barrier for the study of drug delivery to the brain. Mol Pharm. 11 (7), 1949-1963 (2014).
- Bellini, M., et al. Protein nanocages for self-triggered nuclear delivery of DNA-targeted chemotherapeutics in Cancer Cells. J. Control. Release. 196, 184-196 (2014).
- Fiandra, L., et al. Nanoformulation of antiretroviral drugs enhances their penetration across the blood brain barrier in mice. Nanomedicine. 11 (6), 1387-1397 (2015).
- Molino, Y., Jabès, F., Lacassagne, E., Gaudin, N., Khrestchatisky, M. Setting-up an in vitro model of rat blood-brain barrier (BBB): a focus on BBB impermeability and receptor-mediated transport. J. Vis. Exp. , e51278 (2014).
- Perrière, N., et al. A functional in vitro model of rat blood-brain barrier for molecular analysis of efflux transporters. Brain Res. 1150, 1-13 (2007).
