Introduction
中枢神经系统（CNS）的疾病（ 即肿瘤，癫痫症，抑郁症，精神分裂症和HIV相关的神经障碍）耐药物疗法是由于各种不同的机制，包括跨越血脑屏障艰巨药物渗透（BBB） 。血脑屏障是隔离在血液中循环的物质的脑组织的边界。在这个障碍，脑微血管内皮细胞（BMECs），通过周细胞和星形胶质细胞endfeet支持层，是负责对血脑屏障的高选择性的那些水溶性药物的分子量高于400达1。另一个与药物有关的耐药机制被链接到上BMECs存在药物外排转运（P-糖蛋白和多药耐药蛋白），其共同操作以减少药物渗透到中枢神经系统和从大脑2促进其挤出。
在过去十年中，大量的纳米技术的方法已被开发，以满足穿过BBB 3-6递送药物的临床和生物学的挑战。在此背景下，铁蛋白纳米球（FNN）代表一种完全创新的和可行的解决方案。 FNN是24自组装铁蛋白（FN）单体，其被布置在8nm的内径的中空球状结构12纳米球体。铁蛋白亚基可以在酸性pH下被拆卸并通过使pH值至中性，允许被包封各种有机分子中的形状记忆的方式重新组合。因此，FNN代表多功能药物递送系统7,8的发展的一个有趣的模型。此外，FNN可以与BMECs由于转铁蛋白受体（铁蛋白）1，这是对这些细胞9的管腔膜表达的特异性识别相互作用。
到目前为止， 在血脑屏障的体外模型不同已在奥德开发R以阐明反式BBB通透性对各种药物，毒性朝向血脑屏障，或流出转运分子的相互作用。的确，这些模型被认为是体外有效与体内研究在继续之前接近为活性分子的快速筛选。这些模型由BMECs或共培养BMECs和星形胶质细胞（更罕见周细胞）的单个内皮细胞层，从动物（大鼠，小鼠，猪和牛），或人细胞系10,11,12得到的。的跨内皮电阻（TEER），并具有限定分子量示踪剂的表观渗透率（P 应用 ）表示用于确定在体外模型的质量的两个关键参数。在这里，我们描述了就业BBB 体外模型的基础上，大鼠BMECs（RBMECs）的共同的文化和大鼠皮层星形胶质细胞（合会）研究纳米笼铁的跨BBB渗透封装荧光isothiocyanate（FITC）。
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Protocol
1.建立血脑屏障模型
注意：对于建立血脑屏障模型，我们建议您使用市售的主RBMECs和RCA接头。所有步骤都必须用无菌的试剂和耗材，在层流罩处理来执行。
- 细胞培养
- 用聚L-赖氨酸100微克/毫升（在RT 1小时）或纤连蛋白50微克/毫升（在37℃下1小时）的外套细胞培养烧瓶，以促进合会或RBMECs的附件，分别。然后，解冻1×10 6个 RCA接头和5×10 5 RBMECs在内皮细胞培养基，补充有5％胎牛血清，1％的内皮细胞生长补充和1％青霉素/链霉素（SECM）。种子合会在在10毫升SECM在20ml SECM和RBMECs在T75烧瓶中T175烧瓶中。
注意：解冻和RCA接头和RBMECs的播种通道必须进行调整，在培养细胞密度和时间方面，根据与血脑屏障模型被测试的实验条件的数目。通过启动用1瓶1×10 6个 RCA接头和5×10 5 RBMECs 1小瓶ING，有可能获得高达20承载血脑屏障插入。 - 保持在37℃和5％的CO 2在大约6天潮湿气氛的细胞，直到大约80％汇合为RCA接头和用于RBMECs超过90％汇合。分离使用胰蛋白酶-EDTA溶液（胰蛋白酶1：250）的细胞5分钟（1 ml胰蛋白酶为T75烧瓶和2ml为T175烧瓶）。停止与SECM胰蛋白酶活性（2：1），在750×g下5分钟离心细胞悬浮液和悬浮颗粒在60ml SECM。
- 播种到插入之前拆分成RBMECs 3 T175瓶和文化SECM另外3天。计数活RCA接头，通过观察稀释1细胞悬浮液的总数量：在Burker室中在光学显微镜下1用锥虫蓝。
- 用聚L-赖氨酸100微克/毫升（在RT 1小时）或纤连蛋白50微克/毫升（在37℃下1小时）的外套细胞培养烧瓶，以促进合会或RBMECs的附件，分别。然后，解冻1×10 6个 RCA接头和5×10 5 RBMECs在内皮细胞培养基，补充有5％胎牛血清，1％的内皮细胞生长补充和1％青霉素/链霉素（SECM）。种子合会在在10毫升SECM在20ml SECM和RBMECs在T75烧瓶中T175烧瓶中。
- 细胞种植到刀片
- 6多井transpar的对待聚对苯二甲酸的一侧（PET）膜用聚L-赖氨酸100微克/毫升，而另一侧与纤连蛋白50微克/毫升，耳鼻喉科插入以允许RCA接头和BMECs的附着。处理与镊子插入件，以避免与PET膜接触。
- 放置插入到一个6孔板中并添加纤连蛋白溶液（最小500微升）到上部室中。在37℃孵育1小时后，取出纤维连接蛋白的解决方案，脱下多孔板嵌件，并把它们倒挂在150 平方厘米的培养皿底部，这是这里用作无菌支持已经涂层刀片。
- 轻轻添加800微升多聚-L-赖氨酸的上刀片的底侧（如在图1A中示出;称为RCA接头播种），并保持在插入的溶液在室温1小时。
- 吸出溶液，并让插入在RT干燥15-30分钟。插入件现在已准备好细胞接种，但也可以存储在多孔板数天在4℃，用血脑屏障结构，然后再继续。
注：记住要保持至少3涂层刀片不含细胞，用作控制由FD40通量测量，以验证BBB建立。
- 种子合会（35,000 /厘米2）到聚-L-赖氨酸包被的插入物的底侧，滴加800微升细胞悬液到倒置插入物（ 图1A）。留在插入RCA的悬浮液在室温4小时，以便使细胞的膜的有效附着。
- 吸出残留溶液，插入件放入含2ml SECM的井和在湿润的气氛中保持在37℃和5％的CO 2的多井板，改变SECM每2天。
- 在3天之后，当合会已涂覆的刀片的下表面，种子RBMECs到插入件的上侧，以下步骤：
- 从T175瓶分离RBMECs和计数总活细胞，据报道在步骤1.1.2和1.1.3。
- 种子RBMECs（60,000 /厘米2）到所述插入件的中SECM（1,000微升）（ 图1B）的上表面上，留下3插入仅与星形胶质细胞，也可以用作TEER背景。放置在标准培养条件下的多孔板。维护系统来培养至少3天，改变SECM在内侧和下部腔室，每2天。
- 6多井transpar的对待聚对苯二甲酸的一侧（PET）膜用聚L-赖氨酸100微克/毫升，而另一侧与纤连蛋白50微克/毫升，耳鼻喉科插入以允许RCA接头和BMECs的附着。处理与镊子插入件，以避免与PET膜接触。
2. BBB验证
- TEER测量
- 上共培养的第 3天，通过将承载血脑屏障插入到一个适当的腔室检查TEER（具有盖和其中两个腔室和盖包含一对电压感测和电流电极的），填充有4 SECM毫升的。连接到上皮组织伏特/欧姆表。
- 连同细胞血脑屏障的系统的TEER测量，记录3插入轴承合会第的TEER值在将从与商务改善局获得的值中减去。通过插入（4.2厘米2）的表面上，以表达结果作为ΩX招商局2相乘所得的TEER值。
- 从联合培养的第 3天，每天测量TEER。注意：一个初始阶段，其中TEER增加后，所记录的值应为连续至少两天保持稳定（通常为5 个和共培养的第 7天之间）。在该点所述BBB准备验证（第2.2节）和/或用于反式血脑屏障实验的第二步骤。
注意：在2.1节中描述的过程可以在专门用于以下渗透性实验（第3节）相同的BBB系统来执行。在无菌条件下进行操作。
- 反式BBB助焊剂FITC右旋糖酐40（FD40）
- 测量从上部的FD40通量相比，在3个空的嵌入式BBB模型的下腔根据下列步骤（见本说明部分1.2.1）：
- 加入1毫克/毫升FD40（在SECM稀释）插入商务改善局的上隔室和后1,2和3小时从下室撤回200微升SECM和由分光光度计测量的荧光强度（λEX 488纳米，λ 青霉 515纳米，狭缝5）。
- 获得SECM背景值fluorescenceby使用相同的分析参数测量500微升处女介质。减去所有FD40荧光值的SECM背景荧光。
- 通过与溶于500微升SECM的荧光示踪剂的已知浓度（ 即 0.312，0.625，1.25,2.5微克/毫升）所产生的校准曲线所观察到的荧光值的比较确定渗透FD40的量。
- 计算从根据平均通量值的表观渗透系数（P 应用 ）：
P = 应用焦耳/ AC
2）和C是在上隔室（摩尔/厘米3）的分子的浓度。
注：三个或更多个已达到适当的TEER值血脑屏障的系统中，必须将专门讨论此验证过程，并且不应当被用于以下渗透性实验（第3节）。育不是强制性的。
- 测量从上部的FD40通量相比，在3个空的嵌入式BBB模型的下腔根据下列步骤（见本说明部分1.2.1）：
3.跨BBB FITC加载铁蛋白渗透（FNN）
注：人类铁蛋白的重组变异体（FN），在大肠杆菌中产生并聚集在纳米笼（FNN）针对不同的荧光分子的封装，可提供从Prosperi教授的NanoBioLab（大学米兰比可卡，意大利）。 FNN装载用FITC，根据先前描述的方案13和Fn和加载的分子的浓度准确determin编辑。
- FITC的跨BBB通量和FITC-FNN
- 测量从上所述的FITC FNN助熔剂验证BBB模型（通常是在第5 次 -共培养的第 7天）的下室中，相对于该后孵化的7和24小时的自由染料，根据以下步骤：
- 添加FITC标记FNN（50微克/毫升FNN，1.1μM，FITC）或等量的游离的FITC成每个制剂至少6血脑屏障系统的上腔室，以便从下部腔室退出的2ml SECM溶液至少3插入后7小时，并从其他3插入物24小时后的下腔室。
- 通过分光光度计测量的500微升收集的样品的荧光强度（λEX 488纳米，λEM 515纳米，狭缝5）。
- 通过使用相同的分析参数测定500μl的培养基中获得的SECM背景荧光。减去SECM背景荧光所有FITC或FITC-FNN荧光值。
- 通过将得到的荧光值与溶解在500微升SECM游离或nanoformulated染料已知浓度（ 即 6.87，13.75，27.5，55纳米）产生两种不同的校准曲线比较确定渗透的FITC或FITC-FNN的浓度。
- 测量从上所述的FITC FNN助熔剂验证BBB模型（通常是在第5 次 -共培养的第 7天）的下室中，相对于该后孵化的7和24小时的自由染料，根据以下步骤：
- FITC-FNN本土化RBMECs
- 从血脑屏障系统的上腔室中移除SECM，用PBS洗，插入和通过在上隔室中加入500μl的多聚甲醛（于磷酸盐缓冲液盐水PBS中的4％）10固定在至少两个插入每个实验组的RBMECs分钟在室温。
- 用PBS洗插入三次以除去残余的多聚甲醛。
注意：从此时起，不育是没有必要的。 - 切割在PET膜的合适的片，并且具有根据以下步骤的单元的immunodecoration继续：
- Permeabi丽泽RBMECs用0.1％的Triton X-100的PBS 10分钟。在RT进行1小时封闭步骤用含2％牛血清白蛋白（BSA），2％山羊血清的PBS溶液中。在1:20稀释孵育与抗血管性血友病因子（vWF）的样品中，在室温下2小时。
- 在用PBS洗涤三次后，在室温下暴露在细胞2小时至2％的BSA，含有适当的二级抗体以1 2％山羊血清溶液：300稀释以揭示抗VWR，和DAPI在一个1：1500稀释的核检测。
- 安装插片上使用防褪色安装解决方案（每插入片段一滴）显微镜玻片，然后用盖玻片关闭样品。使用油浸镜头放大40倍，1.5变焦和1024x1024个像素分辨率的激光共聚焦显微镜分析。
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Representative Results
在建立血脑屏障模型，细胞附着和生长的插入物可以使用光学显微镜由于在PET膜的透明性进行监测。合会，在35,000个细胞/ cm 2时，有效地连接到所述插入件的底侧之后在RT（ 图2A）孵育4小时的密度接种并生长到覆盖膜表面在3天，采取纺锤形的形态（ 图2B）。 RBMECs，在60,000个细胞/ cm 2的密度接种，在37℃下（ 图2C）明显附着于PET膜的上表面上后约3小时培养的。显影RBMEC层可能难以显现在接下来的几天用光学显微镜，因为与底层的RCA层（ 图2D）的重叠。
在B的正确验证BB模型总是需要TEER测定，这可以通过评估低渗透性示踪剂，如FD40中的反式血脑屏障P 应用程式来确认。
该TEER值，记录了共培养期间，代表正确形成内皮屏障的第一注明。 RBMEC接种后三天，所记录的TEER，从星形承载刀片的TEER减去，主要是由于合会的非生电层和RBMECs的展开层的贡献。在这个时间点，我们的BBB给出值范围X招商局2 20和40之间Ω。在接下来的日子里，通常是4 个共培养的第 5日之间的TEER值增加，因为相邻的内皮细胞14之间紧密连接的形成，通常在55和110ΩX招商局2深远值，在特殊情况下喜gher值14。在共培养的第 4 / 第 5天测得的数值保持稳定，至少直到第 7 次 - 第 8天，他们开始降低之前;因此，没有可用于进行跨血脑屏障通量实验非常窄时间窗。
第5 次和共培养的第 7天之间，该实验模型的完整性可以通过评估FD40反式的BBB渗透性的确认。 图3显示FD40中的反式血脑屏障磁通的一个例子（1毫克/毫升），相比在整个空插入磁通，经培养3小时;该商务改善局正处于联合培养的第 6天，拍摄的TEER为55.6±15.8Ω厘米2（平均值±SE，N = 3）。焊剂是孵育1和3小时，1和2小时之间计算的平均p 应用之间的线性，并且保温的2和3之间小时是0.12±0.01×10 - 6厘米秒- 1（±标准差，N = 6）。
一旦在至少三个连续成功商务改善局，在TEER和FD40 P 应用而言，已在独立的实验，可避免示踪剂渗透性的测量获得;然而，TEER总是需要记录每个实验。
荧光分子中的反式的BBB渗透性和在其递送纳米复合物的效果可使用上述的BBB模型大鼠进行研究。 图4示出了模型染料FITC的经包封在FNN渗透穿过商务改善局与TEER的100.4±3.5 Ω厘米2（N = 16）共培养的第 7天。直方图，表示在下部腔室FITC浓缩后从加法游离或nanoformulated染料的7和24小时在上部隔室，表明FNN能够显著增加的FITC穿过BBB的交付。
后用FITC FNN（ 图5A，C）或FITC培养7和24小时的插入件的上侧的共聚焦显微镜图像（ 图5B中的D）表明，尽管游离的FITC不被RBMECs，其装载到内在化的FNN允许它进入细胞。
处理所述插入件为共聚焦显微镜之前，TEER的进一步检查是必要的，以确保有在血脑屏障完整性没有FNN介导的作用。
图 1： 细胞接种到插入 RCA（A）和RBMEC（B）中播种过程上的两个相对侧多孔板插入。 请点击此处查看该图的放大版本。
图2：RCA接头的光学显微镜图像和RBMVECs上嵌件与合会和RBMECs用光学显微镜（20X光学变焦）观察接种。 （A）中播种，圆形和半透明合会被明显地附连到所述插入件的底表面后4小时; （B）梭形合会是对文化的第 3天可见; （C）的圆形和半透明RBMECs附着在刀片的后培养3小时的上侧; （D）在共培养两刀片的表面的第 4天完全被细胞覆盖，并且两个外行ERS不易分辨。比例尺= 100微米。 请点击此处查看该图的放大版本。
图 3： 穿过BBB从上部到血脑屏障体外系统的下侧FD40的通量（1毫克/毫升）FD40焊剂 ，相比于整个空插入物。 FD40的在下部腔室中的量已经测量在60，120和180分钟后加入染料到上部室中。意味着±SE; N°插入= 3。 请点击此处查看该图的放大版本。
图4：在加法FITC或FITC的FNN进入上部腔室后在第7和24小时计算血脑屏障体外系统的下腔室上的FITC渗透FNN封装的影响跨 FITC的血脑屏障浓度。平均值±SE 4-5复制; **** P <0.0005，FITC-FNN VS。 FITC（学生t检验）。 请点击此处查看该图的放大版本。
图5：RBMECs 的共聚焦显微镜在插入后7小时RBMECs的激光扫描共聚焦显微照片（单光段）（A，B）或24小时提供免费FITC孵育（C，D）（B，C）或FITC。 -FnN（A，
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Discussion
此处描述的体外方法是一项有用的验证方法来研究在nanoformulation与纳米颗粒的荧光分子中的反式血脑屏障输送。在这里，我们使用FNN，它代表一个很好的候选来研究穿过BBB货物分子的易位。 FNN被认为是金nanovector为反式血脑屏障递送药物/剂的，因为它是专门通过TFR1受体，这是在BMECs的管腔膜表达并介导使用受体介导的内化途径中的纳米颗粒的摄取识别。此外，模糊神经网络是一种天然纳米粒子，它有一个，因此良好的生物相容性配置文件。最后，FNN能够通过一个简单而有效的机构来封装低维水溶性分子。其它不同类型的有机或无机纳米颗粒中的反式的BBB渗透可以还评估与这个协议中，根据关于纳米颗粒的特性几方面的考虑。首架prerequisite研究nanoformulated药物/药剂的渗透是空隙纳米颗粒的安全性。另一个关键的问题是与在PET滤器所研究纳米粒子的相互作用。这个方面，必须要以排除一个显著保留进入膜孔隙并避免穿过BBB的渗透变化初步评价。我们小组最近使用该策略来研究聚合物涂布氧化铁纳米颗粒作为反式血脑屏障输送系统用于荧光标记的抗逆转录病毒药物14。在这种情况下，我们相关nanoformulations的电子显微镜定位在RBMECs到荧光检测。此外，其他高度敏感的诊断方法，例如电感耦合等离子体（ICP）-MS可以采用评价无机纳米系统中的反式血脑屏障输送。
在这个协议中使用的血脑屏障的体外模型是基于大鼠BMECs和星形胶质细胞的共培养。在体外BBB模型10,11,12，其中一些已在文献中有良好的详细协议15准确地描述的宽的情况下，我们的模型表示良好的品质的替代。事实上，即使所记录的TEER低于最佳标准建议在文献（150-200Ωcm 2）的图10中 ，高维示踪剂右旋糖酐40是在同一个密闭的栅栏的形成总协议中的反式的BBB渗透性。
该体外模型中，用市售的大鼠BMECs和星形胶质细胞获得的，有几个优点：（1）在内皮细胞的最佳生长效率，为生产最终血脑屏障模型（的时间（2）的合适时间没有超过13天），（3）的符合伦理问题，避免了使用从人脑组织（尸检材料，手术标本，和胎儿组织细胞）和4）的时间节约和有关动物壳体成本和初级的细胞提取。尽管如此，本模型的一个限制是与每个实验设置的非永生化初级RBMECs的高费用，必须购买（于第一代冻结）。事实上，我们的血脑屏障生产初步研究已经表明，血管内皮细胞，以产生一个紧血脑屏障的能力严格与RBMECs的传代培养的第一次购买后解冻后的数量相关联。内皮补充剂，如cAMP和氢化可的松，这里所描述的血脑屏障模型的进一步实施可以为了改善内皮密封性和增加TEER值加以考虑。10,11,16
本技术涉及的可能性采取单一血脑屏障模型为不同测定的优点，因此，从各实验环境中提供多个数据集。与暴露于游离或nanocomplexed荧光分子单一的BBB系统，它是可能的：（1）测量第通过分析从培养的不同时间点的下室中收集SECM等分试样的荧光强度在分子电子反式屏障通量; （2），调查RBMECs的分子及其通过在插入细胞的共聚焦显微镜分析细胞内运输的纳米介导的内; （3）以获得的血脑屏障的细胞在暴露于nanoformulations状态的指示，通过在实验结束时测量TEER的或通过电子显微镜分析内皮完整性。
总之，我们在这里所描述的协议nanocomplexed荧光分子穿过高品质血脑屏障体外模型中的渗透的研究。我们认为这种方法用于研究nanoformulation的上穿过BBB药物递送的效果的有用工具。
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Rat Brain Microvascular Endothelial Cells | Innoprot | P10308 | isolated from Sprague Dawley rat brain tissue, cryopreserved at passage one and delivered frozen |
| Cortical Astrocytes | Innoprot | P10202 | isolated from 2 days rat brain tissue, cryopreserved at passage one and delivered frozen. |
| Endothelial Cell Medium kit | Innoprot | P60104 | ECM (500 ml) and fetal bovin serum (25 ml), endothelial cell growth supplement (5 ml) and penicillin/streptomycin (5 ml). Warm in 37 °C water bath before use and protect from light |
| Trypsin-EDTA without Phenol Red | EuroClone | ECM0920D | Warm in 37 °C water bath before use |
| Fluorescein isothiocyanate-dextran 40,000 | Sigma | FD40S | protect from light |
| paraformaldehyde | Sigma | 158127 | diluition in chemical hood |
| Dulbecco's phosphate buffer saline w/o Ca and Mg | EuroClone | ECB4004L | |
| Triton X-100 | Sigma | T8787 | |
| bovine serum albumin | Sigma | A7906 | |
| goat serum | EuroClone | ECS0200D | |
| mouse monoclonal anti-Von Willebrand Factor | Dako | M0616 | |
| AlexaFluor 546-conjugated antibody against mouse IgGs | ThermoFischer Scientific | A-11003 | protect from light |
| DAPI (4’ ,6-diamidino-2-phenylindole) | ThermoFischer Scientific | D1306 | protect from light |
| ProLong Gold Antifade Mountant | ThermoFischer Scientific | P36934 | |
| Poly-L-lysine Hydrobromide | Sigma | P1274 | the same solution can be used several times |
| fibronectin from bovine plasma | Sigma | F1141 | the same solution can be used several times |
| Polyethylene terephthalate (PET) inserts | Falcon | F3090 | Transparent Polyethylene terephthalate (PET) membranes; surface area: 4.2 cm2; pore size 0.4 µm/surface area |
| T75 Primo TC flask | EuroClone | ET7076 | |
| T175 Primo TC flask | EuroClone | ET7181 | |
| EVOM2 Epithelial Tissue Volt/Ohmmeter | World Precision Instruments Germany | EVOM2 | |
| Endohm- 24SNAP cup | World Precision Instruments Germany | ENDOHM-24SNAP | |
| Light/fluorescence microscope with camera | Leica Microsystems | DM IL LED Fluo/ ICC50 W Camera Module | inverted microscope for live cells with camera |
| Confocal Microscope | Leica Microsystems | TCS SPE | |
| Spectrofluorimeter | Jasco | FP-8000 |
References
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