Introduction
La résistance du système nerveux central (SNC) , des maladies ( par exemple. Le cancer, l' épilepsie, la dépression, la schizophrénie et le trouble neurologique associée au VIH) à des thérapies pharmacologiques est due à divers mécanismes, y compris la perméation du médicament difficile à travers la barrière hémato-encéphalique (BBB) . La BHE est la limite qui permet d'isoler les tissus cérébraux des substances qui circulent dans le sang. Au sein de cette barrière, une couche de cellules endothéliales microvasculaires cérébrales (BMECs), soutenus par péricytes et astrocytes endfeet, est responsable de la grande sélectivité de la BHE à ces médicaments hydrosolubles avec un poids moléculaire supérieur à 400 Da 1. Un autre mécanisme de résistance liée à la drogue est liée à la présence sur BMECs des transporteurs à efflux (protéines P-glycoprotéine et de résistance multidrogue), qui coopèrent pour réduire la pénétration du médicament dans le système nerveux central et faciliter leur extrusion du cerveau 2.
Dans la dernière décennie, Un grand nombre d'approches nanotechnologiques ont été développés pour relever le défi clinique et biologique de fournir des médicaments à travers le 3-6 BBB. Dans ce contexte, nanosphères ferritine (FNN) représentent une solution totalement innovante et prometteuse. FNN sont des sphères 12 nm de 24 ferritine auto-assemblage (Fn) des monomères qui sont disposés dans une structure sphérique creuse de diamètre intérieur 8 nm. les sous-unités de ferritine peuvent être démontées à pH acide et réassemblés de façon à mémoire de forme en amenant le pH à la neutralité, ce qui permet diverses molécules organiques à encapsuler. Par conséquent, FNN représente un modèle intéressant pour le développement de l' administration de médicaments multifonctionnels systèmes 7,8. En outre, FNN peut interagir avec BMECs grâce à la reconnaissance spécifique du récepteur de la transferrine (TfR) 1, qui est exprimé sur la membrane luminale de ces cellules 9.
Jusqu'à présent, différents modèles in vitro du BBB ont été développés en order pour élucider trans-BBB perméabilité à divers médicaments, toxicité vers le BBB, ou l'interaction des molécules avec des transporteurs d'efflux. En effet, ces modèles sont considérés comme valides des approches in vitro pour un dépistage rapide de molécules actives avant de procéder à des études in vivo. Ces modèles sont constitués d'une seule couche endothéliale de BMECs ou BMECs et astrocytes co-culture (plus rarement péricytes), obtenu à partir d' animaux (rat, souris, porcs et bovins) ou des lignées cellulaires humaines 10,11,12. La résistance électrique transendothéliale (TEER) et la perméabilité apparente (P app) des traceurs avec un poids moléculaire défini représentent deux paramètres critiques qui sont utilisés pour déterminer la qualité du modèle in vitro. Ici , nous décrivons l'emploi d'un modèle BBB in vitro, sur la base d' une co-culture de rat BMECs (RBMECs) et le rat astrocytes corticales (OIEC) pour étudier la pénétration trans-BBB de nanocages ferritine encapsuler isothi fluorescéineocyanate (FITC).
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Protocol
1. Mise en place du modèle BBB
Remarque: Pour établir le modèle BBB, nous vous suggérons d'utiliser RBMECs primaires disponibles dans le commerce et RCAs. Toutes les étapes doivent être effectuées avec des réactifs et consommables stériles, manipulés dans une hotte à flux laminaire.
- Culture de cellules
- Manteau des flacons de culture cellulaire avec poly-L-lysine 100 pg / ml (1 h à température ambiante) ou fibronectine 50 pg / ml (1 heure à 37 ° C) afin de promouvoir l'attachement des RCAs ou RBMECs, respectivement. Ensuite, décongeler 1 x 10 6 et 5 x CR 10 5 RBMECs dans des cellules endothéliales supplémenté avec 5% de sérum de fœtus bovin, le supplément de croissance cellulaire endothélial à 1% et 1% de pénicilline / streptomycine (SecM). RCAs de semences dans un flacon T175 dans 20 ml SECM et RBMECs dans un flacon T75 dans 10 ml SECM.
Note: La décongélation et passages d'ensemencement de RCAs et RBMECs doivent être ajustés, en termes de densité et de temps dans la culture cellulaire, en fonction du nombre de conditions expérimentales à tester avec le modèle du Bureau. En débutment avec une fiole de 1 x 10 6 et CR 1 flacon de 5 x 10 5 RBMECs, il est possible d'obtenir jusqu'à 20 plaquettes BBB roulement. - Maintenir les cellules à 37 ° C et 5% de CO2 dans une atmosphère humidifiée pendant environ 6 jours, jusqu'à environ 80% de confluence pour RCAs et plus de 90% de confluence pour RBMECs. Détacher les cellules en utilisant une solution de trypsine-EDTA (trypsine 1: 250) pendant 5 min (1 ml de trypsine pour les flacons T75 et de 2 ml pour les flacons T175). Arrêtez l'activité de la trypsine avec SECM (2: 1), les suspensions cellulaires de centrifugation à 750 g pendant 5 min et remettre les pastilles dans 60 ml SECM.
- Divisez les RBMECs dans 3 flacons T175 et la culture en SECM pendant encore 3 jours avant le semis sur inserts. Compter le nombre total de la vie RCAs, en observant une suspension cellulaire diluée 1: 1 avec le bleu trypan sous un microscope optique dans une chambre Burker.
- Manteau des flacons de culture cellulaire avec poly-L-lysine 100 pg / ml (1 h à température ambiante) ou fibronectine 50 pg / ml (1 heure à 37 ° C) afin de promouvoir l'attachement des RCAs ou RBMECs, respectivement. Ensuite, décongeler 1 x 10 6 et 5 x CR 10 5 RBMECs dans des cellules endothéliales supplémenté avec 5% de sérum de fœtus bovin, le supplément de croissance cellulaire endothélial à 1% et 1% de pénicilline / streptomycine (SecM). RCAs de semences dans un flacon T175 dans 20 ml SECM et RBMECs dans un flacon T75 dans 10 ml SECM.
- Cellule Semis sur Inserts
- Traiter un côté du polyéthylène téréphtalate (PET) membrane de transpa 6 multi-puitsinserts ent de poly-L-lysine 100 pg / ml et de l'autre côté de fibronectine à 50 ug / ml, pour permettre la fixation de RCAs et BMECs. Manipuler les inserts avec des pinces afin d'éviter tout contact avec la membrane PET.
- Placez les inserts dans une plaque à 6 puits et ajouter la solution de fibronectine (minimum 500 pi) dans la chambre supérieure. Après 1 heure d'incubation à 37 ° C, retirer la solution de fibronectine, prendre les inserts au large de la plaque multi-puits et mettez - les à l' envers sur le fond d'un 150 cm plat 2 Petri, qui est utilisé ici comme un support stérile pour la déjà revêtu des inserts.
- Ajouter doucement 800 ul de poly-L-lysine sur la face inférieure de l'insert (comme représenté sur la figure 1A, dénommé CR ensemencement), et maintenir la solution sur les inserts pendant 1 heure à température ambiante.
- Aspirer la solution et laisser les inserts sécher à température ambiante pendant 15-30 min. Les inserts sont maintenant prêts pour l'ensemencement des cellules, mais ils peuvent également être stockés dans la plaque multi-puits pour plusieursjours à 4 ° C, avant de procéder à la construction BBB.
Note: Rappelez-vous de garder au moins 3 inserts enrobés exempts de cellules, pour être utilisés comme témoins pour valider BBB établissement par FD40 mesures de flux.
- RCAs graines (35 000 / cm 2) sur le côté inférieur des plaquettes de poly-L-lysine, en déposant 800 pl de suspension cellulaire sur la plaquette à l' envers (figure 1A). Laisser la suspension RCA sur les inserts pendant 4 heures à la température ambiante, afin de permettre la fixation efficace des cellules à la membrane.
- Aspirer la solution résiduelle, on place les inserts dans les puits contenant 2 ml de SecM et de maintenir la plaque multi-puits à 37 ° C et 5% de CO2 dans une atmosphère humidifiée, en changeant la SecM tous les 2 jours.
- Après 3 jours, lorsque les RCAs ont revêtu la face inférieure de l'insert, RBMECs de semences sur la face supérieure de l'insert, suivant ces étapes:
- Détachez RBMECs de flacons T175 et compter leles cellules vivantes totales, tel que rapporté dans les étapes 1.1.2 et 1.1.3.
- RBMECs de graines (60,000 / cm 2) sur la surface supérieure de l'insert dans SECM (1000 pi) (figure 1B), laissant 3 inserts avec seulement les astrocytes, à utiliser comme TEER fond. Placer la plaque multi-puits dans des conditions de culture standard. Maintenir le système à la culture pendant au moins 3 jours, en changeant la SecM dans la chambre intérieure inférieure et tous les 2 jours.
- Traiter un côté du polyéthylène téréphtalate (PET) membrane de transpa 6 multi-puitsinserts ent de poly-L-lysine 100 pg / ml et de l'autre côté de fibronectine à 50 ug / ml, pour permettre la fixation de RCAs et BMECs. Manipuler les inserts avec des pinces afin d'éviter tout contact avec la membrane PET.
2. BBB Validation
- TEER mesure
- Sur le 3 ème jour de co-culture, vérifiez la TEER en insérant les inserts BBB portant dans une chambre appropriée (qui a une casquette et où à la fois la chambre et le bouchon contiennent une paire de tension de détection et électrodes de courant), rempli de 4 ml de SECM. Se connecter à un épithéliale volts de tissu / ohmmètre.
- Ensemble avec les mesures de TEER des cellules BBB-systèmes, enregistrer les valeurs TEER des 3 inserts portant les RCAs eà sera soustrait des valeurs obtenues avec le BBBs. Multipliez les valeurs TEER résultant par la surface de l'insert (4,2 cm 2) afin d'exprimer les résultats sous forme de Ω x cm 2.
- De la 3 ème jour de co-culture, mesurer la TEER chaque jour. Remarque: Après une première période où le TEER augmente, les valeurs enregistrées devraient rester stables pendant au moins deux jours consécutifs (généralement entre le 5 e et le 7 e jour de co-culture). À ce stade, le BBB est prêt pour la deuxième étape de validation (section 2.2) et / ou pour les expériences trans-BBB.
Remarque: La procédure décrite dans la section 2.1 peut être effectuée sur les mêmes BBB-systèmes dédiés aux expériences de perméabilité suivantes (section 3). Faire fonctionner dans des conditions stériles.
- Trans-BBB Flux de FITC-dextran 40 (FD40)
- Mesurer le flux FD40 de la partie supérieure à la chambre inférieure des modèles BBB par rapport à celle sur 3 inserts vides(Voir la note de la section 1.2.1) selon les étapes suivantes:
- Ajouter 1 mg / ml FD40 (dilué dans SECM) dans le compartiment supérieur du BBBs, et après 1, 2 et 3 h retirer 200 pi SECM de la chambre inférieure et de mesurer l'intensité de fluorescence par spectrofluorimètre (λ ex 488 nm, λ em 515 nm, fente 5).
- Obtenir les valeurs de SECM fond fluorescenceby mesurant 500 pi de milieu vierge en utilisant les mêmes paramètres analytiques. Soustraire la SECM fluorescence de fond de toutes les valeurs de fluorescence FD40.
- Déterminer la quantité de FD40 pénétrée par comparaison des valeurs de fluorescence observée avec une courbe d'étalonnage réalisée avec des concentrations connues (p. 0,312, 0,625, 1,25, 2,5 pg / ml) du traceur fluorescent dissous dans 500 ul de SecM.
- Calculer le coefficient de perméabilité apparente (P APP) à partir des valeurs moyennes de flux selon l' équation :
P app = J / AC
2) et C est la concentration de la molécule dans le compartiment supérieur (mole / cm 3).
Note: Trois ou plus BBB-systèmes qui ont atteint des valeurs TEER appropriées, doivent être exclusivement consacrés à cette procédure de validation, et ne doivent pas être utilisés pour les expériences de perméabilité suivantes (section 3). Stérilité est pas obligatoire.
- Mesurer le flux FD40 de la partie supérieure à la chambre inférieure des modèles BBB par rapport à celle sur 3 inserts vides(Voir la note de la section 1.2.1) selon les étapes suivantes:
3. Trans-BBB perméation de FITC-chargé ferritines (FNN)
Remarque: Une variante recombinante de ferritine humaine (Fn), produite dans Escherichia coli et assemblé en nanocages (FNN) pour l'encapsulation de différentes molécules fluorescentes, est disponible à partir du NanoBioLab du Prof. Prosperi (Université de Milan-Bicocca, Italie). FNN sont chargés avec FITC, selon un protocole décrit précédemment 13 et les concentrations des deux Fn et les molécules chargées sont exactement détermined.
- Trans-BBB Flux de FITC et FITC-FNN
- Mesurer le flux FITC FNN de la partie supérieure à la chambre inférieure de modèles BBB validés (habituellement au 5 ème - 7 ème jour de co-culture), par rapport à celle du colorant libre après 7 et 24 heures d'incubation, selon les étapes suivantes:
- Ajouter FITC-FNN (50 pg / ml FNN, 1,1 uM FITC) ou un montant égal à la libre FITC dans la chambre supérieure d'au moins 6 systèmes BBB pour chaque formulation, afin de retirer 2 ml de solution SECM de la chambre basse du au moins 3 inserts après 7 h, et de la chambre basse du 3 autres inserts après 24 h.
- Mesurer l'intensité de la fluorescence de 500 ul des échantillons prélevés par spectrofluorimètre (λ ex 488 nm, λ em 515 nm, fente 5).
- Obtenir la fluorescence de fond SECM en mesurant 500 pi de milieu en utilisant les mêmes paramètres analytiques. Soustraire la fluorescence de fond SECMde toutes les valeurs de fluorescence FITC ou FITC FNN.
- Déterminer la concentration de FITC infiltrée ou FITC FNN en comparant les valeurs de fluorescence obtenues avec deux courbes d'étalonnage différentes produites avec des concentrations connues (p. 6,87, 13,75, 27,5, 55 nm) du colorant libre ou nanoformulated dissous dans 500 SecM ul.
- Mesurer le flux FITC FNN de la partie supérieure à la chambre inférieure de modèles BBB validés (habituellement au 5 ème - 7 ème jour de co-culture), par rapport à celle du colorant libre après 7 et 24 heures d'incubation, selon les étapes suivantes:
- FITC-FNN Localisation dans RBMECs
- Retirer SECM de la chambre supérieure des systèmes BBB, se laver les inserts avec PBS et fixer les RBMECs sur au moins deux inserts pour chaque groupe expérimental en ajoutant 500 ul paraformaldéhyde (4% dans un tampon phosphate salin-PBS) dans le compartiment supérieur pour 10 min à température ambiante.
- Laver les inserts trois fois avec du PBS pour éliminer le paraformaldehyde résiduel.
Remarque: A partir de ce point, la stérilité est pas nécessaire. - Coupez des morceaux appropriés de la membrane PET, et procéder à la immunodecoration des cellules selon les étapes suivantes:
- PermeabiRBMECs liser avec 0,1% de Triton X-100 dans du PBS pendant 10 minutes. Effectuer une étape de blocage pendant 1 heure à température ambiante avec une solution contenant 2% d'albumine de sérum bovin (BSA), le sérum de chèvre à 2% dans du PBS. Incuber les échantillons avec un anticorps anti-facteur Von Willebrand (VWF), à une dilution 1:20, pendant 2 heures à la température ambiante.
- Après trois lavages avec du PBS, exposer les cellules pendant 2 heures à température ambiante à une BSA 2%, une solution de sérum de chèvre à 2% contenant un anticorps secondaire approprié à une dilution 1: 300 dans le but de mettre en évidence l'anticorps anti-REO, et DAPI à 1: 1500 dilution pour la détection des noyaux.
- Monter les pièces d'insertion sur des lames de microscope en utilisant une solution de antifade de montage (une goutte par fragment d'insert), puis fermez l'échantillon avec une lamelle. Analyser par microscopie confocale en utilisant une lentille à immersion d'huile à un grossissement de 40X, 1,5 zoom et 1,024 x 1,024 pixels de résolution.
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Representative Results
Au cours de la mise en place du modèle de BBB, l'attachement et la croissance cellulaire sur les inserts peuvent être surveillés à l'aide d'un microscope optique grâce à la nature transparente de la membrane en PET. RCAs, ensemencées à une densité de 35.000 cellules / cm2, fixer efficacement à la face inférieure de l'insert après 4 heures d'incubation à la température ambiante (figure 2A) et se développer pour couvrir la surface de la membrane en 3 jours, en prenant une morphologie en forme de fuseau (figure 2B). RBMECs, ensemencées à une densité de 60.000 cellules / cm 2, sont visiblement attaché à la face supérieure de la membrane PET après environ 3 heures d'incubation à 37 ° C (figure 2C). La couche RBMEC développement peut être difficile de visualiser les jours suivants avec un microscope optique, en raison du chevauchement avec la couche sous - jacente RCA (figure 2D).
Une validation correcte du BBB modèle exige toujours la mesure de TEER et cela peut être confirmé par l' évaluation de la Papp trans-BBB d'un traceur à faible perméabilité, par exemple FD40.
Les valeurs TEER, enregistrées au cours de la période de co-culture, représentent la première indication claire de la formation correcte de la barrière endothéliale. Trois jours après l'ensemencement RBMEC, la TEER enregistrée, soustraite de la TEER des astrocytes portant des inserts, est principalement due à la contribution de la couche non-électrogénique de RCAs et de la couche de développement de RBMECs. A ce point de temps, notre BBB donne des valeurs comprises entre 20 et 40 Ω x cm 2. Au cours des jours suivants, habituellement entre le 4 e et le 5 e jour de co-culture, la TEER des valeurs augmentée en raison de la formation des jonctions serrées entre les cellules endotheliales adjacentes 14, pour atteindre des valeurs habituellement entre 55 et 110 Ω x cm 2, et dans des cas exceptionnels salutvaleurs gher 14. Les valeurs mesurées à la 4 e / 5 e jour de co-culture restent stables au moins jusqu'à ce que le 7 e - 8 e jour avant qu'ils ne commencent à diminuer; par conséquent, il y a une fenêtre de temps très étroite disponible pour entreprendre les expériences trans-BBB flux.
Entre le 5 ème et 7 ème jour de co-culture, l'intégrité des modèles expérimentaux peut être confirmée par l' évaluation de la perméabilité FD40 trans-BBB. La figure 3 montre un exemple du flux trans-BBB FD40 (1 mg / ml ), par rapport au flux à travers les inserts vides, plus de 3 heures d'incubation; l'BBBs sont à la 6 e jour de co-culture et de la TEER enregistrée est de 55,6 ± 15,8 Ω cm 2 (moyenne ± SE, n = 3). Le flux est linéaire entre 1 et 3 heures d'incubation et l'application moyenne P calculée entre 1 et 2 heures, et entre 2 et 3 heures d'incubation est0,12 ± 0,01 x 10-6 cm s - 1 (± ET , n = 6).
Une fois au moins trois succès consécutifs BBBs, en termes de TEER et FD40 P app, ont été obtenus dans des expériences indépendantes de la mesure du traceur perméabilité peut être évitée; cependant, la TEER a toujours besoin d'être enregistrées pour chaque expérience.
La perméabilité trans-BBB de molécules fluorescentes et l'effet de la nanocomplexe sur leur livraison peuvent être étudiés en utilisant le rat modèles BBB décrits ci - dessus. La figure 4 montre la pénétration du modèle colorant FITC sur l' encapsulation dans FNN travers BBBs avec TEER de 100,4 ± 3,5 Ω cm 2 (n = 16) à la 7 e jour de co-culture. Les histogrammes, représentant la concentration FITC dans la chambre inférieure après 7 et 24 h de l'addition de colorant libre ou nanoformulateddans le compartiment supérieur, indiquent que FNN est en mesure d'augmenter de manière significative la livraison de FITC à travers la BHE.
Images de microscopie confocale de la face supérieure de l'insert après 7 et 24 heures d'incubation avec FITC-FNN (figure 5A, C) ou FITC (figure 5B, D) montrent que si libre FITC est pas internalisé par le RBMECs, son chargement dans la FNN lui permet de pénétrer dans les cellules.
Avant de traiter les inserts pour la microscopie confocale, une nouvelle vérification de la TEER est nécessaire pour assurer qu'il n'y a pas d'effets FNN médiées sur BBB intégrité.
Figure 1:. Cellule Semis sur Inserts RCA (A) et RBMEC (B) la procédure d'ensemencement sur les deux côtés opposés deles inserts de plaque multi-puits. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 2:. Microscope optique Images de RCAs et RBMVECs sur Inserts Inserts ensemencées avec RCAs et RBMECs sont observés avec un microscope optique (20X zoom optique). (A) Quatre heures après l' ensemencement, ronds et RCAs translucides sont visiblement attachées à la surface inférieure de l'insert; RCAs en forme de broche (B) sont visibles sur le 3 ème jour de culture; (C) ronds et RBMECs translucides sont fixés sur la face supérieure de l'insert , après 3 heures d'incubation; (D) Au 4 ème jour de co-culture à la fois les surfaces de l'insert sont complètement recouverte de cellules, et les deux layteurs ne sont pas faciles à distinguer. Barre d' échelle = 100 um. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 3:. FD40 flux à travers la BHE Flux de FD40 (1 mg / ml) à partir de la partie supérieure à la partie inférieure du système BHE in vitro, comparée à celle à travers l'insert vide. La quantité de FD40 dans la chambre inférieure a été mesurée à 60, 120 et 180 min après l'addition du colorant à la chambre supérieure. Moyens ± SE; n ° insère = 3. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 4: Effet de la FNN Encapsulation sur FITC perméation à travers la BHE Concentration de FITC dans la chambre inférieure du système BBB in vitro calculée à 7 et 24 heures après l'addition de FITC ou FITC-FNN dans la chambre supérieure.. Moyenne ± SE de 4-5 répétitions; **** P <0,0005, par rapport au FITC FNN. FITC (t-test de Student). S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 5: Microscopie confocale de RBMECs sur Inserts confocale Les micrographies à balayage laser (sections optiques simples) de RBMECs après 7 h (A, B) ou 24 h (C, D) d'incubation avec connexion FITC (B, C) ou FITC. -FnN (A,
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Discussion
La méthode in vitro décrite ici représente une approche validée utile d'étudier la livraison trans-BBB de molécules fluorescentes sur nanoformulation avec des nanoparticules. Ici, nous utilisons FNN, ce qui représente un bon candidat pour étudier la translocation de molécules de fret à travers la BHE. FNN est considéré comme le nanovecteur d'or trans-BBB fourniture de médicaments / agents puisqu'il est spécifiquement reconnu par le récepteur TfR1, qui est exprimé sur la membrane luminale des BMECs et médie l'absorption de nanoparticules en utilisant une voie d'internalisation médiée par un récepteur. En outre, FNN est une nanoparticule naturelle et il a donc un bon profil de biocompatibilité. Enfin, FNN est capable d'encapsuler faible dimension des molécules hydrosolubles par un mécanisme simple et efficace. La perméation trans-BBB d'autres types de nanoparticules organiques ou inorganiques différentes pourrait être également évalué avec ce protocole, selon quelques considérations sur les nanoparticules caractéristiques. p premiersrerequisite pour étudier la pénétration de nanoformulated médicaments / agents est la sécurité de la nanoparticule vide. Une autre question cruciale est l'interaction de la nanoparticule étudié avec le filtre de PET. Cet aspect, doit être évalué au préalable afin d'exclure une rétention significative dans les pores de la membrane et éviter des altérations de leur perméation à travers la BHE. Notre groupe a récemment employé la stratégie proposée pour étudier un oxyde de fer nanoparticule revêtu de polymère comme BBB-trans système de distribution des médicaments antirétroviraux marqués par fluorescence 14. Dans ce cas, la microscopie électronique localisation de nanoformulations nous avons associé dans RBMECs à la détection de fluorescence. En outre, d'autres méthodes de diagnostic très sensibles, tels que plasma à couplage inductif (ICP) -MS pourrait être utilisé pour évaluer la prestation trans-BBB des nanosystèmes inorganiques.
Le modèle BBB in vitro utilisé dans ce protocole est basé sur la co-culture de BMECs de rat et astrocytes. Dans le vaste scénario des modèles BBB 10,11,12, dont certains ont été décrits avec précision dans la littérature avec un protocole bien détaillé 15, notre modèle représente une bonne alternative de qualité. En effet, même si la TEER enregistrée était inférieure aux meilleures normes suggéré dans la littérature (150-200 Ω cm 2) 10, la perméabilité trans-BBB du traceur de haute dimension Dextran 40 est en accord total avec la formation d'une barrière étanche.
Ce modèle in vitro obtenus avec disponible dans le commerce chez le rat BMECs et les astrocytes, a quelques avantages: (1) L' efficacité optimale de croissance des cellules endotheliales, (2) une période de temps appropriée pour la production du modèle de BHE finale (pas plus de 13 jours), (3) le respect des questions éthiques, en évitant l'utilisation de cellules de tissus humains du cerveau (matériaux d'autopsie, les prélèvements chirurgicaux et tissus fœtaux) et 4) gain de temps et les coûts liés au logement des animaux et primaireextraction des cellules. Néanmoins, une limitation du modèle actuel est lié aux coûts élevés de RBMECs primaires non immortalisées, qui doivent être achetés (congelés à un seul passage) pour chaque milieu expérimental. En effet, nos études préliminaires de la production du Bureau ont montré que la capacité des cellules endothéliales pour produire un BBB serré est strictement liée au nombre de passages en culture des RBMECs après le premier après l'achat de la décongélation. Poursuite de l' application du modèle BBB décrit ici avec des suppléments endothéliales, tels que l' AMPc et de l' hydrocortisone, pourrait être envisagée afin d'améliorer l' étanchéité endothéliale et augmenter les valeurs TEER. 10,11,16
La présente technique est liée à la possibilité de tirer profit d'un modèle unique BBB pour différents dosages, fournissant ainsi plusieurs ensembles de données de chaque paramètre expérimental. Avec un seul système BBB exposé à des molécules fluorescentes libres ou nanocomplexed, il est possible: (1) pour mesurer ee trans-barrière de flux de la molécule par analyse de l'intensité de fluorescence d'aliquotes SecM collectées à partir de la chambre inférieure à différents points de temps d'incubation; (2) afin d'examiner l'intériorisation nano à médiation par des molécules dans RBMECs et leur trafic intracellulaire par microscopie confocale analyse par des cellules sur les inserts; (3) pour obtenir une indication de l'état des cellules BBB lors de l'exposition aux nanoformulations, en mesurant la TEER à la fin de l'expérience ou par analyse de l'intégrité de l'endothélium par microscopie électronique.
En conclusion, nous avons décrit ici un protocole pour l'étude de la perméation de molécules fluorescentes nanocomplexed à travers une haute qualité BBB modèle in vitro. Nous considérons cette méthode un outil utile pour étudier l'effet de nanoformulation sur l'administration de médicaments à travers la BHE.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Rat Brain Microvascular Endothelial Cells | Innoprot | P10308 | isolated from Sprague Dawley rat brain tissue, cryopreserved at passage one and delivered frozen |
| Cortical Astrocytes | Innoprot | P10202 | isolated from 2 days rat brain tissue, cryopreserved at passage one and delivered frozen. |
| Endothelial Cell Medium kit | Innoprot | P60104 | ECM (500 ml) and fetal bovin serum (25 ml), endothelial cell growth supplement (5 ml) and penicillin/streptomycin (5 ml). Warm in 37 °C water bath before use and protect from light |
| Trypsin-EDTA without Phenol Red | EuroClone | ECM0920D | Warm in 37 °C water bath before use |
| Fluorescein isothiocyanate-dextran 40,000 | Sigma | FD40S | protect from light |
| paraformaldehyde | Sigma | 158127 | diluition in chemical hood |
| Dulbecco's phosphate buffer saline w/o Ca and Mg | EuroClone | ECB4004L | |
| Triton X-100 | Sigma | T8787 | |
| bovine serum albumin | Sigma | A7906 | |
| goat serum | EuroClone | ECS0200D | |
| mouse monoclonal anti-Von Willebrand Factor | Dako | M0616 | |
| AlexaFluor 546-conjugated antibody against mouse IgGs | ThermoFischer Scientific | A-11003 | protect from light |
| DAPI (4’ ,6-diamidino-2-phenylindole) | ThermoFischer Scientific | D1306 | protect from light |
| ProLong Gold Antifade Mountant | ThermoFischer Scientific | P36934 | |
| Poly-L-lysine Hydrobromide | Sigma | P1274 | the same solution can be used several times |
| fibronectin from bovine plasma | Sigma | F1141 | the same solution can be used several times |
| Polyethylene terephthalate (PET) inserts | Falcon | F3090 | Transparent Polyethylene terephthalate (PET) membranes; surface area: 4.2 cm2; pore size 0.4 µm/surface area |
| T75 Primo TC flask | EuroClone | ET7076 | |
| T175 Primo TC flask | EuroClone | ET7181 | |
| EVOM2 Epithelial Tissue Volt/Ohmmeter | World Precision Instruments Germany | EVOM2 | |
| Endohm- 24SNAP cup | World Precision Instruments Germany | ENDOHM-24SNAP | |
| Light/fluorescence microscope with camera | Leica Microsystems | DM IL LED Fluo/ ICC50 W Camera Module | inverted microscope for live cells with camera |
| Confocal Microscope | Leica Microsystems | TCS SPE | |
| Spectrofluorimeter | Jasco | FP-8000 |
References
- Banks, W. A. Characteristics of compounds that cross the blood-brain barrier. BMC Neurol. 9 (1), 3 (2009).
- Löscher, W., Potschka, H. Drug resistance in brain disease and the role of efflux transporters. Nat Rev Neurosci. 6, 591-602 (2005).
- Xu, G., Mahajan, S., Roy, I., Yong, K. -T. Theranostic quantum dots for crossing blood-brain barrier in vitro and providing therapy of HIV-associated encephalopathy. Front Pharmacol. 15 (4), 140 (2013).
- Masserini, M. Nanoparticles for Brain Drug Delivery. ISRN Biochem. , (2013).
- Sagar, V., Pilakka-Kanthikeel, S., Pottathil, R., Saxena, S. K., Nair, M. Towards nanomedicines for neuroAIDS. Rev. Med. Virol. 24 (2), 103-124 (2014).
- Kreuter, J. Drug delivery to the central nervous system by polymeric nanoparticles: What do we know. Adv. Drug Deliver. Rev. 71, 2-14 (2014).
- Arosio, P., Ingrassia, R., Cavadini, P. Ferritins: a family of molecules for iron storage, antioxidation and more. Biochim. Biophys. Acta. 1790 (7), 589-599 (2009).
- Jääskeläinen, A., Soukka, T., Lamminmäki, U., Korpimäki, T., Virta, M. Development of a denaturation/renaturation-based production process for ferritin nanoparticles. Biotechnol. Bioeng. 102 (4), 1012-1024 (2009).
- Jefferies, W. A., Brandon, M. R., Hunt, S. V., Williams, A. F., Gatter, K. C., Mason, D. Y. Transferrin receptor on endothelium of brain capillaries. Nature. 312, 162-163 (1984).
- Deli, M. A., Abraham, C. S., Kataoka, Y., Niwa, M. Permeability studies on in vitro blood-brain barrier models: physiology, pathology, and pharmacology. Cell. Mol. Neurobiol. 25 (1), 59-127 (2005).
- Wilhelm, I., Fazakas, C., Krizbai, I. A. In vitro models of the blood-brain barrier. Acta Neurobiol. Exp. (Wars). 71, 113-128 (2011).
- Wilhelm, I., Krizbai, I. A. In vitro models of the blood-brain barrier for the study of drug delivery to the brain. Mol Pharm. 11 (7), 1949-1963 (2014).
- Bellini, M., et al. Protein nanocages for self-triggered nuclear delivery of DNA-targeted chemotherapeutics in Cancer Cells. J. Control. Release. 196, 184-196 (2014).
- Fiandra, L., et al. Nanoformulation of antiretroviral drugs enhances their penetration across the blood brain barrier in mice. Nanomedicine. 11 (6), 1387-1397 (2015).
- Molino, Y., Jabès, F., Lacassagne, E., Gaudin, N., Khrestchatisky, M. Setting-up an in vitro model of rat blood-brain barrier (BBB): a focus on BBB impermeability and receptor-mediated transport. J. Vis. Exp. , e51278 (2014).
- Perrière, N., et al. A functional in vitro model of rat blood-brain barrier for molecular analysis of efflux transporters. Brain Res. 1150, 1-13 (2007).
