Introduction
المقاومة من الجهاز العصبي المركزي (CNS) الأمراض (أي السرطان والصرع والاكتئاب وانفصام الشخصية وما يرتبط بها من فيروس نقص المناعة البشرية اضطراب عصبي) إلى العلاجات الدوائية ويرجع ذلك إلى آليات مختلفة مختلفة، بما في ذلك تخلل المخدرات شاقة عبر حاجز الدم في الدماغ (BBB) . بي بي بي هي الحدود التي تعزل أنسجة الدماغ من المواد في الدم. ضمن هذا الحاجز، وطبقة من خلايا الاوعية الدموية الدقيقة في الدماغ البطانية (BMECs)، بدعم من pericytes وendfeet النجمية، هي المسؤولة عن الانتقائية العالية من BBB إلى تلك العقاقير ذواب بالماء ذات وزن جزيئي أعلى من 400 دا 1. يرتبط آلية أخرى مقاومة ذات الصلة بالمخدرات وجود على BMECs من الناقلين هروب رأس المال المخدرات (P-بروتين سكري والمقاومة للأدوية المتعددة البروتينات)، التي تتعاون للحد من انتشار المخدرات في الجهاز العصبي المركزي وتسهيل قذف بهم من الدماغ 2.
في العقد الماضيوقد تم وضع عدد كبير من نهج تقنية النانو لمواجهة التحدي السريرية والبيولوجية لإيصال المخدرات عبر BBB 3-6. في هذا السياق، nanospheres الفيرتين (FNN) تمثل حلا مبتكرا تماما واعد. FNN هي 12 نانومتر المجالات من 24 الفيريتين الذاتي تجميع (الجبهة الوطنية) أحادية، والتي يتم ترتيبها في هيكل كروي مجوف من 8 القطر الداخلي نانومتر. مفارز الفيرتين يمكن تفكيكها في درجة الحموضة الحمضية وتجميعها في شكل أزياء الذاكرة من خلال جلب الرقم الهيدروجيني إلى الحياد، والسماح مختلف الجزيئات العضوية إلى المغلفة. لذلك، FNN تمثل نموذجا للاهتمام لتطوير متعددة الوظائف تسليم المخدرات الأنظمة 7،8. وعلاوة على ذلك، قد FNN التفاعل مع BMECs بفضل الاعتراف معين من ترانسفيرين مستقبلات (معدل الخصوبة الاجمالي) 1، وهو ما يعبر عنه على الغشاء اللمعية من هذه الخلايا 9.
حتى الآن، وقد وضعت مختلف نماذج في المختبر من BBB في أورديr لتوضيح العابرة للBBB نفاذية لمختلف انواع المخدرات، سمية تجاه BBB، أو تفاعل الجزيئات مع الناقلين هروب رأس المال. في الواقع، تعتبر هذه النماذج صالحة في المختبر النهج لفحص السريع من الجزيئات النشطة قبل الشروع في الدراسات المجراة. وتتألف هذه النماذج من طبقة واحدة من البطانية BMECs أو المشارك مثقف BMECs والخلايا النجمية (أكثر نادرا pericytes)، تم الحصول عليها من الحيوانات (الجرذان والفئران والخنازير والأبقار) أو خطوط الخلايا البشرية 10،11،12. وTransEndothelial المقاومة الكهربائية (طير) والنفاذية واضحة (P التطبيق) من استشفاف مع الوزن الجزيئي محددة تمثل معلمتين الحرجة التي تستخدم لتحديد نوعية النموذج في المختبر. نحن هنا وصف العمل لفي المختبر نموذج BBB، استنادا إلى ثقافة مشتركة من الفئران BMECs (RBMECs) والفئران الخلايا النجمية القشرية (تقييمات النتائج والكفاءات) لدراسة تخلل العابر للBBB من قفص نانوي الفيرتين التغليف isothi فلوريسئينocyanate (FITC).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. إنشاء نموذج BBB
ملاحظة: لإنشاء نموذج BBB نقترح استخدام RBMECs الأولية المتاحة تجاريا وتقييمات النتائج والكفاءات. يجب تنفيذ جميع الخطوات مع الكواشف والمستهلكات العقيمة، والتعامل معها في غطاء تدفق الصفحي.
- زراعة الخلايا
- معطف قوارير زراعة الخلايا مع بولي-L-ليسين 100 ميكروغرام / مل (1 ساعة على RT) أو فبرونيكتين 50 ميكروغرام / مل (1 ساعة على 37 درجة مئوية) لتعزيز مرفق من تقييمات النتائج والكفاءات أو RBMECs، على التوالي. ثم، ذوبان الجليد 1 × 10 6 تقييمات النتائج والكفاءات و5 × 10 5 RBMECs في البطانية المتوسطة الخلية، على أن تستكمل مع 5٪ مصل بقري جنيني، 1٪ تكملة نمو الخلايا البطانية و 1٪ البنسلين / الستربتومايسين (SECM). تقييمات النتائج والكفاءات البذور في قارورة T175 في 20 مل SECM وRBMECs في قارورة T75 في 10 مل SECM.
ملاحظة: يجب أن يتم تعديل ذوبان الجليد والممرات البذر من تقييمات النتائج والكفاءات وRBMECs، من حيث كثافة الخلايا والوقت في الثقافة، وفقا لعدد من الظروف التجريبية لفحصها مع النموذج BBB. قبل بدايةجي مع 1 قارورة من 1 × 10 6 تقييمات النتائج والكفاءات و1 قنينة من 5 × 10 5 RBMECs، فمن الممكن الحصول على ما يصل إلى 20 إدراج BBB الحاملة. - الحفاظ على الخلايا عند 37 درجة مئوية و CO 2 في الغلاف الجوي مرطب لحوالي 6 أيام 5٪ إلى حوالي 80٪ التقاء لتقييمات النتائج والكفاءات وأكثر من 90٪ التقاء لRBMECs. فصل الخلايا باستخدام حل التربسين-EDTA (التربسين 1: 250) لمدة 5 دقائق (1 مل التربسين لقوارير T75 و 2 مل لقوارير T175). وقف النشاط التربسين مع SECM (2: 1)، تعليق خلية الطرد المركزي في 750 × ز لمدة 5 دقائق و resuspend الكريات في 60 مل SECM.
- تقسيم RBMECs إلى 3 قوارير T175 والثقافة في SECM لمدة 3 أيام أخرى قبل البذر على إدراج. عد عدد من يعيشون تقييمات النتائج والكفاءات، من خلال مراقبة تعليق خلية المخفف 1: 1 مع الأزرق التريبان تحت المجهر الضوئي في غرفة Burker.
- معطف قوارير زراعة الخلايا مع بولي-L-ليسين 100 ميكروغرام / مل (1 ساعة على RT) أو فبرونيكتين 50 ميكروغرام / مل (1 ساعة على 37 درجة مئوية) لتعزيز مرفق من تقييمات النتائج والكفاءات أو RBMECs، على التوالي. ثم، ذوبان الجليد 1 × 10 6 تقييمات النتائج والكفاءات و5 × 10 5 RBMECs في البطانية المتوسطة الخلية، على أن تستكمل مع 5٪ مصل بقري جنيني، 1٪ تكملة نمو الخلايا البطانية و 1٪ البنسلين / الستربتومايسين (SECM). تقييمات النتائج والكفاءات البذور في قارورة T175 في 20 مل SECM وRBMECs في قارورة T75 في 10 مل SECM.
- البذر الخلية على إدراجات
- علاج جانب واحد من البولي إثيلين (PET) غشاء transpar 6 متعددة أيضاإدراج والأنف والحنجرة مع بولي-L-ليسين 100 ميكروغرام / مل وعلى الجانب الآخر مع فبرونيكتين 50 ميكروغرام / مل، للسماح الحجز على تقييمات النتائج والكفاءات وBMECs. التعامل مع إدراج مع ملاقط من أجل تجنب الاتصال مع غشاء PET.
- وضع تدرج في لوحة 6 جيدا وإضافة محلول فبرونيكتين (الحد الأدنى 500 ميكرولتر) في مجلس الشيوخ. بعد 1 ساعة من الحضانة عند 37 درجة مئوية، وإزالة حل فبرونيكتين، واتخاذ إدراج قبالة لوحة متعددة جيدا ووضعها رأسا على عقب على الجزء السفلي من 150 سم طبق 2 بيتري، والذي يستخدم هنا كدعم معقم لل المغلفة بالفعل إدراج.
- إضافة بلطف 800 ميكرولتر من بولي-L-يسين على الجانب السفلي من إدراج (كما هو موضح في الشكل 1A، يشار إلى تقييمات النتائج والكفاءات البذر)، والحفاظ على حل على إدراج لمدة 1 ساعة على RT.
- نضح الحل والسماح للإدراج الجافة في RT مدة 15-30 دقيقة. يدرج هي الآن جاهزة للزرع الخلايا، ولكن يمكن أيضا أن يتم تخزينها في لوحة متعددة جيدا لعدةأيام في 4 درجات مئوية، وذلك قبل الشروع في البناء BBB.
ملاحظة: تذكر أن تحافظ على الأقل 3 إدراج المغلفة خالية من الخلايا، لاستخدامها الضوابط للتحقق من صحة إنشاء BBB من قبل FD40 قياسات التدفق.
- تقييمات النتائج والكفاءات البذور (35000 / سم 2) على الجانب السفلي من إدراج المغلفة بولي-L-ليسين، من خلال إسقاط 800 ميكرولتر من تعليق على الخلية رأسا على عقب إدراج (الشكل 1A). ترك تعليق RCA على إدراج لمدة 4 ساعة على RT، من أجل السماح للمرفق كفاءة الخلايا لغشاء.
- نضح الحل المتبقية، ضع تدرج في الآبار التي تحتوي على 2 مل من SECM والحفاظ على لوحة متعددة جيدا عند 37 درجة مئوية وCO 2 5٪ في جو مرطب، وتغيير SECM كل أيام 2.
- بعد 3 أيام، عندما المغلفة تقييمات النتائج والكفاءات الوجه السفلي للإدراج، RBMECs البذور على الجانب العلوي من إدراج، باتباع الخطوات التالية:
- فصل RBMECs من قوارير T175 وعدمجموع الخلايا الحية، كما ورد في خطوات 1.1.2 و 1.1.3.
- RBMECs البذور (60000 / سم 2) على السطح العلوي للإدراج في SECM (1000 ميكرولتر) (الشكل 1B)، وترك 3 إدراج مع الخلايا النجمية فقط، لاستخدامها طير الخلفية. وضع لوحة متعددة جيدا في ظروف ثقافة القياسية. الحفاظ على نظام للثقافة لمدة 3 أيام على الأقل، وتغيير SECM في الغرفة الداخلية وانخفاض كل أيام 2.
- علاج جانب واحد من البولي إثيلين (PET) غشاء transpar 6 متعددة أيضاإدراج والأنف والحنجرة مع بولي-L-ليسين 100 ميكروغرام / مل وعلى الجانب الآخر مع فبرونيكتين 50 ميكروغرام / مل، للسماح الحجز على تقييمات النتائج والكفاءات وBMECs. التعامل مع إدراج مع ملاقط من أجل تجنب الاتصال مع غشاء PET.
2. التحقق من صحة BBB
- قياس طير
- في يوم 3 الثالثة وثقافة مشتركة، والتحقق من طير عن طريق إدراج إدراج BBB الحاملة الى غرفة المناسبة (التي لديها سقف واذا كان كل من غرفة وغطاء تحتوي على زوج من الجهد الاستشعار عن بعد والأقطاب الكهربائية الحالية)، مليئة 4 مل من SECM. اتصال الظهارية فولت الأنسجة / جهاز قياس المقاومة.
- جنبا إلى جنب مع القياسات طير الخلية BBB-أنظمة، تسجيل القيم طير من 3 إدراج تحمل تقييمات النتائج والكفاءات عشرفي سوف تطرح من القيم التي تم الحصول عليها مع BBBS. ضرب القيم طير الناجم عن سطح إدراج (4.2 سم 2) من أجل التعبير عن النتائج على النحو Ω س سم 2.
- من يوم 3 الثالثة وثقافة مشتركة، وقياس طير كل يوم. ملاحظة: بعد فترة أولية حيث يزيد من طير، وينبغي أن تظل القيم المسجلة مستقر لمدة سنتين على الأقل أيام متتالية (عادة ما بين ال 5 واليوم ال 7 من شارك في الثقافة). في هذه النقطة BBB مستعدة للخطوة الثانية من التحقق من صحة (القسم 2.2) و / أو التجارب العابرة للBBB.
ملاحظة: الإجراء هو موضح في القسم 2.1 لا يمكن أن يؤديها على نفس BBB-نظم المكرسة ل(القسم 3) التجارب نفاذية التالية. تعمل تحت ظروف معقمة.
- عبر BBB الجريان من FITC-ديكستران 40 (FD40)
- قياس تدفق FD40 من الأعلى إلى مجلس النواب من النماذج BBB مقارنة بما كان عليه في 3 إدراج فارغة(راجع الملاحظة من القسم 1.2.1) وفقا للخطوات التالية:
- إضافة 1 ملغ / مل FD40 (المخفف في SECM) في حجرة العليا من BBBS، وبعد 1 و 2 و 3 ساعة سحب 200 ميكرولتر SECM من مجلس النواب وقياس كثافة مضان من قبل spectrofluorimeter (λ السابق 488 نانومتر، λ م 515 نانومتر، شق 5).
- الحصول على قيم SECM خلفية fluorescenceby قياس 500 ميكرولتر من المتوسطة البكر باستخدام نفس المعايير التحليلية. طرح مضان الخلفية SECM من كل القيم مضان FD40.
- تحديد مقدار FD40 تعم من خلال المقارنة بين القيم مضان لوحظ مع منحنى المعايرة المنتجة مع تركيزات المعروفة (أي 0.312، 0.625، 1.25، 2.5 ميكروغرام / مل) من التتبع الفلورسنت المذاب في 500 ميكرولتر من SECM.
- حساب معامل نفاذية واضح (P التطبيق) من قيم التدفق يعني فقا لما يلي:
P التطبيق = J / AC
2) وC هو تركيز جزيء في المقصورة العليا (الشامات / سم 3).
ملاحظة: ثلاثة أو أكثر من BBB-النظم التي وصلت قيم طير مناسبة، يجب أن يخصص حصرا لهذا الإجراء التحقق من صحة، وينبغي ألا تستخدم للتجارب نفاذية التالية (القسم 3). العقم ليس إلزاميا.
- قياس تدفق FD40 من الأعلى إلى مجلس النواب من النماذج BBB مقارنة بما كان عليه في 3 إدراج فارغة(راجع الملاحظة من القسم 1.2.1) وفقا للخطوات التالية:
3. تخلل من Ferritins تحميل FITC (FNN) عبر BBB
ملاحظة: البديل المؤتلف من الفيريتين الإنسان (الجبهة الوطنية)، التي تنتج في القولونية وتجميعها في قفص نانوي (FNN) لتغليف جزيئات الفلورسنت مختلفة، متاح من NanoBioLab الأستاذ بروسبيري (جامعة ميلانو بيكوكا، إيطاليا). يتم تحميل FNN مع FITC، وفقا لبروتوكول سبق وصفها 13 و تركيزات كل من الجبهة الوطنية والجزيئات تحميل وdetermin بدقةأد.
- عبر BBB الجريان من FITC وFITC-FNN
- قياس تدفق FITC-FNN من الأعلى إلى مجلس النواب من نماذج BBB التحقق من صحة (عادة في 5 تشرين - يوم ال 7 من شارك في ثقافة)، مقارنة بما كان عليه الصبغة حرة بعد 7 و 24 ساعة من الحضانة، وفقا ل الخطوات التالية:
- إضافة FITC-FNN (50 ميكروغرام / مل FNN، 1.1 ميكرومتر FITC) أو مبلغا مساويا لحرية FITC في مجلس الشيوخ لا يقل عن 6 أنظمة BBB لكل صياغة، من أجل سحب 2 مل من محلول SECM من مجلس النواب من على الأقل 3 إدراج بعد 7 ساعات، ومن مجلس النواب من 3 إدراج أخرى بعد 24 ساعة.
- قياس كثافة مضان من 500 ميكرولتر من العينات التي تم جمعها spectrofluorimeter (λ السابق 488 نانومتر، λ م 515 نانومتر، شق 5).
- الحصول على مضان خلفية SECM عن طريق قياس 500 ميكرولتر من المتوسط باستخدام نفس المعايير التحليلية. طرح مضان الخلفية SECMمن كل القيم مضان FITC أو FITC-FNN.
- تحديد تركيز تعم FITC أو FITC-FNN بمقارنة القيم مضان الحصول عليها مع اثنين من منحنيات المعايرة المختلفة المنتجة مع تركيزات المعروفة (أي 6.87، 13.75، 27.5، 55 نانومتر) من الصبغة مجانا أو nanoformulated المذاب في 500 SECM ميكرولتر.
- قياس تدفق FITC-FNN من الأعلى إلى مجلس النواب من نماذج BBB التحقق من صحة (عادة في 5 تشرين - يوم ال 7 من شارك في ثقافة)، مقارنة بما كان عليه الصبغة حرة بعد 7 و 24 ساعة من الحضانة، وفقا ل الخطوات التالية:
- FITC-FNN التعريب في RBMECs
- إزالة SECM من الغرفة العليا من أنظمة BBB، وغسل إدراج مع برنامج تلفزيوني وإصلاح RBMECs على اثنين على الأقل إدراج لكل المجموعة التجريبية وذلك بإضافة 500 ميكرولتر بارافورمالدهيد (4٪ في الفوسفات عازلة المالحة PBS) في المقصورة العليا لل10 دقيقة في RT.
- غسل إدراج ثلاث مرات مع برنامج تلفزيوني لإزالة امتصاص العرق المتبقي.
ملاحظة: من هذه النقطة، والعقم ليس من الضروري. - قطع قطع مناسبة للغشاء PET، والمضي قدما في immunodecoration من الخلايا وفقا للخطوات التالية:
- Permeabiليز RBMECs مع 0.1٪ تريتون X-100 في برنامج تلفزيوني لمدة 10 دقيقة. إجراء خطوة حجب لمدة 1 ساعة على RT مع محلول يحتوي على 2٪ ألبومين المصل البقري (BSA)، 2٪ مصل الماعز في برنامج تلفزيوني. احتضان هذه العينات مع مضاد للعامل فون ويل براند (VWF) في 1:20 التخفيف، لمدة 2 ساعة على RT.
- بعد غسل ثلاث مرات مع برنامج تلفزيوني، وتعريض الخلايا لمدة 2 ساعة على RT لجيش صرب البوسنة 2٪ و 2٪ من محلول المصل الماعز يحتوي على الأجسام المضادة الثانوية مناسبة في التخفيف 1: 300 وذلك للكشف عن مكافحة VWR، ودابي في 1: 1500 تخفيف للكشف نوى.
- تركيب قطع إدراج على الشرائح المجهر باستخدام تصاعد antifade حل (قطرة واحدة في إدراج جزء)، ثم أغلق عينة مع انزلاق الغطاء. تحليل بواسطة المجهر متحد البؤر باستخدام عدسة الغمر النفط في 40X التكبير، 1.5 التكبير و1،024 X 1024 بيكسل.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
خلال إنشاء نموذج BBB، مرفق الخلية والنمو على إدراج يمكن رصدها باستخدام المجهر الخفيفة وذلك بفضل طبيعة شفافة من الأغشية PET. تقييمات النتائج والكفاءات، المصنف في مناطق ذات كثافة من 35،000 خلية / سم 2، ونعلق بكفاءة إلى الجانب السفلي من إدراج بعد 4 ساعات من الحضانة في RT (الشكل 2A) وتنمو لتغطية سطح الغشاء في 3 أيام، مع الأخذ في التشكل على شكل مغزلي (الشكل 2B). RBMECs المصنفة في مناطق ذات كثافة من 60،000 خلية / سم 2، وترد واضح على وجهه العلوي من غشاء PET بعد حوالي 3 ساعات من الحضانة عند 37 درجة مئوية (الشكل 2C). طبقة RBMEC وضع يمكن أن يكون من الصعب تصور مدى الأيام التالية مع المجهر الضوئي، بسبب التداخل مع طبقة RCA الأساسية (الشكل 2D).
والتحقق من صحة الصحيح للBBB نموذج يتطلب دائما قياس طير ويمكن التأكد من ذلك من خلال تقييم P التطبيق العابر للBBB من التتبع نفاذية منخفضة، مثل FD40.
قيم طير، وسجلت خلال الفترة الثقافة المشتركة، وتمثل أول مؤشر واضح لتشكيل الصحيح للحاجز غشائي. بعد ثلاثة أيام RBMEC البذر، وطير المسجلة، تطرح من طير للمحامل الخلايا النجمية، ويرجع ذلك أساسا إلى مساهمة طبقة غير كهربي من تقييمات النتائج والكفاءات وتطوير طبقة من RBMECs. عند هذه النقطة الوقت، لدينا BBB يعطي القيم التي تتراوح بين 20 و 40 Ω س سم 2. وخلال الأيام التالية، وعادة ما بين ال 4 و اليوم الموافق 5 من الثقافة المشتركة، وطير تقدر الزيادة بسبب تشكيل منعطفات ضيقة بين الخلايا البطانية المجاورة 14، حيث بلغت قيم عادة بين 55 و 110 Ω س سم 2، و في حالات استثنائية مرحباgher تقدر 14. تبقى القيم المقاسة في اليوم ال 4/5 عشر من شارك في ثقافة مستقرة على الأقل حتى ال 7 - اليوم ال 8 قبل أن تبدأ في الانخفاض. وبالتالي، هناك نافذة زمنية ضيقة للغاية المتاحة لإجراء التجارب العابرة للBBB تغير مستمر.
بين ال 5 واليوم ال 7 من الثقافة المشتركة، من سلامة نماذج تجريبية يمكن التأكد من تقييم نفاذية FD40 العابر للBBB. ويبين الشكل 3 مثال على تدفق العابر للBBB من FD40 (1 ملغ / مل )، مقارنة مع تدفق عبر إدراج فارغة، وأكثر من 3 ساعات من الحضانة. وBBBS هي في يوم 6 تشرين المشترك ثقافة وطير سجلت هو 55.6 ± 15.8 Ω سم 2 (يعني ± SE، ن = 3). تدفق غير خطية بين 1 و 3 ساعة من الحضانة والتطبيق متوسط ف المحسوبة بين 1 و 2 ساعة، وبين 2 و 3 ساعات من الحضانة0.12 ± 0.01 × 10 - 6 سم في الثانية - 1 (± SE، ن = 6).
مرة واحدة على الأقل ثلاثة متتالية ناجحة BBBS، من حيث طير وFD40 P التطبيق، قد تم الحصول عليها في تجارب مستقلة يمكن تجنبها قياس نفاذية التتبع. ومع ذلك، فإن طير يحتاج دائما إلى أن تسجل لكل تجربة.
نفاذية العابر للBBB من جزيئات الفلورسنت وتأثير نانو معقدة على إيصالها يمكن التحقيق باستخدام الفئران نماذج BBB المذكورة أعلاه. ويبين الشكل 4 تخلل الصبغة نموذج FITC على الكبسلة في FNN عبر BBBS مع طير من 100.4 ± 3.5 Ω سم 2 (ن = 16) في يوم 7 تشرين المشترك الثقافة. رسوم بيانية، وهو ما يمثل تركيز FITC في مجلس النواب بعد 7 و 24 ساعة من إضافة صبغة خالية أو nanoformulatedفي المقصورة العليا، تشير إلى أن FNN غير قادرة على زيادة كبيرة في إيصال FITC عبر BBB.
صور المجهر متحد البؤر من الجانب العلوي من إدراج بعد 7 و 24 ساعة من الحضانة مع FITC-FNN (الشكل 5A، C) أو FITC (الشكل 5B، D) تظهر أنه في حين لا المنضوية مجانا FITC قبل RBMECs، تحميل لها في وFNN يسمح لها بالدخول إلى الخلايا.
قبل معالجة ملحقة للفحص المجهري متحد البؤر، شيك مزيد من طير ضروري لضمان عدم وجود آثار بوساطة FNN عليها سلامة BBB.
الشكل 1: البذر الخلية على مدرجات RCA (A) وRBMEC (ب) إجراء البذر على اثنين من جانبيلإدراج لوحة متعددة أيضا. الرجاء النقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: مجهر بصري صور من تقييمات النتائج والكفاءات وRBMVECs على مدرجات المصنفة إدراجات مع لوحظ تقييمات النتائج والكفاءات وRBMECs مع مجهر الضوء (20X زووم بصري). (A) أربعة ساعة بعد الغرس، وجولة وتقييمات النتائج والكفاءات شفافة وترد واضح على السطح السفلي للإدراج. شكل المغزل (B) تقييمات النتائج والكفاءات مرئية في يوم 3 الثالثة والثقافة؛ وتعلق (C) جولة وRBMECs شفافة على الجانب العلوي من إدراج بعد 3 ساعات من الحضانة. (D) في اليوم ال 4 من شارك في ثقافة كل من أسطح إدراج مغطاة بالكامل مع الخلايا، وتكمن اثنينالمتطلبات البيئية لا يمكن تمييزها بسهولة. مقياس شريط = 100 ميكرون. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الرقم 3: FD40 الجريان عبر BBB الجريان من FD40 (1 ملغ / مل) من الأعلى إلى الجانب السفلي من في المختبر نظام BBB، مقارنة ذلك عبر إدراج فارغة. وقد تم قياس كمية FD40 في مجلس النواب في 60 و 120 و 180 دقيقة منصب إضافة الصبغة للغرفة العليا. يعني ± سراج الدين. رقم إدراج = 3. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 4: تأثير FNN تغليف على FITC تخلل عبر BBB تركيز FITC في مجلس النواب للفي المختبر نظام BBB محسوبة على 7 و 24 ساعة بعد إضافة FITC أو FITC-FNN في مجلس الشيوخ. يعني ± SE 4-5 يعيد. **** P <0.0005، FITC-FNN مقابل. FITC (الطالب اختبار t). الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الرقم 5: متحد البؤر المجهري من RBMECs على مدرجات متحد البؤر الميكروسكوب الليزر المسح الضوئي (المقاطع البصرية واحدة) من RBMECs بعد 7 ساعات (A، B) أو 24 ساعة (C، D) من الحضانة مع free FITC (B، C) أو FITC. -FnN (A،
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
الأسلوب في المختبر الموصوفة هنا يمثل نهجا التحقق من المفيد دراسة تقديم العابر للBBB من جزيئات الفلورسنت على nanoformulation مع النانوية. هنا نستخدم FNN، وهو ما يمثل مرشح جيد لدراسة النبات من الجزيئات البضائع عبر BBB. يعتبر FNN وnanovector الذهب العابرة للBBB تسليم المخدرات / وكلاء لأن من المسلم به على وجه التحديد من قبل مستقبلات TfR1، وهو ما يعبر عنه على الغشاء اللمعية من BMECs وتتوسط امتصاص جسيمات متناهية الصغر باستخدام استيعاب مسار بوساطة مستقبلات. وعلاوة على ذلك، FNN هو جسيمات متناهية الصغر الطبيعية ولها بالتالي الشخصي توافق مع الحياة جيدة. وأخيرا، FNN غير قادرة على تغليف منخفض البعد جزيئات ذواب بالماء من خلال آلية بسيطة وفعالة. يمكن تقييم تخلل العابر للBBB من أنواع أخرى مختلفة من الجسيمات النانوية العضوية أو غير العضوية أيضا مع هذا البروتوكول، وفقا لبعض الاعتبارات المتعلقة النانوية الميزات. ع الأولrerequisite لدراسة تخلل nanoformulated المخدرات / وكلاء وسلامة جسيمات متناهية الصغر الفراغ. قضية حاسمة أخرى هي تفاعل جسيمات متناهية الصغر التحقيق مع مرشح الدائرة. هذا الجانب، لابد من تقييمها مبدئيا من أجل استبعاد الاحتفاظ كبير في المسام الغشاء وتجنب التعديلات من تغلغل في كافة أرجاء BBB. مجموعتنا قد استخدمت مؤخرا الاستراتيجية المقترحة لدراسة أكسيد الحديد جسيمات متناهية الصغر المغلفة البوليمر كما BBB عبر نظام تسليم الأدوية المضادة للفيروسات القهقرية مضان المسمى 14. في هذه الحالة، فإننا المرتبطة الإلكترون المجهري توطين nanoformulations في RBMECs إلى الكشف عن مضان. وعلاوة على ذلك، طرق التشخيص حساسة للغاية أخرى، مثل بالحث جانب البلازما (ICP) -MS يمكن استخدامها لتقييم تسليم العابر للBBB من النانو غير العضوية.
ويستند هذا النموذج BBB في المختبر المستخدمة في هذا البروتوكول على ثقافة مشتركة من BMECs الفئران والخلايا النجمية. في السيناريو واسعة من النماذج BBB 10،11،12، والبعض منها قد تم وصفها بدقة في الأدب مع بروتوكول جيدا مفصلا 15، يمثل نموذجا لدينا بديل ذات نوعية جيدة. في الواقع، على الرغم من أن طير سجلت كانت تحت أفضل المعايير المقترحة في الأدب (150-200 Ω سم 2) 10، نفاذية العابر للBBB من ارتفاع التتبع البعد كان ديكستران 40 في اتفاق تام مع تشكيل حاجز مشددة.
هذا في المختبر نموذج، وحصل مع متوفرة تجاريا الفئران BMECs والخلايا النجمية، لديه بعض المزايا: (1) كفاءة النمو المثلى من الخلايا البطانية، (2) فترة مناسبة من الوقت لإنتاج نموذج BBB النهائي (لا تزيد عن 13 يوما)، (3) والامتثال القضايا الأخلاقية، وتجنب استخدام خلايا من أنسجة الإنسان الدماغ (مواد التشريح، العينات الجراحية، والأنسجة الجنينية) و 4) توفير الوقت والتكاليف المتصلة حظائر الحيوانات، والابتدائياستخراج الخلايا. ومع ذلك، ويرتبط وجود قيود على النموذج الحالي لارتفاع تكاليف RBMECs الابتدائي غير مخلد، والتي يجب شراؤها (المجمدة في ممر واحد) لكل إعداد التجريبية. في الواقع، لقد أظهرت دراساتنا الأولية للإنتاج BBB أن قدرة الخلايا البطانية لإنتاج BBB ضيق ويرتبط بشكل صارم مع عدد من المقاطع في ثقافة RBMECs بعد أول الذوبان بعد الشراء. ويمكن اعتبار مواصلة تنفيذ نموذج BBB الموصوفة هنا مع ملاحق البطانية، مثل معسكر والهيدروكورتيزون، من أجل تحسين ضيق البطانية وزيادة القيم طير. 10،11،16
ويرتبط تقنية الحالية إلى إمكانية الاستفادة من نموذج BBB واحد لفحوصات مختلفة، وبالتالي توفير عدة مجموعات البيانات من كل إعداد التجريبية. مع نظام BBB واحدة تتعرض لجزيئات الفلورسنت مجانية أو nanocomplexed، فمن الممكن: (1) لقياس عشرالبريد عبر الحاجز تدفق جزيء من خلال تحليل كثافة مضان من قسامات SECM التي تم جمعها من النواب في نقاط زمنية مختلفة من الحضانة. (2) للتحقيق في استيعاب بوساطة نانو جزيئات في RBMECs والاتجار داخل الخلايا عن طريق التحليل المجهري متحد البؤر الخلايا على إدراج. (3) للحصول على إشارة لحالة الخلايا BBB عند التعرض لnanoformulations، عن طريق قياس طير في نهاية التجربة أو عن طريق تحليل سلامة البطانة بواسطة المجهر الإلكتروني.
في الختام، هنا وصفنا بروتوكول لدراسة تخلل جزيئات الفلورسنت nanocomplexed عبر ذات جودة عالية BBB في المختبر النموذجي. ونحن نعتبر هذه المنهجية أداة مفيدة لدراسة أثر nanoformulation على تسليم المخدرات عبر BBB.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Rat Brain Microvascular Endothelial Cells | Innoprot | P10308 | isolated from Sprague Dawley rat brain tissue, cryopreserved at passage one and delivered frozen |
| Cortical Astrocytes | Innoprot | P10202 | isolated from 2 days rat brain tissue, cryopreserved at passage one and delivered frozen. |
| Endothelial Cell Medium kit | Innoprot | P60104 | ECM (500 ml) and fetal bovin serum (25 ml), endothelial cell growth supplement (5 ml) and penicillin/streptomycin (5 ml). Warm in 37 °C water bath before use and protect from light |
| Trypsin-EDTA without Phenol Red | EuroClone | ECM0920D | Warm in 37 °C water bath before use |
| Fluorescein isothiocyanate-dextran 40,000 | Sigma | FD40S | protect from light |
| paraformaldehyde | Sigma | 158127 | diluition in chemical hood |
| Dulbecco's phosphate buffer saline w/o Ca and Mg | EuroClone | ECB4004L | |
| Triton X-100 | Sigma | T8787 | |
| bovine serum albumin | Sigma | A7906 | |
| goat serum | EuroClone | ECS0200D | |
| mouse monoclonal anti-Von Willebrand Factor | Dako | M0616 | |
| AlexaFluor 546-conjugated antibody against mouse IgGs | ThermoFischer Scientific | A-11003 | protect from light |
| DAPI (4’ ,6-diamidino-2-phenylindole) | ThermoFischer Scientific | D1306 | protect from light |
| ProLong Gold Antifade Mountant | ThermoFischer Scientific | P36934 | |
| Poly-L-lysine Hydrobromide | Sigma | P1274 | the same solution can be used several times |
| fibronectin from bovine plasma | Sigma | F1141 | the same solution can be used several times |
| Polyethylene terephthalate (PET) inserts | Falcon | F3090 | Transparent Polyethylene terephthalate (PET) membranes; surface area: 4.2 cm2; pore size 0.4 µm/surface area |
| T75 Primo TC flask | EuroClone | ET7076 | |
| T175 Primo TC flask | EuroClone | ET7181 | |
| EVOM2 Epithelial Tissue Volt/Ohmmeter | World Precision Instruments Germany | EVOM2 | |
| Endohm- 24SNAP cup | World Precision Instruments Germany | ENDOHM-24SNAP | |
| Light/fluorescence microscope with camera | Leica Microsystems | DM IL LED Fluo/ ICC50 W Camera Module | inverted microscope for live cells with camera |
| Confocal Microscope | Leica Microsystems | TCS SPE | |
| Spectrofluorimeter | Jasco | FP-8000 |
References
- Banks, W. A. Characteristics of compounds that cross the blood-brain barrier. BMC Neurol. 9 (1), 3 (2009).
- Löscher, W., Potschka, H. Drug resistance in brain disease and the role of efflux transporters. Nat Rev Neurosci. 6, 591-602 (2005).
- Xu, G., Mahajan, S., Roy, I., Yong, K. -T. Theranostic quantum dots for crossing blood-brain barrier in vitro and providing therapy of HIV-associated encephalopathy. Front Pharmacol. 15 (4), 140 (2013).
- Masserini, M. Nanoparticles for Brain Drug Delivery. ISRN Biochem. , (2013).
- Sagar, V., Pilakka-Kanthikeel, S., Pottathil, R., Saxena, S. K., Nair, M. Towards nanomedicines for neuroAIDS. Rev. Med. Virol. 24 (2), 103-124 (2014).
- Kreuter, J. Drug delivery to the central nervous system by polymeric nanoparticles: What do we know. Adv. Drug Deliver. Rev. 71, 2-14 (2014).
- Arosio, P., Ingrassia, R., Cavadini, P. Ferritins: a family of molecules for iron storage, antioxidation and more. Biochim. Biophys. Acta. 1790 (7), 589-599 (2009).
- Jääskeläinen, A., Soukka, T., Lamminmäki, U., Korpimäki, T., Virta, M. Development of a denaturation/renaturation-based production process for ferritin nanoparticles. Biotechnol. Bioeng. 102 (4), 1012-1024 (2009).
- Jefferies, W. A., Brandon, M. R., Hunt, S. V., Williams, A. F., Gatter, K. C., Mason, D. Y. Transferrin receptor on endothelium of brain capillaries. Nature. 312, 162-163 (1984).
- Deli, M. A., Abraham, C. S., Kataoka, Y., Niwa, M. Permeability studies on in vitro blood-brain barrier models: physiology, pathology, and pharmacology. Cell. Mol. Neurobiol. 25 (1), 59-127 (2005).
- Wilhelm, I., Fazakas, C., Krizbai, I. A. In vitro models of the blood-brain barrier. Acta Neurobiol. Exp. (Wars). 71, 113-128 (2011).
- Wilhelm, I., Krizbai, I. A. In vitro models of the blood-brain barrier for the study of drug delivery to the brain. Mol Pharm. 11 (7), 1949-1963 (2014).
- Bellini, M., et al. Protein nanocages for self-triggered nuclear delivery of DNA-targeted chemotherapeutics in Cancer Cells. J. Control. Release. 196, 184-196 (2014).
- Fiandra, L., et al. Nanoformulation of antiretroviral drugs enhances their penetration across the blood brain barrier in mice. Nanomedicine. 11 (6), 1387-1397 (2015).
- Molino, Y., Jabès, F., Lacassagne, E., Gaudin, N., Khrestchatisky, M. Setting-up an in vitro model of rat blood-brain barrier (BBB): a focus on BBB impermeability and receptor-mediated transport. J. Vis. Exp. , e51278 (2014).
- Perrière, N., et al. A functional in vitro model of rat blood-brain barrier for molecular analysis of efflux transporters. Brain Res. 1150, 1-13 (2007).
