Introduction
A resistência do sistema nervoso central (SNC) de doenças (ou seja. O cancro, epilepsia, depressão, esquizofrenia e desordem neurológica associada ao HIV) para terapias farmacológicas é devido a vários mecanismos diferentes, incluindo permeação do fármaco árdua através da barreira sangue-cérebro (BBB) . O BBB é a fronteira que isola tecidos do cérebro a partir de substâncias que circulam no sangue. Dentro desta barreira, uma camada de células endoteliais microvasculares cerebrais (BMECs), suportados por pericitos e endfeet astrócitos, é responsável pela elevada selectividade da certificação para aquelas drogas hidrossolúveis com um peso molecular superior a 400 Da 1. Outro mecanismo de resistência relacionada com a droga está ligada à presença na BMECs dos transportadores de efluxo de drogas (proteínas glicoproteína-P e resistência a múltiplas drogas), que co-atuam para reduzir a penetração da droga no SNC e facilitar a sua extrusão do cérebro 2.
Na última década, Um grande número de abordagens nanotecnologia têm sido desenvolvidos para satisfazer o desafio biológica e clinica de entrega de drogas através da certificação 3-6. Neste contexto, nanoesferas ferritina (Fnn) representam uma solução completamente inovadora e promissora. Fnn são 12 esferas nm de 24 ferritina auto-montagem (Fn) monômeros, que são dispostos em uma estrutura esférica oca, de 8 de diâmetro interno nm. subunidades de ferritina pode ser desmontado em pH ácido e reagrupados numa forma com memória de forma, trazendo o pH até à neutralidade, permitindo que várias moléculas orgânicas a ser encapsulado. Portanto, Fnn representam um modelo interessante para o desenvolvimento de multifuncional entrega da droga sistemas 7,8. Além disso, podem interagir com Fnn BMECs graças ao reconhecimento específico de receptor de transferrina (TfR) 1, que é expresso sobre a membrana luminal destas células 9.
Até agora, diferentes em modelos in vitro da BHE foram desenvolvidos na order para elucidar trans-certificação permeabilidade para vários fármacos, a toxicidade para a certificação, ou a interacção de moléculas com transportadores de efluxo. De facto, estes modelos são considerados válidos abordagens in vitro para uma triagem rápida de moléculas activas, antes de prosseguir com os estudos in vivo. Estes modelos consistir de uma única camada endotelial de BMECs ou BMECs astrócitos e co-cultivadas (mais raramente) pericitos, obtido a partir de animais (rato, ratinho, porco e bovino) ou linhas celulares humanas 10,11,12. A resistência eléctrica transendotelial (TEER) e a permeabilidade aparente (P app) de marcadores com um peso molecular definido representam dois parâmetros críticos que são usados para determinar a qualidade do modelo in vitro. Aqui nós descrevemos o emprego de um modelo de certificação in vitro, com base numa co-cultura de rato BMECs (RBMECs) e Rat astrócitos corticais (RCA) para estudar a permeação trans-BBB de nanocages ferritina encapsular isothi fluoresceínaocyanate (FITC).
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Protocol
1. Estabelecer o modelo de certificação
Nota: Para estabelecer o modelo de certificação, sugerimos o uso RBMECs primários disponíveis comercialmente e RCA. Todos os passos devem ser executados com reagentes estéreis e descartáveis, manipulados numa câmara de fluxo laminar.
- Cultura de células
- frascos de cultura de células com revestimento de poli-L-lisina 100 ug / ml (1 h à temperatura ambiente) ou fibronectina 50 ug / ml (1 h a 37 ° C) para promover a ligação de RCA ou RBMECs, respectivamente. Em seguida, descongelar 1 x 10 6 RCA e 5 x 10 5 RBMECs em meio de células endoteliais, suplementado com 5% de soro fetal bovino, suplemento de crescimento celular endotelial 1% e 1% de penicilina / estreptomicina (SECM). RCAs de sementes em um frasco T175 em 20 ml SECM e RBMECs em um frasco T75 em 10 ml SECM.
Nota: A descongelação e passagens de semeadura de RCA e RBMECs deve ser ajustada, em termos de densidade celular e o tempo em cultura, de acordo com o número de condições experimentais a ser testado com o modelo de certificação. Ao inícioção com um frasco de 1 x 10 6 RCA e um frasco de 5 x 10 5 RBMECs, é possível obter-se a 20 inserções de certificação de rolamento. - Manter as células a 37 ° C e 5% de CO2 numa atmosfera húmida durante cerca de 6 dias, até cerca de 80% de confluência de RCA e mais de 90% de confluência para RBMECs. Retire células utilizando uma solução de tripsina-EDTA (tripsina 1: 250) durante 5 min (1 ml de tripsina para frascos T75 e 2 ml para frascos T175). Pare a actividade da tripsina com SECM (2: 1), suspensões de células, centrifugar a 750 x g durante 5 minutos e voltar a suspender as pelotas em 60 ml SECM.
- Dividir os RBMECs em 3 frascos T175 e cultura em SECM por mais 3 dias antes da semeadura em inserções. Contar o número total de vida RCA, por observação de uma suspensão de células diluída 1: 1 com o azul de tripano ao microscópio óptico numa câmara de Burker.
- frascos de cultura de células com revestimento de poli-L-lisina 100 ug / ml (1 h à temperatura ambiente) ou fibronectina 50 ug / ml (1 h a 37 ° C) para promover a ligação de RCA ou RBMECs, respectivamente. Em seguida, descongelar 1 x 10 6 RCA e 5 x 10 5 RBMECs em meio de células endoteliais, suplementado com 5% de soro fetal bovino, suplemento de crescimento celular endotelial 1% e 1% de penicilina / estreptomicina (SECM). RCAs de sementes em um frasco T175 em 20 ml SECM e RBMECs em um frasco T75 em 10 ml SECM.
- Semeadura de células em inserções
- Tratar um lado do tereftalato de polietileno (PET) de membrana de transpa 6 multi-poçosinserções ent com poli-L-lisina 100 ug / ml e do outro lado com fibronectina 50 ug / ml, para permitir a ligação de RCA e BMECs. Lidar com as inserções com uma pinça, a fim de evitar o contacto com a membrana PET.
- Coloque as inserções em uma placa de 6 poços e adicionar solução de fibronectina (mínimo de 500 ul) para dentro da câmara superior. Após 1 h de incubação a 37 ° C, remover a solução de fibronectina, tomar as pastilhas da placa multi-poços e colocá-los de cabeça para baixo na parte inferior do de 150 cm2 numa caixa de Petri, que é aqui utilizada como um suporte estéril para o já revestido inserções.
- Adicionar cuidadosamente 800 ul de poli-L-lisina sobre o lado inferior do inserto (como mostrado na Figura 1A; referido como sementeira RCA), e manter a solução sobre as pastilhas durante 1 h à TA.
- Aspirar a solução e deixar que as inserções secar à temperatura ambiente durante 15-30 min. As inserções estão agora prontos para a semeadura de células, mas também pode ser armazenada na placa multi-poços para váriasdias a 4 ° C, antes de prosseguir com a construção BBB.
Nota: Lembre-se de manter pelo menos 3 inserções revestidas livre de células, para ser usado como controles para validar estabelecimento BBB pela FD40 medições de fluxo.
- RCA sementes (35000 / cm 2) sobre o lado inferior das inserções poli-L-lisina-revestidas, deixando cair a 800 ul de suspensão de células para a inserção de cabeça para baixo (Figura 1A). Deixar a suspensão RCA nas pastilhas durante 4 h à TA, a fim de permitir a ligação eficiente das células à membrana.
- Aspirar a solução residual, colocar as inserções em poços contendo 2 ml de SECM e manter a placa de multi-poços, a 37 ° C e 5% de CO2 numa atmosfera humidificada, a alteração do SECM a cada 2 dias.
- Após 3 dias, quando os RCA ter revestido a face inferior da peça inserta, RBMECs semente sobre o lado superior da peça inserta, seguindo estes passos:
- Retire RBMECs de frascos T175 e contar océlulas vivas totais, conforme relatado nos passos 1.1.2 e 1.1.3.
- RBMECs sementes (60000 / cm 2) sobre a superfície superior do inserto no SECM (1,000 mL) (Figura 1B), deixando 3 inserções com apenas os astrócitos, para ser utilizado como fundo TEER. Colocar a placa de multi-poços em condições de cultura padrão. Manter o sistema para a cultura durante pelo menos 3 dias, mudando o SECM na câmara interior e inferior a cada 2 dias.
- Tratar um lado do tereftalato de polietileno (PET) de membrana de transpa 6 multi-poçosinserções ent com poli-L-lisina 100 ug / ml e do outro lado com fibronectina 50 ug / ml, para permitir a ligação de RCA e BMECs. Lidar com as inserções com uma pinça, a fim de evitar o contacto com a membrana PET.
2. Validação BBB
- Medição TEER
- No dia 3 rd de co-cultura, verificar o TEER inserindo as inserções de certificação de rolamento para uma câmara apropriada (que tem uma tampa e que ambos câmara e o tampão conter um par de tensão de detecção e eléctrodos de corrente), encheu-se com quatro ml de SECM. Ligue a um epitelial volts de tecido / ohmímetro.
- Juntamente com as medições TEER do BBB-sistemas celulares, registre os valores TEER dos 3 inserções, levando as RCAs them vão ser subtraídos dos valores obtidos com o BBBs. Multiplicar os valores TEER resultantes por a superfície da peça inserta (4,2 cm 2), a fim de expressar os resultados como Ω x 2 cm.
- A partir do 3º dia de co-cultura, medir a TEER todos os dias. Nota: Após um período inicial em que o TEER aumenta, os valores registados devem permanecer estáveis durante pelo menos dois dias consecutivos (normalmente entre a 5 e a 7 ° dia de co-cultura). Nesse ponto, a certificação está pronta para o segundo passo de validação (secção 2.2) e / ou para as experiências de trans-BBB.
Nota: O procedimento descrito na secção 2.1, pode ser realizada nas mesmas BBB-sistemas dedicados para as seguintes experiências de permeabilidade (secção 3). Operar sob condições estéreis.
- Trans-BBB Flux de FITC-dextrano 40 (FD40)
- Medir o fluxo FD40 da parte superior para a câmara inferior dos modelos de BBB comparada com a do outro lado 3 inserções vazios(Ver a nota do ponto 1.2.1) de acordo com as seguintes etapas:
- Adicionar 1 mg / ml FD40 (diluído em SECM) no compartimento superior do BBBs, e após 1, 2 e 3 h retirar 200 ul SECM da câmara inferior e medir a intensidade da fluorescência por espectrof (λ ex 488 nm, λ in 515 nm, fenda 5).
- Obter os valores para SECM fundo fluorescenceby medindo 500 ul de meio virgem utilizando os mesmos parâmetros analíticos. Subtrair o fundo de fluorescência SECM de todos os valores de fluorescência FD40.
- Determinar a quantidade de FD40 permeado por comparação dos valores de fluorescência observado com uma curva de calibração produzida com concentrações conhecidas (ie. 0,312, 0,625, 1,25, 2,5 ug / mL) do marcador fluorescente dissolvido em 500 ul de SECM.
- Calcular o coeficiente de permeabilidade aparente (P app) a partir dos valores de fluxo médios de acordo com:
P app = J / AC
(2 cm) e C é a concentração da molécula no compartimento superior (moles / cm3).
Nota: Três ou mais BBB-sistemas que tenham atingido valores TEER adequados, devem ser exclusivamente dedicados a este procedimento de validação, e não deve ser empregue para as seguintes experiências de permeabilidade (secção 3). A esterilidade não é obrigatória.
- Medir o fluxo FD40 da parte superior para a câmara inferior dos modelos de BBB comparada com a do outro lado 3 inserções vazios(Ver a nota do ponto 1.2.1) de acordo com as seguintes etapas:
3. Trans-BBB permeação de Ferritinas FITC-carregado (Fnn)
Nota: Uma variante recombinante de ferritina humana (FN), produzido em Escherichia coli e montados em nanocages (Fnn) para a encapsulação de diferentes moléculas fluorescentes, estão disponíveis a partir do NanoBioLab do Prof. Prosperi (Universidade de Milão-Bicocca, Itália). FNN são carregados com FITC, de acordo com um protocolo previamente descrito 13 e as concentrações de ambas as moléculas e Fn são carregados com exactidão determinEd.
- Trans-certificação fluxo de FITC e FITC-FNN
- Medir o fluxo de FITC-FNN a partir da parte superior para a câmara inferior de modelos de BBB validados (normalmente na 5ª - 7 ° dia de co-cultura), em comparação com a do corante livre depois de 7 e 24 horas de incubação, de acordo com a as etapas a seguir:
- Adicionar FITC-FNN (50 ug / ml Fnn, 1,1 uM FITC) ou uma quantidade igual de livre FITC para dentro da câmara superior de pelo menos 6 sistemas BBB para cada formulação, a fim de retirar a 2 ml de solução SECM a partir da câmara inferior pelo menos 3 inserções após 7 horas, e da câmara baixa do outros 3 inserções após 24 horas.
- Medir a intensidade de fluorescência de 500 ul das amostras recolhidas por espectrof (λ ex 488 nm, λ in 515 nm, fenda de 5).
- Obter a fluorescência de fundo SECM medindo 500 ul de meio utilizando os mesmos parâmetros analíticos. Subtrair a fluorescência de fundo SECMa partir de todos os valores de fluorescência ou FITC FITC-FNN.
- Determinar a concentração do permeado com FITC ou FITC-FNN pela comparação dos valores de fluorescência obtidos com duas curvas de calibração diferentes, produzidos com concentrações conhecidas (isto é,. 6,87, 13,75, 27,5, 55 nM) do corante livre ou nanoformulated dissolvido em 500 ul SECM.
- Medir o fluxo de FITC-FNN a partir da parte superior para a câmara inferior de modelos de BBB validados (normalmente na 5ª - 7 ° dia de co-cultura), em comparação com a do corante livre depois de 7 e 24 horas de incubação, de acordo com a as etapas a seguir:
- FITC-Fnn Localização no RBMECs
- Remover SECM da câmara superior dos sistemas de BBB, lavar as inserções com PBS e fixar os RBMECs em, pelo menos, duas pastilhas de cada grupo experimental por adição de 500 uL de paraformaldeído (4% em tampão fosfato salino-PBS) no compartimento superior para 10 min à temperatura ambiente.
- Lavam-se as pastilhas três vezes com PBS para remover o paraf ormaldeido residual.
Nota: Deste ponto em diante, a esterilidade não é necessário. - Corte pedaços adequados da membrana PET, e prosseguir com a immunodecoration das células de acordo com os seguintes passos:
- permealize RBMECs com 0,1% de Triton X-100 em PBS durante 10 minutos. Realizar uma etapa de bloqueio durante 1 h à temperatura ambiente com uma solução contendo 2% de albumina de soro bovino (BSA), soro de cabra a 2% em PBS. Incubar as amostras com uma Willebrand factor anti-Von (vWF) a diluição de 1:20, durante 2 h à TA.
- Após lavagem três vezes com PBS, expor as células durante 2 horas à temperatura ambiente a uma BSA 2%, solução de soro de cabra a 2% contendo um anticorpo secundário adequado, a uma diluição de 1: 300, a fim de revelar o anti-VWR, e DAPI numa diluição de 1: 1500 para detecção de núcleos.
- Monte as peças de inserção em lâminas de microscópio utilizando uma solução de montagem Antifade (uma gota por fragmento de inserção), em seguida, feche a amostra com uma lamela. Analisar por microscopia confocal usando uma lente de imersão em óleo e 40X, 1,5 zoom e resolução de 1.024 x 1.024 pixels.
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Representative Results
Durante o estabelecimento do modelo de certificação, a fixação de células e crescimento das inserções pode ser monitorizada utilizando um microscópio de luz graças à natureza transparente das membranas de PET. RCA, semeadas a uma densidade de 35.000 células / cm2, prender de forma eficiente para o lado inferior do inserto após 4 h de incubação à temperatura ambiente (Figura 2A) e crescem-se a cobrir a superfície da membrana em 3 dias, tendo uma morfologia fusiforme (Figura 2B). RBMECs, semeadas a uma densidade de 60.000 células / cm2, são visivelmente ligado à face superior da membrana de PET após cerca de 3 horas de incubação a 37 ° C (Figura 2C). A camada RBMEC em desenvolvimento pode ser difícil de visualizar nos dias seguintes com um microscópio óptico, por causa da sobreposição com a camada subjacente RCA (Figura 2D).
A validação correta do BModelo BB exige sempre medição TEER e esta pode ser confirmada através da avaliação da P app trans-a certificação de um traçador de baixa permeabilidade, tais como FD40.
Os valores TEER, registados durante o período de co-cultura, representam a primeira indicação clara da formação correcta da barreira endotelial. Três dias após a semeadura RBMEC, o TEER gravado, subtraída da TEER das inserções astrócitos de rolamento, é principalmente devido à contribuição da camada não-eletrogênica de RCA e a camada de desenvolvimento de RBMECs. Neste ponto de tempo, a certificação dá valores que variam entre 20 e 40 Ω x 2 cm. Durante os dias seguintes, geralmente entre a 4 e a 5 ° dia de co-cultura, o TEER valores aumentam devido à formação de junções apertadas entre as células endoteliais adjacentes 14, atingindo valores geralmente entre 55 e 110 Ω x cm2, e em casos excepcionais oigher valores 14. Os valores medidos no 4º / 5º dia de co-cultura permanecer estável pelo menos até o 7º - 8º dia antes de começar a diminuir; Portanto, há uma janela de tempo muito estreita disponível para levar a cabo as experiências de trans-certificação fluxo.
Entre os dias 5 e o 7o dias de co-cultura, a integridade dos modelos experimentais podem ser confirmadas avaliando a permeabilidade FD40 trans-certificação. Figura 3 mostra um exemplo do fluxo trans-certificação de FD40 (1 mg / ml ), em comparação com o fluxo através inserções de vazios, ao longo de 3 h de incubação; o BBBs estão no 6º dia de co-cultura eo TEER registrada é 55,6 ± 15,8 Ω cm 2 (média ± SE, n = 3). O fluxo é linear entre 1 e 3 horas de incubação e a aplicação significativo P calculada entre 1 e 2 horas, e entre 2 e 3 horas de incubação é0,12 ± 0,01 x 10 - 6 centímetros seg - 1 (± EP, n = 6).
Uma vez que, pelo menos, três anos consecutivos de sucesso BBBs, em termos de TEER e FD40 P app, foram obtidos em experimentos independentes a medição da permeabilidade marcador podem ser evitados; no entanto, o TEER sempre precisa ser registrado para cada experimento.
A permeabilidade trans-certificação de moléculas fluorescentes e o efeito do Nano na sua entrega pode ser investigado utilizando o rato modelos de BBB descrito acima. A Figura 4 mostra a permeação do modelo corante FITC mediante encapsulamento em Fnn através BBBs com TEER de 100,4 ± 3,5 Ω cm 2 (n = 16) no 7 ° dia de co-cultura. Os histogramas, que representam a concentração de FITC na câmara inferior após 7 e 24 horas a partir da adição de corante livre ou nanoformulatedno compartimento superior, indicam que Fnn é capaz de aumentar significativamente a entrega de FITC em toda a certificação.
Imagens de microscopia confocal do lado superior da peça inserta, após 7 e 24 horas de incubação com FITC-FNN (Figura 5A, C) ou com FITC (Figura 5B, D) mostram que, embora livre FITC não é internalizado pela RBMECs, o seu carregamento em o Fnn lhe permite entrar nas células.
Antes de processar as inserções para microscopia confocal, um controlo suplementar do TEER é necessário para assegurar que não existem efeitos Fnn mediadas na integridade BBB.
Figura 1:. Semeadura de células para inserções RCA (A) e RBMEC (B) Procedimento de sementeira para os dois lados opostos doas inserções de placas multi-bem. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2:. Microscópio óptico Imagens de RCAs e RBMVECs em inserções inserções semeada com RCAs e RBMECs são observados com um microscópio de luz (zoom óptico de 20x). (A) Quatro horas após a sementeira, redondo e RCA translúcidas são visivelmente ligado à superfície inferior da peça inserta; RCAs fusiformes (B) são visíveis no 3º dia da cultura; (C) redondo e RBMECs translúcido são ligados no lado superior do inserto após 3 horas de incubação; (D) no 4 ° dia de co-cultura de ambas as superfícies da peça inserta está completamente recoberta com células, e os dois leigosers não são facilmente distinguíveis. Barra de escala = 100 mm. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3:. FD40 fluxo através da certificação de fluxo de FD40 (1 mg / ml) a partir da parte superior para o lado inferior do sistema de certificação in vitro, em comparação com o outro lado da inserção vazio. A quantidade de FD40 na câmara inferior foi medido a 60, 120 e 180 min após a adição do corante para a câmara superior. Médias ± SE; n ° insere = 3. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: Efeito de Fnn encapsulamento em FITC Permeação através da bbb Concentração de FITC na câmara inferior do sistema de certificação calculada in vitro em 7 e 24 h depois da adição de FITC ou com FITC Fnn para dentro da câmara superior.. A média ± SE de 4-5 repetições; **** P <0,0005, FITC-FNN vs. FITC (teste t de Student). Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5: microscopia confocal de RBMECs em inserções Micrografia confocal de varredura a laser (secções ópticas individuais) de RBMECs após 7 horas (A, B) ou 24 horas (C, D) de incubação com acesso FITC (B, C) ou FITC. -FnN (A,
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Discussion
O método in vitro descrito aqui, representa uma abordagem útil validado para estudar a entrega trans-certificação de moléculas fluorescentes mediante nanoformulation com nanopartículas. Aqui usamos Fnn, o que representa um bom candidato para estudar a translocação de moléculas de carga através da bbb. FNN é considerado o nanovector ouro para a certificação trans-entrega de drogas / agentes uma vez que é especificamente reconhecido pelo receptor TfR1, que é expresso sobre a membrana luminal de BMECs e medeia a captação de nanopartículas utilizando uma via mediada por receptores de internalização. Além disso, Fnn é uma nanopartícula natural e tem, portanto, um bom perfil de biocompatibilidade. Finalmente, Fnn é capaz de encapsular moléculas hidrossolúveis de baixa dimensão por um mecanismo simples e eficiente. A permeação trans-BBB de outros tipos diferentes de nanopartículas orgânicas ou inorgânicas poderia também ser avaliada com este protocolo, de acordo com algumas considerações sobre recursos nanopartículas. primeira prerequisite para estudar a permeação de drogas / agentes nanoformulated é a segurança da nanopartícula vazio. Um outro problema importante é a interacção das nanopartículas investigada com o filtro de PET. Este aspecto, tem de ser avaliado preliminarmente, a fim de excluir uma retenção significativa para os poros da membrana e evitar a alteração da sua permeação através da certificação. Nosso grupo tem utilizado recentemente a estratégia proposta para estudar uma nanopartícula de óxido de ferro revestido de polímero como um sistema de entrega trans-BBB para drogas anti-retrovirais marcados com fluorescência 14. Nesse caso, nós associada microscopia eletrônica localização de nanoformulações em RBMECs para a detecção de fluorescência. Além disso, outros métodos de diagnóstico altamente sensíveis, tais como plasma indutivamente acoplado (ICP) -MS pode ser empregue para avaliar a entrega trans-certificação de nanosystems inorgânicos.
O modelo de certificação in vitro utilizado neste protocolo é baseado em co-cultura de BMECs ratos e astrócitos. No cenário de largura dos modelos de BBB 10,11,12, alguns dos quais têm sido descritos na literatura de forma precisa com um protocolo bem detalhados 15, o nosso modelo representa uma alternativa de boa qualidade. Com efeito, mesmo que a TEER registada foi abaixo dos melhores padrões sugerido na literatura (150-200 Ω cm 2) 10, a permeabilidade trans-certificação da alta traçador dimensão Dextrano 40 estava em total concordância com a formação de uma barreira apertada.
Este modelo in vitro, obtidos com disponível comercialmente rato BMECs e astrócitos, tem algumas vantagens: (1) a eficiência do crescimento óptimo das células endoteliais, (2) um período de tempo adequado para a produção do modelo final certificação (não mais do que 13 dias), (3) o cumprimento de questões éticas, evitando o uso de células a partir de tecido humano cérebro (materiais de autópsia, espécimes cirúrgicos, e do tecido fetal) e 4) economia de tempo e custos relacionados com a habitação animal, e primáriacélulas de extracção. No entanto, uma limitação do atual modelo está relacionada com os elevados custos de RBMECs primários não imortalizadas, que devem ser comprados (congelados a passagem de um) para cada configuração experimental. De facto, os nossos estudos preliminares de produção certificação demonstraram que a capacidade das células endoteliais para produzir uma certificação apertado é estritamente relacionado com o número de passagens em cultura das RBMECs após o primeiro descongelamento pós-venda. Intensificar a aplicação do modelo de certificação descrito aqui com suplementos endoteliais, tais como cAMP e hidrocortisona, pode ser considerada a fim de melhorar o aperto endotelial e aumentar os valores TEER 10,11,16.
A presente técnica é relacionada com a possibilidade de tirar vantagem de um único modelo de certificação para ensaios diferentes, proporcionando, assim, vários conjuntos de dados de cada situação experimental. Com um único sistema de certificação exposto a moléculas fluorescentes ou nanocomplexed livres, é possível: (1) para medir the fluxo de trans-barreira da molécula através da análise da intensidade de fluorescência de alíquotas SECM recolhidos a partir da câmara inferior em diferentes pontos de tempo de incubação; (2) para investigar a internalização mediada por nano das moléculas em RBMECs e seu tráfico intracelular por análise de microscopia confocal de células em inserções; (3) para obter uma indicação do estado das células da BBB após exposição à nanoformulações, medindo TEER no final da experiência, ou por meio da análise da integridade do endotélio por microscopia electrónica.
Em conclusão, nós aqui descrito um protocolo para o estudo da permeação de moléculas fluorescentes nanocomplexed através de um de alta qualidade a certificação modelo in vitro. Consideramos esta metodologia uma ferramenta útil para investigar o efeito de nanoformulation na entrega de drogas em todo o BBB.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Rat Brain Microvascular Endothelial Cells | Innoprot | P10308 | isolated from Sprague Dawley rat brain tissue, cryopreserved at passage one and delivered frozen |
| Cortical Astrocytes | Innoprot | P10202 | isolated from 2 days rat brain tissue, cryopreserved at passage one and delivered frozen. |
| Endothelial Cell Medium kit | Innoprot | P60104 | ECM (500 ml) and fetal bovin serum (25 ml), endothelial cell growth supplement (5 ml) and penicillin/streptomycin (5 ml). Warm in 37 °C water bath before use and protect from light |
| Trypsin-EDTA without Phenol Red | EuroClone | ECM0920D | Warm in 37 °C water bath before use |
| Fluorescein isothiocyanate-dextran 40,000 | Sigma | FD40S | protect from light |
| paraformaldehyde | Sigma | 158127 | diluition in chemical hood |
| Dulbecco's phosphate buffer saline w/o Ca and Mg | EuroClone | ECB4004L | |
| Triton X-100 | Sigma | T8787 | |
| bovine serum albumin | Sigma | A7906 | |
| goat serum | EuroClone | ECS0200D | |
| mouse monoclonal anti-Von Willebrand Factor | Dako | M0616 | |
| AlexaFluor 546-conjugated antibody against mouse IgGs | ThermoFischer Scientific | A-11003 | protect from light |
| DAPI (4’ ,6-diamidino-2-phenylindole) | ThermoFischer Scientific | D1306 | protect from light |
| ProLong Gold Antifade Mountant | ThermoFischer Scientific | P36934 | |
| Poly-L-lysine Hydrobromide | Sigma | P1274 | the same solution can be used several times |
| fibronectin from bovine plasma | Sigma | F1141 | the same solution can be used several times |
| Polyethylene terephthalate (PET) inserts | Falcon | F3090 | Transparent Polyethylene terephthalate (PET) membranes; surface area: 4.2 cm2; pore size 0.4 µm/surface area |
| T75 Primo TC flask | EuroClone | ET7076 | |
| T175 Primo TC flask | EuroClone | ET7181 | |
| EVOM2 Epithelial Tissue Volt/Ohmmeter | World Precision Instruments Germany | EVOM2 | |
| Endohm- 24SNAP cup | World Precision Instruments Germany | ENDOHM-24SNAP | |
| Light/fluorescence microscope with camera | Leica Microsystems | DM IL LED Fluo/ ICC50 W Camera Module | inverted microscope for live cells with camera |
| Confocal Microscope | Leica Microsystems | TCS SPE | |
| Spectrofluorimeter | Jasco | FP-8000 |
References
- Banks, W. A. Characteristics of compounds that cross the blood-brain barrier. BMC Neurol. 9 (1), 3 (2009).
- Löscher, W., Potschka, H. Drug resistance in brain disease and the role of efflux transporters. Nat Rev Neurosci. 6, 591-602 (2005).
- Xu, G., Mahajan, S., Roy, I., Yong, K. -T. Theranostic quantum dots for crossing blood-brain barrier in vitro and providing therapy of HIV-associated encephalopathy. Front Pharmacol. 15 (4), 140 (2013).
- Masserini, M. Nanoparticles for Brain Drug Delivery. ISRN Biochem. , (2013).
- Sagar, V., Pilakka-Kanthikeel, S., Pottathil, R., Saxena, S. K., Nair, M. Towards nanomedicines for neuroAIDS. Rev. Med. Virol. 24 (2), 103-124 (2014).
- Kreuter, J. Drug delivery to the central nervous system by polymeric nanoparticles: What do we know. Adv. Drug Deliver. Rev. 71, 2-14 (2014).
- Arosio, P., Ingrassia, R., Cavadini, P. Ferritins: a family of molecules for iron storage, antioxidation and more. Biochim. Biophys. Acta. 1790 (7), 589-599 (2009).
- Jääskeläinen, A., Soukka, T., Lamminmäki, U., Korpimäki, T., Virta, M. Development of a denaturation/renaturation-based production process for ferritin nanoparticles. Biotechnol. Bioeng. 102 (4), 1012-1024 (2009).
- Jefferies, W. A., Brandon, M. R., Hunt, S. V., Williams, A. F., Gatter, K. C., Mason, D. Y. Transferrin receptor on endothelium of brain capillaries. Nature. 312, 162-163 (1984).
- Deli, M. A., Abraham, C. S., Kataoka, Y., Niwa, M. Permeability studies on in vitro blood-brain barrier models: physiology, pathology, and pharmacology. Cell. Mol. Neurobiol. 25 (1), 59-127 (2005).
- Wilhelm, I., Fazakas, C., Krizbai, I. A. In vitro models of the blood-brain barrier. Acta Neurobiol. Exp. (Wars). 71, 113-128 (2011).
- Wilhelm, I., Krizbai, I. A. In vitro models of the blood-brain barrier for the study of drug delivery to the brain. Mol Pharm. 11 (7), 1949-1963 (2014).
- Bellini, M., et al. Protein nanocages for self-triggered nuclear delivery of DNA-targeted chemotherapeutics in Cancer Cells. J. Control. Release. 196, 184-196 (2014).
- Fiandra, L., et al. Nanoformulation of antiretroviral drugs enhances their penetration across the blood brain barrier in mice. Nanomedicine. 11 (6), 1387-1397 (2015).
- Molino, Y., Jabès, F., Lacassagne, E., Gaudin, N., Khrestchatisky, M. Setting-up an in vitro model of rat blood-brain barrier (BBB): a focus on BBB impermeability and receptor-mediated transport. J. Vis. Exp. , e51278 (2014).
- Perrière, N., et al. A functional in vitro model of rat blood-brain barrier for molecular analysis of efflux transporters. Brain Res. 1150, 1-13 (2007).
