Introduction
Resistansen hos det centrala nervsystemet (CNS) sjukdomar (dvs cancer, epilepsi, depression, schizofreni och HIV-associerat neurologisk störning.) Till farmakologiska terapier beror på flera olika mekanismer, inklusive mödosam läkemedels permeation genom blod-hjärnbarriären (BBB) . BBB är gränsen som isolerar hjärnvävnad från de ämnen som cirkulerar i blodet. Inom denna barriär, ett skikt av hjärnan mikrovaskulära endotelceller (BMECs), med stöd av pericyter och astrocyter endfeet, är ansvarig för den höga selektiviteten av BBB till de vattenlösliga läkemedel med en molekylvikt högre än 400 Da 1. En annan narkotikarelaterade resistensmekanism är kopplad till närvaro på BMECs läkemedelsutflödestransportörer (P-glykoprotein och multiläkemedelsresistens proteiner), som samarbetar för att minska läkemedelspenetration i CNS och underlätta deras extrudering från hjärnan 2.
Under det senaste årtiondet, Ett stort antal av nanotekniska tillvägagångssätt har utvecklats för att möta den kliniska och biologiska utmaningen att leverera läkemedel över BBB 3-6. I detta sammanhang, ferritin nanosfärer (Fnn) representerar en helt nyskapande och lovande lösning. Fnn finns 12 nm sfärer av 24 självsamlande ferritin (Fn) monomerer, vilka är anordnade i en ihålig sfärisk struktur av 8 nm innerdiameter. Ferritin subenheter kan demonteras vid surt pH och ihop i en formminnes mode genom att bringa pH till neutralitet, vilket gör att olika organiska molekyler som skall inkapslas. Därför Fnn representerar en intressant modell för utveckling av multifunktionella läkemedelsavgivningssystem 7,8. Vidare kan Fnn interagera med BMECs tack vare den specifika igenkänningen av Transferrin Receptor (TfR) 1, som uttrycks på den luminala membran av dessa celler 9.
Hittills olika i vitro-modeller av BBB har utvecklats i order att belysa trans BBB permeabilitet för olika läkemedel, toxicitet mot BBB, eller interaktionen mellan molekyler med utflödes transportörer. I själva verket är dessa modeller anses giltig in vitro metoder för en snabb screening av aktiva molekyler innan du fortsätter med in vivo-studier. Dessa modeller består av en enda endotelskikt av BMECs eller samodlade BMECs och astrocyter (mer sällan pericyter), som erhållits från djur (råtta, mus, gris och nötkreatur) eller humana cellinjer 10,11,12. Den Transendothelial Electrical Resistance (TEER) och den skenbara permeabiliteten (P app) av spårämnen med en definierad molekylvikt representerar två kritiska parametrarna som används för att bestämma kvaliteten på den in vitro-modell. Här beskriver vi användandet av en BBB in vitro-modell, baserad på en co-kultur av råtta BMECs (RBMECs) och råtta kortikala astrocyter (RCAs) för att studera trans BBB trängning av ferritin nanocages inkapsling fluorescein isothiocyanate (FITC).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Etablera BBB Model
Obs: Vid fastställandet BBB modell föreslår vi att du använder kommersiellt tillgängliga primära RBMECs och RCAs. Alla steg måste utföras med sterila reagens och engångsmaterial, hanteras i ett laminärt flöde huva.
- Cell kultur
- Coat cellodlingsflaskor med poly-L-lysin 100 ug / ml (1 timme vid RT) eller fibronektin 50 | ig / ml (1 h vid 37 ° C) för att främja fastsättningen av RCAs eller RBMECs, respektive. Sedan, tö 1 x 10 6 RCAs och 5 x 10 5 RBMECs i Endothelial Cell Medium, kompletterat med 5% fetalt bovint serum, 1% endotelial celltillväxtsupplement och 1% penicillin / streptomycin (sECM). Seed RCAs i en T175 kolv i 20 ml sECM och RBMECs i en T75 kolv i 10 ml sECM.
Obs! Upptining och sådd passager av RCAs och RBMECs måste justeras, i termer av celldensiteten och tid i odling, beroende på antalet experimentella betingelser som skall testas med BBB-modellen. genom starting med en injektionsflaska 1 x 10 6 RCAs och en injektionsflaska med 5 x 10 5 RBMECs, är det möjligt att få upp till 20 BBB-bärande skär. - Bibehålla cellerna vid 37 ° C och 5% CO2 i en fuktad atmosfär under ca 6 dagar, tills ca 80% konfluens för RCAs och över 90% sammanflytning för RBMECs. Loss celler med användning av trypsin-EDTA-lösning (trypsin 1: 250) under 5 minuter (1 ml trypsin för T75-kolvar och 2 ml för T175 kolvar). Stoppa trypsinaktiviteten med sECM (2: 1), centrifugera cellsuspensioner vid 750 x g under 5 min och resuspendera pelletarna i 60 ml sECM.
- Dela upp RBMECs i 3 T175-kolvar och kultur i sECM i ytterligare 3 dagar innan sådd på skären. Räkna det totala antalet levande RCAs, genom att observera en cellsuspension späddes 1: 1 med trypanblått under ett optiskt mikroskop i en Burker kammare.
- Coat cellodlingsflaskor med poly-L-lysin 100 ug / ml (1 timme vid RT) eller fibronektin 50 | ig / ml (1 h vid 37 ° C) för att främja fastsättningen av RCAs eller RBMECs, respektive. Sedan, tö 1 x 10 6 RCAs och 5 x 10 5 RBMECs i Endothelial Cell Medium, kompletterat med 5% fetalt bovint serum, 1% endotelial celltillväxtsupplement och 1% penicillin / streptomycin (sECM). Seed RCAs i en T175 kolv i 20 ml sECM och RBMECs i en T75 kolv i 10 ml sECM.
- Cell sådd på Inlägg
- Behandla en sida av Polyetentereftalat (PET) membran av 6 flera brunnar genoent skär med poly-L-lysin 100 | ig / ml och den andra sidan med fibronektin 50 | ig / ml, för att möjliggöra fastsättning av RCAs och BMECs. Hantera skär med pincett för att undvika kontakt med PET-membran.
- Placera skären i en 6-brunnsplatta och tillsätt fibronektin lösning (minst 500 | j, l) in i den övre kammaren. Efter 1 h av inkubation vid 37 ° C, ta bort fibronektin lösningen, ta skären utanför platta med flera brunnar och sätta dem upp och ner på botten av en 150 cm 2 petriskål, som används här som en steril stöd för redan belagda skär.
- Försiktigt lägga 800 pl av poly-L-lysin på den undre sidan av insatsen (såsom visas i figur 1 A; kallad RCAs seeding), och hålla lösningen på skären under 1 h vid RT.
- Aspirera lösningen och låta skären torka vid RT under 15 till 30 min. Skären är nu redo för cellsådd, men kan också lagras i den platta med flera brunnar för fleradagar vid 4 ° C, innan du fortsätter med BBB konstruktion.
Obs: Kom ihåg att hålla åtminstone 3 belagda skär fri från celler, för att användas som kontroller för att bekräfta BBB etablering av FD40 flödesmätningar.
- Utsädes RCAs (35.000 / cm 2) på bottensidan av de poly-L-lysin-belagda skär, genom att tappa 800 | il cellsuspension på upp och ned insatsen (Figur 1A). Lämnar RCA suspensionen på skären under 4 h vid RT, för att möjliggöra en effektiv vidhäftning av cellerna till membranet.
- Aspirera resterande lösningen, placera skären i brunnar innehållande 2 ml sECM och bibehålla den platta med flera brunnar vid 37 ° C och 5% CO2 i en fuktad atmosfär, ändra sECM var 2 dagar.
- Efter 3 dagar, då RCAs har belagt den undre ytan av insatsen, utsäde RBMECs på ovansidan av insatsen, så här:
- Loss RBMECs från T175-kolvar och räknatotala levande celler, som rapporterats i steg 1.1.2 och 1.1.3.
- Utsädes RBMECs (60.000 / cm 2) på den övre ytan av insatsen i sECM (1000 | j, l) (Figur 1 B), som lämnar 3 skär med endast de astrocyter, som skall användas som TEER bakgrund. Placera platta med flera brunnar i vanliga odlingsbetingelser. Upprätthålla systemet till kultur under minst 3 dagar, ändra sECM i den inre och nedre kammaren var 2 dagar.
- Behandla en sida av Polyetentereftalat (PET) membran av 6 flera brunnar genoent skär med poly-L-lysin 100 | ig / ml och den andra sidan med fibronektin 50 | ig / ml, för att möjliggöra fastsättning av RCAs och BMECs. Hantera skär med pincett för att undvika kontakt med PET-membran.
2. BBB Validering
- TEER Mätning
- Den 3: e dagen av co-kultur, kontrollera TEER genom att föra in BBB bärande insatser i en lämplig kammare (som har ett tak och där både kammaren och locket innehåller ett par spänningskänsliga och strömelektroder), fylld med 4 ml sECM. Anslut till en epitelvävnad volt / ohmmeter.
- Tillsammans med Teer mätningar av cell bbb-system, registrera Teer värdena för 3 skär bär RCAs thpå kommer att dras från de värden som erhålls med BBBs. Multiplicera den resulterande Teer värdena av ytan av insatsen (4,2 cm 2) för att uttrycka resultaten som Ω x cm2.
- Från den 3: e dagen av co-kultur, mäta TEER varje dag. Obs: Efter en inledande period där TEER ökar, bör de registrerade värdena förblir stabil under minst två dagar i följd (vanligtvis mellan 5: e och 7: e dagen av co-kultur). Vid denna tidpunkt BBB är redo för det andra steget av validering (avsnitt 2.2) och / eller för de trans-BBB experiment.
Obs: Det förfarande som beskrivs i avsnitt 2.1 kan utföras på samma bbb-system ägnas åt följande permeabilitet experiment (avsnitt 3). Arbeta under sterila förhållanden.
- Trans-BBB Flux av FITC-dextran 40 (FD40)
- Mät FD40 flödet från den övre till den undre kammaren av BBB modeller jämfört med över 3 tomma skär(Se anmärkningen i avsnitt 1.2.1) enligt följande steg:
- Lägg 1 mg / ml FD40 (utspädd i sECM) in i den övre avdelningen av BBBs, och efter 1, 2 och 3 h återkalla 200 pl sECM från den undre kammaren och mäta fluorescensintensiteten med spektrofluorimeter (λ ex 488 nm, λ em 515 nm, spalt 5).
- Erhålla värdena för sECM bakgrund fluorescenceby mäter 500 pl jungfru medium med användning av samma analysparametrarna. Subtrahera sECM bakgrundsfluorescens från alla FD40 fluorescensvärdena.
- Bestämma mängden trängt FD40 genom jämförelse av de observerade fluorescensvärdena med en kalibreringskurva som framställts med kända koncentrationer (dvs.. 0,312, 0,625, 1,25, 2,5 | j, g / ml) av det fluorescerande spårämnet upplöstes i 500 pl sECM.
- Beräkna den skenbara permeabilitetskoefficienten (P app) från de genomsnittliga flödesvärdena enligt:
P app = J / AC
2) och C är koncentrationen av molekylen i den övre kammaren (mol / cm 3).
Obs: Tre eller fler bbb-system som har nått lämpliga Teer värden, måste uteslutande ägnas åt detta godkännandeförfarande, och bör inte användas för följande permeabilitet experiment (avsnitt 3). Sterilitet är inte obligatoriskt.
- Mät FD40 flödet från den övre till den undre kammaren av BBB modeller jämfört med över 3 tomma skär(Se anmärkningen i avsnitt 1.2.1) enligt följande steg:
3. Trans BBB Permeation av FITC-laddade ferritiner (Fnn)
Obs: Ett rekombinant variant av humant ferritin (Fn) som produceras i Escherichia coli och monteras i nanocages (Fnn) för inkapsling av olika fluorescerande molekyler, är tillgänglig från NanoBioLab Prof. Prosperi (University of Milano-Bicocca, Italien). Fnn är laddade med FITC, enligt en tidigare beskriven protokoll 13 och koncentrationerna av både Fn och de laddade molekylerna exakt fastställbaraed.
- Trans-BBB Flux av FITC och FITC-Fnn
- Mät FITC-Fnn flöde från den övre till den undre kammaren validerade BBB: modeller (vanligen vid 5: e - 7: e dagen av co-kultur), jämfört med den fria färgämnet efter 7 och 24 timmar av inkubation, enligt följande steg:
- Lägg FITC-Fnn (50 mikrogram / ml Fnn, 1,1 ^ M FITC) eller en lika stor mängd fri FITC i den övre kammaren av minst 6 BBB: system för varje formulering, i syfte att dra tillbaka två ml sECM lösning från den undre kammaren av åtminstone 3 skär efter 7 timmar, och från den undre kammaren andra 3 skär efter 24 timmar.
- Mäta fluorescensintensiteten hos 500 fil av de uppsamlade proverna genom spektrofluorimeter (λ ex 488 nm, λ em 515 nm, spalt 5).
- Skaffa sECM bakgrundsfluorescens genom att mäta 500 pl medium använder samma analytiska parametrar. Subtrahera sECM bakgrundsfluorescensfrån alla FITC- eller FITC-Fnn fluorescensvärdena.
- Bestäm koncentrationen av genomträngd FITC eller FITC-Fnn genom att jämföra de erhållna fluorescensvärdena med två olika kalibreringskurvor som framställts med kända koncentrationer (dvs. 6,87, 13,75, 27,5, 55 nm) av den fria eller nanoformulated färgämne upplöst i 500 pl sECM.
- Mät FITC-Fnn flöde från den övre till den undre kammaren validerade BBB: modeller (vanligen vid 5: e - 7: e dagen av co-kultur), jämfört med den fria färgämnet efter 7 och 24 timmar av inkubation, enligt följande steg:
- FITC-Fnn Lokalisering i RBMECs
- Ta sECM från den övre kammaren av BBB-system, tvätta skär med PBS och fixa RBMECs på åtminstone två skär för varje försöksgrupp genom att tillsätta 500 l paraformaldehyd (4% i fosfatbuffert saltlösning PBS) i det övre utrymmet för 10 min vid RT.
- Tvätta insatserna tre gånger med PBS för att avlägsna kvarvarande paraformaldehyd.
Obs! Från och med nu, är inte nödvändigt sterilitet. - Skär lämpliga bitar av PET-membran, och fortsätt med immunodecoration av cellerna enligt följande steg:
- Permeabilize RBMECs med 0,1% Triton X-100 i PBS under 10 minuter. Utföra en blockeringssteg under 1 h vid RT med en lösning innehållande 2% bovint serumalbumin (BSA), 2% getserum i PBS. Inkubera proverna med en anti-von Willebrand-faktor (VWF) vid 1:20 utspädning, under 2 h vid RT.
- Efter tvättning tre gånger med PBS, exponera cellerna under 2 h vid RT för att en 2% BSA, 2% getserum lösning innehållande en lämplig sekundär antikropp vid en 1: till 300 utspädning i syfte att avslöja den anti-VWR, och DAPI vid en 1: 1500 utspädning för kärnor upptäckt.
- Montera insats bitar på objektglas med hjälp av en antifade monteringslösning (en droppe per skär fragment), stäng sedan provet med ett täckglas. Analysera med konfokalmikroskopi med hjälp av en oljeimmersionslins vid 40X förstoring, 1,5 zoom och 1024 x 1024 pixlar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Under upprättandet av BBB-modellen, cellvidhäftning och tillväxt på skären kan övervakas med användning av ett ljusmikroskop tack vare den öppna karaktären hos de PET-membran. RCAs, ympades vid en densitet av 35.000 celler / cm 2, fäst på ett effektivt sätt till undersidan av skäret efter 4 h av inkubering vid RT (Figur 2A) och växa för att täcka membranytan i 3 dagar, tar en spolformad morfologi (Figur 2B). RBMECs, ympades vid en densitet av 60.000 celler / cm 2, är synligt fäst vid den övre ytan av PET-membranet efter omkring 3 h av inkubation vid 37 ° C (figur 2C). Framkallnings RBMEC skiktet kan vara svåra att visualisera under de följande dagarna med ett optiskt mikroskop, på grund av överlappningen med det underliggande RCA skiktet (figur 2D).
En korrekt validering av BBB modell kräver alltid TEER mätning och detta kan bekräftas genom att utvärdera det trans BBB P app av en låg permeabilitet spårämne, såsom FD40.
De Teer värden, som noterats under samtidig odlingsperioden, representerar den första tydlig indikation på korrekt bildandet av endotel barriären. Tre dagar efter RBMEC sådd, den inspelade TEER, subtraheras från TEER av astrocyter-lagerinsatser, främst på grund av bidraget från icke-electrogenic lager RCAs och framkallningsskiktet av RBMECs. Vid denna tidpunkt, vår BBB ger värden som varierar mellan 20 och 40 Ω x cm 2. Under de följande dagarna, vanligen mellan 4: e och 5: e dagen av co-kultur, TEER värden ökar på grund av bildandet av täta förbindelser mellan angränsande endotelceller 14, når värden vanligtvis mellan 55 och 110 Ω x cm 2, och i undantagsfall hiGher värden 14. De värden som uppmätts vid 4: e / 5: e dagen i samodling förbli stabila åtminstone fram till 7: e - 8: e dagen innan de börjar minska; Därför finns det ett mycket smalt tidsfönster för att genomföra de trans BBB flux experiment.
Mellan 5: e och den 7: e dagen i sam-kultur, kan integriteten för de experimentella modeller bekräftas genom att utvärdera FD40 trans BBB permeabilitet. Figur 3 visar ett exempel på det trans BBB flöde av FD40 (1 mg / ml ), jämfört med flödet över tomma skär, över 3 h av inkubering; den BBBs är på 6: e dagen i sam-kultur och den inspelade TEER är 55,6 ± 15,8 Ω cm 2 (medelvärde ± SE, n = 3). Flödet är linjär mellan en och tre timmar av inkubation och medel P app beräknas mellan 1 och 2 timmar, och mellan två och tre timmar av inkubation är0,12 ± 0,01 x 10-6 cm sek - 1 (± SE, n = 6).
När åtminstone tre på varandra följande framgångsrik BBBs, i termer av TEER och FD40 P app, har erhållits i oberoende experiment mätningen av spår permeabilitet kan undvikas; behöver dock TEER alltid registreras för varje experiment.
Trans-BBB permeabiliteten hos fluorescerande molekyler och effekten av den nanocomplex på deras leverans kan undersökas med användning av rått-BBB: modeller som beskrivits ovan. Figur 4 visar den genomträngning av modell färgämnet FITC upon inkapsling i Fnn tvärs BBBs med TEER av 100,4 ± 3,5 Ω cm 2 (n = 16) vid 7: e dagen i samodling. Histogrammen, representerande FITC-koncentrationen i den nedre kammaren efter 7 och 24 h från tillsatsen av fri eller nanoformulated färgämnei det övre facket, indikerar att Fnn är i stånd att avsevärt öka leveransen av FITC över BBB.
Konfokala mikroskopbilder av den övre sidan av insatsen efter 7 och 24 h av inkubering med FITC-Fnn (figur 5A, C) eller FITC (figur 5B, D) visar att medan fria FITC inte internaliseras av den RBMECs, dess lastning in i den Fnn gör det möjligt att komma in i cellerna.
Före bearbetning skären för konfokalmikroskopi, är det nödvändigt med en ytterligare kontroll av TEER att säkerställa att det inte finns några Fnn-medierade effekter på BBB-integritet.
Figur 1:. Cell Seeding på Skär RCA (A) och RBMEC (B) ympning förfarande på de två motstående sidor avmulti-brunnar skär. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2:. Optiskt mikroskop Bilder inom RCAs och RBMVECs på Inserts Inserts ympades med RCAs och RBMECs observeras med ett ljusmikroskop (20X optisk zoom). (A) Fyra timmar efter sådd, runda och genomskinliga RCAs synligt fastsatt vid bottenytan av insatsen; (B) spolformad RCAs är synliga på 3: e dagen av odling; (C) Runda och genomskinliga RBMECs är fästa på den övre sidan av skäret efter 3 h av inkubering; (D) Den 4: e dagen av samodling både ytorna hos insatsen är helt täckt med celler, och de två lågers inte lätt urskiljbara. Skalstreck = 100 nm. Klicka god här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3:. FD40 Flux över BBB Flux av FD40 (1 mg / ml) från den övre till den nedre sidan av BBB in vitro-system, jämfört med den över den tomma insatsen. Mängden FD40 i undre kammaren har uppmätts till 60, 120 och 180 min efter tillsats av färgämnet till den övre kammaren. Medelvärde ± SE; n ° infogar = 3. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4: Effekt av Fnn inkapsling på FITC trängningen av över BBB Koncentration av FITC i den nedre kammaren av BBB in vitro-system beräknas till 7 och 24 timmar efter tillsats av FITC eller FITC-Fnn i den övre kammaren.. Medelvärde ± SE av 4-5 replikerar; **** P <0,0005, FITC-Fnn vs. FITC (t-test). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5: konfokalmikroskopi av RBMECs på Insatser Confocal laserskanningsmikrografer (enda optisk avsnitt) av RBMECs efter 7 timmar (A, B) eller 24 h (C, D) inkubation med fri FITC (B, C) eller FITC. -FnN (A,
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Metoden in vitro som beskrivs här är en användbar validerad metod för att studera trans BBB leverans av fluorescerande molekyler på nanoformulation med nanopartiklar. Här använder vi Fnn, som utgör en bra kandidat för att studera translokation av last molekyler över BBB. Fnn anses guld nanovector för trans BBB leverans av läkemedels / agenter eftersom det är specifikt känns igen av TfR1 receptorn, som uttrycks på luminala membran av BMECs och förmedlar nanopartikel upptag med hjälp av en receptor-medierad interna vägen. Dessutom är Fnn en naturlig nanopartikel och har därför en god biokompatibilitet profil. Slutligen är Fnn kunna inkapsla låga dimensionshydrolösliga molekyler med en enkel och effektiv mekanism. Trans-BBB trängning av andra typer av organiska eller oorganiska nanopartiklar kan också bedömas med detta protokoll, enligt några överväganden om nanopartiklar funktioner. första prerequisite att studera permeationen av nanoformulated droger / agenter är säkerheten för tomrummet nanopartiklar. En annan viktig fråga är samspelet mellan den undersökta nanopartiklar med PET filter. Denna aspekt måste utvärderas preliminärt för att utesluta en betydande kvarhållande i membranporerna och undvika förändringar av deras trängningen av över BBB. Vår grupp har nyligen användes den föreslagna strategin för att studera en polymerbelagd järnoxidnanopartiklar som en trans BBB leveranssystem för fluorescensmärkta antiretrovirala läkemedel 14. I så fall, vi associerade elektronmikroskopi lokalisering av nanoformulations i RBMECs till fluorescensdetektion. Dessutom bör andra mycket känsliga diagnostiska metoder, såsom induktivt kopplad plasma (ICP) -MS skulle kunna användas för att utvärdera det trans BBB leverans av oorganiska nanosystem.
BBB in vitro-modell som används i detta protokoll bygger på samodling av rått BMECs och astrocyter. I det breda scenariot BBB modeller 10,11,12, av vilka några har noggrant beskrivits i litteraturen med en väl detaljerat protokoll 15, representerar vår modell en god kvalitet alternativ. I själva verket, även om den inspelade TEER var under de bästa standarder föreslagits i litteraturen (150-200 Ω cm 2) 10, trans-BBB permeabilitet hög dimensionen spår Dextran 40 var helt överens med bildandet av en tät barriär.
Denna modell in vitro, som erhållits med kommersiellt tillgänglig från råtta BMECs och astrocyter, har några fördelar: (1) en optimal tillväxt effektiviteten av endotelcellerna, (2) en lämplig tidsperiod för produktion av det slutliga BBB modellen (inte längre än 13 dagar), (3) överensstämmelse med etiska frågor, undvika användning av celler från mänsklig hjärnvävnad (obduktionsmaterial, kirurgiska prover och fostervävnad) och 4) spara tid och kostnader i samband med djurstallar, och primäraceller extraktion. Ändå är en begränsning av den nuvarande modellen i samband med de höga kostnaderna för icke-immortaliserade primära RBMECs, som måste köpas (frysta vid passage ett) för varje experimentell inställning. I själva verket har våra preliminära studier av BBB produktion visat att förmågan hos endotelceller att producera en tät BBB strikt samband med antalet passager i kultur RBMECs efter den första post-köp upptining. Fortsatt genomförande av BBB modell som beskrivs här med endotelceller tillägg, såsom cAMP och hydrokortison, skulle kunna övervägas för att förbättra endotel täthet och öka Teer värden. 10,11,16
Den nuvarande tekniken är relaterad till möjligheten att dra nytta av en enda BBB modell för olika analyser, vilket ger flera datamängder från varje experimentell inställning. Med en enda BBB-systemet utsätts för fria eller nanocomplexed fluorescerande molekyler är det möjligt: (1) för att mäta the transbarriärflöde av molekylen genom att analysera fluorescensintensiteten för sECM alikvoter uppsamlade från den nedre kammaren vid olika punkter av inkubationstid; (2) för att undersöka den nano-medierad internalisering av molekylerna i RBMECs och deras intracellulära trafficking genom konfokal mikroskopi-analys av cellerna på skären; (3) för att få en indikation på statusen av BBB-celler vid exponering för de nanoformulations, genom att mäta TEER vid slutet av experimentet eller genom analys av endotel integritet genom elektronmikroskopi.
Sammanfattningsvis, här har vi beskrivit ett protokoll för att studera den genomträngning av nanocomplexed fluorescerande molekyler över en högkvalitativ BBB in vitro-modell. Vi anser att denna metod ett användbart verktyg för att undersöka effekten av nanoformulation på drug delivery över BBB.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Rat Brain Microvascular Endothelial Cells | Innoprot | P10308 | isolated from Sprague Dawley rat brain tissue, cryopreserved at passage one and delivered frozen |
| Cortical Astrocytes | Innoprot | P10202 | isolated from 2 days rat brain tissue, cryopreserved at passage one and delivered frozen. |
| Endothelial Cell Medium kit | Innoprot | P60104 | ECM (500 ml) and fetal bovin serum (25 ml), endothelial cell growth supplement (5 ml) and penicillin/streptomycin (5 ml). Warm in 37 °C water bath before use and protect from light |
| Trypsin-EDTA without Phenol Red | EuroClone | ECM0920D | Warm in 37 °C water bath before use |
| Fluorescein isothiocyanate-dextran 40,000 | Sigma | FD40S | protect from light |
| paraformaldehyde | Sigma | 158127 | diluition in chemical hood |
| Dulbecco's phosphate buffer saline w/o Ca and Mg | EuroClone | ECB4004L | |
| Triton X-100 | Sigma | T8787 | |
| bovine serum albumin | Sigma | A7906 | |
| goat serum | EuroClone | ECS0200D | |
| mouse monoclonal anti-Von Willebrand Factor | Dako | M0616 | |
| AlexaFluor 546-conjugated antibody against mouse IgGs | ThermoFischer Scientific | A-11003 | protect from light |
| DAPI (4’ ,6-diamidino-2-phenylindole) | ThermoFischer Scientific | D1306 | protect from light |
| ProLong Gold Antifade Mountant | ThermoFischer Scientific | P36934 | |
| Poly-L-lysine Hydrobromide | Sigma | P1274 | the same solution can be used several times |
| fibronectin from bovine plasma | Sigma | F1141 | the same solution can be used several times |
| Polyethylene terephthalate (PET) inserts | Falcon | F3090 | Transparent Polyethylene terephthalate (PET) membranes; surface area: 4.2 cm2; pore size 0.4 µm/surface area |
| T75 Primo TC flask | EuroClone | ET7076 | |
| T175 Primo TC flask | EuroClone | ET7181 | |
| EVOM2 Epithelial Tissue Volt/Ohmmeter | World Precision Instruments Germany | EVOM2 | |
| Endohm- 24SNAP cup | World Precision Instruments Germany | ENDOHM-24SNAP | |
| Light/fluorescence microscope with camera | Leica Microsystems | DM IL LED Fluo/ ICC50 W Camera Module | inverted microscope for live cells with camera |
| Confocal Microscope | Leica Microsystems | TCS SPE | |
| Spectrofluorimeter | Jasco | FP-8000 |
References
- Banks, W. A. Characteristics of compounds that cross the blood-brain barrier. BMC Neurol. 9 (1), 3 (2009).
- Löscher, W., Potschka, H. Drug resistance in brain disease and the role of efflux transporters. Nat Rev Neurosci. 6, 591-602 (2005).
- Xu, G., Mahajan, S., Roy, I., Yong, K. -T. Theranostic quantum dots for crossing blood-brain barrier in vitro and providing therapy of HIV-associated encephalopathy. Front Pharmacol. 15 (4), 140 (2013).
- Masserini, M. Nanoparticles for Brain Drug Delivery. ISRN Biochem. , (2013).
- Sagar, V., Pilakka-Kanthikeel, S., Pottathil, R., Saxena, S. K., Nair, M. Towards nanomedicines for neuroAIDS. Rev. Med. Virol. 24 (2), 103-124 (2014).
- Kreuter, J. Drug delivery to the central nervous system by polymeric nanoparticles: What do we know. Adv. Drug Deliver. Rev. 71, 2-14 (2014).
- Arosio, P., Ingrassia, R., Cavadini, P. Ferritins: a family of molecules for iron storage, antioxidation and more. Biochim. Biophys. Acta. 1790 (7), 589-599 (2009).
- Jääskeläinen, A., Soukka, T., Lamminmäki, U., Korpimäki, T., Virta, M. Development of a denaturation/renaturation-based production process for ferritin nanoparticles. Biotechnol. Bioeng. 102 (4), 1012-1024 (2009).
- Jefferies, W. A., Brandon, M. R., Hunt, S. V., Williams, A. F., Gatter, K. C., Mason, D. Y. Transferrin receptor on endothelium of brain capillaries. Nature. 312, 162-163 (1984).
- Deli, M. A., Abraham, C. S., Kataoka, Y., Niwa, M. Permeability studies on in vitro blood-brain barrier models: physiology, pathology, and pharmacology. Cell. Mol. Neurobiol. 25 (1), 59-127 (2005).
- Wilhelm, I., Fazakas, C., Krizbai, I. A. In vitro models of the blood-brain barrier. Acta Neurobiol. Exp. (Wars). 71, 113-128 (2011).
- Wilhelm, I., Krizbai, I. A. In vitro models of the blood-brain barrier for the study of drug delivery to the brain. Mol Pharm. 11 (7), 1949-1963 (2014).
- Bellini, M., et al. Protein nanocages for self-triggered nuclear delivery of DNA-targeted chemotherapeutics in Cancer Cells. J. Control. Release. 196, 184-196 (2014).
- Fiandra, L., et al. Nanoformulation of antiretroviral drugs enhances their penetration across the blood brain barrier in mice. Nanomedicine. 11 (6), 1387-1397 (2015).
- Molino, Y., Jabès, F., Lacassagne, E., Gaudin, N., Khrestchatisky, M. Setting-up an in vitro model of rat blood-brain barrier (BBB): a focus on BBB impermeability and receptor-mediated transport. J. Vis. Exp. , e51278 (2014).
- Perrière, N., et al. A functional in vitro model of rat blood-brain barrier for molecular analysis of efflux transporters. Brain Res. 1150, 1-13 (2007).
