Introduction
Motstanden i sentralnervesystemet (CNS) sykdommer (f.eks. Kreft, epilepsi, depresjon, schizofreni og HIV-assosiert nevrologisk lidelse) til farmakologisk behandling er på grunn av en rekke forskjellige mekanismer, inkludert vanskelige medikament gjennomtrengningen gjennom blod-hjerne-barrieren (BBB) . BBB er den grense som isolerer hjernevev fra substansene som sirkulerer i blodet. Innenfor denne barrieren, et lag av hjerne mikrovaskulære endotelceller (BMECs), støttet av pericytes og astrocytter endfeet, er ansvarlig for den høye selektivitet av BBB til de vannløselige stoffer med en molekylvekt som er høyere enn 400 Da en. En annen legemiddelrelatert resistensmekanismen er knyttet til tilstedeværelsen av BMECs av medikament efflux transportører (P-glykoprotein og multiresistens proteiner), som samvirker for å redusere medikamentpenetrering inn i CNS og lette deres ekstrudering fra hjernen 2.
I det siste tiåret, Et stort antall av nanoteknologi metoder er blitt utviklet for å møte den kliniske og biologiske utfordring å levere medikamenter på tvers av BBB 3-6. I denne sammenheng, ferritin nanosfærer (FNN) representerer et helt innovativ og lovende løsning. FNN er 12 nm kuler av 24 selvsammen ferritin (Fn) monomerer, som er anordnet i en hul sfærisk struktur av 8 nm indre diameter. Ferritin underenheter kan demonteres ved sur pH og settes sammen igjen i en formhuskende måte ved å bringe pH-verdien til nøytralitet, slik at forskjellige organiske molekyler som skal bli innkapslet. Derfor FNN representerer et interessant modell for utviklingen av multifunksjonelle medikamentleveringssystemer 7,8. Videre kan interagere med FNN BMECs takket være den innpassing av transferrin-reseptor (TfR) 1, som uttrykkes på den luminale membranen av disse cellene 9.
Så langt er forskjellig in vitro-modeller av BBB har blitt utviklet i order å belyse trans-BBB permeabilitet for forskjellige stoffer, giftighet overfor BBB, eller interaksjonen av molekylene med efflux transportører. Faktisk er disse modellene gyldig in vitro tilnærminger for en rask screening av aktive molekyler før du fortsetter med in vivo studier. Disse modellene bestå av et enkelt lag av endotelial BMECs eller ko-dyrket BMECs og astrocytter (sjeldnere pericytes), oppnådd fra dyr (rotte, mus, svin og storfe) eller humane cellelinjer 10,11,12. Den TransEndothelial elektrisk motstand (Teer) og den tilsynelatende permeabilitet (P app) av tracere med en definert molekylvekt representerer to viktige parametre som brukes for å bestemme kvaliteten på in vitro modell. Her beskriver vi ansettelse av en BBB in vitro modell, basert på en co-kultur av rotte BMECs (RBMECs) og rotte kortikale astrocytter (RCAS) for å studere den trans-BBB gjennomtrengning av ferritin nanocages innkapsle fluorescein isothiocyanate (FITC).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Etablering BBB Model
Merk: For å etablere BBB modellen vi foreslår å bruke kommersielt tilgjengelige primære RBMECs og RCAs. Alle trinn må utføres med sterile reagenser og forbruksmateriell, håndteres i en laminær hette.
- Cell Culture
- Belegge cellekulturflasker med poly-L-lysin 100 ug / ml (1 time ved romtemperatur) eller fibronektin 50 ug / ml (1 time ved 37 ° C) for å fremme festing av RCAs eller RBMECs, respektivt. Deretter tine 1 x 10 6 RCAs og 5 x 10 5 RBMECs i endotelcelle Medium, supplert med 5% føtalt bovint serum, 1% endotelial celleveksttilskudd og 1% penicillin / streptomycin (sECM). Seed RCAs i en T175 kolbe i 20 ml sECM og RBMECs i en T75 kolbe i 10 ml sECM.
Merk: tining og poding passasjer av RCAs og RBMECs må justeres, i form av celletetthet og tid i kultur, i henhold til antall eksperimentelle betingelser som skal testes med BBB-modellen. ved starting med en ampulle med 1 x 10 6 RCAs og en ampulle på 5 x 10 5 RBMECs, er det mulig å oppnå opp til 20 BBB-lagerinnsatser. - Opprettholde cellene ved 37 ° C og 5% CO2 i en fuktig atmosfære i omtrent 6 dager, til omtrent 80% konfluens for RCAs og over 90% konfluens for RBMECs. Løsne cellene ved hjelp av trypsin-EDTA-oppløsning (trypsin 1: 250) i 5 minutter (1 ml trypsin i T75-kolber og 2 ml til T175 kolber). Stoppe trypsin-aktivitet med sECM (2: 1), sentrifuger cellesuspensjoner ved 750 x g i 5 minutter og resuspender pelleten i 60 ml sECM.
- Splitte RBMECs til 3 T175 kolber og kultur i sECM for en annen 3 dager før såing på innlegg. Telle det totale antall levende RCAs, ved å observere en cellesuspensjon ble fortynnet 1: 1 med trypanblått under et optisk mikroskop i et Burker kammer.
- Belegge cellekulturflasker med poly-L-lysin 100 ug / ml (1 time ved romtemperatur) eller fibronektin 50 ug / ml (1 time ved 37 ° C) for å fremme festing av RCAs eller RBMECs, respektivt. Deretter tine 1 x 10 6 RCAs og 5 x 10 5 RBMECs i endotelcelle Medium, supplert med 5% føtalt bovint serum, 1% endotelial celleveksttilskudd og 1% penicillin / streptomycin (sECM). Seed RCAs i en T175 kolbe i 20 ml sECM og RBMECs i en T75 kolbe i 10 ml sECM.
- Cell Seeding på Setter
- Behandle den ene side av polyetylentereftalat (PET) membran av 6 multi-brønn gjennoent innsatser med poly-L-lysin 100 ug / ml og den andre siden med fibronektin 50 ug / ml, for å tillate feste av RCAs og BMECs. Håndter innsatser med pinsett for å unngå kontakt med PET membran.
- Plasser innsatsene til en 6 brønn plate og legge fibronectin løsning (minimum 500 mL) i det øvre kammeret. Etter 1 time med inkubering ved 37 ° C, fjerner fibronektin løsning, kan innsatsene utenfor multi-brønn plate og sette dem opp ned på bunnen av en 150 cm2 Petri-skål, som brukes her som en steril støtte for allerede belagt inserts.
- Tilsett 800 ul av poly-L-lysin på undersiden av innsatsen (som vist i figur 1A, referert til som RCAs seeding), og holde løsningen på innsatsene i 1 time ved RT.
- Aspirer løsningen og la innsatsene tørke ved romtemperatur i 15-30 min. Skjærene er nå klar for celle såing, men kan også være lagret i multi-brønn plate for fleredager ved 4 ° C, før du fortsetter med BBB konstruksjon.
Merk: Husk å holde minst 3 belagt inserts fri fra cellene, som skal brukes som kontroller for å validere BBB etablering av FD40 flux målinger.
- Seed RCAs (35 000 / cm 2) på bunnsiden av poly-L-lysin-belagte innsatser, ved å slippe 800 ul av cellesuspensjonen på opp ned innsatsen (figur 1A). La RCA suspensjonen på innsatsene i 4 timer ved romtemperatur, for å tillate effektiv festing av cellene til membranen.
- Aspirer restløsningen, plasserer skivene i brønner inneholdende 2 ml sECM og opprettholde den multi-brønn plate ved 37 ° C og 5% CO2 i en fuktig atmosfære, endring av sECM hver 2 dager.
- Etter 3 dager, når RCAs har belagt undersiden av innsatsen, frø RBMECs på den øvre side av innlegget, følgende fremgangsmåte:
- Ta RBMECs fra T175 kolber og telletotale levende celler, som rapportert i trinn 1.1.2 og 1.1.3.
- Seed RBMECs (60 000 / cm 2) på den øvre overflaten av innsatsen i sECM (1000 ul) (figur 1B), og etterlater 3 innsatser med astrocyttene eneste, som skal brukes som teer bakgrunn. Plasser den multi-brønn plate i standard kulturbetingelser. Opprettholde systemet i kultur i minst 3 dager, endring av sECM i den indre og nedre kammer hver 2 dager.
- Behandle den ene side av polyetylentereftalat (PET) membran av 6 multi-brønn gjennoent innsatser med poly-L-lysin 100 ug / ml og den andre siden med fibronektin 50 ug / ml, for å tillate feste av RCAs og BMECs. Håndter innsatser med pinsett for å unngå kontakt med PET membran.
2. BBB Validation
- Teer Måling
- På den 3. dagen av co-kultur, sjekk Teer ved å sette BBB-bærende innsatser i en passende kammer (som har en cap og hvor både kammer og cap inneholde et par spenningssensor og strømelektroder), fylt med 4 ml sECM. Koble til en epitelvev volt / ohmmeter.
- Sammen med Teer målinger av celle BBB-systemer, registrere Teer verdiene av 3 innsatser bærer RCAs thpå vil bli trukket fra verdiene oppnådd med BBBs. Multiplisere de resulterende teer verdier ved overflaten av innsatsen (4,2 cm2) for å uttrykke resultatene i Ω x cm 2.
- Fra den 3. dagen av co-kultur, måle Teer hver dag. Merk: Etter en innledende periode hvor Teer øker, bør de registrerte verdiene forblir stabilt i minst to påfølgende dager (vanligvis mellom 5. og 7. dagen av co-kultur). På det tidspunktet BBB er klar for det andre steget i validering (avsnitt 2.2) og / eller for de trans BBB eksperimenter.
Merk: Fremgangsmåten beskrevet i punkt 2.1 kan utføres på samme BBB-systemer viet til følgende permeabilitet eksperimenter (§ 3). Operere under sterile forhold.
- Trans-BBB Flux av FITC-dekstran 40 (FD40)
- Mål FD40 fluksen fra det øvre til det nedre kammer av BBB-modeller sammenlignet med den på tvers av 3 tomme innsatser(Se note § 1.2.1) i henhold til følgende trinn:
- Tilsett 1 mg / ml FD40 (fortynnet i sECM) inn i det øvre kammer av den BBBs, og etter 1, 2 og 3 timer trekke tilbake 200 ul sECM fra det nedre kammer og måle fluorescensintensiteten ved spectrofluorimeter (λ ex 488 nm, λ em 515 nm, spalte 5).
- Skaff verdiene for sECM bakgrunn fluorescenceby måle 500 mL av jomfru medium med de samme analytiske parametere. Trekk sECM bakgrunnsfluorescens fra alle FD40 fluorescens verdier.
- Bestemme mengden av yret FD40 ved sammenligning av de observerte fluorescens-verdier med en kalibreringskurve fremstilt med kjente konsentrasjoner (f.eks. 0,312, 0,625, 1,25, 2,5 ug / ml) av det fluorescerende tracer oppløst i 500 ul av sECM.
- Beregn den tilsynelatende permeabilitet koeffisient (P app) fra middel flux verdier i henhold til:
P app = J / AC
2), og C er konsentrasjonen av molekylet i det øvre kammeret (mol / cm3).
Merk: Tre eller flere BBB-systemer som har nådd egnede Teer verdier, må utelukkende viet til denne valideringsprosedyre, og bør ikke være ansatt for følgende permeabilitet eksperimenter (seksjon 3). Sterilitet er ikke obligatorisk.
- Mål FD40 fluksen fra det øvre til det nedre kammer av BBB-modeller sammenlignet med den på tvers av 3 tomme innsatser(Se note § 1.2.1) i henhold til følgende trinn:
3. Trans-BBB Permeasjon av FITC-lastet Ferritins (FNN)
Merk: En rekombinant variant av menneskelig ferritin (Fn), produsert i Escherichia coli og satt sammen i nanocages (FNN) for innkapsling av ulike fluorescerende molekyler, er tilgjengelig fra NanoBioLab av Prof. Prosperi (University of Milan-Bicocca, Italia). FNN er lastet med FITC, i henhold til en tidligere beskrevet protokoll 13 og konsentrasjonene av både Fn og det belastede molekylene er nøyaktig fastsettelseed.
- Trans-BBB Flux av FITC og FITC-FNN
- Mål FITC-FNN fluks fra det øvre til det nedre kammer av validerte BBB-modeller (som regel på den 5. - 7. dag med ko-kultur), sammenlignet med det frie fargestoff etter 7 og 24 timer av inkubasjonen ifølge følgende trinn:
- Legg FITC-FNN (50 ug / ml FNN, 1,1 uM FITC) eller en tilsvarende mengde fri FITC inn i det øvre kammer på minst 6 BBB systemer for hver formulering, for å ta ut 2 ml av sECM oppløsning fra det nedre kammer minst 3 innsatser etter 7 timer, og fra det nedre kammer av andre 3 innsatser etter 24 timer.
- Måle fluorescensintensiteten av 500 ul av de innsamlede prøvene ved spectrofluorimeter (λ ex 488 nm, λ em 515 nm, spalte 5).
- Skaff sECM bakgrunnsfluorescens ved å måle 500 mL av medium med de samme analytiske parametere. Trekk sECM bakgrunnsfluorescensfra alle FITC eller FITC-FNN fluorescens verdier.
- Bestemme konsentrasjonen av mettete eller FITC FITC-FNN ved å sammenligne de oppnådde fluorescens-verdier med to forskjellige kalibreringskurver som fremstilles med kjente konsentrasjoner (f.eks. 6,87, 13,75, 27,5, 55 nM) av den frie eller nanoformulated fargestoff ble oppløst i 500 ul sECM.
- Mål FITC-FNN fluks fra det øvre til det nedre kammer av validerte BBB-modeller (som regel på den 5. - 7. dag med ko-kultur), sammenlignet med det frie fargestoff etter 7 og 24 timer av inkubasjonen ifølge følgende trinn:
- FITC-FNN Lokalisering i RBMECs
- Fjern sECM fra det øvre kammer av BBB-systemer, vaskes innsatsene med PBS og feste RBMECs på minst to innsatser for hver forsøksgruppe ved tilsetning av 500 ul paraformaldehyd (4% i fosfatbuffer saltvann-PBS) i det øvre kammeret for 10 min ved RT.
- Vask innsatsene tre ganger med PBS for å fjerne gjenværende para-formaldehyd.
Merk: Fra nå av er det ikke nødvendig sterilitet. - Skjær passende biter av PET-membran, og fortsette med immunodecoration av cellene i henhold til følgende fremgangsmåte:
- Permeabiisere seg RBMECs med 0,1% Triton X-100 i PBS i 10 minutter. Utføre et blokkeringstrinn i 1 time ved RT med en oppløsning inneholdende 2% bovint serumalbumin (BSA), 2% geiteserum i PBS. Inkuber prøver med et anti-von Willebrand faktor (VWF) ved 1:20 fortynning i 2 timer ved RT.
- Etter vasking tre ganger med PBS, eksponere cellene i 2 timer ved RT til en 2% BSA, 2% geiteserum oppløsning inneholdende et passende sekundært antistoff ved en 1: 300 fortynning i rekkefølge viser den anti-VWR, og DAPI ved en 1: 1500 fortynning for kjerner deteksjon.
- Monter innsatsen brikkene på objektglass ved hjelp av en antifade monteringsløsning (en dråpe per innsats fragment), og lukk prøven med et dekkglass. Analyser av konfokalmikroskopi med olje nedsenking linse på 40X forstørrelse, 1,5 zoom og 1024 x 1024 pikslers oppløsning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Under etableringen av BBB-modellen, celleadhesjon og cellevekst på innsatsene kan overvåkes ved hjelp av et lysmikroskop takket være den gjennomsiktige natur av PET-membraner. RCAs, sådd ut ved en tetthet på 35.000 celler / cm 2, festes effektivt til undersiden av innsatsen etter 4 timers inkubering ved romtemperatur (figur 2A) og vokse til å dekke den membranoverflaten i 3 dager, tar en spindelformet morfologi (figur 2B). RBMECs, sådd ut ved en tetthet på 60.000 celler / cm 2, er synlig festet til den øvre flate av PET membranen etter ca. 3 timers inkubering ved 37 ° C (figur 2C). Fremkallings RBMEC Sjiktet kan være vanskelig å visualisere i løpet av de følgende dager med et optisk mikroskop, på grunn av overlappingen med det underliggende lag RCA (figur 2D).
En riktig validering av BBB modell krever alltid teer måling og dette kan bekreftes ved å evaluere den trans-BBB P app av en lav permeabilitet sporstoff, slik som FD40.
De Teer verdier, innspilt over co-kultur periode, representerer den første klar indikasjon på riktig dannelsen av endothelial barriere. Tre dager etter RBMEC såing, den innspilte Teer, trekkes fra Teer av astrocytter bærende inserts, er hovedsakelig på grunn av bidraget fra den ikke-electrogenic lag av RCAs og utvikling lag RBMECs. På dette tidspunkt gir vår BBB-verdier i området mellom 20 og 40 Ω x cm 2. I løpet av de neste dagene, vanligvis mellom den 4. og 5. dag av co-kultur, verdier Teer økning på grunn av dannelse av tett veikryss mellom tilstøtende endotelceller 14, nådde verdier vanligvis mellom 55 og 110 Ω x cm 2, og unntaksvis higher verds 14. De målte på 4. / 5. dag av co-kultur verdiene forblir stabile frem til den 7. - 8. dagen før de begynner å avta; Derfor, er det et meget smalt tidsvindu er tilgjengelig for å gjennomføre trans-BBB fluks eksperimenter.
Mellom den 5. og 7. dag av ko-kultur, kan integriteten av de eksperimentelle modeller bli bekreftet ved å evaluere den FD40 trans-BBB permeabilitet. Figur 3 viser et eksempel på den trans-BBB fluks av FD40 (1 mg / ml ), sammenlignet med den fluks over tomme innsatser, i løpet av 3 timer av inkubasjonen; den BBBs er på den 6. dag av co-kulturen og den innspilte Teer er 55,6 ± 15,8 Ω cm 2 (gjennomsnitt ± SE, n = 3). Fluksen er lineær mellom en og tre timer av inkubasjon og den midlere P app beregnet mellom 1 og 2 timer, og mellom 2 og 3 timer med inkubasjon er0,12 ± 0,01 x 10 - 6 cm sek - 1 (± SE, n = 6).
Når minst tre påfølgende vellykket BBBs, i form av Teer og FD40 P app, har blitt oppnådd i uavhengige eksperimenter måling av tracer permeabilitet kan unngås; Imidlertid må Teer alltid skal registreres for hvert forsøk.
Den trans-BBB permeabilitet av fluorescerende molekyler og effekten av Nanokompleks på deres levering kan undersøkes ved hjelp av rotte BBB-modeller som er beskrevet ovenfor. Figur 4 viser gjennomtrengningen av modellen fargestoff FITC ved innkapsling i FNN tvers BBBs med teer av 100,4 ± 3,5 Ω cm 2 (n = 16) på den 7. dagen av co-kultur. Histogrammene, som representerer FITC-konsentrasjonen i det nedre kammer etter 7 og 24 timer fra tilsetningen av fri eller nanoformulated fargestoffi det øvre kammeret, indikerer at FNN er i stand til i betydelig grad å øke leveringen av FITC tvers av BBB.
Konfokale mikroskop bilder på oversiden av innsatsen etter 7 og 24 timer med inkubering med FITC-FNN (figur 5A, C) eller FITC (figur 5B, D) viser at mens fri FITC ikke blir internalisert av RBMECs, dens lasting inn i den FNN gjør det mulig å gå inn i cellene.
Før behandlingen av innsatser for konfokalmikroskopi, er en ytterligere sjekk av Teer er nødvendig for å sikre at det ikke FNN-medierte effekter på BBB integritet.
Fig. 1: Celle såing på Setter RCA (A) og RBMEC (B) poding fremgangsmåte på de to motsatte sider avmulti-brønn plate inserts. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2:. Optisk mikroskop Bilder av RCAs og RBMVECs på Setter Setter sådd med RCAs og RBMECs er observert med et lysmikroskop (20X optisk zoom). (A) Fire timer etter såing, rundt og gjennomskinnelige RCAs er synlig festet til bunnflaten av innsatsen; (B) spindel-formet RCAs er synlige på den 3. dag med kultur; (C) Rund og gjennomskinnelig RBMECs er festet på oversiden av innsatsen etter tre timers inkubering; (D) På den 4. dagen i ko-kultur begge overflatene av innsatsen er helt dekket med celler, og de to layere er ikke lett gjenkjennelig. Scale bar = 100 mikrometer. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Fig. 3: FD40 fluks over BBB Flux av FD40 (1 mg / ml) fra den øvre til den nedre side av BBB in vitro-system, sammenlignet med den over den tomme innsatsen. Mengden av FD40 i det nedre kammer er målt ved 60, 120 og 180 minutter etter tilsetningen av fargestoff til det øvre kammer. Betyr ± SE; n ° setter = 3. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4: Effekt av FNN Innkapsling på FITC gjennomtrengningen gjennom BBB Konsentrasjon av FITC i det nedre kammer av BBB in vitro-system beregnet ved 7 og 24 timer etter tilsetning av FITC eller FITC-FNN inn i det øvre kammer.. Gjennomsnitt ± SE av 4-5 replikerer; **** P <0,0005, FITC-FNN vs. FITC (t-test). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 5: Konfokalmikroskopi av RBMECs på Setter Confocal laserskanning mikroskopi (single optiske deler) av RBMECs etter 7 timer (A, B) eller 24 timer (C, D) av inkubasjon med gratis FITC (B, C) eller FITC. -FnN (A,
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den in vitro-metode som er beskrevet her representerer en nyttig tilnærming validert for å studere den trans-BBB levering av fluorescerende molekyler ved nanoformulation med nanopartikler. Her bruker vi FNN, noe som representerer en god kandidat til å studere translokasjon av cargomolekyler over BBB. FNN regnes som gull nanovector for trans-BBB levering av legemiddel / midler siden det er spesifikt gjenkjent av TfR1-reseptoren, som uttrykkes på den luminale membranen av BMECs og medierer de nanopartikkel-opptaket ved hjelp av et reseptor-formidlet internalisering reaksjonsvei. Videre er FNN en naturlig nanopartikkel, og den har derfor en god biokompatibilitet profil. Endelig er FNN i stand til å innkapsle lav dimensjonsvannløselige molekyler med en enkel og effektiv mekanisme. Den trans-BBB gjennomtrengning av forskjellige andre typer organiske eller uorganiske nanopartikler kan også vurderes sammen med denne protokoll, i henhold til noen betraktninger angående nanopartikler egenskaper. første prerequisite å studere gjennomtrengelighet av nanoformulated narkotika / agenter er sikkerheten til tomrommet nanopartikler. Et annet viktig spørsmål er samspillet av den undersøkte nanopartikkel med PET filter. Dette aspektet, må evalueres preliminært for å utelukke en betydelig retensjon inn i membranporene og unngå endringer av deres gjennomtrengning på tvers av BBB. Vår gruppe har nylig ansatt den foreslåtte strategien for å studere et polymer-belagt jernoksid nanopartikkel som en trans-BBB leveringssystem for fluorescens-merket antiretrovirale legemidler 14. I så fall blir forbundet elektronmikroskopi lokalisering av nanoformulations i RBMECs til fluorescensdeteksjon. Videre har andre svært sensitive diagnostiske metoder, slik som induktivt koblet plasma (ICP) -MS kan bli anvendt for å evaluere trans-BBB levering av uorganiske nanosystemer.
BBB in vitro modellen som brukes i denne protokollen er basert på co-kultur av rotte BMECs og astrocytter. I det brede scenario av BBB modeller 10,11,12, noen som har blitt nøyaktig beskrevet i litteraturen med en godt detaljert protokoll 15, representerer vår modell en god kvalitet alternativ. Faktisk, selv om den innspilte teer var under de beste standardene foreslått i litteraturen (150-200 Ω cm2) 10, trans-BBB permeabiliteten av den høye dimensjon tracer Dextran 40 var i overensstemmelse med total dannelse av en tett barriere.
Denne in vitro-modell, oppnådd med kommersielt tilgjengelig rotte BMECs og astrocytter, har noen fordeler: (1) optimal vekst effektiviteten av endotelceller, (2) en passende periode for fremstilling av den endelige BBB-modellen (ikke lenger enn 13 dager), (3) overholdelse av etiske problemstillinger, unngå bruk av celler fra menneskelige hjerne vev (obduksjonsmateriale, kirurgiske prøver, og fosterets vev) og 4) besparelse av tid og kostnader knyttet til dyr bolig, og primærceller utvinning. Ikke desto mindre er en begrensning av den foreliggende modell relatert til de høye kostnadene ved ikke-immortaliserte primære RBMECs, som må kjøpes (frosset ved passasje en) for hver eksperimentell innstilling. Faktisk har våre foreløpige undersøkelser av BBB produksjon viste at evnen av endoteliale celler til å produsere en tett BBB er strengt forbundet med antall passasjer i kultur av de RBMECs etter at den første post-kjøp tining. Videre implementering av BBB modellen beskrevet her med endotelceller kosttilskudd, slik som cAMP og hydrokortison, kan anses for å bedre endotelial tetthet og øke Teer verdier. 10,11,16
Den foreliggende teknikk er relatert til muligheten for å utnytte en enkelt BBB modell for forskjellige analyser, og dermed gi flere datasett fra hver eksperimentell innstilling. Med et enkelt BBB system utsettes for frie eller nanocomplexed fluorescerende molekyler, er det mulig: (1) å måle the trans-barriere fluks av molekylet ved å analysere fluorescensintensiteten av sECM aliquoter innsamlet fra det nedre kammer ved forskjellige tidspunkter inkubering; (2) for å undersøke den nano-medierte internalisering av molekyler i RBMECs og deres intracellulære handel ved konfokal mikroskopi-analyse av cellene på innsatsene; (3) for å få en indikasjon på status av BBB-celler etter eksponering til de nanoformulations, ved å måle teer ved slutten av forsøket, eller ved å analysere endotel integritet ved elektronmikroskopi.
Som konklusjon, her vi beskrevet en protokoll for studiet av gjennomtrengningen av nanocomplexed fluorescerende molekyler over en høy kvalitet BBB in vitro modell. Vi anser denne metodikken et nyttig verktøy for å undersøke effekten av nanoformulation på levering av legemidler over BBB.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Rat Brain Microvascular Endothelial Cells | Innoprot | P10308 | isolated from Sprague Dawley rat brain tissue, cryopreserved at passage one and delivered frozen |
| Cortical Astrocytes | Innoprot | P10202 | isolated from 2 days rat brain tissue, cryopreserved at passage one and delivered frozen. |
| Endothelial Cell Medium kit | Innoprot | P60104 | ECM (500 ml) and fetal bovin serum (25 ml), endothelial cell growth supplement (5 ml) and penicillin/streptomycin (5 ml). Warm in 37 °C water bath before use and protect from light |
| Trypsin-EDTA without Phenol Red | EuroClone | ECM0920D | Warm in 37 °C water bath before use |
| Fluorescein isothiocyanate-dextran 40,000 | Sigma | FD40S | protect from light |
| paraformaldehyde | Sigma | 158127 | diluition in chemical hood |
| Dulbecco's phosphate buffer saline w/o Ca and Mg | EuroClone | ECB4004L | |
| Triton X-100 | Sigma | T8787 | |
| bovine serum albumin | Sigma | A7906 | |
| goat serum | EuroClone | ECS0200D | |
| mouse monoclonal anti-Von Willebrand Factor | Dako | M0616 | |
| AlexaFluor 546-conjugated antibody against mouse IgGs | ThermoFischer Scientific | A-11003 | protect from light |
| DAPI (4’ ,6-diamidino-2-phenylindole) | ThermoFischer Scientific | D1306 | protect from light |
| ProLong Gold Antifade Mountant | ThermoFischer Scientific | P36934 | |
| Poly-L-lysine Hydrobromide | Sigma | P1274 | the same solution can be used several times |
| fibronectin from bovine plasma | Sigma | F1141 | the same solution can be used several times |
| Polyethylene terephthalate (PET) inserts | Falcon | F3090 | Transparent Polyethylene terephthalate (PET) membranes; surface area: 4.2 cm2; pore size 0.4 µm/surface area |
| T75 Primo TC flask | EuroClone | ET7076 | |
| T175 Primo TC flask | EuroClone | ET7181 | |
| EVOM2 Epithelial Tissue Volt/Ohmmeter | World Precision Instruments Germany | EVOM2 | |
| Endohm- 24SNAP cup | World Precision Instruments Germany | ENDOHM-24SNAP | |
| Light/fluorescence microscope with camera | Leica Microsystems | DM IL LED Fluo/ ICC50 W Camera Module | inverted microscope for live cells with camera |
| Confocal Microscope | Leica Microsystems | TCS SPE | |
| Spectrofluorimeter | Jasco | FP-8000 |
References
- Banks, W. A. Characteristics of compounds that cross the blood-brain barrier. BMC Neurol. 9 (1), 3 (2009).
- Löscher, W., Potschka, H. Drug resistance in brain disease and the role of efflux transporters. Nat Rev Neurosci. 6, 591-602 (2005).
- Xu, G., Mahajan, S., Roy, I., Yong, K. -T. Theranostic quantum dots for crossing blood-brain barrier in vitro and providing therapy of HIV-associated encephalopathy. Front Pharmacol. 15 (4), 140 (2013).
- Masserini, M. Nanoparticles for Brain Drug Delivery. ISRN Biochem. , (2013).
- Sagar, V., Pilakka-Kanthikeel, S., Pottathil, R., Saxena, S. K., Nair, M. Towards nanomedicines for neuroAIDS. Rev. Med. Virol. 24 (2), 103-124 (2014).
- Kreuter, J. Drug delivery to the central nervous system by polymeric nanoparticles: What do we know. Adv. Drug Deliver. Rev. 71, 2-14 (2014).
- Arosio, P., Ingrassia, R., Cavadini, P. Ferritins: a family of molecules for iron storage, antioxidation and more. Biochim. Biophys. Acta. 1790 (7), 589-599 (2009).
- Jääskeläinen, A., Soukka, T., Lamminmäki, U., Korpimäki, T., Virta, M. Development of a denaturation/renaturation-based production process for ferritin nanoparticles. Biotechnol. Bioeng. 102 (4), 1012-1024 (2009).
- Jefferies, W. A., Brandon, M. R., Hunt, S. V., Williams, A. F., Gatter, K. C., Mason, D. Y. Transferrin receptor on endothelium of brain capillaries. Nature. 312, 162-163 (1984).
- Deli, M. A., Abraham, C. S., Kataoka, Y., Niwa, M. Permeability studies on in vitro blood-brain barrier models: physiology, pathology, and pharmacology. Cell. Mol. Neurobiol. 25 (1), 59-127 (2005).
- Wilhelm, I., Fazakas, C., Krizbai, I. A. In vitro models of the blood-brain barrier. Acta Neurobiol. Exp. (Wars). 71, 113-128 (2011).
- Wilhelm, I., Krizbai, I. A. In vitro models of the blood-brain barrier for the study of drug delivery to the brain. Mol Pharm. 11 (7), 1949-1963 (2014).
- Bellini, M., et al. Protein nanocages for self-triggered nuclear delivery of DNA-targeted chemotherapeutics in Cancer Cells. J. Control. Release. 196, 184-196 (2014).
- Fiandra, L., et al. Nanoformulation of antiretroviral drugs enhances their penetration across the blood brain barrier in mice. Nanomedicine. 11 (6), 1387-1397 (2015).
- Molino, Y., Jabès, F., Lacassagne, E., Gaudin, N., Khrestchatisky, M. Setting-up an in vitro model of rat blood-brain barrier (BBB): a focus on BBB impermeability and receptor-mediated transport. J. Vis. Exp. , e51278 (2014).
- Perrière, N., et al. A functional in vitro model of rat blood-brain barrier for molecular analysis of efflux transporters. Brain Res. 1150, 1-13 (2007).
