Introduction
ההתנגדות של מערכת העצבים המרכזית (CNS) מחלות (כלומר. סרטן, אפילפסיה, דיכאון, סכיזופרניה והפרעה נוירולוגית הקשורים HIV) לטיפולים תרופתיים נובע מנגנונים שונים, כולל חלחול התרופה מפרך דרך מחסום הדם-מוח (BBB) . של BBB הוא הגבול מבודד רקמות מוח מפני החומרים במחזור הדם. בתוך המחסום הזה, שכבה של תאי אנדותל כלי דם במוח (BMECs), נתמכים על ידי pericytes האסטרוציטים endfeet, אחראית סלקטיביות הגבוהה של BBB לאלו תרופות hydrosoluble עם משקל מולקולרי גבוהה מ -400 Da 1. עוד מנגנון עמידות הקשורות לסמים קשורים לנוכחות על BMECs של מובילים בזרימת התרופה (P-glycoprotein והתנגדות multidrug חלבונים), אשר שיתוף פעולה כדי לצמצם את חדירת התרופה לתוך מערכת העצבים המרכזית ואת להקל שהחול שלהם מהמוח 2.
בעשור האחרון, מספר רב של גישות nanotechnological פותח כדי לעמוד באתגר הקליני וביולוגי של אספקת סמים ברחבי BBB 3-6. בהקשר זה, nanospheres פריטין (FNN) מייצג פתרון חדשני ומבטיח לחלוטין. FNN הם 12 תחומים ננומטר של 24 פריטין הרכבה עצמית (Fn) מונומרים, אשר מסודרים במבנה כדורי חלול של 8 קוטר פנימי ננומטר. יחידות משנת פריטין יכולה להיות מפורקת ב- pH חומצי מחדש באופן צורה-זיכרון על ידי הביא את ה- pH ניטראלי, המאפשר מולקולות אורגניות שונות להיות במארז. לכן, FNN מייצג מודל מעניין לפיתוח 7,8 למערכות אספקת תרופות רבות תכליתי. יתר על כן, FNN עלול ליצור אינטראקציה עם הודות BMECs אל הכרה ספציפית של transferrin קולטן (TFR) 1, אשר באה לידי ביטוי על הממברנה luminal של תאים אלה 9.
עד כה, שונה במודלים חוץ גופייה של BBB פותח יורדr להבהיר חדירות טראנס-BBB לסמים שונים, רעיל לכיוון BBB, או האינטראקציה של מולקולות עם מובילים בזרימה. אכן, מודלים אלה נחשבים תקפים במבחנת גישות להקרנה מהירה של מולקולות פעילות לפני שתמשיך עם מחקרי in vivo. מודלים אלה כוללים שכבת האנדותל יחידה של BMECs או BMECs שיתוף תרבותי האסטרוציטים (לעתים רחוקות יותר pericytes), המתקבלת מן החי (חולדה, עכבר, חזיר שור) או שורות תאים אנושיות 10,11,12. את ההתנגדות החשמלית Transendothelial (TEER) ואת החדירות לכאורה (אפליקצית P) של קליעים נותבים עם משקל מולקולרי מוגדר מייצגי שני פרמטרים קריטיים המשמשים כדי לקבוע את איכות המודל חוץ גופייה. כאן אנו מתארים את העסקת מודל BBB במבחנה, מבוסס על שיתוף התרבות של עכברוש BMECs (RBMECs) וחולדה האסטרוציטים קליפת המוח (RCAs) ללמוד את חלחול טרנס-BBB של nanocages פריטין encapsulating isothi והעמסתocyanate (FITC).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. הקמת מודל BBB
הערה: הקמת מודל BBB אנו ממליצים להשתמש RBMECs העיקרי זמין מסחרי RCAs. כל הצעדים חייבים להתבצע עם ריאגנטים מתכלים סטרילי, טיפל במנדף זרימה למינרית.
- תרבית תאים
- תא מעיל צלוחיות תרבות עם מ"ל פולי- L- ליזין 100 מיקרוגרם / (שעה 1 ב RT) או פיברונקטין 50 מיקרוגרם / מ"ל (שעה 1 ב 37 ° C) כדי לקדם את הקובץ המצורף של RCAs או RBMECs, בהתאמה. ואז, להפשיר 1 x 10 6 RCAs ו -5 x 10 5 RBMECs ב בינוני תא האנדותל, בתוספת 5% בסרום שור עוברי, 1% תוספת צמיחת תא האנדותל ו -1% פניצילין / סטרפטומיצין (sECM). RCAs זרע בבקבוק T175 ב sECM 20 מ"ל ו RBMECs בבקבוק T75 ב 10 מ"ל sECM.
הערה: ההפשרה ומעברי זריעה של RCAs ו RBMECs חייבים להיות מותאמים, מבחינת צפיפות תאים וזמן בתרבות, בהתאם למספר של תנאי ניסוי להיבדק עם מודל BBB. הסטארטing עם 1 בקבוקון של 1 x 10 6 RCAs ו 1 בקבוקון של 5 x 10 5 RBMECs, אפשר לקבל עד 20 BBB נושאות מוסיף. - לשמור על התאים ב 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2 באווירה humidified למשך כ- 6 ימים, עד בערך המפגש 80% עבור RCAs ולמעלה מ -90% מפגש עבור RBMECs. ניתוק התאים באמצעות פתרון טריפסין-EDTA (טריפסין 1: 250) במשך 5 דקות (1 מ"ל טריפסין עבור צלוחיות T75 ו -2 מ"ל עבור צלוחיות T175). תפסיק פעילות טריפסין עם sECM (2: 1), השעיות תא צנטריפוגות ב g 750 × 5 דקות ו resuspend את הכדורים ב 60 מיליליטר sECM.
- פיצול RBMECs לתוך 3 צלוחיות T175 ותרבות sECM במשך 3 ימים אחרים לפני הזריעה על מוסיף. לספור את המספר הכולל של החיים RCAs, על ידי התבוננות ההשעיה תא מדולל 1: 1 עם trypan כחול תחת מיקרוסקופ אופטי בתא "שודד גופות.
- תא מעיל צלוחיות תרבות עם מ"ל פולי- L- ליזין 100 מיקרוגרם / (שעה 1 ב RT) או פיברונקטין 50 מיקרוגרם / מ"ל (שעה 1 ב 37 ° C) כדי לקדם את הקובץ המצורף של RCAs או RBMECs, בהתאמה. ואז, להפשיר 1 x 10 6 RCAs ו -5 x 10 5 RBMECs ב בינוני תא האנדותל, בתוספת 5% בסרום שור עוברי, 1% תוספת צמיחת תא האנדותל ו -1% פניצילין / סטרפטומיצין (sECM). RCAs זרע בבקבוק T175 ב sECM 20 מ"ל ו RBMECs בבקבוק T75 ב 10 מ"ל sECM.
- זריעת תאים על הוספה
- פנקו את צד אחד של terephthalate פוליאתילן (PET) קרום של 6 רב גם transparמוסיף אף אוזן גרון עם L- ליזין פולי 100 מיקרוגרם / מ"ל ואת הצד השני עם מ"ל / מיקרוגרם 50 פיברונקטין, כדי לאפשר התקשרות של RCAs ו BMECs. טפל מחדיר עם פינצטה על מנת להימנע ממגע עם קרום PET.
- מניחים את מוסיף לתוך צלחת 6 היטב ולהוסיף פתרון פיברונקטין (מינימום 500 μl) לתוך החדר העליון. אחרי שעה 1 של דגירה על 37 ° C, להסיר את הפתרון פיברונקטין, לקחת מחדיר את צלחת רב היטב ולשים אותם במהופך על החלק התחתון של צלחת 150 ס"מ 2 פטרי, אשר משמש כאן כתמיכה סטרילי עבור כבר מצופה מוסיף.
- בעדינות להוסיף 800 μl של L- ליזין פולי על הצד התחתון של הכנס (כפי שמוצג באיור 1 א; המכונה זריעת RCAs), ולשמור את פתרון מוסיף עבור שעה 1 ב RT.
- לשאוב את הפתרון ולתת המחדיר לייבש ב RT במשך 15-30 דקות. המחדיר מוכן כעת זריעת תאים, אבל יכול גם להיות מאוחסן בצלחת רבה גם עבור מספרימים על 4 מעלות צלזיוס, לפני שתמשיך עם בניית BBB.
הערה: זכור לשמור לפחות 3 מצופה מוסיף חינם מתאי, כדי לשמש שולט לאמת הקמת BBB על ידי FD40 מדידות שטף.
- RCAs Seed (35,000 / 2 ס"מ) על הצד התחתון של מוסיף פולי- L- מצופה ליזין, על ידי הטלת 800 μl של ההשעיה התא על במהופך להוסיף (איור 1 א). השאירו את ההשעיה RCA על הכנסות עבור 4 שעות ב RT, על מנת לאפשר התקשרות יעילה של תאים הממברנה.
- לשאוב את הפתרון שיורית, למקם מחדיר לתוך בארות המכילות 2 מיליליטר של sECM ולשמור על הצלחת רבה גם על 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2 באווירה humidified, שינוי sECM כל 2 ימים.
- לאחר 3 ימים, כאשר RCAs יש מצופה בחלק התחתון של הפנים של הכנס, זרע RBMECs על הצד העליון של הכנס, ביצוע השלבים הבאים:
- ניתוק RBMECs צלוחיות T175 ולספור אתתאים חיים הכולל, כפי שדווח צעדים 1.1.2 ו 1.1.3.
- RBMECs Seed (60,000 / 2 ס"מ) על פני השטח העליונים של הכנס ב sECM (1,000 μl) (איור 1 ב), עוזב 3 מוסיף עם האסטרוציטים בלבד, כדי לשמש כרקע TEER. מניח את הצלחת רבה היטב בתנאי תרבות סטנדרטיים. לשמור על המערכת לתרבות במשך 3 ימים לפחות, שינוי sECM בחדר הפנימי ותחתון כל 2 ימים.
- פנקו את צד אחד של terephthalate פוליאתילן (PET) קרום של 6 רב גם transparמוסיף אף אוזן גרון עם L- ליזין פולי 100 מיקרוגרם / מ"ל ואת הצד השני עם מ"ל / מיקרוגרם 50 פיברונקטין, כדי לאפשר התקשרות של RCAs ו BMECs. טפל מחדיר עם פינצטה על מנת להימנע ממגע עם קרום PET.
2. אימות BBB
- מדידת TEER
- ביום 3 rd של התרבות המשותפת, בדוק את TEER ידי החדרת מחדיר BBB נושא לתוך תא מתאים (שהינה בעלת כובע והיכן הוא קאמרי כובע להכיל זוג-חישת מתח ואלקטרודות נוכחי), מלא 4 מ"ל של sECM. חבר מד התנגדות / וולט רקמת האפיתל.
- יחד עם מדידות TEER של BBB-מערכות תא, להקליט הערכים TEER של 3 מוסיף הנושאת את RCAs הב ינוכה הערכים שהתקבלו עם BBBS. הכפל את הערכים TEER שהתקבל על ידי פני השטח של הכנס (4.2 ס"מ 2) על מנת להביע את התוצאות כפי x Ω 2 ס"מ.
- מהיום 3 rd של תרבות משותפת, למדוד את TEER מדי יום. הערה: לאחר תקופה ראשונית שבה TEER מגביר, ערכי רשמתה צריכים להישאר יציבים במשך ימים רצופים לפחות (בדרך כלל בין ה 5 ואת יום ה -7 של שיתוף תרבות). בשלב זה BBB הוא מוכן לשלב השני של אימות (סעיף 2.2) ו / או עבור הניסויים טרנס-BBB.
הערה: ההליך המתואר בסעיף 2.1 יכול להתבצע על BBB-המערכות באותו מוקדש הניסויים החדירים הבא (סעיף 3). Operate בתנאים סטריליים.
- חוצה BBB שטף של FITC-dextran 40 (FD40)
- מדוד את שטף FD40 מהמפלס העליון אל בתא התחתון של מודלי BBB בהשוואה לזו פני 3 מוסיפה ריק(ראה הערה בסעיף 1.2.1) על פי השלבים הבאים:
- הוסף 1 מ"ג / מ"ל FD40 (מדולל sECM) לתא העליון של BBBS, ואחרי 1, 2 ו -3 שעות למשוך עד 200 sECM μl מהאולם התחתון למדוד את עוצמת הקרינה על ידי spectrofluorimeter (לשעבר λ 488 ננומטר, λ em 515 ננומטר, ושיסף 5).
- השג את הערכים עבור רקע sECM fluorescenceby מדיד 500 μl של מדיום בתולה באמצעות אותם הפרמטרים אנליטיים. הפחת את קרינת רקע sECM מכל ערכי קרינת FD40.
- לקבוע את כמות חלחלה FD40 ידי השוואה של ערכי הקרינה נצפתה עם עקומת כיול מיוצר עם ריכוזים ידועים (כלומר. 0.312, 0.625, 1.25, 2.5 מיקרוגרם / מ"ל) של נותב ניאון מומס 500 μl של sECM.
- חשבתי את המקדם חדירות לכאורה (אפליקצית P) מן ערכי שטף הממוצעים לפי:
אפליקצית P = J / AC
(2 ס"מ) ו- C הוא הריכוז של מולקולה בתא העליון (שומות / ס"מ 3).
הערה: שלוש או יותר BBB-מערכות שהגיעו ערכי TEER מתאימים, חייבות להיות מוקדשות אך ורק הליך אימות זה, ולא צריך להיות מועסק על הניסויים החדירים הבאים (סעיף 3). עקרות אינה חובה.
- מדוד את שטף FD40 מהמפלס העליון אל בתא התחתון של מודלי BBB בהשוואה לזו פני 3 מוסיפה ריק(ראה הערה בסעיף 1.2.1) על פי השלבים הבאים:
3. חוצה BBB חלחול של FITC טעון Ferritins (FNN)
הערה: גרסה רקומביננטי של פריטין האדם (Fn), המיוצר Escherichia coli והורכבו nanocages (FNN) אנקפסולציה של מולקולות ניאון שונים, זמין אצל NanoBioLab של פרופ פרוספרי (אוניברסיטת מילאנו-Bicocca, איטליה). FNN נטען עם FITC, על פי פרוטוקול שתואר לעיל 13 ועל הריכוזי הוא Fn ואת המולקולות הטעונות הם במדויק determined.
- חוצה BBB שטף של FITC ו FITC-FNN
- מדוד את שטף FITC-FNN מהמפלס העליון אל בתא התחתון של מודלי BBB תוקף (בדרך כלל 5 th - יום ה -7 של שיתוף תרבות), בהשוואה לזו של צבע חינם לאחר 7 ו -24 שעות של דגירה, על פי את הפעולות הבאות:
- הוסף FITC-FNN (50 מיקרוגרם / מ"ל FNN, 1.1 מיקרומטר FITC) או כמות שווה של FITC חופשי לתוך החדר העליון של מערכות BBB 6 לפחות לכל ניסוח, כדי למשוך 2 מ"ל של תמיסת sECM מהאולם התחתון של לפחות 3 מוסיף לאחר 7 שעות, וממנה בתא התחתון של 3 מוסיף אחרים לאחר 24 שעות.
- למדוד את עוצמת הקרינה של 500 μl של דגימות שנאספו על ידי spectrofluorimeter (לשעבר λ 488 ננומטר, λ em 515 ננומטר, ושיסף 5).
- השג את קרינת רקע sECM ידי מדידת 500 μl של מדיום באמצעות אותם הפרמטרים אנליטיים. הפחת את קרינת רקע sECMמכל ערכי הקרינה FITC או FITC-FNN.
- קבע את הריכוז של חלחלה FITC או FITC-FNN ידי השוואת ערכי הקרינה שהושג עם שתי עקומות כיול שונים המיוצרים עם ריכוזים ידועים (כלומר. 6.87, 13.75, 27.5, 55 ננומטר) של צבע בחינם או nanoformulated מומס 500 sECM μl.
- מדוד את שטף FITC-FNN מהמפלס העליון אל בתא התחתון של מודלי BBB תוקף (בדרך כלל 5 th - יום ה -7 של שיתוף תרבות), בהשוואה לזו של צבע חינם לאחר 7 ו -24 שעות של דגירה, על פי את הפעולות הבאות:
- FITC-FNN לוקליזציה RBMECs
- הסר sECM מהאולם העליון של מערכות BBB, לשטוף את מוסיף עם PBS ולתקן את RBMECs על שני מוסיף לפחות לכל קבוצת הניסוי על ידי הוספת 500 paraformaldehyde μl (4% חיץ פוספט מלוחים-PBS) בתא העליון עבור 10 דקות ב RT.
- שטפו את מוסיף שלוש פעמים עם PBS להסיר paraformaldehyde שיורית.
הערה: מנקודה זו ואילך, עקרות אינן הכרחיות. - חותך חתיכות מתאימות של קרום PET, ולהמשיך עם immunodecoration של התאים על פי השלבים הבאים:
- PermeabiLize RBMECs עם 0.1% Triton X-100 ב PBS במשך 10 דקות. בצע צעד חסימה עבור שעה 1 ב RT עם תמיסה המכילה אלבומין 2% השור (BSA), 2% נסיוב עז ב PBS. דגירה דגימות עם אנטי-פון Willebrand Factor (VWF) בשעה 1:20 דילול עבור שעה 2 ב RT.
- לאחר שטיפת שלוש פעמים עם PBS, לחשוף את התאים במשך שעה 2 ב RT על BSA 2%, פתרון סרום עיזים 2% המכיל נוגדנים משני מתאים ביחס של 1: דילול 300 כדי לחשוף את-VWR אנטי, ו DAPI בכל 1: 1,500 דילול לגילוי גרעינים.
- הר החתיכות להוסיף על גבי שקופיות מיקרוסקופ באמצעות פתרון הרכבת antifade (טיפה אחת לכל קטע כנס), ולאחר מכן סגור את המדגם עם תלוש כיסוי. לנתח ידי מיקרוסקופ confocal שימוש בעדשת טבילת שמן בהגדלה 40X, 1.5 זום 1,024 x 1,024 פיקסלים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
במהלך הקמת מודל BBB, מצורף התא והצמיחה על המחדיר ניתן לנטר באמצעות מיקרוסקופ אור הודות לאופי השקוף של ממברנות PET. RCAs, זורעים בצפיפות של 35,000 תאים / 2 ס"מ, לצרף ביעילות את הצד התחתון של הכנס לאחר 4 שעות של דגירה על RT (איור 2 א) ולגדול כדי לכסות את פני השטח קרום ב 3 ימים, לוקח מורפולוגיה כישוריות (תרשים 2B). RBMECs, זורעים בצפיפות של 60,000 תאים / 2 ס"מ, מחוברים בעליל על הפנים העליון של קרום PET לאחר כ 3 שעות של דגירה על 37 ° C (איור 2 ג). שכבת RBMEC בפיתוח יכולה להיות קשה לדמיין במהלך הימים הבאים עם מיקרוסקופ אופטי, בגלל החפיפה עם שכבת RCA הבסיסית (איור 2 ד).
אימות נכונה של BBB מודל תמיד דורש מדידת TEER וזה יכול להיות מאושר על ידי הערכת יישום P חוצה BBB של נותב חדירות נמוכות, כגון FD40.
ערכי TEER, רשמו לאורך תקופת שיתוף התרבות, מייצגים את האינדיקציה הברורה הראשונה של ההיווצרות הנכונה של מחסום אנדותל. שלושה ימים לאחר זריעת RBMEC, שנרשם TEER, מפחית את TEER של מוסיף האסטרוציטים נושאות, הוא בעיקר בשל תרומתו של השכבה הלא electrogenic של RCAs והשכבה המתפתחת של RBMECs. בנקודה זו בזמן, BBB שלנו נותן ערכים הנעים בין 20 ל 40 Ω x 2 ס"מ. בימים הבאים, בדרך כלל בין ה 4 ואת יום ה -5 של תרבות משותפת, את TEER ערכי עלייה בגלל היווצרות של צמתים הדוקים בין תאי אנדותל סמוכים 14 והגיע הערכים בדרך כלל בין 55 ל 110 Ω x 2 ס"מ, ו במקרים חריגים הייgher ערכים 14. הערכים הנמדדים היום 4 th / ה -5 של התרבות המשותפת להישאר יציבים לפחות עד ה -7 - יום ה -8 לפני שהם מתחילים להקטין; ולכן, יש חלון זמן צר מאוד זמין עבור התחייבות הניסויים טרנס-BBB שטף.
בין ה 5 ואת יום ה -7 של תרבות משותפת, על שלמות דגמים ניסיוניים יכול להיות מאושרת על ידי הערכת חדירות FD40 טרנס-BBB. איור 3 מראה דוגמה של השטף טרנס-BBB של FD40 (1 מ"ג / מ"ל ) בהשוואה השטף ברחבי מוסיף ריק, מעל 3 שעות של דגירה; BBBS נמצאים היום ה -6 של שיתוף התרבות ואת TEER המוקלט 55.6 ± 15.8 Ω ס"מ 2 (ממוצע ± SE, n = 3). השטף הוא ליניארי בין 1 ל 3 שעות של דגירה ואת האפליקציה P הממוצע מחושב בין 1 ל 2 שעות, ובין 2 ו -3 שעות של הדגירה0.12 ± 0.01 x 10 - 6 ס"מ שניות - 1 (± SE, n = 6).
לאחר לפחות שלושה רצופים BBBS המוצלח, מבחינת TEER ו FD40 P אפליקציה, התקבלו בניסויים עצמאיים למדידת חדירות נותבו ניתן להימנע; עם זאת, TEER תמיד צריך להיות מוקלט עבור כל ניסוי.
חדירות טראנס-BBB של מולקולות ניאון ואת השפעת nanocomplex על מסירתם יכולים להיחקר באמצעות עכברוש מודלי BBB שתוארו לעיל. איור 4 מראות את החלחול של צבע המודל FITC על אנקפסולציה ב FNN ברחבי BBBS עם TEER של 100.4 ± 3.5 Ω ס"מ 2 (n = 16) ליום ה -7 של שיתוף התרבות. היסטוגרמות, מייצג ריכוז FITC בתא התחתון לאחר 7 ו -24 שעות מהתוספת של צבע בחינם או nanoformulatedבתא העליון, עולה כי FNN הוא מסוגל להגדיל את אספקת FITC משמעותי על פני BBB.
תמונות מיקרוסקופ Confocal של הצד העליון של הכנס לאחר 7 ו -24 שעות של דגירה עם FITC-FNN (איור 5 א, ג) או FITC (איור 5 ב ', ד') מראים כי בעוד FITC חינם לא הפנימו ידי RBMECs, הטעינה שלה לתוך FNN מאפשר זאת כדי להזין את התאים.
לפני עיבוד מוסיף עבור מיקרוסקופיה confocal, בדיקה נוספת של TEER יש צורך להבטיח אין תופעות בתיווך FNN על שלמות BBB.
איור 1:. זריעת תאים על הוספת RCA (א) ו RBMEC (B) הליך זריעה על שני צדי המתרס שלמחדיר הצלחת רב היטב. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 2:. תמונות מיקרוסקופ אופטי של RCAs ו RBMVECs על הוספת והתוספות זורעים עם RCAs ו RBMECs הם נצפו עם מיקרוסקופ אור (זום אופטי 20X). (א) ארבע שעות לאחר זריעה, עגול RCAs שקוף מחוברים בעליל על פני השטח התחתון של הכנס; (ב) RCAs בצורת כישור גלוי על 3 היום השלישי של תרבות; (C) העגול RBMECs השקוף מחוברים בצד העליון של הכנס לאחר 3 שעות של דגירה; (ד) ביום 4 th של התרבות המשותפת הן המשטחים של הכנס מכוסה לחלוטין עם תאים, ואת נחו שניERS לא מובחן בקלות. סרגל קנה מידה = 100 מיקרומטר. לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 3:. FD40 שטף ברחבי BBB שטף של FD40 (1 מ"ג / מ"ל) מהמפלס העליון אל הצד התחתון של מערכת BBB במבחנה, בהשוואה לזו ברחבי הכנס ריק. כמות FD40 בתא התחתון כבר נמדד ב 60, 120 ו -180 דקות לפרסם תוספת של צבע לתא העליון. אמצעי ± SE; n ° מחדיר = 3. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 4: השפעת Encapsulation FNN על חלחול FITC מעבר ריכוז BBB של FITC בתא התחתון של מערכת BBB במבחנה מחושב ב -7 ו -24 שעות לאחר תוספת של FITC או FITC-FNN לתוך החדר העליון.. ממוצע ± SE של 4-5 משכפל; **** P <0.0005, FITC-FNN vs. FITC (מבחן t). נא ללחוץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 5: מיקרוסקופיה Confocal של RBMECs על הוספת micrographs לייזר סריקה Confocal (סעיפים אופטי בודד) של RBMECs לאחר 7 שעות (A, B) או 24 שעות (C, D) של הדגירה עם חופשי FITC (B, C) או FITC. -FnN (A,
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
שיטת מחקר in vitro המתוארת כאן מייצגת גישה תוקף שימושית כדי לחקור מתן טרנס-BBB של מולקולות ניאון על nanoformulation עם חלקיקים. כאן אנו משתמשים FNN, מייצגת מועמד טוב כדי ללמוד את טרנסלוקציה של מולקולות מטען ברחבי BBB. FNN נחשבת nanovector הזהב למסירה טרנס-BBB של סמים / סוכנים שכן הוא מוכר במיוחד ידי הקולטן TfR1, אשר באה לידי ביטוי על הממברנה luminal של BMECs ומתווך את ספיגת ננו-חלקיקים באמצעות מסלול הפנמה קולטן בתיווך. יתר על כן, FNN הוא ננו-חלקיק טבעי ויש לו ולכן פרופיל biocompatibility טוב. לבסוף, FNN הוא מסוגל לתמצת מולקולות נמוך מימד hydrosoluble ידי מנגנון פשוט ויעיל. חלחול טרנס-BBB מסוגים שונים אחרים של חלקיקים אורגניים או אנאורגניים ניתן להעריך גם עם פרוטוקול זה, על פי כמה שיקולים לגבי תכונות חלקיקים. p ראשיתrerequisite ללמוד את החלחול של תרופות / סוכני nanoformulated הוא הבטיחות של ננו-החלקיקים והמבוטלים. נושא מכריע נוסף הוא האינטראקציה של ננו-חלקיקים נחקרו עם מסנן PET. היבט זה, יש להיבדק באופן ראשוני על מנת לכלול שמירה משמעותית לתוך הנקבוביות הממברנה ולהימנע שינויים של החלחול שלהם ברחבי BBB. הקבוצה שלנו מעסיקה לאחרונה את האסטרטגיה המוצעת ללמוד ננו-חלקיק תחמוצת ברזל מצופה פולימר כמערכת משלוח טרנס-BBB לתרופות תרופתיות שכותרתו פלואורסצנטי 14. במקרה כזה, אנו נשייך לוקליזציה במיקרוסקופ אלקטרונים של nanoformulations ב RBMECs אל גילוי הקרינה. יתר על כן, מאוד אחרות שיטות אבחון רגישות, כגון מצמידי אינדוקטיבי פלזמה (ICP) -MS יכול להיות מועסק על מנת להעריך את משלוח טרנס-BBB של ננו האורגני.
מודל BBB במבחנה להשתמש בפרוטוקול זה מבוסס על שיתוף התרבות של BMECs העכברוש האסטרוציטים. בתרחיש הרחב של הדגמים BBB 10,11,12, שחלקם תוארו במדויק בספרות עם פרוטוקול היטב מפורט 15, המודל שלנו מהווה אלטרנטיבה באיכות טובה. ואכן, למרות שנרשם TEER היה מתחת הסטנדרטים הטובים ביותר הציע בספרות (150-200 Ω סנטימטר 2) 10, חדירות טראנס-BBB של הממד נותב הגבוה Dextran 40 הייתה בהסכמה מוחלטת עם ההיווצרות של מחסום חזק.
מודל במבחנה זה, שהושג עם BMECs עכברוש זמין מסחרי האסטרוציטים, יש כמה יתרונות: (1) יעיל לצמיחה אופטימלית של תאי אנדותל, (2) פרק הזמן מתאים לייצור מודל BBB הסופי (לא יותר מ 13 ימים), (3) עמידת סוגיות אתיות, הימנעות משימוש תאים מרקמות מוח אנושיות (חומרי נתיחה, דגימות כירורגית, ורקמות עובריות) ו -4) חסכון של זמן ועלויות הקשורות לדיור בעלי חיים, ועיקרימיצוי תאים. עם זאת, מגבלה של המודל הנוכחי קשורה העלויות הגבוהות של RBMECs הלא הנציח העיקרי, אשר יש לרכוש (קפואות ב מעבר אחד) עבור כל הגדרה ניסיונית. ואכן, המחקרים הראשוניים שלנו ייצור BBB הוכיחו שהיכולת של תאי האנדותל לייצר חזק BBB מזוהה לחלוטין עם מספר הקטעים בתרבות של RBMECs לאחר ההפשרה שלאחר הרכישה הראשונה. יישום נוסף של מודל BBB המתואר כאן עם תוספי אנדותל, כגון מחנה הידרוקורטיזון, יכול להיחשב על מנת לשפר אטימות אנדותל ולהגדיל ערכי TEER. 10,11,16
הטכניקה הנוכחית קשורה לאפשרות לנצל מודל BBB יחיד עבור מבחנים שונים, ובכך לספק כמה ערכות נתונים מכל הגדרה ניסיונית. עם מערכת BBB יחידה חשופות מולקולות ניאון בחינם או nanocomplexed, זה אפשרי: (1) כדי למדוד הדואר השטף טרנס מחסום של מולקולה על ידי ניתוח עוצמת הקרינה של aliquots sECM שנאספו בתא התחתון בנקודות זמן שונות של דגירה; (2) לחקור את הפנמת בתיווך ננו של המולקולות RBMECs וסחר תאיים שלהם על ידי ניתוח מיקרוסקופיה confocal של תאים על מוסיף; (3) כדי לקבל אינדיקציה על מצב התאים BBB בחשיפה אל nanoformulations, על ידי מדידת TEER בסוף הניסוי או על ידי ניתוח שלמות האנדותל על ידי מיקרוסקופית אלקטרונים.
לסיכום, כאן אנו תארנו פרוטוקול לחקר החלחול של מולקולות ניאון nanocomplexed פני מודל במבחנה איכותי BBB ב. אנו רואים מתודולוגיה זו כלי שימושי עבור חוקר את השפעת nanoformulation על משלוח סמים ברחבי BBB.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Rat Brain Microvascular Endothelial Cells | Innoprot | P10308 | isolated from Sprague Dawley rat brain tissue, cryopreserved at passage one and delivered frozen |
| Cortical Astrocytes | Innoprot | P10202 | isolated from 2 days rat brain tissue, cryopreserved at passage one and delivered frozen. |
| Endothelial Cell Medium kit | Innoprot | P60104 | ECM (500 ml) and fetal bovin serum (25 ml), endothelial cell growth supplement (5 ml) and penicillin/streptomycin (5 ml). Warm in 37 °C water bath before use and protect from light |
| Trypsin-EDTA without Phenol Red | EuroClone | ECM0920D | Warm in 37 °C water bath before use |
| Fluorescein isothiocyanate-dextran 40,000 | Sigma | FD40S | protect from light |
| paraformaldehyde | Sigma | 158127 | diluition in chemical hood |
| Dulbecco's phosphate buffer saline w/o Ca and Mg | EuroClone | ECB4004L | |
| Triton X-100 | Sigma | T8787 | |
| bovine serum albumin | Sigma | A7906 | |
| goat serum | EuroClone | ECS0200D | |
| mouse monoclonal anti-Von Willebrand Factor | Dako | M0616 | |
| AlexaFluor 546-conjugated antibody against mouse IgGs | ThermoFischer Scientific | A-11003 | protect from light |
| DAPI (4’ ,6-diamidino-2-phenylindole) | ThermoFischer Scientific | D1306 | protect from light |
| ProLong Gold Antifade Mountant | ThermoFischer Scientific | P36934 | |
| Poly-L-lysine Hydrobromide | Sigma | P1274 | the same solution can be used several times |
| fibronectin from bovine plasma | Sigma | F1141 | the same solution can be used several times |
| Polyethylene terephthalate (PET) inserts | Falcon | F3090 | Transparent Polyethylene terephthalate (PET) membranes; surface area: 4.2 cm2; pore size 0.4 µm/surface area |
| T75 Primo TC flask | EuroClone | ET7076 | |
| T175 Primo TC flask | EuroClone | ET7181 | |
| EVOM2 Epithelial Tissue Volt/Ohmmeter | World Precision Instruments Germany | EVOM2 | |
| Endohm- 24SNAP cup | World Precision Instruments Germany | ENDOHM-24SNAP | |
| Light/fluorescence microscope with camera | Leica Microsystems | DM IL LED Fluo/ ICC50 W Camera Module | inverted microscope for live cells with camera |
| Confocal Microscope | Leica Microsystems | TCS SPE | |
| Spectrofluorimeter | Jasco | FP-8000 |
References
- Banks, W. A. Characteristics of compounds that cross the blood-brain barrier. BMC Neurol. 9 (1), 3 (2009).
- Löscher, W., Potschka, H. Drug resistance in brain disease and the role of efflux transporters. Nat Rev Neurosci. 6, 591-602 (2005).
- Xu, G., Mahajan, S., Roy, I., Yong, K. -T. Theranostic quantum dots for crossing blood-brain barrier in vitro and providing therapy of HIV-associated encephalopathy. Front Pharmacol. 15 (4), 140 (2013).
- Masserini, M. Nanoparticles for Brain Drug Delivery. ISRN Biochem. , (2013).
- Sagar, V., Pilakka-Kanthikeel, S., Pottathil, R., Saxena, S. K., Nair, M. Towards nanomedicines for neuroAIDS. Rev. Med. Virol. 24 (2), 103-124 (2014).
- Kreuter, J. Drug delivery to the central nervous system by polymeric nanoparticles: What do we know. Adv. Drug Deliver. Rev. 71, 2-14 (2014).
- Arosio, P., Ingrassia, R., Cavadini, P. Ferritins: a family of molecules for iron storage, antioxidation and more. Biochim. Biophys. Acta. 1790 (7), 589-599 (2009).
- Jääskeläinen, A., Soukka, T., Lamminmäki, U., Korpimäki, T., Virta, M. Development of a denaturation/renaturation-based production process for ferritin nanoparticles. Biotechnol. Bioeng. 102 (4), 1012-1024 (2009).
- Jefferies, W. A., Brandon, M. R., Hunt, S. V., Williams, A. F., Gatter, K. C., Mason, D. Y. Transferrin receptor on endothelium of brain capillaries. Nature. 312, 162-163 (1984).
- Deli, M. A., Abraham, C. S., Kataoka, Y., Niwa, M. Permeability studies on in vitro blood-brain barrier models: physiology, pathology, and pharmacology. Cell. Mol. Neurobiol. 25 (1), 59-127 (2005).
- Wilhelm, I., Fazakas, C., Krizbai, I. A. In vitro models of the blood-brain barrier. Acta Neurobiol. Exp. (Wars). 71, 113-128 (2011).
- Wilhelm, I., Krizbai, I. A. In vitro models of the blood-brain barrier for the study of drug delivery to the brain. Mol Pharm. 11 (7), 1949-1963 (2014).
- Bellini, M., et al. Protein nanocages for self-triggered nuclear delivery of DNA-targeted chemotherapeutics in Cancer Cells. J. Control. Release. 196, 184-196 (2014).
- Fiandra, L., et al. Nanoformulation of antiretroviral drugs enhances their penetration across the blood brain barrier in mice. Nanomedicine. 11 (6), 1387-1397 (2015).
- Molino, Y., Jabès, F., Lacassagne, E., Gaudin, N., Khrestchatisky, M. Setting-up an in vitro model of rat blood-brain barrier (BBB): a focus on BBB impermeability and receptor-mediated transport. J. Vis. Exp. , e51278 (2014).
- Perrière, N., et al. A functional in vitro model of rat blood-brain barrier for molecular analysis of efflux transporters. Brain Res. 1150, 1-13 (2007).
