Introduction
La resistenza del sistema nervoso centrale (SNC) malattie (es. Cancro, epilessia, depressione, schizofrenia e disturbo neurologico HIV-associato) alle terapie farmacologiche è dovuto a diversi meccanismi diversi, tra cui arduo permeazione farmaco attraverso la barriera emato-encefalica (BBB) . La BBB è il confine che isola i tessuti cerebrali da sostanze circolanti nel sangue. All'interno di questa barriera, uno strato di cellule microvascolari cerebrali endoteliali (BMECs), supportati da periciti e astrociti endfeet, è responsabile per l'alta selettività della BBB a tali farmaci idrosolubili con un peso molecolare superiore a 400 Da 1. Un altro meccanismo di resistenza connessa alla droga è legata alla presenza sul BMECs di trasportatori di efflusso di droga (P-glicoproteina e multidrug resistance proteine), che co-operano per ridurre la penetrazione farmaco nel sistema nervoso centrale e facilitare la loro espulsione dal cervello 2.
Nell'ultima decade, Sono stati sviluppati un gran numero di approcci nanotecnologici per affrontare la sfida clinico e biologico di fornire farmaci attraverso la BBB 3-6. In questo contesto, nanosfere ferritina (FNN) rappresentano una soluzione completamente innovativa e promettente. FNN sono 12 sfere nm di 24 auto-assemblaggio ferritina (Fn) monomeri, che sono disposti in una struttura sferica cava di diametro interno 8 nm. subunità ferritina possono essere smontati a pH acido e riassemblate in un modo a memoria di forma, portando il pH a neutralità, permettendo varie molecole organiche per essere incapsulati. Pertanto, FNN rappresentano un modello interessante per lo sviluppo di multifunzionale drug delivery sistemi 7,8. Inoltre, FNN può interagire con BMECs grazie al riconoscimento specifico di transferrina Receptor (TfR) 1, che è espresso sulla membrana luminale di queste cellule 9.
Finora, diversi modelli in vitro della BBB sono stati sviluppati in order per chiarire trans-BBB permeabilità ai vari farmaci, tossicità verso la BBB, o l'interazione di molecole con trasportatori di efflusso. Infatti, questi modelli sono considerati validi in vitro approcci per un rapido screening di molecole attive prima di procedere con studi in vivo. Questi modelli sono costituiti da un singolo strato endoteliale dei BMECs o BMECs e astrociti co-coltura (più raramente periciti), ottenuto da animali (ratti, topi, maiali e bovini) o linee cellulari umane 10,11,12. Il transendoteliale Resistenza elettrica (TEER) e la permeabilità apparente (P app) di traccianti con un peso molecolare definito rappresentano due parametri critici che vengono utilizzati per determinare la qualità del modello in vitro. Qui si descrive l'impiego di un modello BBB in vitro, sulla base di una co-coltura di ratto BMECs (RBMECs) e nel ratto astrociti corticali (RCA) per studiare la permeazione trans-BBB di nanocages ferritina incapsulare isothi fluoresceinaocyanate (CIC).
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Protocol
1. Stabilire il modello BBB
Nota: Per stabilire il modello BBB si consiglia di utilizzare commercialmente disponibili RBMECs primarie e RCA. Tutte le operazioni devono essere eseguite con i reagenti e prodotti monouso sterili, trattati in una cappa a flusso laminare.
- Coltura cellulare
- Coat fiasche di coltura cellulare con poli-L-lisina 100 mg / ml (1 ora a RT) o fibronectina 50 mg / ml (1 ora a 37 ° C) per promuovere l'attaccamento di RCA o RBMECs, rispettivamente. Poi, disgelo 1 x 10 6 RCA e 5 x 10 5 RBMECs in cellule endoteliali medio, integrati con il 5% di siero fetale bovino, 1% supplemento di crescita delle cellule endoteliali e l'1% di penicillina / streptomicina (SECM). RCA seme in un pallone T175 in 20 ml SECM e RBMECs in un pallone T75 in 10 ml SECM.
Nota: Lo scongelamento e passaggi semina di RCA e RBMECs devono essere regolati, in termini di densità cellulare e tempo di coltura, in base al numero di condizioni sperimentali da testare con il modello BBB. Con l'iniziore con 1 fiala di 1 x 10 6 RCA e 1 fiala di 5 x 10 5 RBMECs, è possibile avere fino a 20 inserti BBB-cuscinetto. - Mantenere le cellule a 37 ° C e 5% CO 2 in atmosfera umidificata per circa 6 giorni, fino a circa 80% di confluenza per RCA e oltre il 90% di confluenza per RBMECs. Staccare cellule utilizzando soluzione tripsina-EDTA (tripsina 1: 250) per 5 min (1 ml tripsina per palloni T75 e 2 ml per palloni T175). Interrompere l'attività tripsina con SECM (2: 1), sospensioni di cellule centrifugare a 750 g per 5 minuti e risospendere il pellet in 60 ml SECM.
- Dividere le RBMECs in 3 palloni T175 e la cultura in SECM per altri 3 giorni prima della semina su inserti. Contare il numero totale di RCA vivente, osservando una sospensione cellulare diluita 1: 1 con trypan blu al microscopio ottico in una camera di Burker.
- Coat fiasche di coltura cellulare con poli-L-lisina 100 mg / ml (1 ora a RT) o fibronectina 50 mg / ml (1 ora a 37 ° C) per promuovere l'attaccamento di RCA o RBMECs, rispettivamente. Poi, disgelo 1 x 10 6 RCA e 5 x 10 5 RBMECs in cellule endoteliali medio, integrati con il 5% di siero fetale bovino, 1% supplemento di crescita delle cellule endoteliali e l'1% di penicillina / streptomicina (SECM). RCA seme in un pallone T175 in 20 ml SECM e RBMECs in un pallone T75 in 10 ml SECM.
- Cellulare Semina su Inserti
- Trattare un lato del tereftalato di polietilene (PET) membrana 6 multi-ben traspainserti ORL con poli-L-lisina 100 ug / ml e l'altro lato con fibronectina 50 pg / ml, per consentire fissaggio di RCA e BMECs. Maniglia gli inserti con pinzette per evitare il contatto con la membrana PET.
- Mettere gli inserti in una piastra 6 bene e aggiungere la soluzione fibronectina (minimo 500 microlitri) nella camera superiore. Dopo 1 h di incubazione a 37 ° C, rimuovere la soluzione di fibronectina, prendere gli inserti fuori la piastra multi-pozzo e metterli capovolta sul fondo di un 150 centimetri piatto 2 Petri, che viene qui utilizzato come supporto sterile per la già ricoperto gli inserti.
- Delicatamente aggiungere 800 ml di poli-L-lisina sul lato inferiore dell'inserto (come mostrato in figura 1A, denominato RCA semina), e mantenere la soluzione sugli inserti per 1 ora a RT.
- Aspirare la soluzione e lasciare gli inserti asciugare a temperatura ambiente per 15-30 minuti. Gli inserti sono ora pronti per la semina delle cellule, ma possono anche essere memorizzati nella piastra multi-bene per diversigiorni a 4 ° C, prima di proseguire con la costruzione BBB.
Nota: Ricordarsi di mantenere almeno 3 inserti rivestiti libera dalle cellule, per essere utilizzati come controlli per convalidare stabilimento BBB da FD40 misure di flusso.
- RCA Seed (35.000 / cm 2) sul lato inferiore degli inserti poli-L-lisina rivestite, facendo cadere 800 ml di sospensione cellulare sul capovolto inserto (Figura 1A). Lasciare la sospensione RCA sugli inserti per 4 ore a temperatura ambiente, al fine di consentire l'attaccamento efficiente delle cellule alla membrana.
- Aspirare la soluzione residua, posizionare gli inserti in pozzetti contenenti 2 ml di SECM e mantenere la piastra multi-pozzo a 37 ° C e 5% CO 2 in atmosfera umidificata, cambiando il SECM ogni 2 giorni.
- Dopo 3 giorni, quando le RCA sono rivestite con la faccia inferiore dell'inserto, RBMECs seme sul lato superiore dell'inserto, nel seguente modo:
- Staccare RBMECs da fiasche T175 e contare ilcellule viventi totale, come riportato nei passi 1.1.2 e 1.1.3.
- RBMECs Seed (60.000 / cm 2) sulla superficie superiore dell'inserto in SECM (1.000 ml) (Figura 1B), lasciando 3 inserti con solo le astrociti, da utilizzare come TEER sfondo. Posizionare la piastra multi-bene in condizioni di coltura standard. Mantenere il sistema di coltura per almeno 3 giorni, cambiando la SECM nella camera interna ed inferiore ogni 2 giorni.
- Trattare un lato del tereftalato di polietilene (PET) membrana 6 multi-ben traspainserti ORL con poli-L-lisina 100 ug / ml e l'altro lato con fibronectina 50 pg / ml, per consentire fissaggio di RCA e BMECs. Maniglia gli inserti con pinzette per evitare il contatto con la membrana PET.
2. Convalida BBB
- misura TEER
- Il giorno 3 ° di co-coltura, controllare la TEER inserendo gli inserti BBB-cuscinetto in una camera appropriata (che ha un tetto e dove sia da camera e berretto contengono una coppia di tensione di rilevamento e elettrodi di corrente), pieno di 4 ml di SECM. Connessione a una epiteliale tessuto volt / ohmetro.
- Insieme con le misure TEER della BBB-sistemi cellulari, registrare i valori TEER dei 3 inserti recanti i RCA Tha saranno sottratti dai valori ottenuti con il BBBs. Moltiplicare i valori TEER risultanti dalla superficie dell'inserto (4.2 cm 2) per esprimere i risultati come Ω x cm 2.
- Dal 3 ° giorno di co-coltura, misurare la TEER ogni giorno. Nota: Dopo un periodo iniziale in cui aumenta la TEER, i valori registrati sono stabili per almeno due giorni consecutivi (di solito tra il 5 ° e il 7 ° giorno di co-coltura). A quel punto la BBB è pronto per la seconda fase di validazione (sezione 2.2) e / o per gli esperimenti trans-BBB.
Nota: La procedura descritta nella sezione 2.1 può essere effettuata sugli stessi BBB-sistemi dedicati ai seguenti esperimenti permeabilità (sezione 3). Operare in condizioni sterili.
- Trans-BBB flusso di FITC-destrano 40 (FD40)
- Misurare il flusso FD40 dalla tomaia alla camera inferiore dei modelli BBB rispetto a quella di tutti 3 inserti vuoti(Vedi nota sezione 1.2.1) secondo le seguenti fasi:
- Aggiungere 1 mg / ml FD40 (diluito in SECM) nel vano superiore del BBBs, e dopo 1, 2 e 3 ore ritirare 200 microlitri SECM dalla camera inferiore e misurare l'intensità di fluorescenza dai spettrofluorimetro (λ ex 488 nm, λ em 515 nm, fessura 5).
- Ottenere i valori per SECM sfondo fluorescenceby, di 500 l di media vergine utilizzando gli stessi parametri analitici. Sottrarre la fluorescenza di fondo SECM da tutti i valori di fluorescenza FD40.
- Determinare la quantità di permeato FD40 per confronto dei valori di fluorescenza osservati con una curva di calibrazione prodotto con concentrazioni note (es. 0,312, 0,625, 1,25, 2,5 mg / ml) di tracciante fluorescente sciolti in 500 ml di SECM.
- Calcolare il coefficiente di permeabilità apparente (P app) dai valori medi di flusso secondo:
P app = J / AC
2) e C è la concentrazione della molecola nel compartimento superiore (moli / cm 3).
Nota: Tre o più BBB-sistemi che hanno raggiunto valori TEER adatti, devono essere dedicati esclusivamente a questa procedura di convalida, e non dovrebbero essere impiegati per i seguenti esperimenti permeabilità (sezione 3). La sterilità non è obbligatorio.
- Misurare il flusso FD40 dalla tomaia alla camera inferiore dei modelli BBB rispetto a quella di tutti 3 inserti vuoti(Vedi nota sezione 1.2.1) secondo le seguenti fasi:
3. Trans-BBB permeazione di FITC-caricato ferritine (FNN)
Nota: Una variante ricombinante di ferritina umana (Fn), prodotto in Escherichia coli e assemblati in nanocages (FNN) per l'incapsulamento di molecole fluorescenti differenti, è disponibile presso la NanoBioLab del Prof. Prosperi (Università degli Studi di Milano-Bicocca, Italia). FNN sono caricati con FITC, secondo il protocollo descritto in precedenza 13 e le concentrazioni sia Fn e le molecole caricate sono accuratamente determined.
- Trans-BBB flusso di FITC e FITC-FNN
- Misurare il flusso FITC-FNN dalla tomaia alla camera inferiore di modelli BBB convalidati (generalmente al 5 ° - 7 ° giorno di co-coltura), rispetto a quella del colorante libero dopo 7 e 24 h di incubazione, secondo le seguenti operazioni:
- Aggiungere FITC-FNN (50 ug / ml FNN, 1.1 pM FITC) o una quantità uguale di connessione FITC nella camera superiore di almeno 6 sistemi BBB per ogni formulazione, per ritirare 2 ml di soluzione di SECM dalla camera inferiore almeno 3 inserti dopo 7 ore, e dalla camera inferiore di altri 3 inserti dopo 24 ore.
- Misurare l'intensità di fluorescenza di 500 ml di campioni raccolti da spettrofluorimetro (λ ex 488 nm, λ em 515 nm, fessura 5).
- Ottenere la fluorescenza di fondo SECM misurando 500 microlitri di media utilizzando gli stessi parametri analitici. Sottrarre la fluorescenza di fondo SECMda tutti i valori di fluorescenza FITC o FITC-FNN.
- Determinare la concentrazione di permeato FITC o FITC-FNN confrontando i valori di fluorescenza ottenuti con due differenti curve di calibrazione ottenuti con concentrazioni note (es. 6,87, 13,75, 27,5, 55 nM) del colorante libero o nanoformulated sciolti in 500 microlitri SECM.
- Misurare il flusso FITC-FNN dalla tomaia alla camera inferiore di modelli BBB convalidati (generalmente al 5 ° - 7 ° giorno di co-coltura), rispetto a quella del colorante libero dopo 7 e 24 h di incubazione, secondo le seguenti operazioni:
- FITC-FNN Localizzazione in RBMECs
- Rimuovere SECM dalla camera superiore dei sistemi BBB, lavare gli inserti con PBS e fissare le RBMECs su almeno due inserti per ogni gruppo sperimentale aggiungendo 500 microlitri paraformaldeide (4% in tampone fosfato salino-PBS) nello scomparto superiore per 10 min a RT.
- Lavare gli inserti tre volte con PBS per rimuovere paraformaldeide residuo.
Nota: Da questo punto in poi, la sterilità non è necessario. - Tagliare adeguati pezzi della membrana PET, e procedere con la immunodecoration delle cellule secondo le seguenti fasi:
- permeabilitàlize RBMECs con 0,1% Triton X-100 in PBS per 10 minuti. Eseguire una fase di blocco per 1 ora a RT con una soluzione contenente 2% di albumina sierica bovina (BSA), 2% di siero di capra in PBS. Incubare i campioni con un Willebrand fattore anti-Von (VWF) a 1:20 di diluizione, per 2 ore a temperatura ambiente.
- Dopo aver lavato tre volte con PBS, esporre le cellule per 2 ore a temperatura ambiente ad una BSA 2%, soluzione al 2% siero di capra contenente un anticorpo secondario adatto ad una diluizione 1: 300 per rivelare l'anti-VWR e DAPI a 1: 1.500 diluizione per il rilevamento dei nuclei.
- Montare i pezzi inserto su vetrini da microscopio utilizzando una soluzione di montaggio Antifade (una goccia al frammento di inserimento), quindi chiudere il campione con un vetrino. Analizzare mediante microscopia confocale utilizzando un obiettivo a immersione in olio a 40X di ingrandimento, 1.5 zoom e risoluzione 1.024 x 1.024 pixel.
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Representative Results
Durante la creazione del modello di BBB, l'attaccamento cellulare e la crescita sugli inserti possono essere monitorati utilizzando un microscopio ottico, grazie alla natura trasparente delle membrane in PET. RCA, seminate ad una densità di 35.000 cellule / cm 2, collegare in modo efficiente al lato inferiore dell'inserto dopo 4 ore di incubazione a RT (Figura 2A) e crescere per coprire la superficie della membrana in 3 giorni, prendendo una morfologia fusiforme (Figura 2B). RBMECs, seminate ad una densità di 60.000 cellule / cm 2, sono visibilmente attaccato alla faccia superiore della membrana PET dopo circa 3 ore di incubazione a 37 ° C (Figura 2C). Lo strato RBMEC sviluppo può essere difficile visualizzare nei giorni successivi con un microscopio ottico, a causa della sovrapposizione con lo strato sottostante RCA (Figura 2D).
Una corretta validazione del BModello BB richiede sempre misurazione TEER e questo può essere confermato valutando il P app trans-BBB di una bassa permeabilità tracciante, ad esempio FD40.
I valori Teer, registrati nel corso del periodo di co-cultura, rappresentano il primo chiara indicazione della corretta formazione della barriera endoteliale. Tre giorni dopo la semina RBMEC, il TEER registrata, sottratto TEER degli inserti astrociti-cuscinetto, è dovuto principalmente al contributo dello strato non-elettrogenico del RCA e lo strato di sviluppo RBMECs. A questo punto di tempo, la nostra BBB dà valori compresi tra 20 e 40 Ω x cm 2. Nei giorni successivi, di solito tra il 4 ° e il 5 ° giorno di co-coltura, il TEER valori aumento a causa della formazione delle giunzioni strette tra le cellule endoteliali adiacenti 14, raggiungendo valori di solito tra 55 e 110 Ω x cm 2, e in casi eccezionali higher Valori 14. I valori misurati al 4 ° / 5 ° giorno di co-coltura rimangono stabili almeno fino al 7 ° - 8 ° giorno prima di iniziare a diminuire; Pertanto, vi è una finestra temporale molto stretta disponibili per intraprendere gli esperimenti trans-BBB flusso.
Tra il 5 ° e il 7 ° giorno di co-coltura, l'integrità dei modelli sperimentali può essere confermata valutando la permeabilità FD40 trans-BBB. Figura 3 mostra un esempio del flusso trans-BBB di FD40 (1 mg / ml ), rispetto al flusso attraverso inserti vuoti, oltre 3 ore di incubazione; il BBBs sono al 6 ° giorno di co-coltura e la TEER registrato è di 55,6 ± 15,8 Ω cm 2 (media ± SE, n = 3). Il flusso è lineare tra 1 e 3 ore di incubazione e l'applicazione medio P calcolata tra 1 e 2 ore, e tra 2 e 3 ore di incubazione è0.12 ± 0.01 x 10 - 6 centimetri sec - 1 (± SE, n = 6).
Una volta almeno tre consecutivi di successo BBBs, in termini di TEER e FD40 P app, sono stati ottenuti in esperimenti indipendenti la misura della permeabilità tracciante può essere evitato; tuttavia, il TEER ha sempre bisogno di essere registrato per ogni esperimento.
La permeabilità trans-BBB di molecole fluorescenti e l'effetto del nanocomplex su una consegna possono essere studiati usando ratto modelli BBB sopra descritti. Figura 4 mostra la permeazione del modello colorante FITC upon incapsulamento in FNN tutti BBBs con TEER di 100,4 ± 3,5 Ω cm 2 (n = 16) al 7 ° giorno di co-coltura. Gli istogrammi, che rappresenta la concentrazione FITC nella camera inferiore dopo 7 e 24 ore l'aggiunta di colorante libero o nanoformulatednel vano superiore, indicano che FNN è in grado di aumentare significativamente la consegna del FITC attraverso la BBB.
Immagini al microscopio confocale del lato superiore dell'inserto dopo 7 e 24 ore di incubazione con FITC-FNN (Figura 5A, C) o FITC (Figura 5B, D) mostrano che mentre libera FITC non viene internalizzato dal RBMECs, il suo caricamento nel il FNN permette di entrare nelle cellule.
Prima di elaborare gli inserti per microscopia confocale, un ulteriore controllo della TEER è necessario per garantire che non vi sono effetti FNN-mediati su integrità BBB.
Figura 1: Cell. Semina su Inserti RCA (A) e RBMEC (B) Procedura semina sui due lati oppostigli inserti piastre a più pozzetti. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 2:. Microscopio ottico Immagini di RCA e RBMVECs su inserti Inserti seminati con RCA e RBMECs sono osservati con un microscopio ottico (20x zoom ottico). (A) Quattro ore dopo la semina, rotondo e RCA traslucidi sono visibilmente fissati alla superficie inferiore dell'inserto; RCA a forma di mandrino (B) sono visibili il giorno 3 ° della cultura; (C) Round e RBMECs traslucidi sono attaccati sul lato superiore dell'inserto dopo 3 ore di incubazione; (D) Il 4 ° giorno di co-coltura sia le superfici dell'inserto sono completamente ricoperta di cellule, e le due layERS non sono facilmente distinguibili. Scala bar = 100 micron. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 3:. FD40 Flux attraverso la BBB Flusso di FD40 (1 mg / ml) dalla parte superiore alla parte inferiore del sistema di BBB in vitro, rispetto a quello attraverso l'inserto vuoto. La quantità di FD40 nella camera inferiore è stato misurato a 60, 120 e 180 min posta l'aggiunta del colorante alla camera superiore. Significa ± SE; n ° inserisce = 3. Fate clic qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 4: Effetto del FNN incapsulamento sulla FITC permeazione attraverso la BBB Concentrazione FITC nella camera inferiore del sistema BBB in vitro calcolata a 7 e 24 ore dopo l'aggiunta di FITC o FITC-FNN nella camera superiore.. Media ± SE di 4-5 repliche; **** P <0.0005, coniugati con FNN vs. FITC (test t). Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 5: Microscopia confocale di RBMECs su inserti confocale microscopio a scansione laser (sezioni ottiche singoli) di RBMECs dopo 7 ore (A, B) o 24 ore (C, D) di incubazione con FITC (B, C) o FITC. -FnN (A,
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Discussion
Il metodo in vitro qui descritto rappresenta un approccio utile convalidato per studiare la consegna trans-BBB di molecole fluorescenti su nanoformulation con le nanoparticelle. Qui usiamo FNN, che rappresenta un buon candidato per studiare la traslocazione di molecole cargo attraverso la BBB. FNN è considerato il Nanovector d'oro per trans-BBB consegna della droga / agenti in quanto è espressamente riconosciuto dal recettore TfR1, che si esprime sulla membrana luminale di BMECs e media l'assorbimento di nanoparticelle utilizzando un percorso internalizzazione mediata da recettori. Inoltre, FNN è una nanoparticella naturale e quindi ha un buon profilo di biocompatibilità. Infine, FNN è in grado di incapsulare bassa dimensione molecole idrosolubili mediante un meccanismo semplice ed efficiente. La permeazione trans-BBB di altri diversi tipi di nanoparticelle organiche o inorganiche potrebbe essere valutata anche con questo protocollo, secondo alcune considerazioni per quanto riguarda nanoparticelle caratteristiche. primo prerequisite per studiare la permeazione di nanoformulated farmaci / agenti è la sicurezza della nanoparticella vuoto. Un altro problema fondamentale è l'interazione della nanoparticella indagato con il filtro PET. Questo aspetto, deve essere valutata preliminarmente al fine di escludere una ritenzione significativa nei pori della membrana ed evitare alterazioni della loro permeazione attraverso la BBB. Il nostro gruppo ha recentemente utilizzato la strategia proposta di studiare una nanoparticella ossido di ferro polimero rivestito come un trans-BBB sistema di consegna di farmaci antiretrovirali fluorescenza marcata con 14. In questo caso, abbiamo associato microscopia elettronica localizzazione del nanoformulazioni in RBMECs al rivelatore a fluorescenza. Inoltre, altri metodi diagnostici altamente sensibili, come ad esempio plasma accoppiato induttivamente (ICP) -MS potrebbe essere impiegato per valutare la consegna trans-BBB di nanosistemi inorganici.
Il modello BBB in vitro utilizzato in questo protocollo si basa sulla co-coltura di BMECs ratto e astrociti. Nel vasto scenario dei modelli BBB 10,11,12, alcuni dei quali sono stati accuratamente descritti in letteratura con un protocollo ben dettagliata 15, il nostro modello rappresenta un'alternativa di qualità. Infatti, anche se la TEER registrata era sotto i migliori standard suggerito in letteratura (150-200 Ω cm 2) 10, la permeabilità trans-BBB dell'alta tracciante dimensione destrano 40 sia in totale accordo con la formazione di una barriera a tenuta.
Questo modello in vitro, ottenuto con commercialmente disponibile ratto BMECs e astrociti, ha alcuni vantaggi: (1) l'efficienza crescita ottimale delle cellule endoteliali, (2) un adeguato periodo di tempo per la produzione del modello BBB finale (non più di 13 giorni), (3) il rispetto delle questioni etiche, evitando l'uso di cellule provenienti da tessuti umani cerebrale (materiali autopsia, campioni chirurgici, e tessuto fetale) e 4) risparmio di tempo e costi relativi alla stabulazione degli animali, e primarial'estrazione delle cellule. Tuttavia, una limitazione del presente modello è legato agli elevati costi di RBMECs primari non immortalizzate, che devono essere acquistati (congelati a passo uno) per ogni impostazione sperimentale. Infatti, i nostri studi preliminari di produzione BBB hanno dimostrato che la capacità delle cellule endoteliali di produrre un BBB stretta è strettamente associato con il numero di passaggi in coltura delle RBMECs dopo la prima post-scongelamento acquisto. Ulteriore implementazione del modello BBB qui descritto con supplementi endoteliali, come campo e idrocortisone, potrebbe essere considerato al fine di migliorare la tenuta endoteliale e aumentare i valori teer. 10,11,16
La tecnica attuale è legata alla possibilità di usufruire di un unico modello BBB per diversi dosaggi, fornendo così diversi set di dati da ciascuna impostazione sperimentale. Con un singolo sistema BBB esposti alle molecole fluorescenti liberi o nanocomplexed, è possibile: (1) per misurare thtrans-barriera flusso e della molecola analizzando l'intensità di fluorescenza delle aliquote SECM raccolti dalla camera inferiore a differenti tempi di incubazione; (2) per studiare la internalizzazione nano-mediata delle molecole in RBMECs e il loro traffico intracellulare mediante analisi di microscopia confocale delle cellule su inserti; (3) per ottenere una indicazione dello stato delle celle BBB dopo esposizione ai nanoformulazioni, misurando TEER alla fine dell'esperimento o mediante analisi integrità dell'endotelio mediante microscopia elettronica.
In conclusione, qui abbiamo descritto un protocollo per lo studio della permeazione di molecole fluorescenti nanocomplexed attraverso una elevata qualità BBB modello in vitro. Consideriamo questa metodologia un utile strumento per indagare l'effetto del nanoformulation sulla somministrazione di farmaci attraverso la BBB.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Rat Brain Microvascular Endothelial Cells | Innoprot | P10308 | isolated from Sprague Dawley rat brain tissue, cryopreserved at passage one and delivered frozen |
| Cortical Astrocytes | Innoprot | P10202 | isolated from 2 days rat brain tissue, cryopreserved at passage one and delivered frozen. |
| Endothelial Cell Medium kit | Innoprot | P60104 | ECM (500 ml) and fetal bovin serum (25 ml), endothelial cell growth supplement (5 ml) and penicillin/streptomycin (5 ml). Warm in 37 °C water bath before use and protect from light |
| Trypsin-EDTA without Phenol Red | EuroClone | ECM0920D | Warm in 37 °C water bath before use |
| Fluorescein isothiocyanate-dextran 40,000 | Sigma | FD40S | protect from light |
| paraformaldehyde | Sigma | 158127 | diluition in chemical hood |
| Dulbecco's phosphate buffer saline w/o Ca and Mg | EuroClone | ECB4004L | |
| Triton X-100 | Sigma | T8787 | |
| bovine serum albumin | Sigma | A7906 | |
| goat serum | EuroClone | ECS0200D | |
| mouse monoclonal anti-Von Willebrand Factor | Dako | M0616 | |
| AlexaFluor 546-conjugated antibody against mouse IgGs | ThermoFischer Scientific | A-11003 | protect from light |
| DAPI (4’ ,6-diamidino-2-phenylindole) | ThermoFischer Scientific | D1306 | protect from light |
| ProLong Gold Antifade Mountant | ThermoFischer Scientific | P36934 | |
| Poly-L-lysine Hydrobromide | Sigma | P1274 | the same solution can be used several times |
| fibronectin from bovine plasma | Sigma | F1141 | the same solution can be used several times |
| Polyethylene terephthalate (PET) inserts | Falcon | F3090 | Transparent Polyethylene terephthalate (PET) membranes; surface area: 4.2 cm2; pore size 0.4 µm/surface area |
| T75 Primo TC flask | EuroClone | ET7076 | |
| T175 Primo TC flask | EuroClone | ET7181 | |
| EVOM2 Epithelial Tissue Volt/Ohmmeter | World Precision Instruments Germany | EVOM2 | |
| Endohm- 24SNAP cup | World Precision Instruments Germany | ENDOHM-24SNAP | |
| Light/fluorescence microscope with camera | Leica Microsystems | DM IL LED Fluo/ ICC50 W Camera Module | inverted microscope for live cells with camera |
| Confocal Microscope | Leica Microsystems | TCS SPE | |
| Spectrofluorimeter | Jasco | FP-8000 |
References
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