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Bioengineering

एक चूहा रक्त मस्तिष्क बाधा पार FITC से भरी हुई Ferritins की इन विट्रो पारगमन में: एक मॉडल का अध्ययन करने के लिए nanoformulated अणु की डिलिवरी

Published: August 22, 2016 doi: 10.3791/54279
Automatic Translation
1, 1, 1, 2, 1, 1
1Dipartimento di Scienze Biomediche e Cliniche Luigi Sacco, Università di Milano, 2Dipartimento di Biotecnologie e Bioscienze, Università di Milano-Bicocca

Introduction

केंद्रीय तंत्रिका तंत्र के प्रतिरोध (सीएनएस) रोग (अर्थात। कैंसर, मिर्गी, अवसाद, मानसिक असंतुलन और एचआईवी जुड़े मस्तिष्क संबंधी विकार) औषधीय उपचार के लिए रक्त मस्तिष्क बाधा पार कठिन दवा पारगमन सहित विभिन्न अलग तंत्र, की वजह से है (बीबीबी) । बीबीबी सीमा है कि पदार्थ रक्त में घूम से मस्तिष्क के ऊतकों को अलग कर रहा है। इस बाधा के भीतर, मस्तिष्क microvascular endothelial कोशिकाओं (BMECs), pericytes और astrocytes endfeet द्वारा समर्थित की एक परत, उच्च आणविक भार 400 की तुलना में अधिक दा 1 के साथ उन लोगों hydrosoluble दवाओं के लिए बीबीबी के चयनात्मकता के लिए जिम्मेदार है। एक और मादक पदार्थों से संबंधित प्रतिरोध तंत्र दवा तपका ट्रांसपोर्टरों (पी-ग्लाइकोप्रोटीन और बहुऔषध प्रतिरोध प्रोटीन) है, जो केंद्रीय तंत्रिका तंत्र में दवा पैठ को कम करने और मस्तिष्क 2 से उनके बाहर निकालना की सुविधा के लिए सहयोग की BMECs पर उपस्थिति से जुड़ा हुआ है।

पिछले दशक में, Nanotechnological दृष्टिकोण की एक बड़ी संख्या को बीबीबी 3-6 भर में दवाओं पहुंचाने के नैदानिक ​​और जैविक चुनौती को पूरा करने के लिए विकसित किया गया है। इस संदर्भ में, ferritin nanospheres (FNN) एक पूरी तरह से अभिनव और होनहार समाधान प्रतिनिधित्व करते हैं। FNN 24 स्वयं कोडांतरण ferritin (एफ एन) monomers, जो 8 एनएम भीतरी व्यास की एक खोखले गोलाकार संरचना में व्यवस्थित कर रहे हैं की 12 एनएम क्षेत्रों रहे हैं। Ferritin सब यूनिटों अम्लीय पीएच पर disassembled और तटस्थता पीएच को लाने की इजाजत दी, विभिन्न जैविक अणुओं समझाया जा करने के लिए एक आकार स्मृति फैशन में reassembled किया जा सकता। इसलिए, FNN multifunctional दवा वितरण प्रणाली 7.8 के विकास के लिए एक दिलचस्प मॉडल का प्रतिनिधित्व करते हैं। इसके अलावा, FNN Transferrin रिसेप्टर (टीएफआर) 1, जो इन कोशिकाओं 9 के ल्यूमिनल झिल्ली पर व्यक्त की है की विशिष्ट पहचान करने के लिए BMECs धन्यवाद के साथ बातचीत कर सकते हैं।

अब तक, बीबीबी की इन विट्रो मॉडल में अलग orde में विकसित किया गया हैआर विभिन्न दवाओं, बीबीबी की ओर विषाक्तता, या तपका ट्रांसपोर्टरों के अणुओं के साथ बातचीत करने के लिए ट्रांस-बीबीबी पारगम्यता को स्पष्ट करने के लिए। दरअसल, इन मॉडलों के लिए इन विट्रो में वैध माना जाता है इन विवो पढ़ाई के साथ आगे बढ़ने से पहले सक्रिय अणुओं की एक तेजी से जांच के लिए दृष्टिकोण। इन मॉडलों को BMECs या सह-सुसंस्कृत BMECs और astrocytes (अधिक शायद ही कभी pericytes) की एक भी endothelial परत, पशु (चूहा, माउस, सुअर और गोजातीय) या मानव कोशिका लाइनों 10,11,12 से प्राप्त से मिलकर बनता है। TransEndothelial विद्युत प्रतिरोध (तीर) और एक परिभाषित आणविक वजन के साथ ट्रेसर के स्पष्ट पारगम्यता (पी एपीपी) दो महत्वपूर्ण पैरामीटर है कि इन विट्रो मॉडल की गुणवत्ता निर्धारित करने के लिए इस्तेमाल कर रहे हैं प्रतिनिधित्व करते हैं। यहाँ हम एक बीबीबी इन विट्रो मॉडल के रोजगार, चूहे BMECs (RBMECs) के सह-संस्कृति पर आधारित का वर्णन है और चूहे cortical astrocytes (RCAs) fluorescein isothi encapsulating ferritin nanocages के पार बीबीबी पारगमन का अध्ययन करने के लिएocyanate (FITC)।

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Protocol

1. बीबीबी मॉडल की स्थापना

नोट: बीबीबी मॉडल की स्थापना के लिए हम व्यावसायिक रूप से उपलब्ध प्राथमिक RBMECs और RCAs उपयोग करने का सुझाव। सभी कदम बाँझ अभिकर्मकों और disposables, एक लामिना का प्रवाह हुड में संभाला के साथ किया जाना चाहिए।

  1. कोशिका संवर्धन
    1. कोट पाली एल लाइसिन 100 माइक्रोग्राम / एमएल (आरटी पर 1 घंटे) या fibronectin 50 माइक्रोग्राम / एमएल (37 डिग्री सेल्सियस पर 1 घंटे) के साथ सेल संस्कृति बोतल, RCAs या RBMECs की कुर्की बढ़ावा देने के लिए क्रमशः। फिर, 1 एक्स 10 6 RCAs और endothelial सेल मध्यम में 5 एक्स 10 5 RBMECs, 5% भ्रूण गोजातीय सीरम, 1% endothelial सेल के विकास के पूरक और 1% पेनिसिलिन / स्ट्रेप्टोमाइसिन (SECM) के साथ पूरक पिघलना। 10 मिलीलीटर SECM में 20 मिलीलीटर SECM और एक T75 फ्लास्क में RBMECs में एक T175 फ्लास्क में बीज RCAs।
      नोट: विगलन और RCAs और RBMECs के बोने मार्ग संस्कृति में सेल घनत्व और समय के संदर्भ में, समायोजित किया जाना चाहिए, प्रयोगात्मक शर्तों की संख्या बीबीबी मॉडल के साथ परीक्षण किया जा करने के हिसाब से। द्वारा शुरू करो1 एक्स 10 6 RCAs के 1 शीशी और 5 x 10 5 RBMECs के 1 शीशी के साथ हैैं, यह 20 बीबीबी असर सम्मिलित करने के लिए प्राप्त करने के लिए संभव है।
    2. , RCAs के लिए के बारे में 80% संगम तक और 37 डिग्री सेल्सियस और 5% लगभग 6 दिनों के लिए एक humidified वातावरण में सीओ 2 में कोशिकाओं को बनाए रखने के लिए 90 से अधिक RBMECs% संगम। 5 मिनट (1 मिलीलीटर T75 बोतल के लिए trypsin और T175 बोतल के लिए 2 मिलीलीटर) के लिए: trypsin-EDTA समाधान (250 trypsin 1) का उपयोग कोशिकाओं को अलग करें। SECM के साथ trypsin गतिविधि को रोकने के (2: 1), पर 5 मिनट के लिए 750 × छ सेंट्रीफ्यूज सेल निलंबन और 60 मिलीलीटर SECM में छर्रों resuspend।
    3. सम्मिलित करता है पर बोने से पहले एक और 3 दिनों के लिए 3 T175 बोतल और SECM में संस्कृति में RBMECs विभाजित। एक Burker कक्ष में एक ऑप्टिकल माइक्रोस्कोप के तहत 1 trypan नीले रंग के साथ: RCAs रहने वाले, एक सेल निलंबन 1 पतला देख कर की कुल संख्या की गणना।
  2. सम्मिलित करता है पर सेल सीडिंग
    1. पॉलीथीन terephthalate के एक तरफ समझो (पीईटी) 6 बहु अच्छी तरह से Transpar की झिल्लीपाली एल लाइसिन 100 माइक्रोग्राम / एमएल और fibronectin 50 माइक्रोग्राम / एमएल के साथ दूसरे पक्ष के साथ ईएनटी सम्मिलित RCAs और BMECs की कुर्की की अनुमति है। आदेश पीईटी झिल्ली के साथ संपर्क से बचने के लिए चिमटी के साथ सम्मिलित संभाल लेना।
      1. सम्मिलित करता है एक 6 अच्छी तरह से थाली में रखें और ऊपरी सदन में fibronectin समाधान (न्यूनतम 500 μl) जोड़ें। 37 डिग्री सेल्सियस पर ऊष्मायन के 1 घंटे के बाद, फ़ाइब्रोनेक्टिन समाधान निकालने बहु अच्छी तरह से थाली से दूर सम्मिलित लेते हैं और उन्हें एक 150 सेमी 2 पेट्री डिश के नीचे है, जिसके लिए एक बाँझ समर्थन के रूप में प्रयोग किया जाता है यहाँ पर उल्टा रख दिया पहले से ही सम्मिलित लेपित।
      2. धीरे डालने के नीचे की ओर (के रूप में चित्रा 1 ए में दिखाया गया है; RCAs बोने के रूप में) पर पाली एल लाइसिन के 800 μl जोड़ने के लिए, और आरटी पर 1 घंटे के लिए सम्मिलित करता है पर समाधान रखें।
      3. समाधान Aspirate और सम्मिलित 15-30 मिनट के लिए आरटी पर सूखे। सम्मिलित करता है अब सेल बोने के लिए तैयार हैं, लेकिन यह भी कई के लिए बहु अच्छी तरह से थाली में संग्रहित किया जा सकता है4 डिग्री सेल्सियस पर दिन, बीबीबी निर्माण के साथ आगे बढ़ने से पहले।
        नोट: FD40 प्रवाह माप से बीबीबी स्थापना मान्य करने के लिए नियंत्रण के रूप में प्रयोग की जाने वाली कोशिकाओं से मुक्त कम से कम 3 लेपित सम्मिलित करता है रखने के लिए, याद है।
    2. बीज RCAs (35,000 / 2 सेमी) पाली एल Lysine लेपित आवेषण के नीचे की ओर पर, नीचे डालने (चित्रा 1 ए) उल्टा पर सेल निलंबन के 800 μl छोड़ने के द्वारा। आरटी पर 4 घंटे के लिए सम्मिलित करता है पर आरसीए निलंबन छोड़ दो, क्रम में झिल्ली को कोशिकाओं के कुशल कुर्की की अनुमति है।
    3. अवशिष्ट समाधान Aspirate, SECM के 2 मिलीलीटर युक्त कुओं में सम्मिलित जगह और एक humidified वातावरण में 37 डिग्री सेल्सियस और 5% सीओ 2 पर बहु अच्छी तरह से थाली को बनाए रखने, SECM बदलते हर 2 दिन।
    4. 3 दिनों के बाद, जब RCAs डालने के निचले चेहरे लेपित है, डालने के ऊपरी किनारे पर बीज RBMECs, इन चरणों का पालन:
      1. T175 बोतल से RBMECs अलग और गिनतीकुल जीवित कोशिकाओं, के रूप में कदम 1.1.2 और 1.1.3 में सूचना दी।
      2. बीज RBMECs (60,000 / 2 सेमी) SECM (1,000 μl) (चित्रा 1 बी) में डालने के ऊपरी सतह पर, astrocytes ही है, साथ 3 सम्मिलित छोड़ने Teer पृष्ठभूमि के रूप में इस्तेमाल किया जाएगा। मानक संस्कृति की स्थिति में बहु अच्छी तरह से थाली रखें। कम से कम 3 दिनों के लिए संस्कृति के लिए प्रणाली को बनाए रखने, आंतरिक और निचले सदन में SECM बदलते हर 2 दिन।

2. बीबीबी मान्यकरण

  1. Teer मापन
    1. सह संस्कृति के 3 दिन, एक उपयुक्त कक्ष में बीबीबी असर सम्मिलित डालने से Teer जांच (है कि एक टोपी है और जहां दोनों चैम्बर और टोपी वोल्टेज संवेदन और वर्तमान इलेक्ट्रोड की एक जोड़ी शामिल), 4 के साथ भरा SECM की मिलीलीटर। एक उपकला ऊतक वाल्ट / ohmmeter से कनेक्ट करें।
    2. सेल बीबीबी-प्रणालियों के Teer माप के साथ एक साथ, असर RCAs वें 3 सम्मिलित करता है की Teer मूल्यों रिकॉर्डBBBs साथ प्राप्त मूल्यों से कम से घटा दिए जाएंगे। आदेश Ω एक्स 2 सेमी के रूप में परिणाम को व्यक्त करने में डालने (4.2 सेमी 2) की सतह से जिसके परिणामस्वरूप Teer मूल्यों गुणा करें।
    3. सह संस्कृति के 3 दिन से, हर दिन Teer उपाय। नोट: एक प्रारंभिक अवधि जहां Teer बढ़ जाती है के बाद, दर्ज की गई मूल्यों कम से कम लगातार दो दिनों के लिए स्थिर रहना चाहिए (आमतौर पर 5 वीं और सह संस्कृति के 7 वें दिन के बीच)। उस समय बीबीबी सत्यापन (धारा 2.2) और / या पार बीबीबी प्रयोगों के लिए के दूसरे चरण के लिए तैयार है।
      नोट: प्रक्रिया धारा 2.1 में वर्णित एक ही बीबीबी-सिस्टम निम्नलिखित पारगम्यता प्रयोगों (धारा 3) के लिए समर्पित पर प्रदर्शन किया जा सकता है। बाँझ शर्तों के तहत कार्य करते हैं।
  2. के ट्रांस-बीबीबी फ्लक्स FITC-dextran 40 (FD40)
    1. कि 3 खाली सम्मिलित भर की तुलना में बीबीबी मॉडल के निचले सदन के लिए ऊपरी से FD40 प्रवाह को मापने(धारा 1.2.1 के नोट देखें) निम्न चरणों के अनुसार:
      1. 1 मिलीग्राम जोड़ें / मिलीलीटर FD40 (SECM में पतला) BBBs के ऊपरी डिब्बे में, और 1, 2 और 3 घंटे के बाद उन्हें निचले सदन से 200 μl SECM वापस लेने और, λ प्रतिदीप्ति तीव्रता spectrofluorimeter द्वारा (λ पूर्व 488 एनएम मापने 515 एनएम, भट्ठा 5)।
      2. एक ही विश्लेषणात्मक मापदंडों का उपयोग वर्जिन माध्यम के 500 μl मापने fluorescenceby SECM पृष्ठभूमि के लिए मूल्यों को प्राप्त करते हैं। सभी FD40 प्रतिदीप्ति मूल्यों से SECM पृष्ठभूमि प्रतिदीप्ति घटाएँ।
      3. एक अंशांकन वक्र SECM के 500 μl में भंग फ्लोरोसेंट दरियाफ्त की (यानी। 0.312, 0.625, 1.25, 2.5 माइक्रोग्राम / एमएल) के ज्ञात सांद्रता के साथ उत्पादन के साथ मनाया प्रतिदीप्ति मूल्यों की तुलना द्वारा रिस FD40 की राशि का निर्धारण करते हैं।
      4. गणना के अनुसार मतलब प्रवाह मूल्यों से स्पष्ट पारगम्यता गुणांक (पी एपीपी):
        पी एप्लिकेशन = जम्मू / एसी
        (2 सेमी) है और सी ऊपरी डिब्बे (मोल्स / सेमी 3) में अणु की एकाग्रता है।
        नोट: तीन या अधिक बीबीबी-व्यवस्था है कि उपयुक्त Teer मूल्यों पर पहुँच गए हैं, विशेष रूप से इस सत्यापन प्रक्रिया के लिए समर्पित किया जाना चाहिए, और निम्न पारगम्यता प्रयोगों (धारा 3) के लिए नियोजित नहीं किया जाना चाहिए। बाँझपन अनिवार्य नहीं है।

3. ट्रांस-बीबीबी FITC से भरी हुई Ferritins के पारगमन (FNN)

नोट: मानव ferritin का एक पुनः संयोजक संस्करण (एफ एन), कोलाई में उत्पादन और विभिन्न फ्लोरोसेंट अणु के encapsulation के लिए nanocages (FNN) में इकट्ठे हुए, प्रो Prosperi की NanoBioLab (विश्वविद्यालय मिलान Bicocca, इटली) से उपलब्ध है। FNN एक पहले से वर्णित प्रोटोकॉल 13 और दोनों एफ एन और लोड अणुओं की सांद्रता के अनुसार, FITC के साथ लोड कर रहे हैं सही कर रहे हैं determinईडी।

  1. ट्रांस-बीबीबी FITC के प्रवाह और FITC-FNN
    1. मान्य बीबीबी मॉडल (आमतौर पर 5 वें पर - सह संस्कृति के 7 वें दिन) के निचले सदन के लिए ऊपरी से FITC-FNN प्रवाह को मापने, ऊष्मायन के 7 और 24 घंटे के बाद मुक्त डाई की तुलना में, के अनुसार निम्नलिखित कदम:
      1. FITC-FNN (50 माइक्रोग्राम / एमएल FNN, 1.1 माइक्रोन के FITC) या प्रत्येक तैयार करने के लिए कम से कम 6 बीबीबी सिस्टम के ऊपरी सदन में मुक्त FITC के बराबर राशि, क्रम में SECM समाधान के 2 मिलीलीटर के निचले सदन से वापस लेने के लिए जोड़े कम से कम 3 सम्मिलित 7 घंटे के बाद, और 24 घंटे के बाद अन्य 3 आवेषण के निचले सदन से।
      2. द्वारा spectrofluorimeter एकत्र नमूनों के 500 μl के प्रतिदीप्ति तीव्रता को मापने (λ पूर्व 488 एनएम, λ उन्हें 515 एनएम, भट्ठा 5)।
      3. एक ही विश्लेषणात्मक मापदंडों का उपयोग मध्यम के 500 μl को मापने के द्वारा SECM पृष्ठभूमि प्रतिदीप्ति प्राप्त करते हैं। SECM पृष्ठभूमि प्रतिदीप्ति घटाएँसभी FITC या FITC-FNN प्रतिदीप्ति मूल्यों से।
      4. नि: शुल्क या nanoformulated डाई 500 μl SECM में भंग के ज्ञात सांद्रता (यानी। 6.87, 13.75, 27.5, 55 एनएम) के साथ उत्पादन दो अलग अंशांकन घटता के साथ प्राप्त प्रतिदीप्ति मूल्यों की तुलना द्वारा रिस FITC या FITC-FNN की एकाग्रता का निर्धारण।
  2. FITC-FNN RBMECs में स्थानीयकरण
    1. बीबीबी सिस्टम के ऊपरी सदन से SECM निकालें, पीबीएस के साथ सम्मिलित धोने और 10 के लिए ऊपरी डिब्बे में 500 μl paraformaldehyde (फॉस्फेट बफर खारा पीबीएस में 4%) जोड़कर प्रत्येक प्रयोगात्मक समूह के लिए कम से कम दो सम्मिलित करता है पर RBMECs ठीक आरटी पर मिनट।
    2. सम्मिलित अवशिष्ट paraformaldehyde दूर करने के लिए पीबीएस के साथ तीन बार धोएं।
      नोट: इस बिंदु पर से, बाँझपन आवश्यक नहीं है।
    3. पीईटी झिल्ली की उपयुक्त टुकड़े काटें, और निम्न चरणों के अनुसार कोशिकाओं के immunodecoration के साथ आगे बढ़ना:
      1. Permeabi0.1% ट्राइटन 10 मिनट के लिए पीबीएस में X-100 के साथ Lize RBMECs। एक समाधान 2% गोजातीय सीरम albumin (बीएसए), पीबीएस में 2% बकरी सीरम युक्त साथ आरटी पर 1 घंटे के लिए एक अवरुद्ध कदम प्रदर्शन। 1:20 कमजोर पड़ने पर एक विरोधी वॉन Willebrand फैक्टर (VWF) के साथ नमूने सेते हैं, आरटी पर 2 घंटे के लिए।
      2. पीबीएस के साथ तीन बार धोने के बाद, एक 2% बीएसए को आरटी पर 2 घंटे के लिए कोशिकाओं का पर्दाफाश, 2% बकरी सीरम एक 1 पर एक उपयुक्त माध्यमिक एंटीबॉडी युक्त समाधान: आदेश में 300 कमजोर पड़ने विरोधी VWR, और एक पर DAPI प्रकट करने के लिए 1: नाभिक का पता लगाने के लिए 1,500 कमजोर पड़ने।
    4. एक antifade बढ़ते समाधान (डालने टुकड़ा प्रति एक बूंद) का उपयोग कर खुर्दबीन स्लाइड पर डालने के टुकड़े माउंट, तो एक कवर पर्ची के साथ नमूना बंद करें। 40x बढ़ाई, 1.5 जूम और 1024 x 1024 पिक्सेल संकल्प पर एक तेल विसर्जन लेंस का उपयोग confocal माइक्रोस्कोपी द्वारा विश्लेषण।

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Representative Results

बीबीबी मॉडल, सेल लगाव और सम्मिलित करता है पर विकास की स्थापना के दौरान पीईटी झिल्ली की पारदर्शी प्रकृति के लिए एक प्रकाश माइक्रोस्कोप धन्यवाद उपयोग पर नजर रखी जा सकती है। RCAs, 35,000 कोशिकाओं / 2 सेमी, आर टी (2A चित्रा) पर ऊष्मायन के 4 घंटे के बाद डालने के नीचे की ओर करने के लिए कुशलतापूर्वक देते हैं के घनत्व पर वरीयता प्राप्त और 3 दिन में झिल्ली सतह को कवर करने के लिए बड़े होते हैं, एक धुरी के आकार आकृति विज्ञान ले जा रही है (चित्रा 2 बी)। RBMECs, 60,000 कोशिकाओं / 2 सेमी के घनत्व पर वरीयता प्राप्त, जाहिरा 37 डिग्री सेल्सियस (चित्रा -2) पर ऊष्मायन के बारे में 3 घंटे के बाद पीईटी झिल्ली के ऊपरी चेहरे से जुड़े होते हैं। विकासशील RBMEC परत अंतर्निहित आरसीए परत (चित्रा 2 डी) के साथ ओवरलैप की वजह से एक ऑप्टिकल माइक्रोस्कोप के साथ निम्न दिनों में कल्पना करने के लिए मुश्किल हो सकता है।

बी के एक सही सत्यापनबी बी मॉडल हमेशा Teer माप की आवश्यकता है और इस तरह के FD40 के रूप में एक कम पारगम्यता दरियाफ्त के पार बीबीबी पी ऐप का आकलन द्वारा की पुष्टि की जा सकती है।

Teer मूल्यों, सह संस्कृति की अवधि में दर्ज की गई, endothelial बाधा का सही गठन के पहले स्पष्ट संकेत प्रतिनिधित्व करते हैं। तीन दिन RBMEC बोने के बाद दर्ज की गई Teer, astrocytes असर आवेषण के तीर से घटाया, मुख्य रूप से RCAs के गैर electrogenic परत और RBMECs के विकास परत के योगदान की वजह से है। इस समय बिंदु पर, हमारे BBB 20 और Ω के बीच 40 x 2 सेमी लेकर मूल्यों देता है। बाद के दिनों के दौरान, 4 वें और सह संस्कृति के 5 वें दिन के बीच आम तौर पर, तीर वृद्धि क्योंकि आसन्न endothelial कोशिकाओं 14 के बीच तंग जंक्शनों के गठन के मूल्यों, आमतौर पर बीच 55 और 110 Ω एक्स 2 सेमी मूल्यों तक पहुंच गया, और असाधारण मामलों में हायgher 14 महत्व देता है। मूल्यों सह संस्कृति के 4 वें / 5 वें दिन पर मापा कम से कम 7 वीं तक स्थिर रहेगा - दिन 8 वीं से पहले वे कम करने के लिए शुरू; इसलिए, वहाँ एक बहुत ही संकीर्ण समय खिड़की पार बीबीबी प्रवाह प्रयोगों के उपक्रम के लिए उपलब्ध है।

के बीच 5 वें और सह संस्कृति के 7 वें दिन, प्रयोगात्मक मॉडल की अखंडता FD40 पार बीबीबी पारगम्यता मूल्यांकन द्वारा की पुष्टि की जा सकती है। चित्रा 3 FD40 के पार बीबीबी प्रवाह का एक उदाहरण दिखाता है (1 मिलीग्राम / मिलीलीटर ), खाली सम्मिलित भर में प्रवाह, ऊष्मायन के 3 घंटा से अधिक की तुलना में; BBBs सह संस्कृति के 6 वें दिन में कर रहे हैं और दर्ज Teer 55.6 ± 15.8 Ω 2 सेमी है (मतलब ± एसई, एन = 3)। प्रवाह ऊष्मायन के 1 और 3 घंटा और 1 और 2 घंटा के बीच की गणना मतलब पी एप्लिकेशन के बीच रैखिक है, और 2 और 3 के बीच ऊष्मायन के मानव संसाधन है0.12 ± 0.01 x 10 - 6 सेमी सेक - 1 (± एसई, एन = 6)।

एक बार में कम से कम लगातार तीन सफल BBBs, तीर और FD40 पी एप्लिकेशन के संदर्भ में, स्वतंत्र प्रयोगों दरियाफ्त पारगम्यता की माप बचा जा सकता है में प्राप्त किया गया है; हालांकि, तीर हमेशा एक प्रयोग के लिए रिकॉर्ड किया जाना चाहिए।

फ्लोरोसेंट अणुओं के पार बीबीबी पारगम्यता और उनके वितरण पर nanocomplex के प्रभाव चूहे बीबीबी मॉडल ऊपर वर्णित का उपयोग कर जांच की जा सकती है। चित्रा 4 मॉडल डाई FITC के 100.4 ± 3.5 के तीर के साथ BBBs भर FNN में पारगमन encapsulation पर पता चलता है Ω सेमी 2 (एन = 16) के सह-संस्कृति के 7 वें दिन पर। histograms, निचले सदन में FITC एकाग्रता का प्रतिनिधित्व मुफ्त या nanoformulated डाई के अलावा से 7 और 24 घंटे के बादऊपरी डिब्बे में संकेत मिलता है कि FNN काफी बीबीबी भर FITC की डिलीवरी बढ़ाने में सक्षम है।

FITC-FNN (चित्रा 5 ए, सी) या FITC के साथ ऊष्मायन के 7 और 24 घंटे के बाद डालने के ऊपरी ओर से confocal खुर्दबीन छवियों (चित्रा 5 ब, डी) बताते हैं कि जबकि मुक्त FITC RBMECs, इसकी लोडिंग में से भली भाँति नहीं है FNN यह कोशिकाओं में प्रवेश करने की अनुमति देता है।

confocal माइक्रोस्कोपी के लिए सम्मिलित प्रक्रिया से पहले, तीर की आगे की जांच सुनिश्चित करने के लिए बीबीबी अखंडता पर कोई FNN की मध्यस्थता प्रभाव देखते हैं आवश्यक है।

आकृति 1
चित्रा 1:। आवेषण पर सेल सीडिंग आरसीए (ए) और के दो विपरीत पक्षों पर RBMEC (बी) बोने प्रक्रियाबहु अच्छी तरह से थाली सम्मिलित करता है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र 2
चित्रा 2:। आवेषण पर RCAs के ऑप्टिकल माइक्रोस्कोप छवियों और RBMVECs आवेषण के साथ RCAs और RBMECs एक प्रकाश माइक्रोस्कोप (20X ऑप्टिकल ज़ूम) के साथ मनाया जाता वरीयता प्राप्त। (ए) के बाद बोने, गोल और पारदर्शी RCAs दिख डालने के नीचे की सतह से जुड़े होते हैं चार मानव संसाधन; (बी) धुरी के आकार RCAs संस्कृति के 3 दिन पर दिखाई दे रहे हैं; (सी) गोल और पारदर्शी RBMECs ऊष्मायन के 3 घंटे के बाद डालने के ऊपरी ओर संलग्न कर रहे हैं; (डी) सह संस्कृति दोनों डालने की सतहों के 4 वें दिन पूरी तरह से कोशिकाओं के साथ कवर कर रहे हैं, और दो ​​जब्रीनेताओं आसानी से अलग पहचाना नहीं हैं। स्केल बार = 100 माइक्रोन। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र तीन
चित्रा 3:। BBB BBB इन विट्रो प्रणाली के निचले तरफ करने के लिए ऊपरी से FD40 के प्रवाह (1 मिलीग्राम / एमएल) के पार FD40 फ्लक्स, कि खाली डालने भर की तुलना में। 60, 120 और 180 मिनट के बाद ऊपरी सदन के लिए डाई के अलावा कम से निचले सदन में FD40 की मात्रा को मापा गया है। ± एसई का मतलब है, n ° आवेषण = 3. यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 4
चित्रा 4:। बीबीबी इन विट्रो प्रणाली FITC या FITC-FNN के अलावा के ऊपरी सदन में बाद 7 और 24 घंटे में गणना के निचले सदन में FITC की बीबीबी एकाग्रता के उस पार FITC पारगमन पर FNN एन्कैप्सुलेशन का प्रभाव। ± एसई मतलब का 4-5 प्रतिकृति; **** पी <0.0005, FITC-FNN बनाम। FITC (छात्र टी परीक्षण)। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 5
चित्रा 5: सम्मिलित करता है पर RBMECs के Confocal माइक्रोस्कोपी 7 घंटे के बाद RBMECs के Confocal लेजर स्कैनिंग micrographs (एकल ऑप्टिकल वर्गों) (ए, बी) या 24 घंटा (सी, डी) के साथ मुक्त FITC ऊष्मायन के (बी, सी) या FITC। -FnN (ए, यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

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Discussion

इन विट्रो विधि यहाँ वर्णित पार बीबीबी नैनोकणों के साथ nanoformulation पर फ्लोरोसेंट अणुओं के वितरण का अध्ययन करने के लिए एक उपयोगी मान्य दृष्टिकोण का प्रतिनिधित्व करता है। यहाँ हम FNN, जो बीबीबी भर में कार्गो अणुओं के translocation अध्ययन करने के लिए एक अच्छे उम्मीदवार का प्रतिनिधित्व करता है का उपयोग करें। FNN दवा / एजेंटों के पार बीबीबी डिलीवरी के लिए सोने nanovector माना जाता है क्योंकि यह विशेष TfR1 रिसेप्टर, जो BMECs की ल्यूमिनल झिल्ली पर व्यक्त की और nanoparticle तेज एक रिसेप्टर की मध्यस्थता internalization मार्ग का उपयोग कर मध्यस्थता करता है के द्वारा मान्यता प्राप्त है। इसके अलावा, FNN एक प्राकृतिक nanoparticle है और इसलिए यह एक अच्छा biocompatibility प्रोफ़ाइल है। अंत में, FNN एक सरल और कुशल तंत्र द्वारा कम आयाम hydrosoluble अणुओं encapsulate करने में सक्षम है। जैविक या अकार्बनिक नैनोकणों के अन्य विभिन्न प्रकार के पार बीबीबी पारगमन भी नैनोकणों सुविधाओं के बारे में कुछ विचार के अनुसार, इस प्रोटोकॉल के साथ मूल्यांकन किया जा सकता है। सबसे पहले पीnanoformulated दवाओं / एजेंटों के पारगमन का अध्ययन करने के rerequisite शून्य nanoparticle की सुरक्षा है। एक अन्य महत्वपूर्ण मुद्दा पीईटी फिल्टर के साथ जांच की nanoparticle की बातचीत है। इस पहलू, आदेश झिल्ली pores में एक महत्वपूर्ण प्रतिधारण बाहर और बीबीबी भर में उनके पारगमन के परिवर्तन से बचने के लिए प्रारंभिक रूप से मूल्यांकन किया जाना है। हमारे समूह ने हाल ही में प्रतिदीप्ति लेबल एंटीरेट्रोवाइरल दवाओं 14 के लिए एक पार बीबीबी वितरण प्रणाली के रूप में एक बहुलक लेपित लोहे के आक्साइड nanoparticle अध्ययन करने के लिए प्रस्तावित रणनीति कार्यरत है। उस मामले में, हम प्रतिदीप्ति का पता लगाने के लिए RBMECs में nanoformulations के इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी स्थानीयकरण जुड़े। इसके अलावा, इस तरह के उपपादन द्वारा मिलकर प्लाज्मा (आईसीपी) के रूप में अन्य अति संवेदनशील निदान विधियों, एमएस अकार्बनिक NanoSystems के पार बीबीबी वितरण का मूल्यांकन करने के लिए नियोजित किया जा सकता है।

बीबीबी इन विट्रो मॉडल इस प्रोटोकॉल में इस्तेमाल चूहे BMECs और astrocytes के सह-संस्कृति पर आधारित है। बीबीबी मॉडल 10,11,12, जिनमें से कुछ सही रूप में एक अच्छी तरह से विस्तृत प्रोटोकॉल 15 के साथ साहित्य में वर्णित किया गया है की व्यापक परिदृश्य में, हमारे मॉडल एक अच्छी गुणवत्ता के विकल्प का प्रतिनिधित्व करता है। दरअसल, भले ही दर्ज की गई Teer सबसे अच्छा मानकों से नीचे था साहित्य (150-200 Ω सेमी 2) 10, उच्च आयाम दरियाफ्त Dextran 40 एक तंग बाधा के गठन के साथ कुल समझौते में किया गया था के पार बीबीबी पारगम्यता में सुझाव दिया।

यह इन विट्रो मॉडल, व्यावसायिक रूप से उपलब्ध चूहे BMECs और astrocytes के साथ प्राप्त की, कुछ फायदे हैं: (1) endothelial कोशिकाओं का इष्टतम विकास दक्षता, अंतिम बीबीबी मॉडल (के उत्पादन के लिए समय की (2) एक उपयुक्त अवधि की तुलना में अब और नहीं 13 दिन), (3) नैतिक मुद्दों के साथ अनुपालन, और मानव मस्तिष्क के ऊतकों (शव परीक्षा सामग्री, शल्य चिकित्सा नमूने, और भ्रूण ऊतक कोशिकाओं से) 4) समय की बचत और पशु आवास से संबंधित लागत, और प्राथमिक के प्रयोग से परहेजकोशिकाओं निकासी। फिर भी, वर्तमान मॉडल की एक सीमा उच्च प्रत्येक प्रयोगात्मक सेटिंग के लिए खरीदा जाना चाहिए जो गैर-अमर प्राथमिक RBMECs की लागत, (बीतने एक पर जमे हुए) से संबंधित है। दरअसल, बीबीबी उत्पादन की हमारी प्रारंभिक अध्ययन दिखा दिया है कि endothelial कोशिकाओं की क्षमता एक तंग बीबीबी उत्पादन करने के लिए सख्ती से पहली पोस्ट-खरीद विगलन के बाद RBMECs की संस्कृति में मार्ग की संख्या के साथ जुड़ा हुआ है। बीबीबी मॉडल इस तरह के शिविर और hydrocortisone, के रूप में endothelial आपूर्ति करता है, के साथ यहाँ वर्णित के आगे कार्यान्वयन endothelial जकड़न में सुधार लाने और Teer मूल्यों में वृद्धि करने के लिए आदेश में माना जा सकता है। 10,11,16

वर्तमान तकनीक संभावना से संबंधित है अलग assays के लिए एक एकल बीबीबी मॉडल का लाभ लेने के लिए, इस प्रकार प्रत्येक प्रयोगात्मक सेटिंग से कई डेटा सेट प्रदान करते हैं। नि: शुल्क या nanocomplexed फ्लोरोसेंट अणुओं के संपर्क में एक भी BBB प्रणाली के साथ, यह संभव है: (1) वें मापने के लिएऊष्मायन के विभिन्न बिंदुओं पर समय निचले सदन से एकत्र SECM aliquots की प्रतिदीप्ति तीव्रता का विश्लेषण करके अणु की ई-पार बाधा प्रवाह; (2) RBMECs में अणुओं और सम्मिलित करता है पर कोशिकाओं के confocal माइक्रोस्कोपी विश्लेषण द्वारा उनके intracellular तस्करी के नैनो की मध्यस्थता internalization की जांच करने के लिए; (3), nanoformulations के लिए जोखिम पर बीबीबी कोशिकाओं की स्थिति का एक संकेत पाने के लिए प्रयोग के अंत में तीर को मापने के द्वारा या इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी द्वारा endothelium अखंडता का विश्लेषण करके।

अंत में, यहाँ हम एक उच्च गुणवत्ता वाले बीबीबी इन विट्रो मॉडल भर nanocomplexed फ्लोरोसेंट अणुओं के पारगमन के अध्ययन के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन किया। हम इस पद्धति बीबीबी भर में दवा वितरण पर nanoformulation के प्रभाव की जांच के लिए एक उपयोगी उपकरण पर विचार करें।

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Rat Brain Microvascular Endothelial Cells  Innoprot P10308 isolated from Sprague Dawley rat brain tissue, cryopreserved at passage one and delivered frozen
Cortical Astrocytes  Innoprot P10202 isolated from 2 days rat brain tissue, cryopreserved at passage one and delivered frozen.
Endothelial Cell Medium kit Innoprot P60104 ECM (500 ml) and fetal bovin serum (25 ml), endothelial cell growth supplement (5 ml) and penicillin/streptomycin (5 ml). Warm in 37 °C water bath before use and protect from light
Trypsin-EDTA without Phenol Red EuroClone ECM0920D Warm in 37 °C water bath before use
Fluorescein isothiocyanate-dextran 40,000 Sigma FD40S protect from light
paraformaldehyde  Sigma 158127 diluition in chemical hood
Dulbecco's phosphate buffer saline w/o Ca and Mg EuroClone ECB4004L
Triton X-100 Sigma T8787
bovine serum albumin  Sigma A7906
goat serum  EuroClone ECS0200D
mouse monoclonal anti-Von Willebrand Factor Dako M0616
AlexaFluor 546-conjugated antibody against mouse IgGs ThermoFischer Scientific A-11003 protect from light
DAPI (4’ ,6-diamidino-2-phenylindole)  ThermoFischer Scientific D1306 protect from light
ProLong Gold Antifade Mountant ThermoFischer Scientific P36934
Poly-L-lysine Hydrobromide Sigma P1274 the same solution can be used several times
fibronectin from bovine plasma  Sigma F1141 the same solution can be used several times
Polyethylene terephthalate (PET) inserts Falcon F3090 Transparent Polyethylene terephthalate (PET) membranes; surface area: 4.2 cm2; pore size 0.4 µm/surface area
T75 Primo TC flask EuroClone ET7076
T175 Primo TC flask EuroClone ET7181
EVOM2 Epithelial Tissue Volt/Ohmmeter    World Precision Instruments Germany EVOM2
Endohm- 24SNAP cup World Precision Instruments Germany ENDOHM-24SNAP
Light/fluorescence microscope with camera Leica Microsystems DM IL LED Fluo/ ICC50 W Camera Module  inverted microscope for live cells with camera 
Confocal Microscope Leica Microsystems TCS SPE
Spectrofluorimeter Jasco FP-8000

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References

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जैव अभियांत्रिकी अंक 114 Nanomedicine रक्त मस्तिष्क बाधा, ferritin नैनोकणों फ्लोरोसेंट अणु ट्रांस-बीबीबी वितरण
एक चूहा रक्त मस्तिष्क बाधा पार FITC से भरी हुई Ferritins की <em>इन विट्रो</em> पारगमन <em>में:</em> एक मॉडल का अध्ययन करने के लिए nanoformulated अणु की डिलिवरी
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Fiandra, L., Mazzucchelli, S.,… More

Fiandra, L., Mazzucchelli, S., Truffi, M., Bellini, M., Sorrentino, L., Corsi, F. In Vitro Permeation of FITC-loaded Ferritins Across a Rat Blood-brain Barrier: a Model to Study the Delivery of Nanoformulated Molecules. J. Vis. Exp. (114), e54279, doi:10.3791/54279 (2016).

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