Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

طريقة لقياس الحمض النووي الريبي Published: December 5, 2016 doi: 10.3791/54672
Automatic Translation
1, 1, 1
1Department of Cardiology, Chang Gung Memorial Hospital, Chang Gung University College of Medicine

Summary

ووصف طريقة النشاف شمال المعدلة لقياس N 6 -methyladenosine (م 6 أ) التعديلات في الحمض النووي الريبي. الطريقة الحالية يمكن الكشف عن تعديلات في الرنا متنوعة والضوابط في إطار مختلف التصاميم التجريبية.

Protocol

ملاحظة: الحمض النووي الريبي مجموع م ويشمل 6 مستوى الريباسي، مرنا، وغيرها من الرنا الصغيرة. منذ الحمض النووي الريبي الريباسي لديها وفرة م 6 والتعديلات، وقياس متر و6 والمستويات في حاجة إلى النظر في هذا الواقع.

1. عزل الحمض النووي الريبي

  1. باستخدام حل ريبونوكلياز إزالة التلوث (رش على مناشف ورقية)، ومسح الماصات والسطوح مختبر مقاعد البدلاء. مناشف ورقية مبللة بالماء nuclease خالية ومسح أسفل الماصات والسطوح مختبر مقاعد البدلاء مرة أخرى.
  2. استخراج الحمض النووي الريبي
    1. مجموع العزلة RNA
      1. باستخدام النمام في سماء المنطقة، التجانس 50-100 ملغ من الأنسجة أو 5-10 × 10 6 الخلايا في 1 مل من محلول الحمض النووي الريبي العزلة الحفاظ على 4 درجات مئوية.
        ملاحظة: عن الأنسجة (100-150 ملغ) قد تكون هناك حاجة لعينات الأنسجة الدهنية من الفئران بسبب انخفاض تركيز الحمض النووي الريبي فيه. عينات من مصادر من قلب فأر والكبد والعضلات والهيكل العظمي والرئة والدماغ، ولقد استخدمت الضامة قبل 4.
      2. فيcubate على الخليط عينة لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
      3. إضافة 100 ميكرولتر من 1-برومو-3-chloropropane (BCP) لكل 1 مل من عينة جناسة. تهز أنابيب بقوة لمدة 15 ثانية، والشروع في عزل الحمض النووي الريبي الإجمالي وفقا لتعليمات الشركة الصانعة 24.
    2. مذيل بعديد الأدينيلات مرنا تنقية من الحمض النووي الريبي مجموع معزولة
      1. تنقية مرنا مذيل بعديد الأدينيلات باستخدام مجموعات أو البروتوكولات المتاحة.
        1. يهز جيدا لإعادة تعليق كل الحلول التالية: 2X حل ملزم، بنسبة ضئيلة (DT) الخرز البوليسترين، ومحلول الغسيل. ضمان بنسبة ضئيلة (DT) الخرز الحارة إلى درجة حرارة الغرفة قبل الاستخدام.
        2. نقل 120 ميكرولتر من محلول شطف للإعداد في أنبوب والحرارة إلى 70 درجة مئوية في كتلة التدفئة.
        3. ماصة يصل إلى 500 ميكروغرام من الحمض النووي الريبي مجموع في أنبوب microcentrifuge. مع nuclease خالية من المياه، وضبط مستوى الصوت إلى 250 ميكرولتر.
        4. إضافة 250 ميكرولتر من حل ملزم 2X إلى الحمض النووي الريبي مجموع ذلكlution ودوامة لفترة وجيزة لخلط المحتويات.
        5. إضافة 15 ميكرولتر من بنسبة ضئيلة (DT) الخرز ودوامة جيدا لخلط.
        6. احتضان الخليط عند 70 درجة مئوية لمدة 3 دقائق.
        7. إزالة عينة من كتلة التدفئة والسماح لها الوقوف في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقيقة.
        8. أجهزة الطرد المركزي في 15000 x ج لمدة 2 دقيقة.
        9. إزالة بعناية طاف، تاركا وراءه ما يقرب من 50 ميكرولتر.
        10. إضافة 500 ميكرولتر من محلول الغسيل لإعادة تعليق بيليه من قبل pipetting.
        11. ماصة تعليق في مجموعة أنبوب فلتر تدور / جمع.
        12. أجهزة الطرد المركزي في 15000 x ج لمدة 2 دقيقة. إزالة عمود من أنبوب جمع والتخلص من التدفق من خلال. العودة العمود إلى أنبوب جمع.
        13. ماصة 500 ميكرولتر من محلول الغسيل على فلتر زيادة ونقصان.
        14. أجهزة الطرد المركزي في 15000 س ز لمدة 2 دقيقة.
        15. نقل مرشح تدور في أنبوب جمع جديدة.
        16. ماصة 50 ميكرولتر من محلول شطف ساخنةإلى 70 درجة مئوية على مركز للتصفية زيادة ونقصان.
        17. احتضان لمدة 2-5 دقائق عند 70 درجة مئوية. أجهزة الطرد المركزي في 15000 x ج لمدة 1 دقيقة.
        18. ماصة على 50 ميكرولتر إضافية من حل شطف تسخينها إلى 70 درجة مئوية على مركز للتصفية زيادة ونقصان.
        19. كرر الخطوة 1.2.2.1.18.
      2. إضافة 100 ميكروغرام / مل الجليكوجين، 0.1 حجم 3 عازلة M خلات الصوديوم (الرقم الهيدروجيني 5.2)، و 2.5 مجلدات من الايثانول المطلق. يعجل بين عشية وضحاها في -80 درجة مئوية.
      3. أجهزة الطرد المركزي في 15000 x ج لمدة 25 دقيقة على 4 درجات مئوية. تجاهل طاف.
      4. غسل بيليه مع 1 مل من الايثانول 75٪. أجهزة الطرد المركزي في 15000 x ج لمدة 15 دقيقة على 4 درجات مئوية. إزالة بعناية الإيثانول.
      5. تجف في الهواء لمدة 3-5 دقيقة.
      6. إضافة 10 ميكرولتر من nuclease خالية من المياه بحل بيليه.
      7. تخزين في -70 درجة مئوية.
  3. RNA التأهيل النوعي والكمي
    1. باستخدام مقياس الطيف الضوئي، تحديد تركيز الحمض النووي الريبي NOTIنانوغرام الامتصاصية في 260 نانومتر و 280 نانومتر. وينبغي أن تكون نسبة 260/280 1،8-2،2.
    2. تحقق من جودة عينة الحمض النووي الريبي باستخدام 0.8٪ هلام الاغاروز الكهربائي 25.
      ملاحظة: الحمض النووي الريبي مجموع حقيقية النواة سليمة يجب أن تظهر مكثفة العصابات 28S و 18S الريباسي. نسبة 28S مقابل 18S الريباسي كثافة الفرقة لإعداد RNA الجيد هو ~ 2.

2. جل الكهربائي ونقل

ملاحظة: يتم إعطاء بروتوكولات إعداد عازلة في الجدول 1.

  1. إعداد جل الفورمالديهايد (1٪)
    1. شطف جميع المعدات الكهربائي مع diethylpyrocarbonate (DEPC) المياه.
    2. تذوب 2.5 غرام من الاغاروز في 215 مل من الماء DEPC تماما في فرن الميكروويف.
    3. إضافة 12.5 مل من 10X 3- (N- morpholino) حمض propanesulfonic (اجتماعات الأطراف) العازلة و 22.5 مل من 37٪ الفورمالديهايد.
    4. سكبه في الجهاز الكهربائي مع مشط سميكة 1.5 مم.
    5. القضاء على فقاعات أو دفع رتنحنح إلى حواف من هلام مع مشط نظيف.
    6. السماح للهلام ليصلب في درجة حرارة الغرفة.
  2. إعداد عينة
    1. مزيج 1-10 ميكروغرام من الحمض النووي الريبي مجموع و 11.3 ميكرولتر من عينة العازلة.
    2. مزيج 2 ميكروغرام من علامة الحمض النووي الريبي (1 ميكروغرام / ميكرولتر) مع 11.3 ميكرولتر من عينة العازلة.
    3. إضافة nuclease خالية من المياه إلى عينات من 2.2.1 و2.2.2 إلى الحجم الكلي لل16 ميكرولتر.
    4. الحرارة عند 60 درجة مئوية لمدة 5 دقائق، ثم البرد على الجليد.
    5. مزيج 16 ميكرولتر من عينة من 2.2.3 مع 4 ميكرولتر من تتبع الصبغ الذي يحتوي على 0.1 ميكروغرام / ميكرولتر إيثيديوم بروميد على الجليد.
      تنبيه: بروميد إيثيديوم هو ماسخ والسامة وربما في حالة استنشاقه. قراءة إيثيديوم بروميد رقة بيانات السلامة.
  3. الكهربائي
    1. إضافة 200 مل من 10X اجتماعات الأطراف العازلة إلى 1800 مل من ده 2 O لجعل العازلة تشغيل 1X اجتماعات الأطراف.
    2. استخدام العازلة تشغيل 1X اجتماعات الأطراف لشطف الآبار من هلام.
    3. ما قبل التشغيل رقال جل في 20 V لمدة 5 دقائق.
    4. تحميل عينات الحمض النووي الريبي في الآبار من هلام.
    5. يغطى بورق لتجنب التعرض للضوء. تشغيل في 35 V لمدة 17 ساعة (بين عشية وضحاها)
    6. فحص وتصوير هلام تحت ضوء الأشعة فوق البنفسجية.
  4. تحويل
    1. قطع هلام لإزالة الجزء غير المستخدم.
    2. إعداد 500 مل من العازلة 10X SSC (250 مل من 20x وعازلة SSC و 250 مل من الماء DEPC).
    3. غسل هلام مرتين مع 10x عازلة SSC لمدة 20 دقيقة مع اهتزاز في 50 دورة في الدقيقة.
    4. قطع ورقة ورقة 1 مرشح كبيرة بما فيه الكفاية لتكون بمثابة ورقة الفتيل، والتي تمتص عازلة نقل من علبة نقل (الشكل 1).
    5. قطع 4 قطع من ورق الترشيح لنفس الحجم مثل هلام.
    6. قطع 1 ورقة من غشاء النايلون المشحونة إيجابيا لنفس حجم هلام.
    7. بمناسبة الشق على هلام والغشاء كعلامة لضمان التوجه السليم.
    8. نقع غشاء العازلة في SSC 2X لمدة 15 دقيقة.
    9. صب 500 مل سو 10X SSC العازلة في علبة نقل.
    10. وضع ورقة ورقة فلتر كبيرة عبر لوحة من الزجاج والرطب ورقة الترشيح مع العازلة نقل.
    11. طرح أي فقاعات مع ماصة.
    12. نقع 2 قطعة من ورق الترشيح قبل قطع العازلة في نقل ووضعها في وسط ورقة الترشيح من الخطوة 2.4.5. إزالة أي فقاعات.
    13. وضع الجل أعلى الجانب السلبي على ورقة الترشيح.
    14. وضع غشاء على أعلى من هلام. محاذاة الشقوق من هلام والغشاء.
    15. ضع 2 قطعة من ورق الترشيح قبل قطع على رأس الغشاء والرطب ورقة الترشيح مع العازلة نقل.
    16. إزالة أي فقاعات بين الطبقات.
    17. تطبيق غلاف بلاستيكي حول هلام لضمان أن المناشف استيعاب سوى عازلة مرورا جل والغشاء.
    18. كومة من المناشف الورقية على رأس ورقة الترشيح.
    19. وضع لوحة زجاجية كبيرة الحجم على رأس المناشف.
    20. وضع الوزن على الجزء العلوي من كومة.
    21. إبقاء بين عشية وضحاها للسماح الحمض النووي الريبي لنقل من الجل على الغشاء.

3. الكشف عن N 6 -methyladenosine

  1. غشاء يشابك
    1. الحفاظ على غشاء رطبة في المخزن 2X SSC.
    2. وضع 2 ورقة من ورق الترشيح مغمورة مع 10x عازلة SSC إلى crosslinker للأشعة فوق البنفسجية.
    3. وضع غشاء على رأس ورقة الترشيح، مع الجانب الحمض النووي الريبي كثف مواجهة.
    4. حدد "وضع autocrosslink" (120،000 μJ) واضغط على زر "ابدأ" لبدء التشعيع.
    5. فحص الغشاء وهلام مع الأشعة فوق البنفسجية الماسك صورة هلام لتأكيد نقل الحمض النووي الريبي من الجل على الغشاء.
  2. Immunoblotting
    1. منع الغشاء في 5٪ الحليب الخالي من الدسم في مخزنة المالحة تريس، مع توين 20 (TBST) عازلة في درجة حرارة الغرفة لمدة 1 ساعة.
    2. يغسل ثلاث مرات مع العازلة TBST لمدة 15 دقيقة.
    3. احتضان الغشاء بين عشية وضحاها في م 6 ألف (<م> ن 6 -methyladenosine) حل الأجسام المضادة (1: 1000 في 5٪ الخالي من الدسم عازلة الحليب TBST) في 4 درجات مئوية.
    4. يغسل الغشاء ثلاث مرات مع العازلة TBST لمدة 15 دقيقة.
    5. احتضان الغشاء في المضادة للأرنب حل حمار HRP-مترافق الأجسام المضادة (1: 2000 في الخالي من الدسم عازلة الحليب TBST 5٪) لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة.
    6. يغسل الغشاء ثلاث مرات مع العازلة TBST لمدة 15 دقيقة.
    7. تطبيق الركيزة chemiluminescent تعزيز (0.125 مل لكل سم 2 من الغشاء).
    8. القبض على التوهج مع الإعدادات المثلى للتصوير الرقمي، وفقا لتعليمات الشركة الصانعة 26.
  3. م 6 والكمي
    1. قياس النسبية م 6 وكثافة chemiluminescent باستخدام برنامج ImageJ.
      1. ضمن القائمة البرمجيات يماغيج، حدد الخيار "ملف" لفتح ملف ذات الصلة.
      2. حدد "مستطيل" أداة من يماغيج ورسم إطار حولالإشارات.
      3. إذا RNA الريباسي ليس التركيز على التجارب، وتجنب 18S و 28S الريباسي الحمض النووي الريبي م 6 والعصابات في الحساب.
      4. انقر على "قيادة" و "1" لتأكيد الممر المحدد.
      5. اضغط على "قيادة" و "3" لإظهار مؤامرة المحدد.
      6. انقر فوق الأداة "مستقيم" ورسم خطوط لفصل منطقة مجزأة.
      7. انقر على "العصا" أداة لتسجيل القياسات.
      8. تصدير البيانات.
      9. تطبيع مستويات م 6 ومع 18S RNA الريباسي الفرقة من تلطيخ بروميد إيثيديوم.

Representative Results

بعد 14 يوما في المرحلة الساعة البيولوجية العادية ضوء الظلام، وضعت الفئران من النوع البري في الظلام مستمر. تم أخذ عينات من الرنا من الكبد في 4 فترات ساعة ودرس مع النشاف شمال تعديلها. تم الكشف عن مثيلة من rRNAs، من mRNAs، والرنا صغيرة بشكل واضح (الشكل 2). المقارنة بين أوقات الإيقاعية المختلفة (CT) يمكن أن تحسب بدقة مع المعيار 18S الريباسي. وكان هناك تذبذب الساعة البيولوجية قوية من م 6 والمستويات في الريباسي، مرنا، والرنا الصغيرة.

لتجنب التدخل المعروضة من قبل الريباسي، الرنا مذيل بعديد الأدينيلات يمكن تنقيته، كما في الخطوة 1.2.2. بعد تنقيتها، والريباسي يمكن القضاء عليها إلى حد كبير للسماح التصور أفضل من الرنا الأخرى (الشكل 3).

شكل 1
ز> الشكل 1: تجميع وحدة نقل وصمة عار. وأظهرت وحدة نقل الشعرية لالنشاف الحمض النووي الريبي لغشاء. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 2
الشكل 2: إيقاع الساعة البيولوجية للومستويات م 6 في C57BL / 6J الفئران. ويظهر هذا الرقم م 6 وصمة عار من الحمض النووي الريبي مجموع من كبد البرية من نوع الفئران التضحية في اليوم الأول من مرحلة مظلمة الظلام بعد 14 يوما من مرحلة ضوء الظلام العادية في 4 ساعات فترات. وقد تم القياس الكمي باستخدام م 6 فرق كثافة الصورة بين 18S و 28S الريباسي. تم تطبيع م 6 وفرة إلى الفرقة 18S الريباسي من هلام الفورمالديهايد في القاع.وآخرون = "_ فارغة"> الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل (3)
الرقم 3: م 6 والبقع مع أو بدون الريباسي. تمثيلية م ترد 6 والبقع من الحمض النووي الريبي مجموع وRNA مذيل بعديد الأدينيلات من كبد البرية من نوع الفئران. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الجدول 1: المخازن المؤقتة والحلول.

Disclosures

الكتاب ليس لديهم ما يكشف.

Materials

1 عازلة 10X اجتماعات الأطراف (7.0 درجة الحموضة، وحماية من الضوء)
اجتماعات الأطراف 41.85 ز 0.2 M
أسيتات الصوديوم 4.1 ز 0.05 M
EDTA، الصوديوم الملح 3.7 ز 0.01 M
المياه DEPC
مجموع 1 L
يقلب في درجة حرارة الغرفة
2 20x وعازلة SSC (7.0 درجة الحموضة)
كلوريد الصوديوم 175.3 ز 3 M
سترات الصوديوم 88.3 ز 0.3 M
المياه DEPC
مجموع 1 L
يقلب في درجة حرارة الغرفة، ثم الأوتوكلاف
3 صبغ تتبع
عازلة 10X اجتماعات الأطراف 500 ميكرولتر 1X
Ficoll 400 0.75 ز 15٪
برموفينول الأزرق 0.01 ز 0.2٪
سيانول زايلين 0.01 ز 0.2٪
المياه DEPC
مجموع 5 مل
مخزن في -20 ° C
4 المياه DEPC
تمييع النسبة 1: 1000 من DEPC في ده 2 O
يقلب بين عشية وضحاها في درجة حرارة الغرفة، ثم الأوتوكلاف
5 عينة العازلة (حماية من الضوء)
عازلة 10X اجتماعات الأطراف 200 ميكرولتر
37٪ الفورمالديهايد 270 ميكرولتر
الفورماميد 660 ميكرولتر
مخزن في -20 ° C
Name Company Catalog Number Comments
RNaseZap solution Ambion AM9782 Protocol 1.1
TRI Reagent solution Ambion AM9738 Protocol 1.2.1.1
1-Bromo-3-chloropropane (BCP) Sigma B9673 Protocol 1.2.1.3
Ethanol JTbaker 8006 Protocol 1.2.1.3
Isopropanol Sigma I9516 Protocol 1.2.1.3
GenElute mRNA Miniprep Kit Sigma MRN70 Protocol 1.2.2.1
Glycogen Ambion AM9510 Protocol 1.2.2.2
Sodium acetate Fluka 71183 Protocol 1.2.2.2
Nuclease-free water Ambion AM9930 Protocol 1.2.2.6
DEPC Sigma D5758 Protocol 2.1.1
Agarose JT Baker A426 Protocol 2.1.2
MOPS Sigma M1254 Protocol 2.1.3
37% formaldehyde Solution Sigma F8775 Protocol 2.1.3
EDTA, Disodium Salt JT Baker 8993 Protocol 2.1.3 10x MOPS buffer
formamide Sigma F7503 Protocol 2.2.1
RNA Millennium Marker Ambion AM7150 Protocol 2.2.2
Ethidium Bromide Amresco X328 Protocol 2.2.5
Ficoll PM400 GE Healthcare 17-0300-10 Protocol 2.2.5 tracking dye
Bromophenol blue Sigma 114391 Protocol 2.2.5 tracking dye
Xylene Cyanol FF Sigma X4126 Protocol 2.2.5 tracking dye
Sodium chloride dihydrate JT Baker 3624 Protocol 2.4.2 20x SSC buffer
Trisodium citrate Sigma S1804 Protocol 2.4.2 20x SSC buffer
Hybond Blotting Paper GE Healthcare RPN6101M Protocol 2.4.4
GE Hybond-N+ membrane GE Healthcare RPN303B Protocol 2.4.6
Stratalinker UV Crosslinker 2400 Stratagene 400075 Protocol 3.1.2
Gel Catcher 1500 ANT Technology Gel Catcher 1500 Protocol 3.1.5
Anti-m6A (N6-methyladenosine) Synaptic Systems 202003 Protocol 3.2.3
Amersham ECL Anti-Rabbit IgG, HRP-linkd whole Ab GE Healthcare NA934 Protocol 3.2.5
ChemiDoc MP System BIO-RAD 1708280 Protocol 3.2.8

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Thammana, P., Held, W. A. Methylation of 16S RNA during ribosome assembly in vitro. Nature. 251 (5477), 682-686 (1974).
  2. Meyer, K. D., Jaffrey, S. R. The dynamic epitranscriptome: N6-methyladenosine and gene expression control. Nat Rev Mol Cell Biol. 15 (5), 313-326 (2014).
  3. Niu, Y., et al. N6-methyl-adenosine (m6A) in RNA: an old modification with a novel epigenetic function. Genomics Proteomics Bioinformatics. 11 (1), 8-17 (2013).
  4. Wang, C. Y., et al. Loss of FTO in adipose tissue decreases Angptl4 translation and alters triglyceride metabolism. Sci Signal. 8 (407), 127 (2015).
  5. Wang, X., et al. N6-methyladenosine-dependent regulation of messenger RNA stability. Nature. 505 (7481), 117-120 (2014).
  6. Berulava, T., Rahmann, S., Rademacher, K., Klein-Hitpass, L., Horsthemke, B. N6-adenosine methylation in MiRNAs. PLoS One. 10 (2), 0118438 (2015).
  7. Deng, X., et al. Widespread occurrence of N6-methyladenosine in bacterial mRNA. Nucleic Acids Res. 43 (13), 6557-6567 (2015).
  8. Dominissini, D., et al. The dynamic N-methyladenosine methylome in eukaryotic messenger RNA. Nature. , (2016).
  9. Fustin, J. M., et al. RNA-methylation-dependent RNA processing controls the speed of the circadian clock. Cell. 155 (4), 793-806 (2013).
  10. Geula, S., et al. Stem cells. m6A mRNA methylation facilitates resolution of naive pluripotency toward differentiation. Science. 347 (6225), 1002-1006 (2015).
  11. Wang, C. Y., et al. FTO modulates fibrogenic responses in obstructive nephropathy. Sci Rep. , SREP18874 (2016).
  12. Jia, G., et al. N6-methyladenosine in nuclear RNA is a major substrate of the obesity-associated FTO. Nat Chem Biol. 7 (12), 885-887 (2011).
  13. Du, T., et al. An association study of the m6A genes with major depressive disorder in Chinese Han population. J Affect Disord. 183, 279-286 (2015).
  14. Wang, C. Y., Yeh, J. K., Shie, S. S., Hsieh, I. C., Wen, M. S. Circadian rhythm of RNA N6-methyladenosine and the role of cryptochrome. Biochem Biophys Res Commun. 465 (1), 88-94 (2015).
  15. Wang, C. Y., Shie, S. S., Hsieh, I. C., Tsai, M. L., Wen, M. S. FTO modulates circadian rhythms and inhibits the CLOCK-BMAL1-induced transcription. Biochem Biophys Res Commun. 464 (3), 826-832 (2015).
  16. Heyn, H., Esteller, M. An Adenine Code for DNA: A Second Life for N6-Methyladenine. Cell. 161 (4), 710-713 (2015).
  17. Xiao, W., et al. Nuclear m(6)A Reader YTHDC1 Regulates mRNA Splicing. Mol Cell. 61 (4), 507-519 (2016).
  18. Meyer, K. D., et al. Comprehensive analysis of mRNA methylation reveals enrichment in 3' UTRs and near stop codons. Cell. 149 (7), 1635-1646 (2012).
  19. Horowitz, S., Horowitz, A., Nilsen, T. W., Munns, T. W., Rottman, F. M. Mapping of N6-methyladenosine residues in bovine prolactin mRNA. Proc Natl Acad Sci U S A. 81 (18), 5667-5671 (1984).
  20. Resnick, R. J., Noreen, D., Munns, T. W., Perdue, M. L. Role of N6-methyladenosine in expression of Rous sarcoma virus RNA: analyses utilizing immunoglobulin specific for N6-methyladenosine. Prog Nucleic Acid Res Mol Biol. 29, 214-218 (1983).
  21. Golovina, A. Y., et al. Method for site-specific detection of m6A nucleoside presence in RNA based on high-resolution melting (HRM) analysis. Nucleic Acids Res. 42 (4), 27 (2014).
  22. Dominissini, D., et al. Topology of the human and mouse m6A RNA methylomes revealed by m6A-seq. Nature. 485 (7397), 201-206 (2012).
  23. Linder, B., et al. Single-nucleotide-resolution mapping of m6A and m6Am throughout the transcriptome. Nat Methods. 12 (8), 767-772 (2015).
  24. Fu, L., et al. Simultaneous Quantification of Methylated Cytidine and Adenosine in Cellular and Tissue RNA by Nano-Flow Liquid Chromatography-Tandem Mass Spectrometry Coupled with the Stable Isotope-Dilution Method. Anal Chem. 87 (15), 7653-7659 (2015).
  25. Rio, D. C., Ares, M., Hannon, G. J., Nilsen, T. W. Nondenaturing agarose gel electrophoresis of RNA. Cold Spring Harb Protoc. 2010 (6), 5445 (2010).
  26. Wang, C. Y., et al. FTO modulates fibrogenic responses in obstructive nephropathy. Sci Rep. 6, 18874 (2016).
  27. Li, X., et al. Transcriptome-wide mapping reveals reversible and dynamic N-methyladenosine methylome. Nat Chem Biol. , (2016).
  28. Sanschagrin, S., Yergeau, E. Next-generation sequencing of 16S ribosomal RNA gene amplicons. J Vis Exp. (90), (2014).
  29. Kukutla, P., Steritz, M., Xu, J. Depletion of ribosomal RNA for mosquito gut metagenomic RNA-seq. J Vis Exp. (74), (2013).
  30. Mishima, E., et al. Immuno-Northern Blotting: Detection of RNA Modifications by Using Antibodies against Modified Nucleosides. PLoS One. 10 (11), 0143756 (2015).
  31. Klungland, A., Dahl, J. A. Dynamic RNA modifications in disease. Curr Opin Genet Dev. 26, 47-52 (2014).

Tags

الكيمياء الحيوية، العدد 118، RNA، م
طريقة لقياس الحمض النووي الريبي<em&gt; N</em<sup&gt; 6</sup&gt; -methyladenosine تعديلات في الخلايا والأنسجة
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Wang, C. Y., Lin, M. H., Su, H. T. A … More

Wang, C. Y., Lin, M. H., Su, H. T. A Method for Measuring RNA N6-methyladenosine Modifications in Cells and Tissues. J. Vis. Exp. (118), e54672, doi:10.3791/54672 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter