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Biochemistry

Um método para medir RNA Published: December 5, 2016 doi: 10.3791/54672
Automatic Translation
1, 1, 1
1Department of Cardiology, Chang Gung Memorial Hospital, Chang Gung University College of Medicine

Summary

Um método de transferência Northern modificado para medir N 6 -methyladenosine (M 6) Um modificações em RNA é descrito. O actual método pode detectar modificações em diversos RNAs e controles sob vários modelos experimentais.

Protocol

NOTA: O total RNA m 6 A nível inclui rRNA, mRNA, e outros pequenos RNAs. Desde RNA ribossomal tem abundantes m 6 modificações A, a medição da m 6 levels terá de considerar este fato.

Isolamento 1. RNA

  1. Usando a solução ribonuclease descontaminação (pulverizado sobre toalhas de papel), limpe as pipetas e superfícies das bancadas do laboratório. papel-toalha molhada com água livre de nuclease e limpar as pipetas e superfícies das bancadas do laboratório novamente.
  2. Extração de RNA
    1. Isolamento de ARN total
      1. Usando um agitador suspenso, homogeneizar 50-100 mg de tecido ou 5-10 X 10 6 células em 1 mL de solução de isolamento de ARN mantidas a 4 ° C.
        NOTA: Mais tecido (100-150 mg) pode ser necessária para amostras de tecido adiposo de ratos por causa das concentrações de ARN inferiores das mesmas. As amostras provenientes de rato coração, fígado, músculo esquelético, o pulmão, cérebro, e os macrófagos foram empregues quatro anteriormente.
      2. DentroCubate os homogenatos de amostra durante 5 minutos a temperatura ambiente.
      3. Adicionar 100 uL de 1-bromo-3-cloropropano (BCP) por 1 ml de homogenato da amostra. Agitar vigorosamente os tubos durante 15 s e proceder para isolar o ARN total de acordo com as instruções do fabricante 24.
    2. A purificação a partir de ARNm poliadenilado do RNA total isolado
      1. Purificar mRNA poliadenilados usando kits ou protocolos disponíveis.
        1. Agitar minuciosamente para re-suspender cada uma das seguintes soluções: A solução de ligação, oligo (dT) de grânulos de poliestireno, e a solução de lavagem 2x. Certifique-se de que o oligo (dT) grânulos quentes à temperatura ambiente antes do uso.
        2. Transferir 120 uL da solução de eluição por preparação para um tubo de calor e a 70 ° C num bloco de aquecimento.
        3. Pipeta-se 500 ^ g de ARN total para um tubo de microcentrífuga. Com água livre de nuclease, ajustar o volume para 250 mL.
        4. Adicionar 250 uL de solução de ligação 2x para o ARN total assimlução e agitar com vortex brevemente para misturar o conteúdo.
        5. Adicionar 15 ul de oligo (dT) e grânulos de vórtice para misturar completamente.
        6. Incubar a mistura a 70 ° C durante 3 min.
        7. Retirar a amostra do bloco de aquecimento e deixou-se em repouso à temperatura ambiente durante 10 min.
        8. Centrifugar a 15000 xg durante 2 min.
        9. Remova cuidadosamente o sobrenadante, deixando para trás cerca de 50 mL.
        10. Adicionar 500 uL de solução de lavagem para re-suspender o sedimento por pipetagem.
        11. Pipetar a suspensão em um conjunto tubo de filtro de spin / coleção.
        12. Centrifugar a 15000 xg durante 2 min. Retirar a coluna do tubo de recolha e o descarte de fluxo. Retornar a coluna para o tubo de recolha.
        13. Pipetar 500 L de solução de lavagem para o filtro de rotação.
        14. Centrifugar a 15.000 x g durante 2 min.
        15. Transferência do filtro de rotação para um tubo de recolha de fresco.
        16. Pipetar 50 ul de solução de eluição aquecidaa 70 ° C para o centro do filtro de rotação.
        17. Incubar durante 2-5 min a 70 ° C. Centrifugar a 15000 xg durante 1 min.
        18. Pipetar um adicional de 50 ul de solução de eluição aquecida a 70 ° C para o centro do filtro de rotação.
        19. Repita o passo 1.2.2.1.18.
      2. Adicionam-se 100 ug / mL de glicogénio, 0,1 volume de tampão de acetato de sódio 3 M (pH 5,2), e 2,5 volumes de etanol absoluto. Precipitar durante a noite a -80 ° C.
      3. Centrifuga-se a 15000 xg durante 25 min a 4 ° C. Descartar o sobrenadante.
      4. Lava-se a pelete com 1 ml de etanol a 75%. Centrifuga-se a 15000 xg durante 15 min a 4 ° C. Retire cuidadosamente o etanol.
      5. Seco ao ar durante 3-5 min.
      6. Adicionar 10 ul de água isenta de nuclease para dissolver o sedimento.
      7. Armazenar a -70 ° C.
  3. RNA qualificação e quantificação
    1. Usando um espectrofotómetro para determinar a concentração de ARN por NotIng a absorvância a 260 nm e 280 nm. A relação A260 / A280 deve ser 1,8-2,2.
    2. Verifique a qualidade da amostra de RNA usando 0,8% eletroforese em gel de agarose 25.
      NOTA: O RNA total eucariótica intacta deve mostrar intensas bandas de 28S e 18S rRNA. A proporção de 28S contra 18S rRNA intensidade da banda para uma boa preparação de RNA é ~ 2.

2. eletroforese em gel e Transferência

NOTA: Os protocolos de preparação tampão são dadas na Tabela 1.

  1. Formaldeído Preparação de gel (1%)
    1. Lavar todo o equipamento de eletroforese com dietilpirocarbonato (DEPC) de água.
    2. Melt 2,5 g de agarose em 215 ml de água com DEPC completamente num forno de microondas.
    3. Adicionar 12,5 ml de 10x 3- (N- morfolino) propanossulfónico (MOPS) Tampão e 22,5 ml de formaldeído a 37%.
    4. Deite-o no aparelho de electroforese com um pente de espessura de 1,5 mm.
    5. Eliminar as bolhas ou empurrar tbainha para as bordas do gel com um pente limpo.
    6. Deixar o gel solidificar à temperatura ambiente.
  2. Preparação de amostra
    1. Misture 1-10 ug de ARN total, e 11,3 ul de tampão de amostra.
    2. Misturar 2 ug do marcador de ARN (1 mg / mL) com 11,3 mL de tampão de amostra.
    3. Adicionar água isenta de nuclease para as amostras a partir de 2.2.1 e 2.2.2 para um volume total de 16 uL.
    4. Aquecer a 60 ° C durante 5 min, e em seguida esfriar em gelo.
    5. Misturar 16 ul da amostra a partir de 2.2.3 com 4 ul de corante de acompanhamento, que contém 0,1 mg / mL de brometo de etidio em gelo.
      CUIDADO: O brometo de etídio é, possivelmente, teratogênico e tóxico se inalado. Leia brometo de etídio segurança folha de dados.
  3. eletroforese
    1. Adicione 200 ml de 10x tampão MOPS a 1.800 mL de DDH 2 O para fazer um tampão de corrida 1x MOPS.
    2. Utilize tampão de corrida 1x MOPS para lavar os poços do gel.
    3. Pré-run tele gel a 20 V durante 5 minutos.
    4. Coloque as amostras de ARN para os poços do gel.
    5. Cubra com papel alumínio para evitar a exposição à luz. Execute a 35 V durante cerca de 17 h (durante a noite)
    6. Examinar e fotografar o gel sob uma luz UV.
  4. Transferir
    1. Cortar o gel para remover a porção não utilizada.
    2. Preparar 500 ml de 10x tampão SSC (250 ml de 20x tampão SSC e 250 mL de água com DEPC).
    3. Lavar o gel duas vezes com 10x tampão SSC durante 20 min com agitação a 50 rpm.
    4. Cortar uma folha de papel de filtro suficientemente grande para servir como um pavio de papel, que absorve tampão de transferência do tabuleiro de transferência (figura 1).
    5. Corte 4 pedaços de papel de filtro para o mesmo tamanho que o gel.
    6. Cortar uma folha de membrana de nylon carregada positivamente para o mesmo tamanho que o gel.
    7. Marcar um entalhe sobre o gel e a membrana, como um marcador para assegurar a orientação correcta.
    8. Embeber a membrana em tampão SSC 2x durante 15 min.
    9. Despeje 500 ml of 10x SSC tampão na bandeja de transferência.
    10. Coloque a folha de papel de filtro grande do outro lado da placa de vidro e molhar o papel de filtro com tampão de transferência.
    11. Rolar para fora todas as bolhas com uma pipeta.
    12. Soak 2 peças de papel de filtro pré-corte em tampão de transferência e coloca-os no centro do papel de filtro a partir do passo 2.4.5. Remover quaisquer bolhas.
    13. Lay topo do lado do gel para baixo no papel de filtro.
    14. Colocar a membrana no topo do gel. Alinhar os entalhes do gel e da membrana.
    15. Coloque 2 peças de papel de filtro pré-corte na parte superior da membrana e molha o filtro de papel com tampão de transferência.
    16. Remover quaisquer bolhas entre as camadas.
    17. Aplicar película de plástico em torno do gel para garantir que as toalhas apenas absorver tampão que passa através do gel e da membrana.
    18. Empilhar as toalhas de papel no topo do papel de filtro.
    19. Coloque uma placa de vidro de grandes dimensões em cima das toalhas.
    20. Coloque um peso no topo da pilha.
    21. Manter durante a noite para permitir que o ARN de transferência do gel para a membrana.

3. Detecção de N 6 -methyladenosine

  1. membrana de reticulação
    1. Mantenha a membrana úmida em tampão 2x SSC.
    2. Coloque 2 folhas de papel de filtro imerso com 10x tampão SSC em reticulador de UV.
    3. Colocar a membrana no topo do papel de filtro, com o lado da ARN-adsorvido voltado para cima.
    4. Selecione "Modo autocrosslink" (120.000 μJ) e pressione o botão "Iniciar" para iniciar a irradiação.
    5. Examinar a membrana e o gel com uma imagem do gel de UV coletor para confirmar a transferência de ARN do gel para a membrana.
  2. immunoblotting
    1. Bloquear a membrana em leite sem gordura a 5% em solução salina tamponada com Tris com Tween 20 (TBST) de tampão à temperatura ambiente durante 1 h.
    2. Lavar três vezes com tampão de TBST, durante 15 min.
    3. Incubar a membrana durante a noite em 6 m A (<em> solução de N 6 -methyladenosine) anticorpo (1: não gordo leite tampão TBST 1000 em 5%) a 4 ° C.
    4. Lava-se a membrana três vezes com tampão de TBST, durante 15 min.
    5. Incubar a membrana na solução de burro conjugado com HRP anti-anticorpo de coelho (1: 2000 em tampão TBST leite 5% sem gordura) durante 1 h à temperatura ambiente.
    6. Lava-se a membrana três vezes com tampão de TBST, durante 15 min.
    7. Aplicar o substrato quimioluminescente melhorado (0,125 ml por cm2 de membrana).
    8. Capture a quimiluminescência com as definições ideais de o gerador de imagens digitais, de acordo com as instruções do fabricante 26.
  3. m 6 A Quantificação
    1. Medir a 6 m Uma intensidade quimioluminescente relativa utilizando o software ImageJ.
      1. Sob o menu do software ImageJ, selecione a opção "File" para abrir o arquivo pertinente.
      2. Selecione a ferramenta "Retângulo" de ImageJ e desenhar uma moldura em voltaos sinais.
      3. Se RNA ribossomal não é o foco dos experimentos, evitar os 18S e 28S RNA ribossomal m 6 a bandas para o cálculo.
      4. Clique "Comando" e "1" para confirmar a pista seleccionada.
      5. Pressione "Command" e "3" para mostrar o enredo selecionado.
      6. Clique no botão "Straight" ferramenta e desenhe linhas para separar a área segmentada.
      7. Clique na ferramenta "Wand" para gravar as medições.
      8. Exportar os dados.
      9. Normalizar os níveis de M 6 um com o ARN ribossómico 18S banda da coloração com brometo de etídio.

Representative Results

Após 14 dias em fase circadiana luz-escuro normais, os ratinhos do tipo selvagem foram colocadas em escuridão constante. Os ARN de fígado foram amostrados a intervalos de 4 horas e estudaram com Northern blotting modificado. A metilação de ARNr, ARNm, e pequenos RNAs foram claramente detectadas (Figura 2). A comparação entre os diferentes tempos circadianos (CT) pode ser calculado com precisão com o padrão de rRNA 18S. Houve oscilação circadiana robusto de m 6 levels em rRNA, mRNA, e pequenos RNAs.

Para evitar a interferência oferecida por ARNr, RNAs poliadenilados pode ser purificado, tal como no passo 1.2.2. Após purificação, o rRNA pode ser largamente eliminada para permitir uma melhor visualização de outros ARN (Figura 3).

figura 1
g> Figura 1: Montagem da unidade de transferência blot. A unidade de transferência capilar para blotting do ARN para a membrana é mostrado. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2
Figura 2: Ritmo circadiano dos m 6 levels em camundongos C57BL / 6J. Esta figura mostra a M 6 Um blot de ARN total a partir de fígados de ratinhos de tipo selvagem sacrificados no primeiro dia da fase de escuro-escuro após 14 dias de uma fase de luz-escuro normal em intervalos de 4 h. A quantificação foi feita usando o m 6 A diferença de densidade de imagem entre 18S e 28S rRNA. O M 6 Uma abundância foi normalizada para a banda de ARNr 18S a partir do gel de formaldeído na parte inferior.et = "_ blank"> Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3
Figura 3: Os m 6 borrões com ou sem rRNA. M representativas 6-blots de ARN total e ARN poliadenilado a partir de fígados de ratinhos do tipo selvagem são mostradas. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Tabela 1: Os tampões e soluções.

Disclosures

Os autores não têm nada para revelar.

Materials

1 tampão 10x MOPS (pH 7,0, proteger da luz)
MOPS 41.85 g 0,2 M
O acetato de sódio 4.1 g 0,05 M
EDTA, sal dissódico 3.7 g 0,01 M
água DEPC
Total 1 eu
Agita-se à temperatura ambiente
2 tampão SSC 20x (pH 7,0)
O cloreto de sódio 175,3 g 3 M
citrato trissódico 88,3 g 0,3 M
água DEPC
Total 1 eu
Agita-se à temperatura ambiente, em seguida, autoclave
3 Acompanhando Dye
tampão 10x MOPS 500 ul 1x
Ficoll 400 0,75 g 15%
azul de bromofenol 0,01 g 0,2%
xileno cianol 0,01 g 0,2%
água DEPC
Total 5 mL
Armazenar a -20 ° C
4 água DEPC
Diluir proporção de 1: 1000 de DEPC em ddH2O
Agita-se durante a noite à temperatura ambiente, em seguida, autoclave
5 tampão de amostra (proteger da luz)
tampão 10x MOPS 200 ul
37% de formaldeído 270 ul
formamida 660 ul
Armazenar a -20 ° C
Name Company Catalog Number Comments
RNaseZap solution Ambion AM9782 Protocol 1.1
TRI Reagent solution Ambion AM9738 Protocol 1.2.1.1
1-Bromo-3-chloropropane (BCP) Sigma B9673 Protocol 1.2.1.3
Ethanol JTbaker 8006 Protocol 1.2.1.3
Isopropanol Sigma I9516 Protocol 1.2.1.3
GenElute mRNA Miniprep Kit Sigma MRN70 Protocol 1.2.2.1
Glycogen Ambion AM9510 Protocol 1.2.2.2
Sodium acetate Fluka 71183 Protocol 1.2.2.2
Nuclease-free water Ambion AM9930 Protocol 1.2.2.6
DEPC Sigma D5758 Protocol 2.1.1
Agarose JT Baker A426 Protocol 2.1.2
MOPS Sigma M1254 Protocol 2.1.3
37% formaldehyde Solution Sigma F8775 Protocol 2.1.3
EDTA, Disodium Salt JT Baker 8993 Protocol 2.1.3 10x MOPS buffer
formamide Sigma F7503 Protocol 2.2.1
RNA Millennium Marker Ambion AM7150 Protocol 2.2.2
Ethidium Bromide Amresco X328 Protocol 2.2.5
Ficoll PM400 GE Healthcare 17-0300-10 Protocol 2.2.5 tracking dye
Bromophenol blue Sigma 114391 Protocol 2.2.5 tracking dye
Xylene Cyanol FF Sigma X4126 Protocol 2.2.5 tracking dye
Sodium chloride dihydrate JT Baker 3624 Protocol 2.4.2 20x SSC buffer
Trisodium citrate Sigma S1804 Protocol 2.4.2 20x SSC buffer
Hybond Blotting Paper GE Healthcare RPN6101M Protocol 2.4.4
GE Hybond-N+ membrane GE Healthcare RPN303B Protocol 2.4.6
Stratalinker UV Crosslinker 2400 Stratagene 400075 Protocol 3.1.2
Gel Catcher 1500 ANT Technology Gel Catcher 1500 Protocol 3.1.5
Anti-m6A (N6-methyladenosine) Synaptic Systems 202003 Protocol 3.2.3
Amersham ECL Anti-Rabbit IgG, HRP-linkd whole Ab GE Healthcare NA934 Protocol 3.2.5
ChemiDoc MP System BIO-RAD 1708280 Protocol 3.2.8

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References

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