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Biochemistry

Verfahren zum Messen von RNA Published: December 5, 2016 doi: 10.3791/54672
Automatic Translation
1, 1, 1
1Department of Cardiology, Chang Gung Memorial Hospital, Chang Gung University College of Medicine

Summary

Modifiziertes Northern - Blotting - Verfahren für N 6 -methyladenosine (m 6 A) Änderungen in RNA Messung beschrieben. Die aktuelle Methode können Änderungen in diversen RNAs und Kontrollen unter verschiedenen experimentellen Designs erkennen.

Protocol

HINWEIS: Die Gesamt - RNA m 6 A Ebene umfasst rRNA, mRNA, und andere kleine RNAs. Da ribosomale RNA hat reichlich m 6 A Änderungen, müssen die Messung von m 6 A - Levels , diese Tatsache zu berücksichtigen.

1. RNA-Isolierung

  1. Mit Hilfe der Ribonuklease Dekontaminationslösung (gesprüht auf Papiertücher), reinigen Sie die Pipetten und Labortisch Oberflächen. Nasse Papiertücher mit Nuklease-freies Wasser und wischen Sie Pipetten und Labortisch taucht wieder auf.
  2. RNA-Extraktion
    1. Gesamt-RNA-Isolation
      1. Mit einem Overhead - Rührer, homogenisieren 50-100 mg Gewebe oder 5-10 x 10 6 Zellen in 1 ml RNA Isolationslösung bei 4 ° C gehalten.
        HINWEIS: Weitere Gewebe (100-150 mg) für Fettgewebe Proben von Mäusen erforderlich wegen der niedrigeren RNA-Konzentrationen darin. Proben aus Mäuse Herz, Leber, Skelettmuskel, Lunge, Gehirn stammen und Makrophagen zuvor 4 eingesetzt wurden.
      2. Imcubate die Probe Homogenate für 5 Minuten bei Raumtemperatur.
      3. Füge 100 & mgr; l 1-Brom-3-chlorpropan (BCP) pro 1 ml Probe Homogenat. Schütteln der Röhrchen kräftig für 15 s und verfahren Gesamt - RNA zu isolieren , gemäß den Anweisungen des Herstellers 24.
    2. Die polyadenylierte mRNA Purification von isolierten Gesamt-RNA
      1. Reinige polyadenylierte mRNA unter Verwendung von erhältlichen Kits oder Protokolle.
        1. Schütteln gründlich resuspendieren jeder der folgenden Lösungen: 2x Bindungslösung, Oligo (dT) Polystyrol-Kügelchen und Waschlösung. Sicherzustellen, dass das Oligo (dT) -Kügelchen erwärme auf Raumtemperatur vor dem Gebrauch.
        2. Übertragung von 120 & mgr; l Elutionslösung pro Zubereitung in ein Rohr und Wärme auf 70 ° C in einem Heizblock.
        3. Pipette bis zu 500 ug Gesamt-RNA in ein Mikrozentrifugenröhrchen. Mit nukleasefreiem Wasser, stellen Sie die Lautstärke auf 250 & mgr; l.
        4. In 250 ul 2x Bindungslösung auf die Gesamt-RNA solution und Wirbel kurz den Inhalt zu mischen.
        5. In 15 ul Oligo (dT) Perlen und Wirbel gründlich zu mischen.
        6. Inkubieren der Mischung bei 70 ° C für 3 min.
        7. Entfernen Sie die Probe aus dem Heizblock und lassen Sie es 10 Minuten lang bei Raumtemperatur stehen.
        8. Zentrifuge bei 15.000 g für 2 min.
        9. Entfernen Sie vorsichtig den Überstand, hinter etwa 50 & mgr; l zu verlassen.
        10. In 500 ul Waschlösung zum Resuspendieren des Pellets durch Pipettieren.
        11. Pipette, um die Suspension in einen Spinfilter / Sammelrohr-Set.
        12. Zentrifuge bei 15.000 g für 2 min. Entfernen Sie die Säule aus Sammelröhrchen und entsorgen Sie die Durchfluss. Bringen Sie die Spalte an die Sammelröhrchen.
        13. Pipette 500 ul Waschlösung auf den Spinfilter.
        14. Zentrifuge bei 15.000 x g für 2 min.
        15. Übertragen Sie die Spinfilter in ein frisches Sammelröhrchen.
        16. Pipettieren von 50 & mgr; l Elutionslösung erhitztbis 70 ° C auf das Zentrum des Spinfilters.
        17. Inkubieren für 2-5 min bei 70 ° C. Zentrifuge bei 15.000 × g für 1 min.
        18. Pipettieren zusätzlich 50 & mgr; l Elutionslösung auf 70 ° C auf das Zentrum des Spinfilters.
        19. Wiederholen Sie Schritt 1.2.2.1.18.
      2. Je 100 & mgr; g / mL Glykogen, 0,1 Volumen von 3 M Natriumacetat-Puffer (pH 5,2) und 2,5 Volumina absolutem Ethanol. Man fällt über Nacht bei -80 ° C.
      3. Zentrifuge bei 15.000 xg für 25 min bei 4 ° C. Überstand verwerfen.
      4. Waschen Sie das Pellet mit 1 ml 75% Ethanol. Zentrifuge bei 15.000 xg für 15 min bei 4 ° C. Sie vorsichtig das Ethanol zu entfernen.
      5. Trockene Luft für 3-5 min.
      6. Fügen Sie 10 ul Nuklease-freies Wasser, um das Pellet aufzulösen.
      7. Lagern Sie bei -70 ° C.
  3. RNA Qualifizierung und Quantifizierung
    1. Verwendung eines Spektrophotometers, bestimmen die RNA-Konzentration durch NotIng der Absorption bei 260 nm und 280 nm. Die A 260 / A 280 Verhältnis sollte 1,8-2,2 sein.
    2. Schauen Sie sich die RNA - Probe Qualität unter Verwendung von 0,8% Agarose - Gelelektrophorese 25.
      HINWEIS: Die intakte eukaryotischen Gesamt-RNA intensiv 28S und 18S rRNA-Banden zeigen. Das Verhältnis von 28S rRNA 18S gegen Bandenintensität für eine gute RNA-Präparation ist ~ 2.

2. Gel-Elektrophorese und Übertragung

HINWEIS: Die Puffervorbereitungsprotokollen sind in Tabelle 1.

  1. Formaldehyd-Gel-Vorbereitung (1%)
    1. Spülen Sie alle Elektrophoreseapparaturen mit Diethylpyrocarbonat (DEPC) Wasser.
    2. Schmelze 2,5 g Agarose in 215 ml DEPC Wasser vollständig in einem Mikrowellenofen.
    3. Hinzufügen 12,5 ml 10x 3- (N- Morpholino) propansulfonsäure (MOPS) -Puffer und 22,5 ml 37% Formaldehyd.
    4. Gießen Sie es in die Elektrophorese-Gerät mit einer 1,5 mm dicken Kamm.
    5. Beseitigen Sie Blasen oder Push them zu den Kanten des Gels mit einem sauberen comb.
    6. Lassen Sie das Gel bei Raumtemperatur zu verfestigen.
  2. Probenvorbereitung
    1. Mischen 1-10 ug Gesamt-RNA und 11,3 & mgr; l Probenpuffer.
    2. Mix 2 ug der RNA-Marker (1 & mgr; g / & mgr; l) mit 11,3 & mgr; l des Probenpuffers.
    3. In nukleasefreiem Wasser zu den Proben von 2.2.1 und 2.2.2 bis zu einem Gesamtvolumen von 16 & mgr; l.
    4. Hitze bei 60 ° C für 5 min, und dann auf Eis kühlen.
    5. Mischungs 16 & mgr; l der Probe aus 2.2.3 mit 4 ul Tracking-Farbstoff, welche 0,1 & mgr; g enthält / & mgr; l Ethidiumbromid auf Eis.
      ACHTUNG: Ethidiumbromid ist möglicherweise teratogen und giftig beim Einatmen. Lesen Sie Ethidiumbromid Sicherheitsdatenblatt.
  3. Elektrophorese
    1. In 200 ml 10x MOPS bis 1.800 ml ddH 2 O - Puffer mit einem 1x MOPS Laufpuffer zu machen.
    2. Verwenden Sie die 1x MOPS Laufpuffer die Vertiefungen des Gels zu spülen.
    3. Pre-run ter Gel bei 20 V für 5 min.
    4. Laden die RNA-Proben in die Vertiefungen des Gels.
    5. Mit Folie abdecken Lichtexposition zu vermeiden. Führen Sie bei 35 V für etwa 17 Stunden (über Nacht)
    6. Untersuchen und fotografieren Sie das Gel unter UV-Licht.
  4. Übertragung
    1. Schneiden Sie das Gel den ungenutzten Teil zu entfernen.
    2. Bereiten 500 ml 10x SSC-Puffer (250 ml 20x SSC-Puffer und 250 ml DEPC-Wasser).
    3. Waschen Sie das Gel zweimal mit 10x SSC-Puffer für 20 min mit 50 Umdrehungen pro Minute schütteln.
    4. Cut 1 Filterpapierblatt groß genug , um als Docht Papier zu dienen, die Transferpuffer aus der Übertragungsschale (Abbildung 1) aufnimmt.
    5. Schneiden 4 Stück Filterpapier der gleichen Größe wie das Gel.
    6. Geschnitten 1 Blatt positiv geladene Nylonmembran auf die gleiche Größe wie das Gel.
    7. Markieren eine Kerbe auf dem Gel und die Membran als eine Markierung, um die richtige Ausrichtung zu gewährleisten.
    8. Einweichen der Membran in 2 × SSC-Puffer für 15 min.
    9. Gießen Sie 500 ml of 10x SSC-Puffer in die Transferschale.
    10. Legen Sie das große Filterpapierbogen über der Glasplatte und benetzt das Filterpapier mit Transferpuffer.
    11. Ausrollen alle Blasen mit einer Pipette.
    12. Soak 2 Stück vorgeschnittene Filterpapier in Transferpuffer und legen sie auf die Mitte des Filterpapiers aus Schritt 2.4.5. Entfernen Sie alle Blasen.
    13. Legen Sie das Gel von oben nach unten auf dem Filterpapier.
    14. Legen Sie die Membran auf der Oberseite des Gels. Ausrichten der Kerben des Gels und der Membran.
    15. Platz 2 Stücke von vorgeschnittenen Filterpapier auf der Oberseite der Membran und benetzt das Filterpapier mit Transferpuffer.
    16. Entfernen Sie alle Blasen zwischen den Schichten.
    17. Tragen Sie Plastikfolie um das Gel, um sicherzustellen, dass die Handtücher genießen nur Puffer durch das Gel vorbei und die Membran.
    18. Stapeln Sie die Papiertücher auf dem Filterpapier.
    19. Legen Sie eine überdimensionale Glasplatte auf der Oberseite der Handtücher.
    20. Legen Sie ein Gewicht auf der Oberseite des Stapels.
    21. Halten über Nacht die RNA zu ermöglichen, aus dem Gel auf die Membran zu übertragen.

3. Nachweis von N 6 -methyladenosine

  1. Membran-Crosslinking
    1. Halten Sie die Membran feucht in 2x SSC-Puffer.
    2. Platz 2 Blätter Filterpapier eingetaucht mit 10x SSC-Puffer in den UV-Vernetzer.
    3. Platzieren Sie die Membran auf der Oberseite des Filterpapiers, mit dem RNA-adsorbierten Seite nach oben.
    4. Wählen Sie "autocrosslink Modus" (120.000 & mgr; J) und drücken Sie die Schaltfläche "Start" die Bestrahlung zu initiieren.
    5. Untersuche die Membran und das Gel mit einem UV Gelbild Fängers die RNA-Transfer von dem Gel auf die Membran zu bestätigen.
  2. Immunoblotting
    1. Blockieren die Membran in 5% fettfreier Milch in Tris-gepufferter Kochsalzlösung mit Tween 20 (TBST) Puffer bei Raumtemperatur für 1 Stunde.
    2. Waschen dreimal mit TBST-Puffer für 15 min.
    3. Inkubieren Sie die Membran über Nacht in m 6 A (<em> N 6 -methyladenosine) Antikörperlösung (1: 1000 in 5% fettfreier Milch TBST - Puffer) bei 4 ° C.
    4. Waschen Sie die Membran dreimal mit TBST-Puffer für 15 min.
    5. Inkubieren der Membran in dem HRP-konjugierter Esel-Anti-Kaninchen-Antikörperlösung (1: 2000 in 5% fettfreier Milch TBST-Puffer) für 1 h bei Raumtemperatur.
    6. Waschen Sie die Membran dreimal mit TBST-Puffer für 15 min.
    7. Wenden Sie den verstärkten chemolumineszenten Substrat (0,125 ml pro cm 2 Membran).
    8. Erfassen die Chemilumineszenz mit den optimalen Einstellungen des Digital Imager nach den Anweisungen des Herstellers 26.
  3. m 6 A Quantifizierung
    1. Messen Sie die relative m 6 A Chemilumineszenzintensität mit der ImageJ Software.
      1. Unter dem ImageJ Software Wählen Sie im Menü "Datei" Option, um die zugehörigen Datei zu öffnen.
      2. Wählen Sie das "Rechteck" Werkzeug aus ImageJ und einen Rahmen ziehen umdie Signale.
      3. Wenn ribosomale RNA nicht im Mittelpunkt der Experimente ist, vermeiden Sie die 18S und 28S ribosomale RNA m 6 A Bänder für die Berechnung.
      4. Klicken Sie auf "Befehl" und "1" die gewählte Spur zu bestätigen.
      5. Drücken Sie die "Command" und "3" das ausgewählte Grundstück zu zeigen.
      6. Klicken Sie auf den "Straight" Werkzeug und Linien zeichnen den segmentierten Bereich zu trennen.
      7. Klicken Sie auf die "Wand" Werkzeug, um die Messungen aufzuzeichnen.
      8. Exportieren Sie die Daten.
      9. Normalisieren die Niveaus von m 6 A mit der 18S ribosomale RNA - Bande aus dem Ethidiumbromidfärbung.

Representative Results

Nach 14 Tagen im normalen Licht-Dunkel-zirkadianen Phase, die Wildtyp-Mäuse wurden in konstanter Dunkelheit platziert. Die RNAs aus der Leber wurden bei 4 Stunden Intervallen abgetastet und mit modifiziertem Northern-Blotting untersucht. Die Methylierung von rRNAs, mRNAs und kleine RNAs wurden eindeutig nachgewiesen (Figur 2). Der Vergleich zwischen den verschiedenen Tageszeiten (CT) kann genau mit der 18S rRNA-Standard berechnet werden. Es gab robuste zirkadiane Oszillation von m 6 A - Spiegel in rRNA, mRNA und kleinen RNAs.

Um die Störungen zu vermeiden, indem rRNA dargebotene kann polyadenylierte RNA gereinigt werden, wie es in Schritt 1.2.2. Nach der Reinigung kann die rRNA weitgehend eliminiert zur besseren Visualisierung der anderen RNAs (Figur 3) zu ermöglichen.

Abbildung 1
g> Abbildung 1: Die Blot-Transfereinheit zusammenbauen. Die kapillare Übertragungseinheit für die RNA an die Membran-Blotting gezeigt. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Figur 2
Abbildung 2: Circadian Rhythmus der m 6 A - Spiegel in C57BL / 6J - Mäusen. Diese Abbildung zeigt die m 6 A - Blot von Gesamt - RNA aus der Leber von Wildtyp - Mäusen am ersten Tag des Dunkeldunkelphase nach 14 Tagen einer normalen Hell-Dunkel - Phase bei 4 h Intervallen geopfert. Die Quantifizierung wurde mit der m getan 6 A Bilddichteunterschied zwischen 18S und 28S rRNA. Die m 6 A Fluss wurde am Boden mit dem 18S - rRNA - Band aus dem Formaldehyd - Gel normalisiert.et = "_ blank"> Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Figur 3
Abbildung 3: Die m 6 A Blots mit oder ohne rRNA. Representative m 6 A - Blots von Gesamt - RNA und polyadenylierte RNA aus der Leber von Wildtyp - Mäusen gezeigt. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Tabelle 1: Puffer und Lösungen.

Disclosures

Die Autoren haben nichts zu offenbaren.

Materials

1 10x MOPS-Puffer (pH 7,0, vor Licht schützen)
MOPS 41,85 G 0,2 M
Natriumacetat 4.1 G 0,05 M
EDTA, Dinatriumsalz 3.7 G 0,01 M
DEPC Wasser
Gesamt 1 L
Rühre bei Raumtemperatur
2 20x SSC-Puffer (pH 7,0)
Kochsalz 175,3 G 3 M
Trinatriumcitrat 88.3 G 0,3 M
DEPC Wasser
Gesamt 1 L
Rühre bei Raumtemperatur, dann autoklaviert
3 Tracking-Dye
10x MOPS-Puffer 500 ul 1x
Ficoll 400 0,75 G 15%
Bromphenolblau 0,01 G 0,2%
Xylencyanol 0,01 G 0,2%
DEPC Wasser
Gesamt 5 ml
Lagerung bei -20 ° C
4 DEPC Wasser
Verdünnen Verhältnis bei 1: 1000 von DEPC in ddH 2 O
Rühre über Nacht bei Raumtemperatur, dann autoklaviert
5 Probenpuffer (vor Licht schützen)
10x MOPS-Puffer 200 ul
37% Formaldehyd 270 ul
Formamid 660 ul
Lagerung bei -20 ° C
Name Company Catalog Number Comments
RNaseZap solution Ambion AM9782 Protocol 1.1
TRI Reagent solution Ambion AM9738 Protocol 1.2.1.1
1-Bromo-3-chloropropane (BCP) Sigma B9673 Protocol 1.2.1.3
Ethanol JTbaker 8006 Protocol 1.2.1.3
Isopropanol Sigma I9516 Protocol 1.2.1.3
GenElute mRNA Miniprep Kit Sigma MRN70 Protocol 1.2.2.1
Glycogen Ambion AM9510 Protocol 1.2.2.2
Sodium acetate Fluka 71183 Protocol 1.2.2.2
Nuclease-free water Ambion AM9930 Protocol 1.2.2.6
DEPC Sigma D5758 Protocol 2.1.1
Agarose JT Baker A426 Protocol 2.1.2
MOPS Sigma M1254 Protocol 2.1.3
37% formaldehyde Solution Sigma F8775 Protocol 2.1.3
EDTA, Disodium Salt JT Baker 8993 Protocol 2.1.3 10x MOPS buffer
formamide Sigma F7503 Protocol 2.2.1
RNA Millennium Marker Ambion AM7150 Protocol 2.2.2
Ethidium Bromide Amresco X328 Protocol 2.2.5
Ficoll PM400 GE Healthcare 17-0300-10 Protocol 2.2.5 tracking dye
Bromophenol blue Sigma 114391 Protocol 2.2.5 tracking dye
Xylene Cyanol FF Sigma X4126 Protocol 2.2.5 tracking dye
Sodium chloride dihydrate JT Baker 3624 Protocol 2.4.2 20x SSC buffer
Trisodium citrate Sigma S1804 Protocol 2.4.2 20x SSC buffer
Hybond Blotting Paper GE Healthcare RPN6101M Protocol 2.4.4
GE Hybond-N+ membrane GE Healthcare RPN303B Protocol 2.4.6
Stratalinker UV Crosslinker 2400 Stratagene 400075 Protocol 3.1.2
Gel Catcher 1500 ANT Technology Gel Catcher 1500 Protocol 3.1.5
Anti-m6A (N6-methyladenosine) Synaptic Systems 202003 Protocol 3.2.3
Amersham ECL Anti-Rabbit IgG, HRP-linkd whole Ab GE Healthcare NA934 Protocol 3.2.5
ChemiDoc MP System BIO-RAD 1708280 Protocol 3.2.8

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References

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Biochemie Heft 118 RNA m Methylierungs Demethylase FTO Epitranscriptome
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