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Biochemistry

Un método para medir el ARN Published: December 5, 2016 doi: 10.3791/54672
Automatic Translation
1, 1, 1
1Department of Cardiology, Chang Gung Memorial Hospital, Chang Gung University College of Medicine

Summary

Se describe un método de transferencia de Northern modificado para la medición de N 6 -methyladenosine (m 6 A) las modificaciones en el ARN. El método actual puede detectar modificaciones en diversos ARN y controles en virtud de diversos diseños experimentales.

Protocol

NOTA: El ARN total m 6 A nivel incluye ARNr, ARNm, y otros ARN pequeños. Puesto que el ARN ribosomal tiene abundantes m 6 modificaciones A, la medición de los niveles A 6 m deberán tener en cuenta este hecho.

1. Aislamiento de ARN

  1. El uso de la solución de descontaminación ribonucleasa (pulveriza sobre toallas de papel), limpie las pipetas y las superficies de mesa de laboratorio. toallas de papel mojadas con agua libre de nucleasa y limpiar las pipetas y las superficies de mesa de laboratorio de nuevo.
  2. La extracción de RNA
    1. Aislamiento de ARN total
      1. El uso de un agitador de cabeza, homogeneizar 50-100 mg de tejido o de 5-10 x 10 6 células en 1 ml de solución de aislamiento de ARN mantenidas a 4 ° C.
        NOTA: Más de tejido (100-150 mg) pueden ser necesarios para las muestras de tejido adiposo de ratones debido a las concentraciones de ARN más bajos en el mismo. Las muestras proceden de corazón de ratón, hígado, músculo esquelético, pulmón, cerebro, y los macrófagos se han empleado previamente 4.
      2. EnCubate los homogeneizados de muestra durante 5 min a temperatura ambiente.
      3. Añadir 100 ml de 1-bromo-3-cloropropano (BCP) por 1 ml de homogeneizado de la muestra. Agitar los tubos vigorosamente durante 15 s y proceder a aislar RNA total de acuerdo con las instrucciones del fabricante 24.
    2. Poliadenilado de purificación de ARNm a partir de ARN total aislado
      1. Purificar el ARNm poliadenilado utilizando kits o protocolos disponibles.
        1. Agitar a fondo para volver a suspender cada una de las siguientes soluciones: solución de enlace, perlas de poliestireno oligo (dT), y solución de lavado de 2x. Asegúrese de que el oligo (dT) Cuentas de calentar a temperatura ambiente antes de su uso.
        2. Transferir 120 l de solución de elución por la preparación en un tubo y se calienta a 70 ° C en un bloque de calentamiento.
        3. Pipetear hasta 500 g de ARN total en un tubo de microcentrífuga. Con agua libre de nucleasa, ajustar el volumen a 250 mL.
        4. Añadir 250 l de solución de enlace 2x con el ARN total, de modolución y vortex brevemente para mezclar el contenido.
        5. Añadir 15 l de oligo (dT) perlas y mezclar bien para mezclar.
        6. Incubar la mezcla a 70 ° C durante 3 min.
        7. Sacar la muestra del bloque de calentamiento y se deja reposar a temperatura ambiente durante 10 min.
        8. Se centrifuga a 15.000 xg durante 2 min.
        9. Retirar con cuidado el sobrenadante, dejando atrás aproximadamente 50 l.
        10. Añadir 500 l de solución de lavado a una nueva suspensión del sedimento con la pipeta.
        11. Pipetear la suspensión en un conjunto tubo de filtro giratorio / colección.
        12. Se centrifuga a 15.000 xg durante 2 min. Retirar la columna del tubo de recogida y desechar el flujo a través. Retorno de la columna para el tubo de recogida.
        13. Pipetear 500 l de solución de lavado sobre el filtro de centrifugado.
        14. Centrifugar a 15.000 x g durante 2 min.
        15. Transferir el filtro giratorio en un tubo de recogida fresca.
        16. Pipetear 50 l de solución de elución calientaa 70 ° C en el centro del filtro de centrifugado.
        17. Incubar durante 2-5 minutos a 70 ° C. Se centrifuga a 15.000 xg durante 1 min.
        18. Pipetear un 50 l adicionales de solución de elución se calienta a 70 ° C en el centro del filtro de centrifugado.
        19. Repita el paso 1.2.2.1.18.
      2. Añadir 100 g / ml de glucógeno, 0,1 volumen de tampón de sodio 3 M de acetato (pH 5,2) y 2,5 volúmenes de etanol absoluto. Precipitar durante la noche a -80 ° C.
      3. Centrifugar a 15.000 xg durante 25 min a 4 ° C. Descartar el sobrenadante.
      4. Lavar el sedimento con 1 ml de 75% de etanol. Centrifugar a 15.000 xg durante 15 min a 4 ° C. Retirar con cuidado el etanol.
      5. Secar al aire durante 3-5 min.
      6. Añadir 10 l de agua libre de nucleasa a disolver el precipitado.
      7. Almacenar a -70 ° C.
  3. Calificación y Cuantificación de ARN
    1. El uso de un espectrofotómetro, determinar la concentración de ARN por NotIng de la absorbancia a 260 nm y 280 nm. La relación A 260 / A 280 debería ser 1/8 a 2/2.
    2. Comprobar la calidad de las muestras de ARN mediante electroforesis en gel de agarosa al 0,8% 25.
      NOTA: El ARN total eucariota intacta debería mostrar intensas bandas 28S y 18S rRNA. La relación de 28S frente a la intensidad de banda 18S rRNA para una buena preparación de ARN es ~ 2.

2. Electroforesis en gel y transferencia

NOTA: Los protocolos de preparación de tampón se dan en la Tabla 1.

  1. El formaldehído Preparación del gel (1%)
    1. Enjuague todo el equipo de electroforesis con agua diethylpyrocarbonate (DEPC).
    2. Derretir 2,5 g de agarosa en 215 ml de agua DEPC completamente en un horno de microondas.
    3. Añadir 12,5 ml de 10x 3- (N- morfolino) propanosulfónico (MOPS) tampón y 22,5 ml de formaldehído al 37%.
    4. Se vierte en el aparato de electroforesis con un peine de espesor 1,5 mm.
    5. Eliminar las burbujas o empujar tdobladillo a los bordes del gel con un peine limpia.
    6. Permitir que el gel solidifique a temperatura ambiente.
  2. Preparación de la muestra
    1. Mezclar 1-10 g de ARN total y 11,3 l de tampón de muestra.
    2. Mezclar 2 g del marcador de ARN (1 g / l) con 11,3 l de tampón de la muestra.
    3. Añadir agua libre de nucleasa a las muestras de 2.2.1 y 2.2.2 a un volumen total de 16 mL.
    4. Se calienta a 60 ° C durante 5 min, y luego se enfría en hielo.
    5. Mezclar 16 l de la muestra a partir de 2.2.3 con 4 l de colorante de seguimiento, que contiene 0,1 g / l de bromuro de etidio en hielo.
      PRECAUCIÓN: El bromuro de etidio es teratogénico y posiblemente tóxicos si se inhalan. Leer bromuro de etidio hoja técnica de seguridad.
  3. electroforesis
    1. Añadir 200 ml de 10x MOPS buffer de 1.800 ml de ddH2O para hacer un tampón de desarrollo 1x MOPS.
    2. Utilice el tampón de MOPS 1x para enjuagar los pocillos del gel.
    3. Previa al funcionamiento de tél gel a 20 V durante 5 min.
    4. Cargar las muestras de ARN en los pocillos del gel.
    5. Cubrir con papel de aluminio para evitar la exposición a la luz. Ejecutar a 35 V durante aproximadamente 17 h (durante la noche)
    6. Examinar y fotografiar el gel bajo una luz ultravioleta.
  4. Transferir
    1. Cortar el gel para eliminar la parte no utilizada.
    2. Preparar 500 ml de tampón 10x SSC (250 ml de 20x tampón SSC y 250 ml de agua DEPC).
    3. Se lava el gel dos veces con 10x tampón SSC durante 20 min con agitación a 50 rpm.
    4. Cortar la hoja de papel 1 de filtro suficientemente grande para servir como un documento de mecha, que absorbe tampón de transferencia de la bandeja de transferencia (Figura 1).
    5. Cortar 4 trozos de papel de filtro para el mismo tamaño que el gel.
    6. Cortar 1 hoja de membrana de nylon cargada positivamente con el mismo tamaño que el gel.
    7. Marque una muesca en el gel y la membrana como un marcador para asegurar la orientación apropiada.
    8. Remojar la membrana en tampón SSC 2x durante 15 minutos.
    9. Verter 500 ml de Of 10x SSC tampón en la bandeja de transferencia.
    10. Ponga la hoja de papel de filtro grande a través de la placa de vidrio y humedecer el papel de filtro con tampón de transferencia.
    11. Estirar las burbujas con una pipeta.
    12. Remojar 2 piezas de papel de filtro de pre-corte en tampón de transferencia y colocarlos en el centro del papel de filtro de paso 2.4.5. Eliminar las burbujas.
    13. Coloque el lado superior del gel en el papel de filtro.
    14. Colocar la membrana en la parte superior del gel. Alinear las muescas del gel y la membrana.
    15. Colocar 2 piezas de papel de filtro de pre-corte en la parte superior de la membrana y humedecer el papel de filtro con tampón de transferencia.
    16. Eliminar las burbujas entre las capas.
    17. Aplicar una envoltura de plástico alrededor del gel para asegurar que las toallas solamente absorben tampón que pasa por el gel y la membrana.
    18. Pila de las toallas de papel en la parte superior del papel de filtro.
    19. Colocar una placa de vidrio de gran tamaño en la parte superior de las toallas.
    20. Coloque un peso en la parte superior de la pila.
    21. Mantener durante la noche para permitir que el ARN para transferir desde el gel a la membrana.

3. Detección de N 6 -methyladenosine

  1. La reticulación de la membrana
    1. Mantener la membrana húmeda en tampón SSC 2x.
    2. Coloque 2 hojas de papel de filtro sumergido con tampón 10x SSC en agente de reticulación UV.
    3. Colocar la membrana en la parte superior del papel de filtro, con el lado de ARN adsorbido hacia arriba.
    4. Seleccionar "modo autocrosslink" (120.000 mu J) y pulse el botón "Inicio" para iniciar la irradiación.
    5. Examinar la membrana y el gel con una imagen gel receptor UV para confirmar la transferencia del ARN del gel a la membrana.
  2. inmunotransferencia
    1. Bloquear la membrana en la leche no grasa 5% en solución salina tamponada con Tris con 20 tampón de Tween (TBST) a temperatura ambiente durante 1 hr.
    2. Lavar tres veces con tampón de TBST durante 15 min.
    3. Incubar la membrana durante la noche en m 6 A (<em> solución de N 6 -methyladenosine) de anticuerpos (1: no grasa de la leche TBST buffer 1.000 en 5%) a 4 ° C.
    4. Se lava la membrana tres veces con tampón de TBST durante 15 min.
    5. Incubar la membrana en la solución de burro conjugado con HRP anti-anticuerpo de conejo (1: 2000 en tampón TBST leche 5% no grasa) durante 1 h a temperatura ambiente.
    6. Se lava la membrana tres veces con tampón de TBST durante 15 min.
    7. Aplicar el sustrato quimioluminiscente intensificado (0,125 ml por cm2 de membrana).
    8. Capturar la quimioluminiscencia con los ajustes óptimos de la cámara digital, de acuerdo con las instrucciones del fabricante 26.
  3. m 6 una cuantificación
    1. Medir la m 6 Una intensidad de quimioluminiscencia relativa utilizando el software ImageJ.
      1. Bajo el menú del software ImageJ, seleccione la opción "Archivo" para abrir el archivo pertinente.
      2. Seleccione la herramienta "Rectángulo" de ImageJ y dibujar un marco alrededorlas señales.
      3. Si RNA ribosomal no es el foco de los experimentos, evitar los 18S y 28S ARN ribosomal m 6 bandas A para el cálculo.
      4. Haga clic en "Comando" y "1" para confirmar el carril seleccionado.
      5. Pulse la tecla "Comando" y "3" para mostrar la parcela seleccionada.
      6. Haga clic en la herramienta "Straight" y trazar líneas para separar el área segmentada.
      7. Haga clic en la herramienta "varita" para registrar las mediciones.
      8. Exportar los datos.
      9. Normalizar los niveles de m 6 A con el 18S ARN ribosomal banda de la tinción con bromuro de etidio.

Representative Results

Después de 14 días en la fase circadiana normal de luz-oscuridad, los ratones de tipo salvaje se colocaron en la oscuridad constante. Los ARN de hígado fueron muestreados a intervalos de 4 horas y estudiados con el norte de secante modificada. La metilación de rRNAs, mRNAs, y pequeños RNAs se detectaron claramente (Figura 2). La comparación entre diferentes momentos circadianos (CT) se puede calcular con precisión con el estándar de 18S rRNA. Hubo robusta oscilación circadiana de m 6 niveles A en ARNr, ARNm y ARN pequeños.

Para evitar la interferencia ofrecida por ARNr, ARN poliadenilados se pueden purificar, como en el paso 1.2.2. Después de la purificación, el rRNA puede ser eliminado en gran medida para permitir una mejor visualización de los otros ARN (Figura 3).

Figura 1
g> Figura 1: Montaje de la unidad de transferencia blot. Se muestra la unidad de transferencia capilar para secar el ARN a la membrana. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2
Figura 2: El ritmo circadiano de los m 6 niveles A en ratones C57BL / 6J. Esta figura muestra la m 6 Una mancha de ARN total de hígado de los ratones de tipo salvaje se sacrificó en el primer día de la fase oscura-oscura después de 14 días de una fase normal de luz-oscuridad a las 4 h intervalos. La cuantificación se realizó utilizando el m 6 A diferencia de densidad de imagen entre 18S y 28S rRNA. El m 6 Un abundancia se normalizó a la banda de 18S rRNA de la gel de formaldehído en la parte inferior.et = "_ blank"> Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 3
Figura 3: Los m 6 borrones A con o sin rRNA. M representativos se muestran 6 A borrones de ARN total y ARN poliadenilado de los hígados de los ratones de tipo salvaje. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Tabla 1: Los tampones y soluciones.

Disclosures

Los autores no tienen nada que revelar.

Materials

1 10x tampón MOPS (pH 7,0, protegerlo de la luz)
MOPS 41.85 gramo 0,2 M
Acetato de sodio 4.1 gramo 0,05 M
EDTA, sal disódica 3.7 gramo 0,01 M
agua DEPC
Total 1 L
Se agita a temperatura ambiente
2 tampón SSC 20x (pH 7,0)
Cloruro de sodio 175.3 gramo 3 M
Citrato de trisodio 88.3 gramo 0,3 M
agua DEPC
Total 1 L
Se agita a temperatura ambiente, a continuación, el autoclave
3 colorante guía
10x tampón MOPS 500 l 1x
Ficoll 400 0.75 gramo 15%
azul de bromofenol 0.01 gramo 0,2%
xileno cianol 0.01 gramo 0,2%
agua DEPC
Total 5 ml
Almacenar a -20 ° C
4 agua DEPC
Diluir en relación 1: 1.000 de DEPC en ddH2O
Se agita durante la noche a temperatura ambiente, a continuación, el autoclave
5 tampón de muestra (protegerlo de la luz)
10x tampón MOPS 200 l
37% de formaldehído 270 l
formamida 660 l
Almacenar a -20 ° C
Name Company Catalog Number Comments
RNaseZap solution Ambion AM9782 Protocol 1.1
TRI Reagent solution Ambion AM9738 Protocol 1.2.1.1
1-Bromo-3-chloropropane (BCP) Sigma B9673 Protocol 1.2.1.3
Ethanol JTbaker 8006 Protocol 1.2.1.3
Isopropanol Sigma I9516 Protocol 1.2.1.3
GenElute mRNA Miniprep Kit Sigma MRN70 Protocol 1.2.2.1
Glycogen Ambion AM9510 Protocol 1.2.2.2
Sodium acetate Fluka 71183 Protocol 1.2.2.2
Nuclease-free water Ambion AM9930 Protocol 1.2.2.6
DEPC Sigma D5758 Protocol 2.1.1
Agarose JT Baker A426 Protocol 2.1.2
MOPS Sigma M1254 Protocol 2.1.3
37% formaldehyde Solution Sigma F8775 Protocol 2.1.3
EDTA, Disodium Salt JT Baker 8993 Protocol 2.1.3 10x MOPS buffer
formamide Sigma F7503 Protocol 2.2.1
RNA Millennium Marker Ambion AM7150 Protocol 2.2.2
Ethidium Bromide Amresco X328 Protocol 2.2.5
Ficoll PM400 GE Healthcare 17-0300-10 Protocol 2.2.5 tracking dye
Bromophenol blue Sigma 114391 Protocol 2.2.5 tracking dye
Xylene Cyanol FF Sigma X4126 Protocol 2.2.5 tracking dye
Sodium chloride dihydrate JT Baker 3624 Protocol 2.4.2 20x SSC buffer
Trisodium citrate Sigma S1804 Protocol 2.4.2 20x SSC buffer
Hybond Blotting Paper GE Healthcare RPN6101M Protocol 2.4.4
GE Hybond-N+ membrane GE Healthcare RPN303B Protocol 2.4.6
Stratalinker UV Crosslinker 2400 Stratagene 400075 Protocol 3.1.2
Gel Catcher 1500 ANT Technology Gel Catcher 1500 Protocol 3.1.5
Anti-m6A (N6-methyladenosine) Synaptic Systems 202003 Protocol 3.2.3
Amersham ECL Anti-Rabbit IgG, HRP-linkd whole Ab GE Healthcare NA934 Protocol 3.2.5
ChemiDoc MP System BIO-RAD 1708280 Protocol 3.2.8

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References

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