Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

Метод для измерения РНК Published: December 5, 2016 doi: 10.3791/54672
Automatic Translation
1, 1, 1
1Department of Cardiology, Chang Gung Memorial Hospital, Chang Gung University College of Medicine

Summary

Модифицированный северный блоттинг метод измерения N 6 -methyladenosine (м 6 а) изменения в РНК описана. Текущий метод может обнаружить изменения в различных РНК и элементов управления в различных экспериментальных конструкций.

Protocol

Примечание: Общую РНК м 6 Уровень включает рРНК, мРНК и другие малые РНК. Так как рибосомальной РНК имеет обильные м 6 модификаций А, измерение м 6 уровней А необходимо будет рассмотреть этот факт.

Выделение 1. РНК

  1. Используя решение рибонуклеазы дезактивации (разбрызгивают на бумажные полотенца), протрите пипеток и лабораторного стола поверхности. Влажные бумажные полотенца с нуклеазы без воды и протирать пипеток и лабораторного стола поверхности снова.
  2. Экстракция РНК
    1. Общая Выделение РНК
      1. С помощью верхней мешалки, гомогенизируют 50-100 мг ткани или 5-10 х 10 6 клеток в 1 мл раствора для выделения РНК выдерживали при 4 ° С.
        Примечание: больше ткани (100-150 мг), которые могут потребоваться для образцов жировой ткани мышей из-за более низкой концентрации РНК в них. Образцы получены из сердца мыши, печени, скелетных мышцах, легких, головного мозга, и макрофаги были использованы ранее 4.
      2. Вcubate выборочные гомогенатов в течение 5 мин при комнатной температуре.
      3. Добавляют 100 мкл 1-бром-3-хлорпропана (БКП) на 1 мл образца гомогената. Встряхнуть пробирки энергично в течение 15 секунд и приступить к изоляции общей РНК в соответствии с инструкциями изготовителя 24.
    2. Полиаденилированная мРНК Очистка от изолированной Общую РНК
      1. Очищают Полиаденилированная мРНК с использованием доступных наборов или протоколов.
        1. Тщательно взболтать, чтобы вновь приостановить каждое из следующих решений: 2x связывающего раствора, олиго (дТ) полистирольные шарики и промывочный раствор. Убедитесь, что олиго (дТ) бусин нагреться до комнатной температуры перед использованием.
        2. Перенести 120 мкл элюирующего раствора на препарата в пробирку и нагревают до 70 ° С в нагревательном блоке.
        3. Пипетировать до 500 мкг общей РНК в микроцентрифужных трубки. С помощью нуклеазы без воды, регулировать громкость до 250 мкл.
        4. Добавьте 250 мкл раствора связывающего 2x до полной РНК, таклюция и вихрь коротко перемешать содержимое.
        5. Добавьте 15 мкл олиго (дТ) бусы и вихрь тщательно перемешать.
        6. Выдержите смесь при температуре 70 ° С в течение 3 мин.
        7. Извлеките образец из нагревательного блока и дать постоять при комнатной температуре в течение 10 мин.
        8. Центрифуга при 15000 мкг в течение 2 мин.
        9. Осторожно удалите супернатант, оставляя позади приблизительно 50 мкл.
        10. Добавьте 500 мкл промывочного раствора повторно приостанавливать осадок пипетированием.
        11. Пипетировать суспензии в набор спинового фильтра / сбора трубки.
        12. Центрифуга при 15000 мкг в течение 2 мин. Удалить столбец из коллекторной трубки и отбросить проточные. Вернуть колонку в пробирку.
        13. Пипетка 500 мкл промывочного раствора на спиновый фильтр.
        14. Центрифуга при 15000 х г в течение 2 мин.
        15. Перенести спиновый фильтр в новую пробирку для сбора.
        16. Пипетка 50 мкл элюирующего раствора нагреваютдо 70 ° С на центр спинового фильтра.
        17. Выдержите в течение 2-5 мин при температуре 70 ° С. Центрифуга при 15000 мкг в течение 1 мин.
        18. Пипетировать дополнительно 50 мкл элюирующего раствора нагревают до 70 ° С на центр спинового фильтра.
        19. Повторите шаг 1.2.2.1.18.
      2. Добавить 100 мкг / мл гликогена, 0,1 объема 3 М буфере ацетата натрия (рН 5,2) и 2,5 объема абсолютного этанола. Осадок в течение ночи при -80 ° С.
      3. Центрифуга при 15000 х г в течение 25 мин при температуре 4 ° С. Удалите супернатант.
      4. Промывают осадок с 1 мл 75% -ного этанола. Центрифуга при 15000 х г в течение 15 мин при температуре 4 ° С. Осторожно удалите этанол.
      5. Сушить в воздухе в течение 3-5 мин.
      6. Добавьте 10 мкл нуклеазы без воды, чтобы растворить осадок.
      7. Хранить при температуре -70 ° С.
  3. РНК Квалификация и Количественная
    1. С помощью спектрофотометра, определяют концентрацию РНК в присутствии NotIнг оптическую плотность при длине волны 260 нм и 280 нм. Отношение А 260 / А 280 должно быть 1,8-2,2.
    2. Проверка качества образцов РНК с использованием 0,8% агарозном геле 25.
      ПРИМЕЧАНИЕ: неповрежденными эукариотической суммарную РНК должны показать интенсивные полосы 28S и 18S рРНК. Отношение 28S в сравнении интенсивности полос 18S рРНК для хорошей подготовки РНК составляет ~ 2.

2. Гель электрофорез и передачи

Примечание: Протоколы подготовки буфера приведены в таблице 1.

  1. Формальдегид гель Приготовление (1%)
    1. Промыть все оборудование электрофорез с диэтилпирокарбонатом (DEPC) водой.
    2. Melt 2,5 г агарозы в 215 мл воды DEPC полностью в микроволновой печи.
    3. Добавить 12,5 мл 10х 3- (N - морфолино) пропансульфоновой кислоты (MOPS) буфер и 22,5 мл 37% -ного формальдегида.
    4. Налейте его в аппарате для электрофореза с толстым гребнем 1,5 мм.
    5. Устранить пузырьки или толкать трубчик к краям геля с чистым гребнем.
    6. Дайте гель затвердеть при комнатной температуре.
  2. Базовые приготовления
    1. Смешайте 1-10 мкг общей РНК и 11,3 мкл буфера для образцов.
    2. Смешайте 2 мкг РНК-маркера (1 мкг / мкл) 11,3 мкл буфера для образцов.
    3. Добавить нуклеазы без воды к образцам из 2.2.1, 2.2.2 до общего объема 16 мкл.
    4. Нагревают при 60 ° С в течение 5 минут, а затем охладить на льду.
    5. Смешайте 16 мкл образца из 2.2.3 с 4 мкл отслеживания красителя, который содержит 0,1 мкг / мкл этидийбромид на льду.
      ВНИМАНИЕ: этидий бромид, возможно, тератогенным и токсичен при вдыхании. Read этидий бромид технический паспорт безопасности.
  3. электрофорез
    1. Добавить 200 мл 10х MOPS буфера до 1800 мл DDH 2 O , чтобы сделать 1x MOPS работает буфера.
    2. Используйте 1x MOPS работает буфера для промывки лунок геля.
    3. Предварительно запуск тон гель при 20 В в течение 5 мин.
    4. Загрузка образцов РНК в лунки геля.
    5. Покрытие с фольгой, чтобы избежать попадания света. Запуск на 35 В в течение приблизительно 17 ч (в течение ночи)
    6. Осмотрите и сфотографируйте гель под УФ-светом.
  4. Перевод
    1. Вырезать гель для удаления неиспользованную часть.
    2. Приготовьте 500 мл 10х SSC-буфере (250 мл 20x SSC буфера и 250 мл DEPC воды).
    3. Вымойте гель дважды с 10-кратным SSC буфером в течение 20 мин при встряхивании при 50 оборотах в минуту.
    4. Вырезать 1 бумажный фильтр лист , достаточно большой , чтобы служить в качестве фитиля бумаги, впитывающей буфера переноса с передающего лотка (рисунок 1).
    5. Вырезать 4 куска фильтровальной бумаги такого же размера, что и гель.
    6. Порезать 1 лист положительно заряженную нейлоновую мембрану в тот же размер, что и гель.
    7. Отметить насечку на геле и мембрану в качестве маркера, чтобы обеспечить правильную ориентацию.
    8. Замочите мембрану в 2х буфера SSC ​​в течение 15 мин.
    9. Залить 500 мл оF 10x SSC буфера в передаточную лоток.
    10. Положите большой фильтр бумажного листа через стеклянную пластину и смочить фильтровальную бумагу буфера переноса.
    11. Раскатать все пузырьки с пипеткой.
    12. Замочить 2 куска фильтровальной бумаги предварительно вырезанное в буфере передачи и поместить их в центр фильтровальной бумаги со стадии 2.4.5. Удалите все пузырьки.
    13. Уложить гель верхняя сторона была обращена вниз на фильтровальную бумагу.
    14. Lay мембрану поверх геля. Совместите вырезы геля и мембраны.
    15. Поместите 2 куска фильтровальной бумаги предварительно вырезанное на верхней стороне мембраны и смочить фильтровальную бумагу буфера переноса.
    16. Удалите все пузырьки между слоями.
    17. Нанести пластмассовую обертку вокруг геля, чтобы гарантировать, что полотенца только впитывать буфер, проходящий через гель и мембрану.
    18. Стек бумажные полотенца на верхней части фильтровальной бумаги.
    19. Поместите негабаритный стеклянную пластину поверх полотенца.
    20. Поместите вес на верхней части стека.
    21. Держите в течение ночи, чтобы позволить РНК перенести из геля на мембрану.

3. Обнаружение N 6 -methyladenosine

  1. Мембрана Сшивание
    1. Держите мембрану влажной в буфер 2x SSC.
    2. Поместите 2 листа фильтровальной бумаги, погруженной с 10x SSC буфером в УФ сшивателя.
    3. Поместите мембрану в верхней части фильтровальной бумаги, чтобы сторона с РНК-адсорбированной лицевой стороной вверх.
    4. Выберите режим "autocrosslink" (120000 мкДж) и нажмите кнопку "Пуск", чтобы начать облучение.
    5. Осмотрите мембрану и гель с УФ-уловителя изображение геля, чтобы подтвердить перевод РНК из геля на мембрану.
  2. иммуноблоттинг
    1. Блок мембраны в 5% молоке обезжиренном в Трис-буферном солевом растворе с Tween 20 (TBST) буфере при комнатной температуре в течение 1 часа.
    2. Промыть трижды TBST буфером в течение 15 мин.
    3. Выдержите в течение ночи в мембрану м 6 А (<EM> N 6 -methyladenosine) раствор антитела (1: 1000 в 5% обезжиренное молоко TBST буфер) при 4 ° С.
    4. Промывают мембрану трижды TBST буфером в течение 15 мин.
    5. Инкубируйте мембраны в растворе конъюгированным с пероксидазой хрена ослиного антителам кролика (1: 2000 в 5% обезжиренном буфера молока TBST) в течение 1 ч при комнатной температуре.
    6. Промывают мембрану трижды TBST буфером в течение 15 мин.
    7. Примените расширенный хемилюминесцентный субстрат (0,125 мл на см 2 мембраны).
    8. Захват хемилюминесценции с оптимальными настройками цифрового формирования изображений, в соответствии с инструкциями изготовителя 26.
  3. м 6 A Количественное
    1. Измерьте относительную м 6 хемилюминесцентный интенсивности с использованием программного обеспечения ImageJ.
      1. В меню программного обеспечения ImageJ, выберите опцию "Файл", чтобы открыть соответствующую файл.
      2. Выберите "Прямоугольник" инструмент из ImageJ и нарисуйте рамку вокругсигналы.
      3. Если рибосомной РНК не является предметом экспериментов, избежать полос 18S и 28S рРНК м 6 А для расчета.
      4. Нажмите кнопку "Command" и "1", чтобы подтвердить выбранную полосу.
      5. Нажмите кнопку "Command" и "3", чтобы показать выбранный участок.
      6. Нажмите на "прямой" инструмент и рисовать линии, чтобы отделить сегментированный область.
      7. Нажмите кнопку "Wand" инструмент для записи измерений.
      8. Экспорт данных.
      9. Нормализовать уровень м 6 А с 18S рибосомальной РНК из группы окрашивания бромистым этидием.

Representative Results

Через 14 дней в нормальной свет-темнота циркадного фазы, мыши дикого типа, были помещены в постоянной темноте. РНК из печени отбирали каждые 4 ч и изучали с модифицированной северной блоттинга. Метилирование рРНК, мРНК, и малых РНК были четко обнаружены (рисунок 2). Сравнение между различными циркадных раза (КТ) могут быть точно вычислены со стандартом 18S рРНК. Был прочный циркадные колебания м 6 уровней А в рРНК, мРНК, и малых РНК.

Для того, чтобы избежать помех протянутую рРНК, Полиаденилированная РНК могут быть очищены, как на этапе 1.2.2. После очистки рРНК может быть в значительной степени устранены , чтобы позволить для лучшей визуализации других РНК (рисунок 3).

Рисунок 1
г> Рисунок 1: Сборка блока переноса блот. Блок переноса капиллярная для блоттинга РНК к мембране показана. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

фигура 2
Рисунок 2: Суточный ритм уровней м 6 А в C57BL / 6J. Эта цифра показывает 6 м пятном тотальной РНК из печени мышей дикого типа , забитых на первый день темно-темно - фазы через 14 дней нормального светло-темной фазы через 4 ч интервалами. Количественное было сделано с использованием м 6 разностное изображение плотности между 18S и 28S рРНК. М 6 А обилие нормализовалось к группе 18S рРНК из геля формальдегида в нижней части.и др = "_blank"> Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Рисунок 3
Рисунок 3: 6 м A кляксы с или без рРНК. Представитель м 6 A - блоты полной РНК и РНК полиаденилированой из печени мышей дикого типа показаны. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Таблица 1: Буферы и растворы.

Disclosures

Авторы не имеют ничего раскрывать.

Materials

1 10x МОПС буфер (рН 7,0, защищенном от света месте)
МОПС 41.85 г 0,2 М
Ацетат натрия 4.1 г 0,05 М
ЭДТА, динатриевой соли 3.7 г 0,01 М
DEPC воды
Всего 1 L
Перемешивают при комнатной температуре
2 20x SSC буфер (рН 7,0)
хлористый натрий 175,3 г 3 М
тринатрийцитрат 88,3 г 0,3 М
DEPC воды
Всего 1 L
Перемешивают при комнатной температуре, а затем автоклав
3 Отслеживание Dye
10x МОПС буфер 500 мкл 1x
Ficoll 400 0,75 г 15%
бромфеноловый синий 0,01 г 0,2%
ксиленцианол 0,01 г 0,2%
DEPC воды
Всего 5 мл
Хранить при температуре -20 ° C
4 DEPC воды
Развести соотношение 1: 1000 из DEPC в DDH 2 O
Перемешивают в течение ночи при комнатной температуре, а затем автоклав
5 Пример буфера (защиты от света)
10x МОПС буфер 200 мкл
37% формальдегида 270 мкл
формамид 660 мкл
Хранить при температуре -20 ° C
Name Company Catalog Number Comments
RNaseZap solution Ambion AM9782 Protocol 1.1
TRI Reagent solution Ambion AM9738 Protocol 1.2.1.1
1-Bromo-3-chloropropane (BCP) Sigma B9673 Protocol 1.2.1.3
Ethanol JTbaker 8006 Protocol 1.2.1.3
Isopropanol Sigma I9516 Protocol 1.2.1.3
GenElute mRNA Miniprep Kit Sigma MRN70 Protocol 1.2.2.1
Glycogen Ambion AM9510 Protocol 1.2.2.2
Sodium acetate Fluka 71183 Protocol 1.2.2.2
Nuclease-free water Ambion AM9930 Protocol 1.2.2.6
DEPC Sigma D5758 Protocol 2.1.1
Agarose JT Baker A426 Protocol 2.1.2
MOPS Sigma M1254 Protocol 2.1.3
37% formaldehyde Solution Sigma F8775 Protocol 2.1.3
EDTA, Disodium Salt JT Baker 8993 Protocol 2.1.3 10x MOPS buffer
formamide Sigma F7503 Protocol 2.2.1
RNA Millennium Marker Ambion AM7150 Protocol 2.2.2
Ethidium Bromide Amresco X328 Protocol 2.2.5
Ficoll PM400 GE Healthcare 17-0300-10 Protocol 2.2.5 tracking dye
Bromophenol blue Sigma 114391 Protocol 2.2.5 tracking dye
Xylene Cyanol FF Sigma X4126 Protocol 2.2.5 tracking dye
Sodium chloride dihydrate JT Baker 3624 Protocol 2.4.2 20x SSC buffer
Trisodium citrate Sigma S1804 Protocol 2.4.2 20x SSC buffer
Hybond Blotting Paper GE Healthcare RPN6101M Protocol 2.4.4
GE Hybond-N+ membrane GE Healthcare RPN303B Protocol 2.4.6
Stratalinker UV Crosslinker 2400 Stratagene 400075 Protocol 3.1.2
Gel Catcher 1500 ANT Technology Gel Catcher 1500 Protocol 3.1.5
Anti-m6A (N6-methyladenosine) Synaptic Systems 202003 Protocol 3.2.3
Amersham ECL Anti-Rabbit IgG, HRP-linkd whole Ab GE Healthcare NA934 Protocol 3.2.5
ChemiDoc MP System BIO-RAD 1708280 Protocol 3.2.8

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Thammana, P., Held, W. A. Methylation of 16S RNA during ribosome assembly in vitro. Nature. 251 (5477), 682-686 (1974).
  2. Meyer, K. D., Jaffrey, S. R. The dynamic epitranscriptome: N6-methyladenosine and gene expression control. Nat Rev Mol Cell Biol. 15 (5), 313-326 (2014).
  3. Niu, Y., et al. N6-methyl-adenosine (m6A) in RNA: an old modification with a novel epigenetic function. Genomics Proteomics Bioinformatics. 11 (1), 8-17 (2013).
  4. Wang, C. Y., et al. Loss of FTO in adipose tissue decreases Angptl4 translation and alters triglyceride metabolism. Sci Signal. 8 (407), 127 (2015).
  5. Wang, X., et al. N6-methyladenosine-dependent regulation of messenger RNA stability. Nature. 505 (7481), 117-120 (2014).
  6. Berulava, T., Rahmann, S., Rademacher, K., Klein-Hitpass, L., Horsthemke, B. N6-adenosine methylation in MiRNAs. PLoS One. 10 (2), 0118438 (2015).
  7. Deng, X., et al. Widespread occurrence of N6-methyladenosine in bacterial mRNA. Nucleic Acids Res. 43 (13), 6557-6567 (2015).
  8. Dominissini, D., et al. The dynamic N-methyladenosine methylome in eukaryotic messenger RNA. Nature. , (2016).
  9. Fustin, J. M., et al. RNA-methylation-dependent RNA processing controls the speed of the circadian clock. Cell. 155 (4), 793-806 (2013).
  10. Geula, S., et al. Stem cells. m6A mRNA methylation facilitates resolution of naive pluripotency toward differentiation. Science. 347 (6225), 1002-1006 (2015).
  11. Wang, C. Y., et al. FTO modulates fibrogenic responses in obstructive nephropathy. Sci Rep. , SREP18874 (2016).
  12. Jia, G., et al. N6-methyladenosine in nuclear RNA is a major substrate of the obesity-associated FTO. Nat Chem Biol. 7 (12), 885-887 (2011).
  13. Du, T., et al. An association study of the m6A genes with major depressive disorder in Chinese Han population. J Affect Disord. 183, 279-286 (2015).
  14. Wang, C. Y., Yeh, J. K., Shie, S. S., Hsieh, I. C., Wen, M. S. Circadian rhythm of RNA N6-methyladenosine and the role of cryptochrome. Biochem Biophys Res Commun. 465 (1), 88-94 (2015).
  15. Wang, C. Y., Shie, S. S., Hsieh, I. C., Tsai, M. L., Wen, M. S. FTO modulates circadian rhythms and inhibits the CLOCK-BMAL1-induced transcription. Biochem Biophys Res Commun. 464 (3), 826-832 (2015).
  16. Heyn, H., Esteller, M. An Adenine Code for DNA: A Second Life for N6-Methyladenine. Cell. 161 (4), 710-713 (2015).
  17. Xiao, W., et al. Nuclear m(6)A Reader YTHDC1 Regulates mRNA Splicing. Mol Cell. 61 (4), 507-519 (2016).
  18. Meyer, K. D., et al. Comprehensive analysis of mRNA methylation reveals enrichment in 3' UTRs and near stop codons. Cell. 149 (7), 1635-1646 (2012).
  19. Horowitz, S., Horowitz, A., Nilsen, T. W., Munns, T. W., Rottman, F. M. Mapping of N6-methyladenosine residues in bovine prolactin mRNA. Proc Natl Acad Sci U S A. 81 (18), 5667-5671 (1984).
  20. Resnick, R. J., Noreen, D., Munns, T. W., Perdue, M. L. Role of N6-methyladenosine in expression of Rous sarcoma virus RNA: analyses utilizing immunoglobulin specific for N6-methyladenosine. Prog Nucleic Acid Res Mol Biol. 29, 214-218 (1983).
  21. Golovina, A. Y., et al. Method for site-specific detection of m6A nucleoside presence in RNA based on high-resolution melting (HRM) analysis. Nucleic Acids Res. 42 (4), 27 (2014).
  22. Dominissini, D., et al. Topology of the human and mouse m6A RNA methylomes revealed by m6A-seq. Nature. 485 (7397), 201-206 (2012).
  23. Linder, B., et al. Single-nucleotide-resolution mapping of m6A and m6Am throughout the transcriptome. Nat Methods. 12 (8), 767-772 (2015).
  24. Fu, L., et al. Simultaneous Quantification of Methylated Cytidine and Adenosine in Cellular and Tissue RNA by Nano-Flow Liquid Chromatography-Tandem Mass Spectrometry Coupled with the Stable Isotope-Dilution Method. Anal Chem. 87 (15), 7653-7659 (2015).
  25. Rio, D. C., Ares, M., Hannon, G. J., Nilsen, T. W. Nondenaturing agarose gel electrophoresis of RNA. Cold Spring Harb Protoc. 2010 (6), 5445 (2010).
  26. Wang, C. Y., et al. FTO modulates fibrogenic responses in obstructive nephropathy. Sci Rep. 6, 18874 (2016).
  27. Li, X., et al. Transcriptome-wide mapping reveals reversible and dynamic N-methyladenosine methylome. Nat Chem Biol. , (2016).
  28. Sanschagrin, S., Yergeau, E. Next-generation sequencing of 16S ribosomal RNA gene amplicons. J Vis Exp. (90), (2014).
  29. Kukutla, P., Steritz, M., Xu, J. Depletion of ribosomal RNA for mosquito gut metagenomic RNA-seq. J Vis Exp. (74), (2013).
  30. Mishima, E., et al. Immuno-Northern Blotting: Detection of RNA Modifications by Using Antibodies against Modified Nucleosides. PLoS One. 10 (11), 0143756 (2015).
  31. Klungland, A., Dahl, J. A. Dynamic RNA modifications in disease. Curr Opin Genet Dev. 26, 47-52 (2014).

Tags

Биохимия выпуск 118 РНК м метилирование деметилазы FTO Epitranscriptome
Метод для измерения РНК<em&gt; N</em<sup&gt; 6</sup&gt; -methyladenosine Изменения в клетках и тканях
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Wang, C. Y., Lin, M. H., Su, H. T. A … More

Wang, C. Y., Lin, M. H., Su, H. T. A Method for Measuring RNA N6-methyladenosine Modifications in Cells and Tissues. J. Vis. Exp. (118), e54672, doi:10.3791/54672 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter