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Biochemistry

Une méthode pour l'ARN de mesure Published: December 5, 2016 doi: 10.3791/54672
Automatic Translation
1, 1, 1
1Department of Cardiology, Chang Gung Memorial Hospital, Chang Gung University College of Medicine

Summary

Une méthode Northern Blot modifiée pour mesurer N6- -methyladenosine (m 6 a) des modifications dans l' ARN est décrite. La méthode actuelle peut détecter des modifications dans divers ARNs et des contrôles en vertu de divers modèles expérimentaux.

Protocol

NOTE: Le m d'ARN total 6 Un niveau comprend l' ARNr, l' ARNm, et d' autres petits ARN. Depuis l' ARN ribosomal a abondant m 6 modifications A, la mesure de m 6 niveaux A devront tenir compte de ce fait.

1. Isolement de l'ARN

  1. En utilisant la solution ribonucléase de décontamination (pulvérisée sur des serviettes en papier), essuyez les pipettes et les surfaces de laboratoire de banc. serviettes en papier humides avec de l'eau sans nucléase et essuyez pipettes et des surfaces de laboratoire de banc à nouveau.
  2. Extraction d'ARN
    1. Isolement de l'ARN total
      1. En utilisant un agitateur suspendu, d' homogénéisation de 50 à 100 mg de tissu ou de 5-10 x 10 6 cellules dans 1 ml de solution d'isolement d'ARN maintenu à 4 ° C.
        NOTE: Plus le tissu (100-150 mg) peuvent être nécessaires pour des échantillons de tissu adipeux de souris en raison des concentrations d'ARN inférieures qui y sont. Les échantillons proviennent de coeur de la souris, le foie, le muscle squelettique, du poumon, du cerveau, et les macrophages ont été employées précédemment 4.
      2. Danscubate homogénats d'échantillons pendant 5 min à température ambiante.
      3. Ajouter 100 ul de 1-bromo-3-chloropropane (PCA) pour 1 ml d'échantillon d'homogénat. Agiter les tubes vigoureusement pendant 15 s et procéder à isoler l' ARN total selon les instructions du fabricant 24.
    2. Polyadénylé de purification d'ARNm de l'ARN total isolé
      1. Purifier ARNm polyadénylés à l'aide de kits ou protocoles disponibles.
        1. Bien agiter pour remettre en suspension chacune des solutions suivantes: solution de liaison, oligo (dT) des billes de polystyrène, et une solution de lavage 2x. Assurez-vous que l'oligo (dT) Perles réchauffer à la température ambiante avant utilisation.
        2. Transférer 120 pi de solution d'élution par préparation dans un tube et on chauffe à 70 ° C dans un bloc chauffant.
        3. Pipeter jusqu'à 500 pg d'ARN total dans un tube de microcentrifugation. Avec de l'eau sans nucléase, ajuster le volume à 250 pi.
        4. Ajouter 250 pi de solution de liaison 2x à l'ARN total ainsirésolu- et brièvement vortex pour mélanger le contenu.
        5. Ajouter 15 ul d'oligo (dT) et des billes vortex pour mélanger à fond.
        6. Laisser incuber le mélange à 70 ° C pendant 3 min.
        7. Retirer l'échantillon du bloc de chauffage et le laisser reposer à température ambiante pendant 10 min.
        8. Centrifuger à 15000 g pendant 2 min.
        9. Retirez délicatement le surnageant, laissant environ 50 pi.
        10. Ajouter 500 pi de solution de lavage pour resuspendre le culot par pipetage.
        11. Pipeter la suspension dans un tube ensemble filtre rotatif / collection.
        12. Centrifuger à 15000 g pendant 2 min. Retirer la colonne du tube collecteur et jeter l'écoulement. Retour à la colonne du tube de collecte.
        13. Pipette 500 pi de solution de lavage sur le filtre de spin.
        14. Centrifugeuse à 15.000 x g pendant 2 min.
        15. Transférer le filtre rotatif dans un tube de collection fraîche.
        16. Introduire à la pipette 50 ul de solution d'élution chaufféà 70 ° C sur le centre du filtre rotatif.
        17. Incuber pendant 2-5 min à 70 ° C. Centrifuger à 15000 g pendant 1 min.
        18. Pipeter une 50 ul supplémentaires de solution d'élution chauffé à 70 ° C sur le centre du filtre rotatif.
        19. Répétez l'étape 1.2.2.1.18.
      2. Ajouter 100 pg / ml de glycogène, 0,1 volume de 3 M de tampon d'acétate de sodium (pH 5,2) et 2,5 volumes d'éthanol absolu. Précipiter nuit à -80 ° C.
      3. Centrifugeuse à 15.000 xg pendant 25 min à 4 ° C. Jeter le surnageant.
      4. Laver le culot avec 1 ml d'éthanol à 75%. Centrifugeuse à 15.000 xg pendant 15 min à 4 ° C. Retirez délicatement l'éthanol.
      5. Sec à l'air pendant 3-5 min.
      6. Ajouter 10 ul d'eau sans nucléase pour dissoudre le culot.
      7. Conserver à -70 ° C.
  3. ARN Qualification et quantification
    1. À l'aide d'un spectrophotomètre, déterminer la concentration d'ARN par Notlng l'absorbance à 260 nm et 280 nm. Le rapport A 260 / A 280 devrait être de 1,8 à 2,2.
    2. Vérifier la qualité de l' échantillon d'ARN en utilisant 0,8% de gel d' agarose électrophorèse 25.
      NOTE: L'ARN total eucaryote intact devrait montrer intenses bandes 28S et 18S. Le rapport de 28S par rapport 18S intensité de la bande pour une bonne préparation de l'ARN est ~ 2.

2. Gel Electrophoresis et le transfert

REMARQUE: Les protocoles de préparation de tampon sont donnés dans le tableau 1.

  1. Préparation du gel de formaldehyde (1%)
    1. Rincer tout l'équipement d'électrophorèse avec de diéthyle (DEPC) l'eau.
    2. Faire fondre 2,5 g d'agarose dans 215 ml d'eau DEPC complètement dans un four à micro-ondes.
    3. Ajouter 12,5 ml de 10x 3- (N- morpholino) propanesulfonique (MOPS) tampon et 22,5 ml de 37% de formaldéhyde.
    4. Verser dans l'appareil d'électrophorèse avec un peigne à une épaisseur de 1,5 mm.
    5. Éliminer les bulles ou pousser tourlet sur les bords du gel avec un peigne propre.
    6. Permettre au gel de se solidifier à la température ambiante.
  2. La préparation des échantillons
    1. Mélanger 1-10 ug de l'ARN total et 11,3 ul de tampon d'échantillon.
    2. Mélanger 2 pg du marqueur d'ARN (1 pg / pl) 11,3 pi de tampon d'échantillon.
    3. Ajouter de l'eau sans nuclease à partir des échantillons 2.2.1 et 2.2.2 à un volume total de 16 ul.
    4. Chauffer à 60 ° C pendant 5 min, puis refroidir sur la glace.
    5. Mélanger 16 ul de l'échantillon à partir 2.2.3 avec 4 pi de colorant de suivi, qui contient 0,1 pg / pl de bromure d'éthidium sur la glace.
      ATTENTION: Le bromure d'éthidium est peut-être tératogène et toxique en cas d'inhalation. Lire le bromure d'éthidium fiche de sécurité.
  3. Electrophorèse
    1. Ajouter 200 ml de 10x MOPS tampon à 1.800 ml de ddH 2 O pour faire un tampon de migration MOPS 1x.
    2. Utilisez le tampon en cours d'exécution 1x MOPS pour rincer les puits du gel.
    3. Pre-run til gel à 20 V pendant 5 min.
    4. Charger les échantillons d'ARN dans les puits du gel.
    5. Couvrir de papier d'aluminium pour éviter exposition à la lumière. Exécutez à 35 V pendant environ 17 h (pendant la nuit)
    6. Examiner et photographier le gel sous une lumière UV.
  4. Transfert
    1. Couper le gel pour éliminer la portion inutilisée.
    2. Préparer 500 ml de 10 x tampon SSC (250 ml de tampon 20x SSC et 250 ml d'eau DEPC).
    3. Laver le gel deux fois avec un tampon 10x SSC pendant 20 minutes avec agitation à 50 tours par minute.
    4. Couper 1 filtre feuille de papier assez grand pour servir de document de mèche, qui absorbe un tampon de transfert à partir du plateau de transfert (Figure 1).
    5. Couper 4 morceaux de papier filtre à la même taille que le gel.
    6. Découper une feuille de membrane en nylon chargée positivement à la même taille que le gel.
    7. Marquer une encoche sur le gel et la membrane en tant que marqueur pour assurer l'orientation correcte.
    8. Faire tremper la membrane dans un tampon SSC 2x pendant 15 min.
    9. Verser 500 ml d'of 10x SSC tampon dans le bac de transfert.
    10. Poser la grande feuille de papier filtre sur la plaque de verre et le papier filtre humide avec un tampon de transfert.
    11. Etaler les bulles avec une pipette.
    12. Faire tremper 2 morceaux de papier filtre pré-découpé dans un tampon de transfert et les placer sur le centre du papier filtre de l'étape 2.4.5. Retirez toutes les bulles.
    13. Poser le côté supérieur de gel sur le papier filtre.
    14. Poser la membrane sur le dessus du gel. Aligner les encoches du gel et la membrane.
    15. Placer 2 morceaux de papier filtre pré-coupe sur le dessus de la membrane et le papier filtre avec un tampon de transfert humide.
    16. Retirez toutes les bulles entre les couches.
    17. Appliquer un film plastique autour du gel pour assurer que les serviettes seulement absorbent le tampon qui passe à travers le gel et la membrane.
    18. Empilez les serviettes en papier sur le dessus du papier filtre.
    19. Placer une plaque de verre surdimensionné sur le dessus des serviettes.
    20. Placer un poids sur le dessus de la pile.
    21. Maintenir pendant une nuit pour permettre à l'ARN de transférer du gel vers la membrane.

3. Détection de la N 6 -methyladenosine

  1. Membrane Réticulation
    1. Gardez la membrane humide dans un tampon 2x SSC.
    2. Placez 2 feuilles de papier filtre immergé avec 10x tampon SSC en réticulant UV.
    3. Placer la membrane sur le dessus du papier-filtre, le côté de l'ARN adsorbé vers le haut.
    4. Sélectionnez "mode autocrosslink" (120.000 pJ) et appuyez sur le bouton "Démarrer" pour lancer l'irradiation.
    5. Examiner la membrane et le gel avec un gel UV image receveur pour confirmer le transfert de l'ARN du gel à la membrane.
  2. immunotransfert
    1. Bloquer la membrane dans 5% de lait dégraissé dans une solution salée tamponnée au Tris avec du Tween 20 (TBST), un tampon à température ambiante pendant 1 h.
    2. Laver trois fois avec du tampon TBST pendant 15 min.
    3. Incuber la membrane pendant une nuit à 6 m A (<em> N 6 -methyladenosine) solution d'anticorps (1: tampon TBST de lait non gras 1000 dans 5%) à 4 ° C.
    4. Laver la membrane trois fois avec le tampon TBST pendant 15 min.
    5. Incuber la membrane dans la solution d'âne conjugué à HRP anti-lapin d'anticorps (1: 2000 dans du tampon TBST de lait non gras à 5%) pendant 1 h à température ambiante.
    6. Laver la membrane trois fois avec le tampon TBST pendant 15 min.
    7. Appliquer le substrat de chimioluminescence amélioré (0,125 ml par cm2 de membrane).
    8. Capturez la chimioluminescence avec les réglages optimaux de l'imageur numérique, selon les instructions du fabricant 26.
  3. m 6 A Quantification
    1. Mesurer la m 6 Une intensité de chimioluminescence par rapport à l' aide du logiciel ImageJ.
      1. Dans le menu du logiciel ImageJ, sélectionnez l'option "Fichier" pour ouvrir le fichier pertinent.
      2. Sélectionnez l'outil "Rectangle" de ImageJ et dessiner un cadre autourles signaux.
      3. Si l' ARN ribosomal est pas l'objet des expériences, d' éviter les 18S et 28S ribosomal RNA m 6 bandes A pour le calcul.
      4. Cliquez sur "Command" et "1" pour confirmer la voie sélectionnée.
      5. Appuyez sur "commande" et "3" pour afficher le tracé sélectionné.
      6. Cliquez sur l'outil "Straight" et tracer des lignes pour séparer la zone segmentée.
      7. Cliquez sur l'outil "baguette" pour enregistrer les mesures.
      8. Exporter les données.
      9. Normaliser les niveaux de m 6 A avec l'ARN ribosomal 18S bande à partir de la coloration au bromure d'éthidium.

Representative Results

Après 14 jours en phase circadienne de lumière-obscurité normale, les souris de type sauvage ont été placés dans l'obscurité constante. Les ARN du foie ont été prélevés à des intervalles de 4 h et étudiés avec Northern Blot modifiée. La méthylation des ARNr, d' ARNm et de petits ARN ont été clairement détectée (figure 2). La comparaison entre les différents moments circadiens (CT) peut être calculé avec précision le niveau ARNr 18S. Il était robuste oscillation circadienne de m 6 niveaux A à ARNr, l' ARNm, et les petits ARN.

Afin d'éviter l'interférence avancé par un ARNr, un ARN polyadénylés peuvent être purifiés comme à l'étape 1.2.2. Après purification, le rARN peut être largement éliminé pour permettre une meilleure visualisation des autres ARN (figure 3).

Figure 1
g> Figure 1: Montage de l'unité de transfert de blot. L'unité de transfert capillaire pour buvard l'ARN sur la membrane est représentée. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 2
Figure 2: le rythme circadien des m 6 niveaux A à C57BL / 6J. Cette figure montre la m 6 Un transfert de l' ARN total à partir de foies de souris de type sauvage a sacrifié le premier jour de la phase sombre sombre après 14 jours d'une phase de lumière-obscurité normale à 4 heures d' intervalle. La quantification a été effectuée en utilisant les 6 m Une différence de densité d'image entre rARN 18S et 28S. M 6 Une abondance a été étalonnée par rapport à la bande 18S du gel de formaldehyde au fond.et = "_ blank"> S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 3
Figure 3: m 6a blots avec ou sans ARNr. M représentant 6 A blot de l' ARN total et de l' ARN polyadénylé à partir de foies de souris de type sauvage sont présentées. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Tableau 1: Tampons et solutions.

Disclosures

Les auteurs n'ont rien à dévoiler.

Materials

1 tampon 10x MOPS (pH 7,0, protéger de la lumière)
MOPS 41.85 g 0,2 M
L'acétate de sodium 4.1 g 0,05 M
EDTA, le sel de disodium 3.7 g 0,01 M
l'eau DEPC
Total 1 L
On agite à la température ambiante
2 tampon de SSC 20x (pH 7,0)
Chlorure de sodium 175,3 g 3 M
Citrate trisodique 88,3 g 0,3 M
l'eau DEPC
Total 1 L
Agiter à la température ambiante, puis l'autoclave
3 Dye Suivi
tampon 10x MOPS 500 ul 1 fois
Ficoll 400 0,75 g 15%
bleu de bromophénol 0,01 g 0,2%
Xylène Cyanol 0,01 g 0,2%
l'eau DEPC
Total 5 mL
Conserver à -20 ° C
4 l'eau DEPC
Diluer ratio à 1: 1.000 de DEPC dans ddH 2 O
Agiter pendant une nuit à température ambiante, puis l'autoclave
5 tampon d'échantillon (abri de la lumière)
tampon 10x MOPS 200 ul
37% de formaldéhyde 270 ul
formamide 660 ul
Conserver à -20 ° C
Name Company Catalog Number Comments
RNaseZap solution Ambion AM9782 Protocol 1.1
TRI Reagent solution Ambion AM9738 Protocol 1.2.1.1
1-Bromo-3-chloropropane (BCP) Sigma B9673 Protocol 1.2.1.3
Ethanol JTbaker 8006 Protocol 1.2.1.3
Isopropanol Sigma I9516 Protocol 1.2.1.3
GenElute mRNA Miniprep Kit Sigma MRN70 Protocol 1.2.2.1
Glycogen Ambion AM9510 Protocol 1.2.2.2
Sodium acetate Fluka 71183 Protocol 1.2.2.2
Nuclease-free water Ambion AM9930 Protocol 1.2.2.6
DEPC Sigma D5758 Protocol 2.1.1
Agarose JT Baker A426 Protocol 2.1.2
MOPS Sigma M1254 Protocol 2.1.3
37% formaldehyde Solution Sigma F8775 Protocol 2.1.3
EDTA, Disodium Salt JT Baker 8993 Protocol 2.1.3 10x MOPS buffer
formamide Sigma F7503 Protocol 2.2.1
RNA Millennium Marker Ambion AM7150 Protocol 2.2.2
Ethidium Bromide Amresco X328 Protocol 2.2.5
Ficoll PM400 GE Healthcare 17-0300-10 Protocol 2.2.5 tracking dye
Bromophenol blue Sigma 114391 Protocol 2.2.5 tracking dye
Xylene Cyanol FF Sigma X4126 Protocol 2.2.5 tracking dye
Sodium chloride dihydrate JT Baker 3624 Protocol 2.4.2 20x SSC buffer
Trisodium citrate Sigma S1804 Protocol 2.4.2 20x SSC buffer
Hybond Blotting Paper GE Healthcare RPN6101M Protocol 2.4.4
GE Hybond-N+ membrane GE Healthcare RPN303B Protocol 2.4.6
Stratalinker UV Crosslinker 2400 Stratagene 400075 Protocol 3.1.2
Gel Catcher 1500 ANT Technology Gel Catcher 1500 Protocol 3.1.5
Anti-m6A (N6-methyladenosine) Synaptic Systems 202003 Protocol 3.2.3
Amersham ECL Anti-Rabbit IgG, HRP-linkd whole Ab GE Healthcare NA934 Protocol 3.2.5
ChemiDoc MP System BIO-RAD 1708280 Protocol 3.2.8

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