Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

En metode for måling av RNA Published: December 5, 2016 doi: 10.3791/54672
Automatic Translation
1, 1, 1
1Department of Cardiology, Chang Gung Memorial Hospital, Chang Gung University College of Medicine

Summary

En modifisert northern-blotting fremgangsmåte for å måle N 6 -methyladenosine (m 6 A) modifikasjoner i RNA er beskrevet. Den nåværende metoden kan påvise endringer i ulike RNA og kontroller under ulike eksperimentelle design.

Protocol

MERK: total RNA m 6 A nivå inkluderer rRNA, mRNA, og andre små RNA. Siden ribosomalt RNA har rikelig m 6 A modifikasjoner, måling av m 6 A nivåer må vurdere dette faktum.

1. RNA Isolation

  1. Bruke ribonuklease dekontaminering løsning (sprayet på tørkepapir), tørk av pipetter og lab benk overflater. Våt papirhåndklær med nukleasefritt vann og tørk av pipetter og lab benk overflater igjen.
  2. RNA Utvinning
    1. Total RNA Isolation
      1. Ved hjelp av en overliggende rører, homogen 50-100 mg vev eller 5-10 x 10 6 celler i 1 ml av RNA isolering oppløsning holdt ved 4 ° C.
        MERK: Mer vev (100-150 mg) kan være nødvendig for adipose vevsprøver fra mus på grunn av de lavere RNA-konsentrasjoner i denne. Prøver hentet fra mus hjerte, lever, skjelettmuskulatur, lunge, hjerne, og makrofager har vært ansatt tidligere fire.
      2. Icubate eksempel homogenater i 5 min ved romtemperatur.
      3. Tilsett 100 ul av 1-brom-3-klorpropan (BCP) per 1 mL prøve homogenat. Rist rørene kraftig i 15 sekunder og videre for å isolere total RNA i henhold til produsentens instruksjoner 24.
    2. Polyadenylert mRNA Rensing fra Isolert Total RNA
      1. Rens polyadenylerte mRNA ved hjelp av tilgjengelige sett eller protokoller.
        1. Rist godt for å re-suspendere hver av følgende løsninger: 2x bindende løsning, oligo (dT) isopor perler, og vaskeløsning. Kontroller at oligo (dT) perler varmes opp til romtemperatur før bruk.
        2. Overfør 120 ul av elueringsoppløsningen pr preparat til et rør og oppvarm til 70 ° C i en varmeblokk.
        3. Pipettere opp til 500 mikrogram av total RNA inn i et mikrosentrifugerør. Med nukleasefritt vann, justere volumet til 250 mL.
        4. Tilsett 250 ul av 2x binding løsning av total RNA såning og vortex kort for å blande innholdet.
        5. Tilsett 15 mL av oligo (dT) perler og virvle grundig å blande.
        6. Inkuber blandingen ved 70 ° C i 3 minutter.
        7. Fjern prøven fra varmeblokken og la det stå ved romtemperatur i 10 min.
        8. Sentrifuger ved 15000 x g i 2 min.
        9. Fjern forsiktig supernatanten, etterlot ca 50 mL.
        10. Legg 500 mL vaskeløsning for å re-suspendere pellet ved pipettering.
        11. Pipetter suspensjonen i en spin filter / samling rør sett.
        12. Sentrifuger ved 15000 x g i 2 min. Fjerne kolonnen fra oppsamlingsrøret og kast gjennomstrømning. Returnere kolonnen til oppsamlingsrøret.
        13. Pipetter 500 mL av vaskeløsning på spin-filter.
        14. Sentrifuger ved 15000 x g i 2 min.
        15. Overfør spinnfilter inn i en ny samling rør.
        16. Pipetter 50 ul av elueringsoppløsningen oppvarmettil 70 ° C på midten av spinn filteret.
        17. Inkuber i 2-5 minutter ved 70 ° C. Sentrifuger ved 15000 x g i 1 min.
        18. Pipetter en ytterligere 50 ul av elueringsoppløsningen oppvarmet til 70 ° C på midten av spinn filteret.
        19. Gjenta trinn 1.2.2.1.18.
      2. Tilsett 100 mg / ml glykogen, 0,1 volum 3 M natriumacetat buffer (pH 5,2) og 2,5 volumer absolutt etanol. Utfelles over natten ved -80 ° C.
      3. Sentrifuger ved 15000 x g i 25 min ved 4 ° C. Kast supernatanten.
      4. Vask pelleten med 1 ml 75% etanol. Sentrifuger ved 15000 x g i 15 min ved 4 ° C. Fjern forsiktig etanol.
      5. Tørr i luft i 3-5 min.
      6. Tilsett 10 ul av nuklease-fritt vann for å oppløse pelleten.
      7. Oppbevar ved -70 ° C.
  3. RNA Kvalifisering og Kvantifisering
    1. Ved hjelp av et spektrofotometer, bestemme RNA-konsentrasjonen med NotIng av absorbans ved 260 nm og 280 nm. Forholdet A 260 / A 280 bør være 1,8-2,2.
    2. Sjekk RNA prøven kvalitet ved hjelp av 0,8% agarose gelelektroforese 25.
      MERK: intakt eukaryote total RNA bør vise intense 28S og 18S rRNA band. Forholdet mellom 28S versus 18S rRNA-band intensitet for en god RNA forberedelse er ~ 2.

2. Gel elektroforese og Transfer

MERK: buffer forberedelse protokoller er gitt i tabell 1.

  1. Formaldehyd Gel Forberedelse (1%)
    1. Skyll alle elektroforese utstyr med dietylpyrokarbonat (DEPC) vann.
    2. Smelt 2,5 g agarose i 215 ml DEPC vann helt i en mikrobølgeovn.
    3. Legg 12,5 ml 10x 3- (N- morfolino) propansulfonsyre (MOPS) buffer og 22,5 ml 37% formaldehyd.
    4. Helle den inn i elektroforese apparat med en 1,5 mm tykk kam.
    5. Eliminer bobler eller push them til kantene av gelen med en ren kam.
    6. La gelen stivne ved romtemperatur.
  2. Prøvepreparering
    1. Bland 1-10 ug av total RNA og 11,3 ul prøvebuffer.
    2. Bland 2 ug av RNA-markør (1 ug / ul) med 11,3 mL av prøvebuffer.
    3. Legg nuklease-fritt vann til prøvene fra 2.2.1 og 2.2.2 til et totalt volum på 16 ul.
    4. Oppvarm til 60 ° C i 5 minutter, og deretter koble på is.
    5. Bland 16 ul av prøven fra 2.2.3 med 4 pl av sporende farvestoff, som inneholder 0,1 ug / ul etidiumbromid på is.
      FORSIKTIG: Etidiumbromid er muligens teratogen og giftig ved innånding. Les etidiumbromid sikkerhetsdatabladet.
  3. elektroforese
    1. Tilsett 200 ml 10x MOPS buffer til 1800 ml DDH 2 O for å lage en 1x MOPS buffer.
    2. Bruk 1x MOPS buffer for å skylle brønnene i gelen.
    3. Pre-run than gel ved 20 V i 5 minutter.
    4. Laste RNA prøver til brønnene i gelen.
    5. Dekk med folie for å unngå lyseksponering. Kjør på 35 V i ca 17 timer (over natten)
    6. Undersøke og fotografere gelen under UV-lys.
  4. Overføre
    1. Kutt gel for å fjerne den ubrukte delen.
    2. Fremstille 500 ml av 10x SSC-buffer (250 ml 20x SSC-buffer og 250 ml DEPC vann).
    3. Vask gelen to ganger med 10 x SSC-buffer i 20 minutter med risting ved 50 rpm.
    4. Kuttes en filterpapirarket stor nok til å tjene som en veke papir, som absorberer overføringsbuffer fra overføringsmagasinet (figur 1).
    5. Skjær 4 stykker av filterpapir til samme størrelse som gel.
    6. Skjær en plate av positivt ladet nylonmembran til samme størrelse som den gel.
    7. Marker et hakk på gelen og membranen som en markør for å sikre riktig retning.
    8. Sug membranen i 2x SSC buffer i 15 min.
    9. Hell 500 ml of 10x SSC buffer i overføringen skuffen.
    10. Lå den store filterpapirarket på tvers av glassplaten og våt filterpapiret med overføringsbuffer.
    11. Rull ut noen bobler med en pipette.
    12. Sug 2 stykker av pre-cut filter papir i overføringsbuffer og plassere dem på midten av filterpapiret fra trinn 2.4.5. Fjern eventuelle bobler.
    13. Legg gelen opp-ned på filterpapiret.
    14. Lå membranen på toppen av gelen. Juster hakkene av gelen og membranen.
    15. Legg 2 stykker av pre-cut filter papir på toppen av membran og fukte filterpapiret med overføringsbuffer.
    16. Fjern eventuelle bobler mellom lagene.
    17. Påfør plastfolie rundt gel for å sikre at håndklær bare suge opp buffer som passerer gjennom gelen og membranen.
    18. Stable papirhåndklær på toppen av filterpapiret.
    19. Plasser en overdimensjonert glassplate på toppen av håndklær.
    20. Plasser en vekt på toppen av stabelen.
    21. Hold over natten for å tillate den å overføre RNA fra gelen til membranen.

3. Påvisning av N 6 -methyladenosine

  1. membran Kryssbinding
    1. Hold membranen fuktig i 2x SSC buffer.
    2. Legg 2 ark med filter papir nedsenket med 10x SSC buffer i UV tverrbinder.
    3. Plasser membran på toppen av filterpapiret med RNA-adsorberte siden vendt opp.
    4. Velg "autocrosslink mode" (120.000 μJ) og trykk på "Start" -knappen for å starte bestråling.
    5. Undersøke membranen og gelen med et UV-gel bildefangeren for å bekrefte at RNA-overføring fra gelen til membranen.
  2. immunoblotting
    1. Blokkere membranen i 5% ikke-fettholdig melk i Tris-bufret saltvann med Tween 20 (TBST) buffer ved romtemperatur i 1 time.
    2. Vask tre ganger med TBST-buffer i 15 min.
    3. Inkuber membran over natten i m 6 A (<em> N 6 -methyladenosine) antistoffoppløsning (1: 1000 i 5% ikke-fettholdig melk TBST-buffer) ved 4 ° C.
    4. Vask membranen tre ganger med TBST-buffer i 15 min.
    5. Inkuber membranen i det HRP-konjugert esel-anti-kanin-antistoff-løsning (1: 2000 i 5% ikke-fettholdig melk TBST-buffer) i 1 time ved romtemperatur.
    6. Vask membranen tre ganger med TBST-buffer i 15 min.
    7. Påfør forbedret kjemiluminescenssubstrat (0,125 ml per cm 2 av membran).
    8. Fang chemiluminescence med de optimale innstillingene for det digitale imager, i henhold til produsentens instruksjoner 26.
  3. m 6 A Kvantifisering
    1. Mål den relative m 6 A kjemiluminescens intensitet bruker ImageJ programvare.
      1. Under ImageJ programvare-menyen, velg "File" for å åpne den aktuelle filen.
      2. Velg "rektangel" verktøyet fra ImageJ og tegn en ramme rundtsignalene.
      3. Hvis ribosomalt RNA er ikke fokus for eksperimentene, unngå 18S og 28S ribosomalt RNA m 6 A band for beregningen.
      4. Klikk "Command" og "1" for å bekrefte den valgte kjørefelt.
      5. Trykk "Command" og "3" for å vise den valgte handlingen.
      6. Klikk på "Straight" -verktøyet og trekke linjer til å skille det segmenterte området.
      7. Klikk på "Wand" verktøy for å registrere målingene.
      8. Eksportere data.
      9. Normalisere nivået av m 6 A med den 18S ribosomale RNA-bånd fra etidiumbromidfarging.

Representative Results

Etter 14 dager i vanlig lys-mørk circadian fase ble villtype-mus plasseres i konstant mørke. De RNA fra leveren ble samplet med 4 timers mellomrom, og studerte med modifisert nordblotting. Den metylering av rRNAs, mRNA, og små RNA ble tydelig påvist (figur 2). Sammenligningen mellom ulike cirkadianske ganger (CT) kan beregnes nøyaktig med 18S rRNA-standarden. Det var robust circadian svinging av m 6 A nivåer i rRNA, mRNA, og små RNA.

For å unngå forstyrrelser bød av rRNA, kan polyadenylerte RNA bli renset, som i trinn 1.2.2. Etter rensing kan rRNA elimineres i stor grad for å tillate bedre visualisering av andre RNA (Figur 3).

Figur 1
g> Figur 1: Montering av blot overføringsenheten. Den kapillære overføringsenhet for blotting av RNA til membranen er vist. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 2
Figur 2: døgnrytme av m 6 A nivåer i C57BL / 6J mus. Denne figuren viser m 6 En blot av total RNA fra lever fra villtype mus avlivet på den første dagen av den mørke-mørke fasen etter 14 dager med en normal lys-mørke-fase ved 4 timers intervaller. Kvantifiseringen ble gjort ved hjelp av m 6 A bildetetthet forskjell mellom 18S og 28S rRNA. M 6 En overflod ble normalisert til 18S rRNA båndet fra formaldehyd gelen i bunnen.et = "_ blank"> Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 3
Figur 3: De m 6 A blotter med eller uten rRNA. Representative m 6 A-blot av total RNA og polyadenylert RNA fra leveren hos villtype-mus er vist. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Tabell 1: Buffere og løsninger.

Disclosures

Forfatterne har ikke noe å avsløre.

Materials

1 10x MOPS buffer (pH 7,0, beskytte mot lys)
MOPS 41.85 g 0,2 M
Natriumacetat 4.1 g 0,05 M
EDTA, dinatriumsalt 3.7 g 0,01 M
DEPC vann
Total 1 L
Omrør ved romtemperatur
2 20x SSC-buffer (pH 7,0)
Natriumklorid 175,3 g 3 M
trinatriumcitrat 88.3 g 0,3 M
DEPC vann
Total 1 L
Omrør ved romtemperatur, deretter autoklav
3 sporing Dye
10x MOPS buffer 500 mL 1x
Ficoll 400 0,75 g 15%
bromfenolblå 0,01 g 0,2%
xylencyanol 0,01 g 0,2%
DEPC vann
Total 5 ml
Oppbevares ved -20 ° C
4 DEPC vann
Fortynn forhold på 1: 1000 av DEPC i DDH 2 O
Omrør over natten ved romtemperatur, deretter autoklav
5 Sample buffer (beskytte mot lys)
10x MOPS buffer 200 mL
37% formaldehyd 270 mL
formamide 660 mL
Oppbevares ved -20 ° C
Name Company Catalog Number Comments
RNaseZap solution Ambion AM9782 Protocol 1.1
TRI Reagent solution Ambion AM9738 Protocol 1.2.1.1
1-Bromo-3-chloropropane (BCP) Sigma B9673 Protocol 1.2.1.3
Ethanol JTbaker 8006 Protocol 1.2.1.3
Isopropanol Sigma I9516 Protocol 1.2.1.3
GenElute mRNA Miniprep Kit Sigma MRN70 Protocol 1.2.2.1
Glycogen Ambion AM9510 Protocol 1.2.2.2
Sodium acetate Fluka 71183 Protocol 1.2.2.2
Nuclease-free water Ambion AM9930 Protocol 1.2.2.6
DEPC Sigma D5758 Protocol 2.1.1
Agarose JT Baker A426 Protocol 2.1.2
MOPS Sigma M1254 Protocol 2.1.3
37% formaldehyde Solution Sigma F8775 Protocol 2.1.3
EDTA, Disodium Salt JT Baker 8993 Protocol 2.1.3 10x MOPS buffer
formamide Sigma F7503 Protocol 2.2.1
RNA Millennium Marker Ambion AM7150 Protocol 2.2.2
Ethidium Bromide Amresco X328 Protocol 2.2.5
Ficoll PM400 GE Healthcare 17-0300-10 Protocol 2.2.5 tracking dye
Bromophenol blue Sigma 114391 Protocol 2.2.5 tracking dye
Xylene Cyanol FF Sigma X4126 Protocol 2.2.5 tracking dye
Sodium chloride dihydrate JT Baker 3624 Protocol 2.4.2 20x SSC buffer
Trisodium citrate Sigma S1804 Protocol 2.4.2 20x SSC buffer
Hybond Blotting Paper GE Healthcare RPN6101M Protocol 2.4.4
GE Hybond-N+ membrane GE Healthcare RPN303B Protocol 2.4.6
Stratalinker UV Crosslinker 2400 Stratagene 400075 Protocol 3.1.2
Gel Catcher 1500 ANT Technology Gel Catcher 1500 Protocol 3.1.5
Anti-m6A (N6-methyladenosine) Synaptic Systems 202003 Protocol 3.2.3
Amersham ECL Anti-Rabbit IgG, HRP-linkd whole Ab GE Healthcare NA934 Protocol 3.2.5
ChemiDoc MP System BIO-RAD 1708280 Protocol 3.2.8

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Thammana, P., Held, W. A. Methylation of 16S RNA during ribosome assembly in vitro. Nature. 251 (5477), 682-686 (1974).
  2. Meyer, K. D., Jaffrey, S. R. The dynamic epitranscriptome: N6-methyladenosine and gene expression control. Nat Rev Mol Cell Biol. 15 (5), 313-326 (2014).
  3. Niu, Y., et al. N6-methyl-adenosine (m6A) in RNA: an old modification with a novel epigenetic function. Genomics Proteomics Bioinformatics. 11 (1), 8-17 (2013).
  4. Wang, C. Y., et al. Loss of FTO in adipose tissue decreases Angptl4 translation and alters triglyceride metabolism. Sci Signal. 8 (407), 127 (2015).
  5. Wang, X., et al. N6-methyladenosine-dependent regulation of messenger RNA stability. Nature. 505 (7481), 117-120 (2014).
  6. Berulava, T., Rahmann, S., Rademacher, K., Klein-Hitpass, L., Horsthemke, B. N6-adenosine methylation in MiRNAs. PLoS One. 10 (2), 0118438 (2015).
  7. Deng, X., et al. Widespread occurrence of N6-methyladenosine in bacterial mRNA. Nucleic Acids Res. 43 (13), 6557-6567 (2015).
  8. Dominissini, D., et al. The dynamic N-methyladenosine methylome in eukaryotic messenger RNA. Nature. , (2016).
  9. Fustin, J. M., et al. RNA-methylation-dependent RNA processing controls the speed of the circadian clock. Cell. 155 (4), 793-806 (2013).
  10. Geula, S., et al. Stem cells. m6A mRNA methylation facilitates resolution of naive pluripotency toward differentiation. Science. 347 (6225), 1002-1006 (2015).
  11. Wang, C. Y., et al. FTO modulates fibrogenic responses in obstructive nephropathy. Sci Rep. , SREP18874 (2016).
  12. Jia, G., et al. N6-methyladenosine in nuclear RNA is a major substrate of the obesity-associated FTO. Nat Chem Biol. 7 (12), 885-887 (2011).
  13. Du, T., et al. An association study of the m6A genes with major depressive disorder in Chinese Han population. J Affect Disord. 183, 279-286 (2015).
  14. Wang, C. Y., Yeh, J. K., Shie, S. S., Hsieh, I. C., Wen, M. S. Circadian rhythm of RNA N6-methyladenosine and the role of cryptochrome. Biochem Biophys Res Commun. 465 (1), 88-94 (2015).
  15. Wang, C. Y., Shie, S. S., Hsieh, I. C., Tsai, M. L., Wen, M. S. FTO modulates circadian rhythms and inhibits the CLOCK-BMAL1-induced transcription. Biochem Biophys Res Commun. 464 (3), 826-832 (2015).
  16. Heyn, H., Esteller, M. An Adenine Code for DNA: A Second Life for N6-Methyladenine. Cell. 161 (4), 710-713 (2015).
  17. Xiao, W., et al. Nuclear m(6)A Reader YTHDC1 Regulates mRNA Splicing. Mol Cell. 61 (4), 507-519 (2016).
  18. Meyer, K. D., et al. Comprehensive analysis of mRNA methylation reveals enrichment in 3' UTRs and near stop codons. Cell. 149 (7), 1635-1646 (2012).
  19. Horowitz, S., Horowitz, A., Nilsen, T. W., Munns, T. W., Rottman, F. M. Mapping of N6-methyladenosine residues in bovine prolactin mRNA. Proc Natl Acad Sci U S A. 81 (18), 5667-5671 (1984).
  20. Resnick, R. J., Noreen, D., Munns, T. W., Perdue, M. L. Role of N6-methyladenosine in expression of Rous sarcoma virus RNA: analyses utilizing immunoglobulin specific for N6-methyladenosine. Prog Nucleic Acid Res Mol Biol. 29, 214-218 (1983).
  21. Golovina, A. Y., et al. Method for site-specific detection of m6A nucleoside presence in RNA based on high-resolution melting (HRM) analysis. Nucleic Acids Res. 42 (4), 27 (2014).
  22. Dominissini, D., et al. Topology of the human and mouse m6A RNA methylomes revealed by m6A-seq. Nature. 485 (7397), 201-206 (2012).
  23. Linder, B., et al. Single-nucleotide-resolution mapping of m6A and m6Am throughout the transcriptome. Nat Methods. 12 (8), 767-772 (2015).
  24. Fu, L., et al. Simultaneous Quantification of Methylated Cytidine and Adenosine in Cellular and Tissue RNA by Nano-Flow Liquid Chromatography-Tandem Mass Spectrometry Coupled with the Stable Isotope-Dilution Method. Anal Chem. 87 (15), 7653-7659 (2015).
  25. Rio, D. C., Ares, M., Hannon, G. J., Nilsen, T. W. Nondenaturing agarose gel electrophoresis of RNA. Cold Spring Harb Protoc. 2010 (6), 5445 (2010).
  26. Wang, C. Y., et al. FTO modulates fibrogenic responses in obstructive nephropathy. Sci Rep. 6, 18874 (2016).
  27. Li, X., et al. Transcriptome-wide mapping reveals reversible and dynamic N-methyladenosine methylome. Nat Chem Biol. , (2016).
  28. Sanschagrin, S., Yergeau, E. Next-generation sequencing of 16S ribosomal RNA gene amplicons. J Vis Exp. (90), (2014).
  29. Kukutla, P., Steritz, M., Xu, J. Depletion of ribosomal RNA for mosquito gut metagenomic RNA-seq. J Vis Exp. (74), (2013).
  30. Mishima, E., et al. Immuno-Northern Blotting: Detection of RNA Modifications by Using Antibodies against Modified Nucleosides. PLoS One. 10 (11), 0143756 (2015).
  31. Klungland, A., Dahl, J. A. Dynamic RNA modifications in disease. Curr Opin Genet Dev. 26, 47-52 (2014).

Tags

Biokjemi RNA m Metylering demetylase FTO Epitranscriptome
En metode for måling av RNA<em&gt; N</em<sup&gt; 6</sup&gt; -methyladenosine Endringer i celler og vev
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Wang, C. Y., Lin, M. H., Su, H. T. A … More

Wang, C. Y., Lin, M. H., Su, H. T. A Method for Measuring RNA N6-methyladenosine Modifications in Cells and Tissues. J. Vis. Exp. (118), e54672, doi:10.3791/54672 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter