Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

En metode til måling af RNA Published: December 5, 2016 doi: 10.3791/54672
Automatic Translation
1, 1, 1
1Department of Cardiology, Chang Gung Memorial Hospital, Chang Gung University College of Medicine

Summary

En modificeret northern blotting metode til måling N6 -methyladenosine (m 6 A) ændringer i RNA er beskrevet. Den nuværende metode kan detektere ændringer i forskellige RNA og kontroller under forskellige eksperimentelle designs.

Protocol

BEMÆRK: total RNA m 6 A niveau omfatter rRNA, mRNA, og andre små RNA. Da ribosomale RNA har rigeligt m 6 A modifikationer, måling af m 6 A-niveauer bliver nødt til at overveje dette faktum.

1. RNA-isolering

  1. Brug af ribonuklease dekontaminering løsning (sprøjtes på papirservietter), tørre pipetter og lab bænk overflader. Våde papirservietter med nuklease-frit vand og tørre ned pipetter og lab bænk overflader igen.
  2. RNA-ekstraktion
    1. Total RNA Isolation
      1. Ved anvendelse af en overliggende omrører, homogenisere 50-100 mg væv eller 5-10 x 10 6 celler i 1 ml RNA-isolering opløsning holdes ved 4 ° C.
        BEMÆRK: Mere væv (100-150 mg) kan være nødvendig for adipose vævsprøver fra mus på grund af de lavere RNA koncentrationer deri. Prøver stammer fra muse hjerte, lever, skeletmuskel, lunge, hjerne, og makrofager har tidligere været ansat 4.
      2. Icubate prøven homogenater i 5 minutter ved stuetemperatur.
      3. Tilsæt 100 pi af 1-brom-3-chlorpropan (BCP) pr 1 ml prøve homogenat. Ryst rørene kraftigt i 15 s og fortsæt til isolere total RNA ifølge producentens anvisninger 24.
    2. Polyadenyleret mRNA Oprensning fra isolerede Total RNA
      1. Rens polyadenylerede mRNA hjælp tilgængelige kits eller protokoller.
        1. Ryst grundigt for at re-suspendere hver af følgende løsninger: 2x bindende løsning, oligo (dT) polystyren perler, og vask løsning. Sørg for, at oligo (dT) perler opvarmes til stuetemperatur før brug.
        2. Overfør 120 pi elueringsopløsning pr forberedelse til et rør og opvarmes til 70 ° C i en varmeblok.
        3. Pipette op til 500 ug totalt RNA i et mikrocentrifugerør. Med nuklease-frit vand, justere lydstyrken til 250 uL.
        4. Tilsættes 250 pi af 2x binding løsning på det totale RNA sålution og kortvarigt vortex at blande indholdet.
        5. Tilføj 15 uL af oligo (dT) perler og vortex grundigt at blande.
        6. Inkuber blandingen ved 70 ° C i 3 minutter.
        7. Fjern prøven fra varmeenheden og lad det stå ved stuetemperatur i 10 min.
        8. Centrifuger ved 15.000 xg i 2 min.
        9. Fjern forsigtigt supernatanten, efterlod ca. 50 uL.
        10. Tilføj 500 pi vaskeopløsning at re-suspendere pellet ved pipettering.
        11. Pipettere suspensionen i et spin filter / opsamlingsrør sæt.
        12. Centrifuger ved 15.000 xg i 2 min. Fjern kolonne fra opsamlingsrøret og kassér gennemløbet. Retur kolonnen til opsamlingsrøret.
        13. Pipette 500 pi vaskeopløsning på spin-filter.
        14. Centrifuge ved 15.000 x g i 2 min.
        15. Overfør spin filter over i en frisk opsamlingsrør.
        16. Pipetter 50 pi elueringsopløsning opvarmettil 70 ° C på midten af ​​centrifugeringsfiltret.
        17. Inkuber i 2-5 min ved 70 ° C. Centrifuger ved 15.000 x g i 1 min.
        18. Pipettere yderligere 50 pi elueringsopløsning opvarmet til 70 ° C på midten af ​​centrifugeringsfiltret.
        19. Gentag trin 1.2.2.1.18.
      2. Tilsæt 100 ug / ml glycogen, 0,1 volumen 3 M natriumacetat (pH 5,2), og 2,5 volumener absolut ethanol. Udfælde natten over ved -80 ° C.
      3. Centrifuger ved 15.000 xg i 25 minutter ved 4 ° C. Supernatanten kasseres.
      4. Vask pelleten med 1 ml 75% ethanol. Centrifuger ved 15.000 xg i 15 minutter ved 4 ° C. Fjern forsigtigt ethanol.
      5. Der tørres i luft i 3-5 min.
      6. Der tilsættes 10 pi af nuklease-frit vand til at opløse bundfaldet.
      7. Opbevar ved -70 ° C.
  3. RNA Kvalifikation og Kvantificering
    1. Ved hjælp af et spektrofotometer, fastlægge RNA koncentration ved noting absorbansen ved 260 nm og 280 nm. The A260 / A280-forholdet skal være 1,8-2,2.
    2. Kontrollér kvaliteten RNA-prøven ved 0,8% agarosegelelektroforese 25.
      BEMÆRK: intakte eukaryote total RNA skal vise intense 28S og 18S rRNA bands. Forholdet mellem 28S versus 18S rRNA båndintensitet for en god RNA-præparat er ~ 2.

2. Gel Elektroforese og overførsel

BEMÆRK: buffer forberedelse protokoller er angivet i tabel 1.

  1. Formaldehyd Gel Fremstilling (1%)
    1. Skyl alt elektroforese udstyr med diethylpyrocarbonat (DEPC) vand.
    2. Smelt 2,5 g agarose i 215 ml DEPC vand fuldstændigt i en mikrobølgeovn.
    3. Tilføj 12,5 ml 10x 3- (N- morpholino) propansulfonsyre (MOPS) -buffer og 22,5 ml 37% formaldehyd.
    4. Hæld det i elektroforese apparat med en 1,5 mm tyk kam.
    5. Eliminer bobler eller skubbe them til kanterne af gelen med en ren kam.
    6. Tillad gelen at størkne ved stuetemperatur.
  2. Prøvefremstilling
    1. Bland 1-10 ug totalt RNA og 11,3 pi prøvepuffer.
    2. Bland 2 ug af RNA markør (1 ug / uL) med 11,3 pi af prøven buffer.
    3. Tilføj nuklease-frit vand til prøverne fra 2.2.1 og 2.2.2 til et samlet volumen på 16 pi.
    4. Der opvarmes til 60 ° C i 5 minutter, og derefter chill på is.
    5. Bland 16 pi af prøven fra 2.2.3 med 4 pi sporing farvestof, som indeholder 0,1 pg / pL ethidiumbromid på is.
      ADVARSEL: Ethidiumbromid er muligvis teratogent og giftigt ved indånding. Læs ethidiumbromid sikkerhedsdatablad.
  3. Elektroforese
    1. 200 ml 10x MOPS buffer til 1800 ml Hedeselskabet 2 O at lave en 1x MOPS kører buffer.
    2. Brug 1x MOPS løbebufferen at skylle brøndene i gelen.
    3. Pre-run than gelere ved 20 V i 5 minutter.
    4. Indlæse RNA-prøver i brøndene på gelen.
    5. Dæk med folie for at undgå udsættelse for lys. Kørt ved 35 V i ca. 17 timer (natten over)
    6. Undersøge og fotografere gel under et UV-lys.
  4. Overførsel
    1. Skær gelen for at fjerne den ubrugte del.
    2. Forbered 500 ml 10x SSC puffer (250 ml 20x SSC buffer og 250 ml DEPC vand).
    3. Vask gelen to gange med 10 x SSC puffer i 20 min under omrystning ved 50 rpm.
    4. Cut 1 filterpapir ark store nok til at tjene som en væge papir, som absorberer transfer buffer fra overførslen bakke (figur 1).
    5. Skær 4 stykker filterpapir til samme størrelse som gelen.
    6. Cut 1 ark af positivt ladet nylonmembran til samme størrelse som gelen.
    7. Markere et hak på gelen og membranen som markør for at sikre den korrekte orientering.
    8. Soak membranen i 2x SSC buffer i 15 min.
    9. Hæld 500 ml of 10x SSC buffer ind i transfer-bakken.
    10. Læg store filter papirarket tværs af glaspladen og våd filtrerpapiret med overførselsbuffer.
    11. Rul eventuelle bobler med en pipette.
    12. Soak 2 stykker af pre-cut filter papir i transfer buffer og placere dem på midten af ​​filtrerpapiret fra trin 2.4.5. Fjern eventuelle bobler.
    13. Læg gel top-side nedad på filterpapir.
    14. Lægge membranen på toppen af ​​gelen. Juster hakkene i gelen og membranen.
    15. Placer 2 stykker af pre-cut filtrerpapir på toppen af ​​membranen og befugte filtrerpapiret med overførselsbuffer.
    16. Fjern eventuelle bobler mellem lagene.
    17. Påfør plastikfolie omkring gelen for at sikre, at håndklæder kun opsuge buffer passerer gennem gelen og membranen.
    18. Stable papirhåndklæder oven på filterpapir.
    19. Placer en overdimensioneret glasplade oven på håndklæder.
    20. Placer en vægt på toppen af ​​stakken.
    21. Holde natten over for at tillade RNA at overføre fra gelen til membranen.

3. Påvisning af N6 -methyladenosine

  1. Membrane Tværbinding
    1. Hold membranen fugtig i 2x SSC buffer.
    2. Placer 2 ark filtrerpapir nedsænkes med 10x SSC buffer i UV tværbindingsmiddel.
    3. Anbring membranen på toppen af ​​filtrerpapiret, med RNA-adsorberede opad.
    4. Vælg "autocrosslink mode" (120.000 μJ) og tryk på knappen "Start" for at starte bestråling.
    5. Undersøg membranen og gelen med en UV gel billede catcher at bekræfte RNA overførsel fra gelen til membranen.
  2. immunoblotting
    1. Blokere membranen i 5% fedtfri mælk i Tris-bufret saltvand med Tween 20 (TBST) buffer ved stuetemperatur i 1 time.
    2. Vask tre gange med TBST-buffer i 15 min.
    3. Inkuber membranen natten over i m 6 A (<em> N 6 -methyladenosine) antistof (1: 1000 i 5% fedtfri mælk TBST buffer) ved 4 ° C.
    4. Vask membranen tre gange med TBST-buffer i 15 min.
    5. Inkuber membranen i HRP-konjugeret æsel-anti-kanin-antistof (1: 2.000 i 5% fedtfri mælk TBST buffer) i 1 time ved stuetemperatur.
    6. Vask membranen tre gange med TBST-buffer i 15 min.
    7. Påfør forstærket kemiluminescerende substrat (0,125 ml pr cm2 af membranen).
    8. Fange kemiluminescens med de optimale indstillinger for den digitale billeddanneren ifølge producentens anvisninger 26.
  3. m 6 A Kvantificering
    1. Mål den relative m 6 et kemiluminescerende intensitet ved hjælp af ImageJ software.
      1. Under software menuen ImageJ, skal du vælge "File" mulighed for at åbne den relevante fil.
      2. Vælg "Rektangel" værktøj fra ImageJ og tegne en ramme omkringsignalerne.
      3. Hvis ribosomalt RNA er ikke i fokus i forsøgene, undgå 18S og 28S ribosomale RNA m 6 A bånd til beregningen.
      4. Klik på "Command" og "1" for at bekræfte den valgte vognbane.
      5. Tryk på "Command" og "3" for at vise den valgte plot.
      6. Klik på "Straight" værktøj og tegne linjer til at adskille det segmenterede område.
      7. Klik på "Wand" værktøj til at registrere målingerne.
      8. Eksportere data.
      9. Normalisere niveauet af m 6 A med 18S ribosomale RNA-båndet fra ethidiumbromidfarvning.

Representative Results

Efter 14 dage i normal lys-mørke døgnrytmen fase blev de vildtypemus placeret i konstant mørke. RNA'erne fra leveren blev samplet ved 4 timers intervaller og undersøgt med modificeret northern blotting. Methylering af rRNA'er, mRNA'er, og små RNA'er blev klart påvist (figur 2). Sammenligningen mellem forskellige døgnrytmen tidspunkter (CT) kan præcist beregnes med 18S rRNA-standarden. Der var robust døgnrytmen oscillation af m 6 A niveauer i rRNA, mRNA, og små RNA.

For at undgå interferens lille som mulig ved rRNA, kan polyadenylerede RNA'er oprenses, som i trin 1.2.2. Efter oprensning kan rRNA stort set fjernes for at muliggøre bedre visualisering af andre RNA'er (figur 3).

figur 1
g> Figur 1: Samling af blot-overførselsenheden. Den kapillære overføringsenhed til blotting af RNA til membranen er vist. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 2
Figur 2: døgnrytmen af m 6 A-niveauer i C57BL / 6J-mus. Denne figur viser m 6 En blot af totalt RNA fra lever fra vildtypemus aflivet på den første dag af den mørke-mørke fase efter 14 dage af en normal lys-mørke fase ved 4 timers intervaller. Kvantificeringen blev udført ved hjælp af m 6 A belysningen forskellen mellem 18S og 28S rRNA. Den m 6 En overflod blev normaliseret til 18S rRNA-båndet fra formaldehyd gel i bunden.et = "_ blank"> Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 3
Figur 3: m 6 A blots med eller uden rRNA. Repræsentative m 6 A blots af totalt RNA og polyadenyleret RNA fra lever fra vildtypemus er vist. Klik her for at se en større version af dette tal.

Tabel 1: Buffere og opløsninger.

Disclosures

Forfatterne har intet at afsløre.

Materials

1 10x MOPS-buffer (pH 7,0, beskyttet mod lys)
MOPS 41,85 g 0,2 M
Natriumacetat 4.1 g 0,05 M
EDTA, dinatriumsalt 3.7 g 0,01 M
DEPC vand
Total 1 L
Der omrøres ved stuetemperatur
2 20x SSC (pH 7,0)
Natriumchlorid 175,3 g 3 M
trinatriumcitrat 88,3 g 0,3 M
DEPC vand
Total 1 L
Der omrøres ved stuetemperatur, derefter autoklaveres
3 Sporing Dye
10x MOPS puffer 500 uL 1x
Ficoll 400 0,75 g 15%
bromphenolblåt 0.01 g 0,2%
xylencyanol 0.01 g 0,2%
DEPC vand
Total 5 ml
Opbevares ved -20 ° C
4 DEPC vand
Fortynd ratio på 1: 1000 af DEPC i Hedeselskabet 2 O
Omrør natten over ved stuetemperatur, derefter autoklaveres
5 Prøve buffer (beskytte mod lys)
10x MOPS puffer 200 uL
37% formaldehyd 270 uL
formamid 660 uL
Opbevares ved -20 ° C
Name Company Catalog Number Comments
RNaseZap solution Ambion AM9782 Protocol 1.1
TRI Reagent solution Ambion AM9738 Protocol 1.2.1.1
1-Bromo-3-chloropropane (BCP) Sigma B9673 Protocol 1.2.1.3
Ethanol JTbaker 8006 Protocol 1.2.1.3
Isopropanol Sigma I9516 Protocol 1.2.1.3
GenElute mRNA Miniprep Kit Sigma MRN70 Protocol 1.2.2.1
Glycogen Ambion AM9510 Protocol 1.2.2.2
Sodium acetate Fluka 71183 Protocol 1.2.2.2
Nuclease-free water Ambion AM9930 Protocol 1.2.2.6
DEPC Sigma D5758 Protocol 2.1.1
Agarose JT Baker A426 Protocol 2.1.2
MOPS Sigma M1254 Protocol 2.1.3
37% formaldehyde Solution Sigma F8775 Protocol 2.1.3
EDTA, Disodium Salt JT Baker 8993 Protocol 2.1.3 10x MOPS buffer
formamide Sigma F7503 Protocol 2.2.1
RNA Millennium Marker Ambion AM7150 Protocol 2.2.2
Ethidium Bromide Amresco X328 Protocol 2.2.5
Ficoll PM400 GE Healthcare 17-0300-10 Protocol 2.2.5 tracking dye
Bromophenol blue Sigma 114391 Protocol 2.2.5 tracking dye
Xylene Cyanol FF Sigma X4126 Protocol 2.2.5 tracking dye
Sodium chloride dihydrate JT Baker 3624 Protocol 2.4.2 20x SSC buffer
Trisodium citrate Sigma S1804 Protocol 2.4.2 20x SSC buffer
Hybond Blotting Paper GE Healthcare RPN6101M Protocol 2.4.4
GE Hybond-N+ membrane GE Healthcare RPN303B Protocol 2.4.6
Stratalinker UV Crosslinker 2400 Stratagene 400075 Protocol 3.1.2
Gel Catcher 1500 ANT Technology Gel Catcher 1500 Protocol 3.1.5
Anti-m6A (N6-methyladenosine) Synaptic Systems 202003 Protocol 3.2.3
Amersham ECL Anti-Rabbit IgG, HRP-linkd whole Ab GE Healthcare NA934 Protocol 3.2.5
ChemiDoc MP System BIO-RAD 1708280 Protocol 3.2.8

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Thammana, P., Held, W. A. Methylation of 16S RNA during ribosome assembly in vitro. Nature. 251 (5477), 682-686 (1974).
  2. Meyer, K. D., Jaffrey, S. R. The dynamic epitranscriptome: N6-methyladenosine and gene expression control. Nat Rev Mol Cell Biol. 15 (5), 313-326 (2014).
  3. Niu, Y., et al. N6-methyl-adenosine (m6A) in RNA: an old modification with a novel epigenetic function. Genomics Proteomics Bioinformatics. 11 (1), 8-17 (2013).
  4. Wang, C. Y., et al. Loss of FTO in adipose tissue decreases Angptl4 translation and alters triglyceride metabolism. Sci Signal. 8 (407), 127 (2015).
  5. Wang, X., et al. N6-methyladenosine-dependent regulation of messenger RNA stability. Nature. 505 (7481), 117-120 (2014).
  6. Berulava, T., Rahmann, S., Rademacher, K., Klein-Hitpass, L., Horsthemke, B. N6-adenosine methylation in MiRNAs. PLoS One. 10 (2), 0118438 (2015).
  7. Deng, X., et al. Widespread occurrence of N6-methyladenosine in bacterial mRNA. Nucleic Acids Res. 43 (13), 6557-6567 (2015).
  8. Dominissini, D., et al. The dynamic N-methyladenosine methylome in eukaryotic messenger RNA. Nature. , (2016).
  9. Fustin, J. M., et al. RNA-methylation-dependent RNA processing controls the speed of the circadian clock. Cell. 155 (4), 793-806 (2013).
  10. Geula, S., et al. Stem cells. m6A mRNA methylation facilitates resolution of naive pluripotency toward differentiation. Science. 347 (6225), 1002-1006 (2015).
  11. Wang, C. Y., et al. FTO modulates fibrogenic responses in obstructive nephropathy. Sci Rep. , SREP18874 (2016).
  12. Jia, G., et al. N6-methyladenosine in nuclear RNA is a major substrate of the obesity-associated FTO. Nat Chem Biol. 7 (12), 885-887 (2011).
  13. Du, T., et al. An association study of the m6A genes with major depressive disorder in Chinese Han population. J Affect Disord. 183, 279-286 (2015).
  14. Wang, C. Y., Yeh, J. K., Shie, S. S., Hsieh, I. C., Wen, M. S. Circadian rhythm of RNA N6-methyladenosine and the role of cryptochrome. Biochem Biophys Res Commun. 465 (1), 88-94 (2015).
  15. Wang, C. Y., Shie, S. S., Hsieh, I. C., Tsai, M. L., Wen, M. S. FTO modulates circadian rhythms and inhibits the CLOCK-BMAL1-induced transcription. Biochem Biophys Res Commun. 464 (3), 826-832 (2015).
  16. Heyn, H., Esteller, M. An Adenine Code for DNA: A Second Life for N6-Methyladenine. Cell. 161 (4), 710-713 (2015).
  17. Xiao, W., et al. Nuclear m(6)A Reader YTHDC1 Regulates mRNA Splicing. Mol Cell. 61 (4), 507-519 (2016).
  18. Meyer, K. D., et al. Comprehensive analysis of mRNA methylation reveals enrichment in 3' UTRs and near stop codons. Cell. 149 (7), 1635-1646 (2012).
  19. Horowitz, S., Horowitz, A., Nilsen, T. W., Munns, T. W., Rottman, F. M. Mapping of N6-methyladenosine residues in bovine prolactin mRNA. Proc Natl Acad Sci U S A. 81 (18), 5667-5671 (1984).
  20. Resnick, R. J., Noreen, D., Munns, T. W., Perdue, M. L. Role of N6-methyladenosine in expression of Rous sarcoma virus RNA: analyses utilizing immunoglobulin specific for N6-methyladenosine. Prog Nucleic Acid Res Mol Biol. 29, 214-218 (1983).
  21. Golovina, A. Y., et al. Method for site-specific detection of m6A nucleoside presence in RNA based on high-resolution melting (HRM) analysis. Nucleic Acids Res. 42 (4), 27 (2014).
  22. Dominissini, D., et al. Topology of the human and mouse m6A RNA methylomes revealed by m6A-seq. Nature. 485 (7397), 201-206 (2012).
  23. Linder, B., et al. Single-nucleotide-resolution mapping of m6A and m6Am throughout the transcriptome. Nat Methods. 12 (8), 767-772 (2015).
  24. Fu, L., et al. Simultaneous Quantification of Methylated Cytidine and Adenosine in Cellular and Tissue RNA by Nano-Flow Liquid Chromatography-Tandem Mass Spectrometry Coupled with the Stable Isotope-Dilution Method. Anal Chem. 87 (15), 7653-7659 (2015).
  25. Rio, D. C., Ares, M., Hannon, G. J., Nilsen, T. W. Nondenaturing agarose gel electrophoresis of RNA. Cold Spring Harb Protoc. 2010 (6), 5445 (2010).
  26. Wang, C. Y., et al. FTO modulates fibrogenic responses in obstructive nephropathy. Sci Rep. 6, 18874 (2016).
  27. Li, X., et al. Transcriptome-wide mapping reveals reversible and dynamic N-methyladenosine methylome. Nat Chem Biol. , (2016).
  28. Sanschagrin, S., Yergeau, E. Next-generation sequencing of 16S ribosomal RNA gene amplicons. J Vis Exp. (90), (2014).
  29. Kukutla, P., Steritz, M., Xu, J. Depletion of ribosomal RNA for mosquito gut metagenomic RNA-seq. J Vis Exp. (74), (2013).
  30. Mishima, E., et al. Immuno-Northern Blotting: Detection of RNA Modifications by Using Antibodies against Modified Nucleosides. PLoS One. 10 (11), 0143756 (2015).
  31. Klungland, A., Dahl, J. A. Dynamic RNA modifications in disease. Curr Opin Genet Dev. 26, 47-52 (2014).

Tags

Biochemistry RNA m Methylering demetylase FTO Epitranscriptome
En metode til måling af RNA<em&gt; N</em<sup&gt; 6</sup&gt; -methyladenosine Ændringer i celler og væv
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Wang, C. Y., Lin, M. H., Su, H. T. A … More

Wang, C. Y., Lin, M. H., Su, H. T. A Method for Measuring RNA N6-methyladenosine Modifications in Cells and Tissues. J. Vis. Exp. (118), e54672, doi:10.3791/54672 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter