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Biochemistry

मापने शाही सेना के लिए एक विधि Published: December 5, 2016 doi: 10.3791/54672
Automatic Translation
1, 1, 1
1Department of Cardiology, Chang Gung Memorial Hospital, Chang Gung University College of Medicine

Summary

शाही सेना में एन 6 -methyladenosine (एम 6 ए) संशोधनों को मापने के लिए एक संशोधित उत्तरी सोख्ता विधि वर्णित है। वर्तमान पद्धति विभिन्न प्रयोगात्मक डिजाइन के तहत विविध RNAs में संशोधनों और नियंत्रण पता लगा सकते हैं।

Protocol

नोट: कुल शाही सेना मीटर 6 एक स्तर rRNA, mRNA, और अन्य छोटे RNAs भी शामिल है। Ribosomal शाही सेना प्रचुर मात्रा में एम ए 6 संशोधनों मीटर की माप 6 ए का स्तर इस तथ्य पर विचार करने की आवश्यकता होगी किया गया है।

1. आरएनए अलगाव

  1. ribonuclease परिशोधन समाधान (कागज तौलिए पर छिड़काव) का उपयोग करना, pipettes और प्रयोगशाला बेंच सतहों पोंछे। nuclease मुक्त पानी से गीला कागज तौलिए और फिर pipettes और प्रयोगशाला बेंच सतहों नीचे पोंछ।
  2. शाही सेना निकालना
    1. कुल शाही सेना अलगाव
      1. एक उपरि दोषी का उपयोग करना, या 4 डिग्री सेल्सियस पर बनाए रखा शाही सेना अलगाव समाधान के 1 एमएल में 5-10 x 10 6 कोशिकाओं ऊतक के 50-100 मिलीग्राम homogenize।
        नोट: अधिक ऊतक (100-150 मिलीग्राम), क्योंकि निचले शाही सेना सांद्रता उसमें से चूहों से वसा ऊतकों के नमूनों के लिए आवश्यक हो सकता है। नमूने माउस दिल, जिगर, कंकाल की मांसपेशी, फेफड़े, मस्तिष्क से स्रोत, और मैक्रोफेज पहले 4 नियोजित किया गया है।
      2. मेंकमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए नमूना homogenates cubate।
      3. 1-ब्रोमो-3-chloropropane (बीसीपी) नमूना homogenate के 1 एमएल प्रति के 100 μL जोड़ें। 15 एस के लिए सख्ती नलियों हिला और कुल शाही सेना को अलग-थलग करने के लिए निर्माता के निर्देशों के अनुसार 24 आगे बढ़ें।
    2. पृथक कुल शाही सेना से polyadenylated mRNA शोधन
      1. उपलब्ध किट या प्रोटोकॉल का उपयोग polyadenylated mRNA शुद्ध।
        1. अच्छी तरह से मिलाओ निम्न समाधानों में से प्रत्येक को फिर से निलंबित करने के लिए: 2x बाध्यकारी समाधान, oligo (डीटी) polystyrene मोती, और धोने समाधान। सुनिश्चित करें कि oligo (डीटी) उपयोग करने से पहले कमरे के तापमान को गर्म मोती।
        2. एक हीटिंग ब्लॉक में 70 डिग्री सेल्सियस के लिए एक ट्यूब और गर्मी में तैयारी प्रति क्षालन समाधान के 120 μL स्थानांतरण।
        3. एक microcentrifuge ट्यूब में कुल शाही सेना के 500 माइक्रोग्राम प्रति अप करने के लिए पिपेट। nuclease मुक्त पानी के साथ, 250 μL करने के लिए मात्रा समायोजित करें।
        4. 2x बाध्यकारी समाधान के 250 μL कुल शाही सेना को जोड़ें ताकिlution और भंवर संक्षिप्त सामग्री मिश्रण करने के लिए।
        5. (डीटी) माला और भंवर मिश्रण अच्छी तरह से करने के लिए oligo के 15 μL जोड़ें।
        6. 3 मिनट के लिए 70 डिग्री सेल्सियस पर मिश्रण सेते हैं।
        7. हीटिंग ब्लॉक से नमूना निकालें और इसे 10 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर खड़े हो जाओ।
        8. 2 मिनट के लिए 15,000 XG पर अपकेंद्रित्र।
        9. ध्यान से सतह पर तैरनेवाला हटाने के पीछे लगभग 50 μL जा रही है।
        10. धोने के समाधान के 500 μL pipetting द्वारा गोली फिर से निलंबित करने के लिए जोड़ें।
        11. एक स्पिन फिल्टर / संग्रह ट्यूब सेट में निलंबन पिपेट।
        12. 2 मिनट के लिए 15,000 XG पर अपकेंद्रित्र। संग्रह ट्यूब से स्तंभ निकालें और प्रवाह के माध्यम से त्यागें। संग्रह ट्यूब के लिए स्तंभ लौटें।
        13. स्पिन फिल्टर पर धोने के समाधान के पिपेट 500 μL।
        14. पर 15,000 एक्स अपकेंद्रित्र 2 मिनट के लिए जी।
        15. एक ताजा संग्रह ट्यूब में स्पिन फिल्टर स्थानांतरण।
        16. क्षालन समाधान के पिपेट 50 μL गर्म किया70 डिग्री सेल्सियस के स्पिन फिल्टर के केंद्र पर।
        17. 70 डिग्री सेल्सियस पर 2-5 मिनट के लिए सेते हैं। 1 मिनट के लिए 15,000 XG पर अपकेंद्रित्र।
        18. स्पिन फिल्टर के केंद्र पर गरम क्षालन समाधान 70 डिग्री सेल्सियस के एक अतिरिक्त 50 μL पिपेट।
        19. दोहराएँ चरण 1.2.2.1.18।
      2. 100 माइक्रोग्राम / एमएल ग्लाइकोजन, 3 एम सोडियम एसीटेट बफर (पीएच 5.2), और निरपेक्ष इथेनॉल के 2.5 संस्करणों के 0.1 मात्रा में जोड़ें। -80 डिग्री सेल्सियस पर रात भर वेग।
      3. 4 डिग्री सेल्सियस पर 25 मिनट के लिए 15,000 XG पर अपकेंद्रित्र। सतह पर तैरनेवाला त्यागें।
      4. 75% इथेनॉल के 1 एमएल के साथ गोली धो लें। 4 डिग्री सेल्सियस पर 15 मिनट के लिए 15,000 XG पर अपकेंद्रित्र। ध्यान से इथेनॉल को हटा दें।
      5. 3-5 मिनट के लिए हवा में सूखी।
      6. nuclease मुक्त पानी की 10 μL गोली भंग करने के लिए जोड़ें।
      7. -70 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर।
  3. आरएनए योग्यता और मात्रा का ठहराव
    1. एक स्पेक्ट्रोफोटोमीटर का प्रयोग, अधिसूचित द्वारा शाही सेना एकाग्रता का निर्धारण260 एनएम और 280 एनएम पर absorbance एनजी। एक 260 / ए 280 अनुपात 1.8-2.2 होना चाहिए।
    2. शाही सेना के नमूने गुणवत्ता 0.8% agarose जेल वैद्युतकणसंचलन 25 का उपयोग कर जाँच करें।
      नोट: बरकरार यूकेरियोटिक कुल शाही सेना तीव्र 28S और 18S rRNA बैंड दिखाना चाहिए। 28S के अनुपात की तुलना में 18S rRNA बैंड तीव्रता एक अच्छा आरएनए तैयारी के लिए ~ 2 है।

2. जेल वैद्युतकणसंचलन और स्थानांतरण

नोट: बफर तैयारी प्रोटोकॉल तालिका 1 में दिया जाता है।

  1. संक्रामक जेल तैयारी (1%)
    1. diethylpyrocarbonate (DEPC) पानी के साथ सभी वैद्युतकणसंचलन उपकरण कुल्ला।
    2. DEPC पानी की 215 एमएल में agarose की 2.5 ग्राम पिघला पूरी तरह से एक माइक्रोवेव ओवन में।
    3. 10x 3- (एन morpholino) propanesulfonic एसिड (MOPS) की 12.5 एमएल बफर और 37% formaldehyde के 22.5 एमएल जोड़ें।
    4. एक 1.5 मिमी मोटी कंघी के साथ वैद्युतकणसंचलन तंत्र में डाल देना।
    5. बुलबुले को खत्म करने या धक्का टीएक साफ कंघी के साथ जेल के किनारों को हेम।
    6. जेल कमरे के तापमान पर जमना करने की अनुमति दें।
  2. नमूना तैयार करना
    1. नमूना बफर के 1-10 ग्राम के कुल शाही सेना के और 11.3 μL मिक्स।
    2. आरएनए मार्कर (1 माइक्रोग्राम / μL) के 2 माइक्रोग्राम मिक्स नमूना बफर के 11.3 μL के साथ।
    3. 16 μL की कुल मात्रा के लिए 2.2.1 और 2.2.2 से नमूने लिए nuclease मुक्त पानी जोड़ें।
    4. 5 मिनट के लिए 60 डिग्री सेल्सियस पर गर्मी, और फिर बर्फ पर ठंडा।
    5. ट्रैकिंग डाई के 4 μL, जो / μL ethidium ब्रोमाइड बर्फ पर 0.1 माइक्रोग्राम शामिल है के साथ 2.2.3 से नमूना के 16 μL मिक्स।
      चेतावनी: ethidium ब्रोमाइड अगर साँस संभवतः टेराटोजेनिक और विषैला होता है। ethidium ब्रोमाइड सुरक्षा पत्रक पढ़ें।
  3. वैद्युतकणसंचलन
    1. 10x mops के 200 एमएल DDH 2 हे के 1800 एमएल बफर एक 1x MOPS चल बफर बनाने के लिए जोड़ें।
    2. जेल के कुओं कुल्ला करने के लिए 1x MOPS चल बफर का प्रयोग करें।
    3. पूर्व रन टीवह 5 मिनट के लिए 20 वी पर जेल।
    4. जेल के कुओं में शाही सेना के नमूने लोड।
    5. पन्नी के साथ कवर प्रकाश जोखिम से बचने के लिए। के बारे में 17 घंटे के लिए 35 वी पर चलाएं (रात)
    6. जांच करने और एक पराबैंगनी प्रकाश के तहत जेल की तस्वीर।
  4. हस्तांतरण
    1. जेल कट अप्रयुक्त भाग हटा दें।
    2. 10x एसएससी बफर (20x एसएससी बफर के 250 एमएल और DEPC पानी की 250 मिलीलीटर) की 500 एमएल तैयार करें।
    3. जेल में 50 rpm पर झटकों के साथ 20 मिनट के लिए 10x एसएससी बफर के साथ दो बार धोएं।
    4. कट 1 फिल्टर पेपर शीट काफी बड़े एक बाती कागज, जो हस्तांतरण ट्रे (चित्रा 1) से स्थानांतरण बफर अवशोषित के रूप में काम करने के लिए।
    5. जेल के रूप में एक ही आकार के लिए फिल्टर पेपर के 4 टुकड़े काटें।
    6. जेल के रूप में एक ही आकार के लिए सकारात्मक आरोप लगाया नायलॉन झिल्ली के 1 शीट में कटौती।
    7. जेल पर एक पायदान और एक मार्कर उचित उन्मुखीकरण सुनिश्चित करने के लिए के रूप में झिल्ली निशान।
    8. 15 मिनट के लिए 2x एसएससी बफर में झिल्ली लेना।
    9. 500 एमएल ओ डालोच 10x एसएससी हस्तांतरण ट्रे में बफर।
    10. कांच की थाली भर में बड़ी फिल्टर पेपर शीट निर्धारित करना और हस्तांतरण बफर के साथ फिल्टर पेपर गीला।
    11. एक विंदुक के साथ किसी भी बुलबुले बाहर रोल।
    12. स्थानांतरण बफर में पूर्व में कटौती फिल्टर पेपर के 2 टुकड़े लेना और कदम 2.4.5 से फिल्टर पेपर के केंद्र पर उन्हें जगह है। किसी भी बुलबुले निकालें।
    13. फिल्टर पेपर पर लेट गया जेल शीर्ष की ओर।
    14. जेल के शीर्ष पर झिल्ली निर्धारित करना। जेल और झिल्ली की डिग्री अधिक संरेखित करें।
    15. पूर्व में कटौती फिल्टर पेपर के 2 टुकड़े झिल्ली के शीर्ष पर रखें और हस्तांतरण बफर के साथ फिल्टर पेपर गीला।
    16. परतों के बीच किसी भी बुलबुले निकालें।
    17. जेल के चारों ओर प्लास्टिक की चादर लागू सुनिश्चित करने के लिए कि तौलिए केवल बफर जेल और झिल्ली के माध्यम से गुजर सोख।
    18. फिल्टर पेपर के शीर्ष पर कागज तौलिए हो चुकी है।
    19. तौलिये के शीर्ष पर एक बड़े आकार के कांच की प्लेट रखें।
    20. ढेर के शीर्ष पर एक वजन रखें।
    21. रात भर रखें आरएनए जेल से झिल्ली को हस्तांतरण करने की अनुमति देने के लिए।

3. एन 6 -methyladenosine की जांच

  1. झिल्ली Crosslinking
    1. झिल्ली 2x एसएससी बफर में नम रखें।
    2. फिल्टर पेपर यूवी crosslinker में 10x एसएससी बफर के साथ डूब के 2 चादरें रखें।
    3. फिल्टर पेपर के शीर्ष पर झिल्ली प्लेस, शाही सेना adsorbed के पक्ष सामना करना पड़ रहा है।
    4. "Autocrosslink मोड" (120,000 μJ) का चयन करें और विकिरण आरंभ करने के लिए "प्रारंभ" बटन दबाएँ।
    5. झिल्ली और एक यूवी जेल छवि पकड़ने के साथ जेल की जांच करने झिल्ली को जेल से शाही सेना हस्तांतरण पुष्टि करने के लिए।
  2. immunoblotting
    1. 1 घंटे के लिए कमरे के तापमान पर बीच 20 (TBST) बफर के साथ Tris बफर खारा में 5% गैर वसा दूध में झिल्ली ब्लॉक।
    2. 15 मिनट के लिए TBST बफर के साथ तीन बार धोएं।
    3. एम 6 ए (झिल्ली में रात भर सेते हैं <उन्हें> एन 6 -methyladenosine) एंटीबॉडी समाधान (1: 4 डिग्री सेल्सियस पर 5% में 1000 गैर वसा दूध TBST बफर)।
    4. 15 मिनट के लिए TBST बफर के साथ तीन बार झिल्ली धो लें।
    5. कमरे के तापमान पर 1 घंटे के लिए: एचआरपी संयुग्मित गधा विरोधी खरगोश एंटीबॉडी समाधान (2,000 5% गैर वसा दूध TBST बफर में 1) में झिल्ली सेते हैं।
    6. 15 मिनट के लिए TBST बफर के साथ तीन बार झिल्ली धो लें।
    7. बढ़ाया chemiluminescent सब्सट्रेट (झिल्ली के 2 सेमी प्रति 0.125 एमएल) को लागू करें।
    8. डिजिटल इमेजर का इष्टतम सेटिंग्स के साथ chemiluminescence कब्जा, निर्माता के निर्देशों के अनुसार 26।
  3. एम 6 मात्रा
    1. रिश्तेदार मीटर 6 एक chemiluminescent तीव्रता ImageJ सॉफ्टवेयर का उपयोग उपाय।
      1. ImageJ सॉफ्टवेयर मेनू के तहत, उचित फ़ाइल को खोलने के लिए "फाइल" विकल्प का चयन करें।
      2. ImageJ से "आयत" उपकरण का चयन करें और चारों ओर एक फ्रेम आकर्षितसंकेत है।
      3. अगर ribosomal शाही सेना प्रयोगों का ध्यान नहीं है, गणना के लिए 18S और 28S ribosomal शाही सेना मीटर 6 बैंड से बचें।
      4. चुने हुए लेन पुष्टि करने के लिए "कमांड" और "1" पर क्लिक करें।
      5. प्रेस "कमांड" और "3" चयनित भूखंड दिखाने के लिए।
      6. "सीधे" उपकरण क्लिक करें और खंडों क्षेत्र को अलग करने के लिए लाइनों आकर्षित।
      7. माप रिकॉर्ड करने के लिए "छड़ी" उपकरण पर क्लिक करें।
      8. डेटा निर्यात करें।
      9. Ethidium ब्रोमाइड धुंधला से 18S ribosomal शाही सेना बैंड के साथ मीटर 6 ए का स्तर मानक के अनुसार।

Representative Results

सामान्य प्रकाश अंधेरे circadian चरण में 14 दिनों के बाद, जंगली प्रकार चूहों लगातार अंधेरे में रखा गया। जिगर से RNAs 4 घंटा के अंतराल पर जांचा और संशोधित उत्तरी सोख्ता के साथ अध्ययन किया गया। RRNAs, mRNAs, और छोटे RNAs के मेथिलिकरण स्पष्ट रूप से (चित्रा 2) पाया गया। अलग circadian समय के बीच तुलना (सीटी) सही 18S rRNA मानक के साथ गणना की जा सकती है। RRNA, mRNA, और छोटे RNAs में मीटर 6 एक स्तर के मजबूत circadian दोलन था।

हस्तक्षेप rRNA द्वारा proffered बचने के लिए, polyadenylated RNAs कदम 1.2.2 के रूप में, शुद्ध किया जा सकता है। शुद्धि के बाद, rRNA काफी हद तक अन्य आरएनए (चित्रा 3) के बेहतर दृश्य के लिए अनुमति देने के लिए समाप्त किया जा सकता है।

आकृति 1
जी> चित्रा 1: धब्बा हस्तांतरण इकाई कोडांतरण। झिल्ली को आरएनए सोख्ता के लिए केशिका हस्तांतरण इकाई दिखाया गया है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र 2
चित्रा 2: C57BL / 6J चूहों में मीटर 6 एक स्तर के circadian ताल। यह आंकड़ा पता चलता मीटर 6 प्रकार के जंगली चूहों के यकृत से कुल शाही सेना के एक धब्बा 4 घंटे के अंतराल पर एक सामान्य प्रकाश अंधेरे चरण के 14 दिनों के बाद काले अंधेरे चरण के पहले दिन पर बलिदान कर दिया। मात्रा का ठहराव मीटर 6 18S और 28S rRNA के बीच एक छवि घनत्व अंतर का उपयोग किया गया था। एम 6 एक बहुतायत तल पर formaldehyde जेल से 18S rRNA बैंड के लिए सामान्यीकृत था।एट = "_blank"> यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र तीन
चित्रा 3: के साथ या बिना rRNA मीटर 6 एक दाग। प्रतिनिधि मीटर 6 कुल शाही सेना और जंगली प्रकार चूहों के यकृत से polyadenylated शाही सेना के एक दाग दिखाए जाते हैं। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

तालिका 1: बफ़र और समाधान।

Disclosures

लेखकों के पास खुलासे के लिए कुछ भी नहीं है।

Materials

1 10x MOPS बफर (पीएच 7.0, प्रकाश से बचाने)
MOPS 41.85 जी 0.2 एम
नाजिया 4.1 जी 0.05 एम
EDTA, disodium नमक 3.7 जी 0.01 एम
DEPC पानी
कुल 1 एल
कमरे के तापमान पर हलचल
2 20x एसएससी बफर (7.0 पीएच)
सोडियम क्लोराइड 175.3 जी 3 एम
ट्रीसोडियम साइट्रेट 88.3 जी 0.3 एम
DEPC पानी
कुल 1 एल
कमरे के तापमान पर हिलाओ, तो आटोक्लेव
3 ट्रैकिंग डाई
10x MOPS बफर 500 μL 1x
Ficoll 400 0.75 जी 15%
bromophenol नीला 0.01 जी 0.2%
ज़ाइलीन Cyanol 0.01 जी 0.2%
DEPC पानी
कुल 5 एमएल
स्टोर -20 डिग्री सेल्सियस पर
4 DEPC पानी
DDH 2 हे में DEPC के 1,000: 1 अनुपात में पतला
कमरे के तापमान पर रात भर हिलाओ, तो आटोक्लेव
5 नमूना बफर (प्रकाश से बचाने)
10x MOPS बफर 200 μL
37% formaldehyde 270 μL
formamide 660 μL
स्टोर -20 डिग्री सेल्सियस पर
Name Company Catalog Number Comments
RNaseZap solution Ambion AM9782 Protocol 1.1
TRI Reagent solution Ambion AM9738 Protocol 1.2.1.1
1-Bromo-3-chloropropane (BCP) Sigma B9673 Protocol 1.2.1.3
Ethanol JTbaker 8006 Protocol 1.2.1.3
Isopropanol Sigma I9516 Protocol 1.2.1.3
GenElute mRNA Miniprep Kit Sigma MRN70 Protocol 1.2.2.1
Glycogen Ambion AM9510 Protocol 1.2.2.2
Sodium acetate Fluka 71183 Protocol 1.2.2.2
Nuclease-free water Ambion AM9930 Protocol 1.2.2.6
DEPC Sigma D5758 Protocol 2.1.1
Agarose JT Baker A426 Protocol 2.1.2
MOPS Sigma M1254 Protocol 2.1.3
37% formaldehyde Solution Sigma F8775 Protocol 2.1.3
EDTA, Disodium Salt JT Baker 8993 Protocol 2.1.3 10x MOPS buffer
formamide Sigma F7503 Protocol 2.2.1
RNA Millennium Marker Ambion AM7150 Protocol 2.2.2
Ethidium Bromide Amresco X328 Protocol 2.2.5
Ficoll PM400 GE Healthcare 17-0300-10 Protocol 2.2.5 tracking dye
Bromophenol blue Sigma 114391 Protocol 2.2.5 tracking dye
Xylene Cyanol FF Sigma X4126 Protocol 2.2.5 tracking dye
Sodium chloride dihydrate JT Baker 3624 Protocol 2.4.2 20x SSC buffer
Trisodium citrate Sigma S1804 Protocol 2.4.2 20x SSC buffer
Hybond Blotting Paper GE Healthcare RPN6101M Protocol 2.4.4
GE Hybond-N+ membrane GE Healthcare RPN303B Protocol 2.4.6
Stratalinker UV Crosslinker 2400 Stratagene 400075 Protocol 3.1.2
Gel Catcher 1500 ANT Technology Gel Catcher 1500 Protocol 3.1.5
Anti-m6A (N6-methyladenosine) Synaptic Systems 202003 Protocol 3.2.3
Amersham ECL Anti-Rabbit IgG, HRP-linkd whole Ab GE Healthcare NA934 Protocol 3.2.5
ChemiDoc MP System BIO-RAD 1708280 Protocol 3.2.8

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References

  1. Thammana, P., Held, W. A. Methylation of 16S RNA during ribosome assembly in vitro. Nature. 251 (5477), 682-686 (1974).
  2. Meyer, K. D., Jaffrey, S. R. The dynamic epitranscriptome: N6-methyladenosine and gene expression control. Nat Rev Mol Cell Biol. 15 (5), 313-326 (2014).
  3. Niu, Y., et al. N6-methyl-adenosine (m6A) in RNA: an old modification with a novel epigenetic function. Genomics Proteomics Bioinformatics. 11 (1), 8-17 (2013).
  4. Wang, C. Y., et al. Loss of FTO in adipose tissue decreases Angptl4 translation and alters triglyceride metabolism. Sci Signal. 8 (407), 127 (2015).
  5. Wang, X., et al. N6-methyladenosine-dependent regulation of messenger RNA stability. Nature. 505 (7481), 117-120 (2014).
  6. Berulava, T., Rahmann, S., Rademacher, K., Klein-Hitpass, L., Horsthemke, B. N6-adenosine methylation in MiRNAs. PLoS One. 10 (2), 0118438 (2015).
  7. Deng, X., et al. Widespread occurrence of N6-methyladenosine in bacterial mRNA. Nucleic Acids Res. 43 (13), 6557-6567 (2015).
  8. Dominissini, D., et al. The dynamic N-methyladenosine methylome in eukaryotic messenger RNA. Nature. , (2016).
  9. Fustin, J. M., et al. RNA-methylation-dependent RNA processing controls the speed of the circadian clock. Cell. 155 (4), 793-806 (2013).
  10. Geula, S., et al. Stem cells. m6A mRNA methylation facilitates resolution of naive pluripotency toward differentiation. Science. 347 (6225), 1002-1006 (2015).
  11. Wang, C. Y., et al. FTO modulates fibrogenic responses in obstructive nephropathy. Sci Rep. , SREP18874 (2016).
  12. Jia, G., et al. N6-methyladenosine in nuclear RNA is a major substrate of the obesity-associated FTO. Nat Chem Biol. 7 (12), 885-887 (2011).
  13. Du, T., et al. An association study of the m6A genes with major depressive disorder in Chinese Han population. J Affect Disord. 183, 279-286 (2015).
  14. Wang, C. Y., Yeh, J. K., Shie, S. S., Hsieh, I. C., Wen, M. S. Circadian rhythm of RNA N6-methyladenosine and the role of cryptochrome. Biochem Biophys Res Commun. 465 (1), 88-94 (2015).
  15. Wang, C. Y., Shie, S. S., Hsieh, I. C., Tsai, M. L., Wen, M. S. FTO modulates circadian rhythms and inhibits the CLOCK-BMAL1-induced transcription. Biochem Biophys Res Commun. 464 (3), 826-832 (2015).
  16. Heyn, H., Esteller, M. An Adenine Code for DNA: A Second Life for N6-Methyladenine. Cell. 161 (4), 710-713 (2015).
  17. Xiao, W., et al. Nuclear m(6)A Reader YTHDC1 Regulates mRNA Splicing. Mol Cell. 61 (4), 507-519 (2016).
  18. Meyer, K. D., et al. Comprehensive analysis of mRNA methylation reveals enrichment in 3' UTRs and near stop codons. Cell. 149 (7), 1635-1646 (2012).
  19. Horowitz, S., Horowitz, A., Nilsen, T. W., Munns, T. W., Rottman, F. M. Mapping of N6-methyladenosine residues in bovine prolactin mRNA. Proc Natl Acad Sci U S A. 81 (18), 5667-5671 (1984).
  20. Resnick, R. J., Noreen, D., Munns, T. W., Perdue, M. L. Role of N6-methyladenosine in expression of Rous sarcoma virus RNA: analyses utilizing immunoglobulin specific for N6-methyladenosine. Prog Nucleic Acid Res Mol Biol. 29, 214-218 (1983).
  21. Golovina, A. Y., et al. Method for site-specific detection of m6A nucleoside presence in RNA based on high-resolution melting (HRM) analysis. Nucleic Acids Res. 42 (4), 27 (2014).
  22. Dominissini, D., et al. Topology of the human and mouse m6A RNA methylomes revealed by m6A-seq. Nature. 485 (7397), 201-206 (2012).
  23. Linder, B., et al. Single-nucleotide-resolution mapping of m6A and m6Am throughout the transcriptome. Nat Methods. 12 (8), 767-772 (2015).
  24. Fu, L., et al. Simultaneous Quantification of Methylated Cytidine and Adenosine in Cellular and Tissue RNA by Nano-Flow Liquid Chromatography-Tandem Mass Spectrometry Coupled with the Stable Isotope-Dilution Method. Anal Chem. 87 (15), 7653-7659 (2015).
  25. Rio, D. C., Ares, M., Hannon, G. J., Nilsen, T. W. Nondenaturing agarose gel electrophoresis of RNA. Cold Spring Harb Protoc. 2010 (6), 5445 (2010).
  26. Wang, C. Y., et al. FTO modulates fibrogenic responses in obstructive nephropathy. Sci Rep. 6, 18874 (2016).
  27. Li, X., et al. Transcriptome-wide mapping reveals reversible and dynamic N-methyladenosine methylome. Nat Chem Biol. , (2016).
  28. Sanschagrin, S., Yergeau, E. Next-generation sequencing of 16S ribosomal RNA gene amplicons. J Vis Exp. (90), (2014).
  29. Kukutla, P., Steritz, M., Xu, J. Depletion of ribosomal RNA for mosquito gut metagenomic RNA-seq. J Vis Exp. (74), (2013).
  30. Mishima, E., et al. Immuno-Northern Blotting: Detection of RNA Modifications by Using Antibodies against Modified Nucleosides. PLoS One. 10 (11), 0143756 (2015).
  31. Klungland, A., Dahl, J. A. Dynamic RNA modifications in disease. Curr Opin Genet Dev. 26, 47-52 (2014).

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जैव रसायन अंक 118 आरएनए मी मेथिलिकरण demethylase FTO Epitranscriptome
मापने शाही सेना के लिए एक विधि<em&gt; एन</em<sup&gt; 6</sup&gt; कोशिकाओं और ऊतकों में -methyladenosine संशोधनों
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Wang, C. Y., Lin, M. H., Su, H. T. A … More

Wang, C. Y., Lin, M. H., Su, H. T. A Method for Measuring RNA N6-methyladenosine Modifications in Cells and Tissues. J. Vis. Exp. (118), e54672, doi:10.3791/54672 (2016).

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