Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

שיטה למדידת RNA Published: December 5, 2016 doi: 10.3791/54672
Automatic Translation
1, 1, 1
1Department of Cardiology, Chang Gung Memorial Hospital, Chang Gung University College of Medicine

Summary

שיטה סופגת צפונית שונה למדידת N 6 -methyladenosine (מ 6 א) שינויים ב RNA מתוארת. השיטה הנוכחית יכולה לזהות שינויים ב RNAs ובקרות מגוונות תחת עיצובים ניסיוניים שונים.

Protocol

הערה: רנ"א הכל מ 6 רמה כוללת rRNA, mRNA, ו RNA קטנים אחרים. מאז RNA ריבוזומלי יש מ שופע 6 שינויים A, מדידת מ 6 הבגרויות תצטרך לשקול את העובדה הזו.

בידוד RNA 1.

  1. באמצעות פתרון טיהור ribonuclease (מרוסס על מגבות נייר), לנגב את טפטפות ומשטחי ספסל מעבדה. מגבות נייר רטובות עם מי nuclease ללא ולנגב טפטפות ומשטחי ספסל במעבדה שוב.
  2. הפקת RNA
    1. בידוד RNA סה"כ
      1. שימוש בוחש עילי, homogenize 50-100 מ"ג של רקמה או 5-10 x 10 6 תאים 1 מ"ל של תמיסת בידוד RNA שמרו על 4 מעלות צלזיוס.
        הערה: רקמה יותר (100-150 מ"ג) עשויה להידרש דגימות רקמה שומניות מעכברים בגלל ריכוזי RNA הנמוכים בו. דוגמאות שמקורו מן הלב העכבר, כבד, שרירי השלד, ריאות, מוח, מקרופאגים הועסק 4 בעבר.
      2. בcubate homogenates מדגם במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר.
      3. הוספת 100 μL של 1-bromo-3-chloropropane (BCP) לכל 1 מ"ל של homogenate המדגם. לנער את צינורות בתוקף למשך 15 שניות ולהמשיך לבודד רנ"א הכל על פי הוראות היצרן 24.
    2. Polyadenylated mRNA טיהור מ- RNA סה"כ מבודד
      1. לטהר mRNA polyadenylated באמצעות ערכות או פרוטוקולים זמינים.
        1. לנער היטב מחדש להשעות כל אחד מהפתרונות הבאים: פתרון מחייב 2x, אוליגו חרוזי פוליסטירן (DT), והפתרון לשטוף. ודא אוליגו (DT) חרוזים חם לטמפרטורת החדר לפני השימוש.
        2. העבר 120 μL של פתרון elution לכל הכנה לתוך צינור וחום עד 70 ° C בתוך גוש חימום.
        3. פיפטה עד 500 מיקרוגרם של רנ"א הכל לתוך צינור microcentrifuge. עם nuclease ללא מים, להתאים את עוצמת הקול כדי 250 μL.
        4. הוסף 250 μL של פתרון מחייב 2x אל רנ"א הכל כךlution מערבולת בקצרה לערבב את תוכנו.
        5. הוסיפו 15 μL של אוליגו (DT) חרוז מערבולת ביסודיות לערבב.
        6. דגירה את התערובת על 70 מעלות צלזיוס במשך 3 דקות.
        7. הסר את המדגם מגוש החימום ולתת לו לעמוד בטמפרטורת חדר למשך 10 דקות.
        8. צנטריפוגה ב 15,000 XG במשך 2 דקות.
        9. מוציאים בזהירות את supernatant, משאיר מאחוריו כ 50 μL.
        10. הוספת 500 μL של פתרון לשטוף מחדש להשעות את הגלולה ידי pipetting.
        11. פיפטה ההשעיה לתוך מערכת צינור ספין מסנן / אוסף.
        12. צנטריפוגה ב 15,000 XG במשך 2 דקות. הסר את עמודת צינור איסוף וזורק את הזרימה דרך. החזר את עמודת צינור האיסוף.
        13. פיפטה 500 μL של פתרון לשטוף על מסנן הספין.
        14. צנטריפוגה ב 15,000 x גרם במשך 2 דקות.
        15. מעביר את מסנן הספין לתוך צינור איסוף טרי.
        16. פיפטה 50 μL של פתרון elution מחומםעד 70 ° C על גבי במרכז מסנן הספין.
        17. דגירה של 2-5 דק 'ב 70 ° C. צנטריפוגה ב 15,000 XG דקות 1.
        18. פיפטה נוסף 50 μL של פתרון elution מחומם ל -70 מעלות צלזיוס על גבי במרכז מסנן הספין.
        19. חזור על שלב 1.2.2.1.18.
      2. הוספת 100 מיקרוגרם / מ"ל ​​גליקוגן, 0.1 נפח של 3 M חיץ נתרן אצטט (5.2 pH), ו 2.5 כרכים של אתנול אבסולוטי. משקע הלילה ב -80 ° C.
      3. צנטריפוגה ב 15,000 XG במשך 25 דקות ב 4 °. בטל supernatant.
      4. שטפו את הכדור עם 1 מ"ל של אתנול 75%. צנטריפוגה ב 15,000 XG במשך 15 דקות ב 4 ° C.. מוציאים בזהירות את אתנול.
      5. יבש באוויר במשך 3-5 דקות.
      6. הוסף 10 μL של מי nuclease ללא לפזר את הגלולה.
      7. חנות ב -70 ° C.
  3. הכשרת RNA וכימות
    1. באמצעות ספקטרופוטומטר, לקבוע את ריכוז RNA על ידי NotIng את הספיגה ב 260 ננומטר ו -280 ננומטר. יחס 260/280 צריך להיות 1.8-2.2.
    2. בדוק את איכות המדגם RNA באמצעות 0.8% ג'ל agarose אלקטרופורזה 25.
      הערה: רנ"א הכל ללא פגע איקריוטיים צריך להראות 28S אינטנסיבי 18S rRNA להקות. יחס 28S לעומת עוצמת להקת 18S rRNA עבור הכנת RNA טובה הוא ~ 2.

2. ג'ל אלקטרופורזה והסעה

הערה: הפרוטוקולים כן חיץ ניתנים בטבלת 1.

  1. הכנת ג'ל פורמלדהיד (1%)
    1. יש לשטוף את כל הציוד אלקטרופורזה עם diethylpyrocarbonate (DEPC) מים.
    2. ממיסים 2.5 גרם של agarose ב 215 מ"ל מים DEPC לחלוטין במיקרוגל.
    3. הוסף 12.5 מ"ל של 10x 3- (N- morpholino) חומצה propanesulfonic (מגבים) חיץ 22.5 מ"ל של פורמלדהיד 37%.
    4. יוצקים את התערובת לתבנית המנגנון אלקטרופורזה עם מסרק סמיך 1.5 מ"מ.
    5. לחסל בועות או לדחוף tשולי עד הקצוות הג'ל במסרק נקי.
    6. אפשר הג'ל לחזק בטמפרטורת החדר.
  2. לדוגמא הכנה
    1. מערבבים 1-10 מיקרוגרם של RNA סך 11.3 μL של חיץ מדגם.
    2. מערבבים 2 מיקרוגרם של הסמן RNA (1 מיקרוגרם / μL) עם 11.3 μL של חיץ מדגם.
    3. מוסיפים מים nuclease ללא דגימות 2.2.1 ו 2.2.2 כדי בהיקף כולל של 16 μL.
    4. מחממים על 60 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות, ולאחר מכן לצנן על הקרח.
    5. מערבבים 16 μL של המדגם מ 2.2.3 עם 4 μL של צבע מעקב, המכיל 0.1 מיקרוגרם / μL ethidium ברומיד על הקרח.
      זהירות: ברומיד Ethidium הוא אולי טרטוגניות ורעילים אם נשאף. קרא גליון בטיחות ברומיד ethidium.
  3. אלקטרופורזה
    1. הוסף 200 מ"ל של 10x מגבים חיץ ל -1,800 מ"ל של DDH 2 O לבצע למאגר פועל מגבים 1x.
    2. השתמש למאגר פועל מגבי 1x לשטוף את הבארות של ג'ל.
    3. t טרום ריצההוא הג'ל על 20 V למשך 5 דקות.
    4. טען את דגימות רנ"א לתוך הבארות של ג'ל.
    5. מכסים בנייר כסף, כדי למנוע חשיפה לאור. הפעלה ב 35 V עבור כ -17 שעות (לילה)
    6. בדוק ולצלם את הג'ל תחת אור UV.
  4. לְהַעֲבִיר
    1. חותכים את ג'ל להסרת החלק בשימוש.
    2. הכן 500 מ"ל של 10x חיץ SSC (250 מ"ל של חיץ 20x SSC ו 250 מ"ל מים DEPC).
    3. שטפו את הג'ל פעמיים עם חיץ 10x SSC במשך 20 דקות עם רועד ב 50 סל"ד.
    4. חותכי 1 נייר סינון גיליון גדול מספיק כדי לשמש נייר פתילה, אשר סופג חיץ העברה ממגש ההעברה (איור 1).
    5. חותכים 4 חתיכות של נייר סינון לאותו גודל כמו ג'ל.
    6. חותכים 1 גיליון קרום ניילון חיובי טעונים לאותו גודל כמו ג'ל.
    7. סמן חריץ על הג'ל ואת הקרום כסמן כדי להבטיח את הכיוון הנכון.
    8. משרים את הממברנה חיץ 2x SSC במשך 15 דקות.
    9. יוצקים 500 מ"ל of 10x SSC חיץ למגש ההעברה.
    10. הנח את גיליון נייר סינון גדול על פני הצלחת זכוכית להרטיב את נייר הסינון עם חיץ העברה.
    11. מרדד כל בועות עם טפטפת.
    12. משרי 2 חתיכות של נייר סינון מראש לחתוך חיץ העברה ומניח אותם על המרכז של נייר הסינון משלב 2.4.5. הסר את כל בועות.
    13. הנח את הדף בצד ג'ל למטה על נייר הסינון.
    14. הנח את קרום על גבי הג'ל. ישר את החריצים של הג'ל ואת הממברנה.
    15. מניחים 2 חתיכות של נייר סינון מראש לחתוך על גבי הממברנה ואת להרטיב את נייר הסינון עם חיץ העברה.
    16. הסר את כל בועות בין השכבות.
    17. החל בניילון סביב הג'ל על מנת להבטיח כי רק מגבה לספוג חיץ עובר דרך ג'ל הממברנה.
    18. סטאק את מגבות נייר על גבי נייר הסינון.
    19. מניח צלחת זכוכית גדולה על גבי המגבות.
    20. מניחים משקל על החלק העליון של הערימה.
    21. שמור לילה לאפשר RNA להעביר מן הג'ל על הממברנה.

3. איתור של N 6 -methyladenosine

  1. ממברנה Crosslinking
    1. שמור את קרום לחת חיץ 2x SSC.
    2. מניחים 2 גיליונות נייר מסנן שקוע עם 10x חיץ SSC לתוך crosslinker UV.
    3. מניחים את קרום על גבי נייר הסינון, כשהצד RNA-adsorbed פונה כלפי מעלה.
    4. בחר "מצב autocrosslink" (120,000 μJ) ולחץ על כפתור "התחל" כדי להתחיל את ההקרנה.
    5. בדוק את הממברנה ואת ג'ל עם לוכד תמונה ג'ל UV כדי לאשר את העברת RNA מן הג'ל על הממברנה.
  2. immunoblotting
    1. חסום את הממברנה ב 5% חלב דל שומן מלוחים טריס שנאגרו עם 20 Tween (TBST) חיץ בטמפרטורת החדר למשך שעה 1.
    2. לשטוף שלוש פעמים עם חיץ TBST במשך 15 דקות.
    3. דגירה הממברנה לילה מ 6 (<em> N 6 פתרון נוגדנים -methyladenosine) (1: 1,000 ב 5% דל שומן חיץ חלב TBST) ב 4 ° C..
    4. לשטוף את הממברנה שלוש פעמים עם חיץ TBST במשך 15 דקות.
    5. דגירה הממברנה ב HRP-מצומדות חמור פתרון נוגדנים נגד ארנב (1: חיץ 2,000 5% דל שומן חלב TBST) במשך שעה 1 בטמפרטורת החדר.
    6. לשטוף את הממברנה שלוש פעמים עם חיץ TBST במשך 15 דקות.
    7. החל את המצע chemiluminescent משופרת (0.125 מ"ל לס"מ 2 של קרום).
    8. ללכוד את chemiluminescence עם ההגדרות האופטימליות של תרמי הדיגיטלי, על פי הוראות יצרן 26.
  3. מ 6 כימות
    1. למדוד את עוצמת chemiluminescent היחסית מ 6 באמצעות תוכנת ImageJ.
      1. בתפריט התוכנה ImageJ, בחר באפשרות "קובץ" כדי לפתוח את הקובץ הרלוונטי.
      2. בחר באפשרות "מלבן" מ ImageJ ולצייר על ידי מסגרת סביבאת האותות.
      3. אם RNA ריבוזומלי הוא לא המוקד של ניסויים, להימנע להקות ריבוזומלי 18S ו -28 RNA מ 6 לחישוב.
      4. לחץ על "פיקוד" ו "1" כדי לאשר את השביל שנבחר.
      5. לחץ "פיקוד" ו "3" כדי להראות את העלילה שנבחרה.
      6. לחץ על הכלי "ישר" לצייר קווים כדי להפריד את האזור המפולח.
      7. לחץ על הכלי "שרביט" כדי לרשום את המידות.
      8. לייצא את הנתונים.
      9. לנרמל את רמות א מ 6 עם להקת RNA ריבוזומלי 18S מן המכתים ברומיד ethidium.

Representative Results

לאחר 14 ימים בשלב יממה רגיל-כהה אור, עכברי wild-type הונחו בחשכה מתמדת. RNAs מהכבד נדגמו ב 4 במרווחים hr ולמד עם סופג הצפוני שונה. מתילציה של rRNAs, mRNAs, ו RNA הקטן התגלתה בבירור (איור 2). ההשוואה בין זמני יממה שונים (CT) ניתן לחשב במדויק עם תקן 18S rRNA. הייתה תנודת יממה חזקה של רמות מ 6 ב rRNA, mRNA, ו RNA הקטן.

כדי למנוע את ההפרעה שהוצעה על ידי rRNA, RNAs polyadenylated יכול להיות מטוהר, כמו בשלב 1.2.2. לאחר הטיהור, rRNA ניתן למנוע במידה רבה, כדי לאפשר ויזואליזציה טובה יותר של RNAs האחר (איור 3).

איור 1
g> איור 1: רכבת יחידת העברת כתם. יחידת העברת נימים עבור סופג את הרנ"א על ​​הקרום מוצגת. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 2
איור 2: קצב היממה של בחינות הבגרות מ 6 ב C57BL / 6J. נתון זה מראה את מ 6 כתם של RNA הכולל כבדים עכברי-בר הקריב ביום הראשון של השלב הכהה כהה לאחר 14 ימים של שלב אור כהה רגיל ב 4 במרווחי h. כימות נעשה באמצעות מ 6 הפרש צפיפות התמונה בין 18S ו -28 rRNA. מ '6 שפע היה מנורמל הלהקה 18S rRNA מן הג'ל פורמלדהיד בתחתית.et = "_ blank"> לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 3
איור 3: כתמי הקלע זרק 6 עם או בלי rRNA. כתמי נציג מ 6 א 'של רנ"א הכל ו- RNA polyadenylated מן הכבדים של עכברי-בר מוצגים. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

טבלה 1: חוצצים ופתרונות.

Disclosures

החוקרים אין לי מה לחשוף.

Materials

1 חיץ 10x מגבים (pH 7.0, להגן מפני אור)
מגבים 41.85 g 0.2 M
אצטט נתרן 4.1 g 0.05 מ '
EDTA, Disodium מלח 3.7 g 0.01 M
מי DEPC
סה"כ 1 L
מערבבים בטמפרטורת החדר
2 20x חיץ SSC (pH 7.0)
נתרן כלורי 175.3 g 3 M
ציטראט Trisodium 88.3 g 0.3 M
מי DEPC
סה"כ 1 L
מערבבים בטמפרטורת החדר, ואז החיטוי
3 דיי מעקב
חיץ 10x מגבים 500 μL 1x
Ficoll 400 0.75 g 15%
bromophenol כחול 0.01 g 0.2%
קסילן Cyanol 0.01 g 0.2%
מי DEPC
סה"כ 5 מ"ל
חנות ב -20 ° C
4 מי DEPC
לדלל יחס של 1: 1,000 של DEPC DDH 2 O
מערבבים למשך הלילה בטמפרטורת החדר, ואז החיטוי
5 חיץ מדגם (להגן מפני אור)
חיץ 10x מגבים 200 μL
37% פורמלדהיד 270 μL
Formamide 660 μL
חנות ב -20 ° C
Name Company Catalog Number Comments
RNaseZap solution Ambion AM9782 Protocol 1.1
TRI Reagent solution Ambion AM9738 Protocol 1.2.1.1
1-Bromo-3-chloropropane (BCP) Sigma B9673 Protocol 1.2.1.3
Ethanol JTbaker 8006 Protocol 1.2.1.3
Isopropanol Sigma I9516 Protocol 1.2.1.3
GenElute mRNA Miniprep Kit Sigma MRN70 Protocol 1.2.2.1
Glycogen Ambion AM9510 Protocol 1.2.2.2
Sodium acetate Fluka 71183 Protocol 1.2.2.2
Nuclease-free water Ambion AM9930 Protocol 1.2.2.6
DEPC Sigma D5758 Protocol 2.1.1
Agarose JT Baker A426 Protocol 2.1.2
MOPS Sigma M1254 Protocol 2.1.3
37% formaldehyde Solution Sigma F8775 Protocol 2.1.3
EDTA, Disodium Salt JT Baker 8993 Protocol 2.1.3 10x MOPS buffer
formamide Sigma F7503 Protocol 2.2.1
RNA Millennium Marker Ambion AM7150 Protocol 2.2.2
Ethidium Bromide Amresco X328 Protocol 2.2.5
Ficoll PM400 GE Healthcare 17-0300-10 Protocol 2.2.5 tracking dye
Bromophenol blue Sigma 114391 Protocol 2.2.5 tracking dye
Xylene Cyanol FF Sigma X4126 Protocol 2.2.5 tracking dye
Sodium chloride dihydrate JT Baker 3624 Protocol 2.4.2 20x SSC buffer
Trisodium citrate Sigma S1804 Protocol 2.4.2 20x SSC buffer
Hybond Blotting Paper GE Healthcare RPN6101M Protocol 2.4.4
GE Hybond-N+ membrane GE Healthcare RPN303B Protocol 2.4.6
Stratalinker UV Crosslinker 2400 Stratagene 400075 Protocol 3.1.2
Gel Catcher 1500 ANT Technology Gel Catcher 1500 Protocol 3.1.5
Anti-m6A (N6-methyladenosine) Synaptic Systems 202003 Protocol 3.2.3
Amersham ECL Anti-Rabbit IgG, HRP-linkd whole Ab GE Healthcare NA934 Protocol 3.2.5
ChemiDoc MP System BIO-RAD 1708280 Protocol 3.2.8

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Thammana, P., Held, W. A. Methylation of 16S RNA during ribosome assembly in vitro. Nature. 251 (5477), 682-686 (1974).
  2. Meyer, K. D., Jaffrey, S. R. The dynamic epitranscriptome: N6-methyladenosine and gene expression control. Nat Rev Mol Cell Biol. 15 (5), 313-326 (2014).
  3. Niu, Y., et al. N6-methyl-adenosine (m6A) in RNA: an old modification with a novel epigenetic function. Genomics Proteomics Bioinformatics. 11 (1), 8-17 (2013).
  4. Wang, C. Y., et al. Loss of FTO in adipose tissue decreases Angptl4 translation and alters triglyceride metabolism. Sci Signal. 8 (407), 127 (2015).
  5. Wang, X., et al. N6-methyladenosine-dependent regulation of messenger RNA stability. Nature. 505 (7481), 117-120 (2014).
  6. Berulava, T., Rahmann, S., Rademacher, K., Klein-Hitpass, L., Horsthemke, B. N6-adenosine methylation in MiRNAs. PLoS One. 10 (2), 0118438 (2015).
  7. Deng, X., et al. Widespread occurrence of N6-methyladenosine in bacterial mRNA. Nucleic Acids Res. 43 (13), 6557-6567 (2015).
  8. Dominissini, D., et al. The dynamic N-methyladenosine methylome in eukaryotic messenger RNA. Nature. , (2016).
  9. Fustin, J. M., et al. RNA-methylation-dependent RNA processing controls the speed of the circadian clock. Cell. 155 (4), 793-806 (2013).
  10. Geula, S., et al. Stem cells. m6A mRNA methylation facilitates resolution of naive pluripotency toward differentiation. Science. 347 (6225), 1002-1006 (2015).
  11. Wang, C. Y., et al. FTO modulates fibrogenic responses in obstructive nephropathy. Sci Rep. , SREP18874 (2016).
  12. Jia, G., et al. N6-methyladenosine in nuclear RNA is a major substrate of the obesity-associated FTO. Nat Chem Biol. 7 (12), 885-887 (2011).
  13. Du, T., et al. An association study of the m6A genes with major depressive disorder in Chinese Han population. J Affect Disord. 183, 279-286 (2015).
  14. Wang, C. Y., Yeh, J. K., Shie, S. S., Hsieh, I. C., Wen, M. S. Circadian rhythm of RNA N6-methyladenosine and the role of cryptochrome. Biochem Biophys Res Commun. 465 (1), 88-94 (2015).
  15. Wang, C. Y., Shie, S. S., Hsieh, I. C., Tsai, M. L., Wen, M. S. FTO modulates circadian rhythms and inhibits the CLOCK-BMAL1-induced transcription. Biochem Biophys Res Commun. 464 (3), 826-832 (2015).
  16. Heyn, H., Esteller, M. An Adenine Code for DNA: A Second Life for N6-Methyladenine. Cell. 161 (4), 710-713 (2015).
  17. Xiao, W., et al. Nuclear m(6)A Reader YTHDC1 Regulates mRNA Splicing. Mol Cell. 61 (4), 507-519 (2016).
  18. Meyer, K. D., et al. Comprehensive analysis of mRNA methylation reveals enrichment in 3' UTRs and near stop codons. Cell. 149 (7), 1635-1646 (2012).
  19. Horowitz, S., Horowitz, A., Nilsen, T. W., Munns, T. W., Rottman, F. M. Mapping of N6-methyladenosine residues in bovine prolactin mRNA. Proc Natl Acad Sci U S A. 81 (18), 5667-5671 (1984).
  20. Resnick, R. J., Noreen, D., Munns, T. W., Perdue, M. L. Role of N6-methyladenosine in expression of Rous sarcoma virus RNA: analyses utilizing immunoglobulin specific for N6-methyladenosine. Prog Nucleic Acid Res Mol Biol. 29, 214-218 (1983).
  21. Golovina, A. Y., et al. Method for site-specific detection of m6A nucleoside presence in RNA based on high-resolution melting (HRM) analysis. Nucleic Acids Res. 42 (4), 27 (2014).
  22. Dominissini, D., et al. Topology of the human and mouse m6A RNA methylomes revealed by m6A-seq. Nature. 485 (7397), 201-206 (2012).
  23. Linder, B., et al. Single-nucleotide-resolution mapping of m6A and m6Am throughout the transcriptome. Nat Methods. 12 (8), 767-772 (2015).
  24. Fu, L., et al. Simultaneous Quantification of Methylated Cytidine and Adenosine in Cellular and Tissue RNA by Nano-Flow Liquid Chromatography-Tandem Mass Spectrometry Coupled with the Stable Isotope-Dilution Method. Anal Chem. 87 (15), 7653-7659 (2015).
  25. Rio, D. C., Ares, M., Hannon, G. J., Nilsen, T. W. Nondenaturing agarose gel electrophoresis of RNA. Cold Spring Harb Protoc. 2010 (6), 5445 (2010).
  26. Wang, C. Y., et al. FTO modulates fibrogenic responses in obstructive nephropathy. Sci Rep. 6, 18874 (2016).
  27. Li, X., et al. Transcriptome-wide mapping reveals reversible and dynamic N-methyladenosine methylome. Nat Chem Biol. , (2016).
  28. Sanschagrin, S., Yergeau, E. Next-generation sequencing of 16S ribosomal RNA gene amplicons. J Vis Exp. (90), (2014).
  29. Kukutla, P., Steritz, M., Xu, J. Depletion of ribosomal RNA for mosquito gut metagenomic RNA-seq. J Vis Exp. (74), (2013).
  30. Mishima, E., et al. Immuno-Northern Blotting: Detection of RNA Modifications by Using Antibodies against Modified Nucleosides. PLoS One. 10 (11), 0143756 (2015).
  31. Klungland, A., Dahl, J. A. Dynamic RNA modifications in disease. Curr Opin Genet Dev. 26, 47-52 (2014).

Tags

ביוכימיה גיליון 118 RNA מ ' מתילציה Demethylase FTO Epitranscriptome
שיטה למדידת RNA<em&gt; N</em<sup&gt; 6</sup&gt; שינויי -methyladenosine ב תאים ורקמות
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Wang, C. Y., Lin, M. H., Su, H. T. A … More

Wang, C. Y., Lin, M. H., Su, H. T. A Method for Measuring RNA N6-methyladenosine Modifications in Cells and Tissues. J. Vis. Exp. (118), e54672, doi:10.3791/54672 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter