Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

En metod för mätning av RNA Published: December 5, 2016 doi: 10.3791/54672
Automatic Translation
1, 1, 1
1Department of Cardiology, Chang Gung Memorial Hospital, Chang Gung University College of Medicine

Summary

En modifierad Northern blotting metod för att mäta N 6 -methyladenosine (m 6 A) förändringar i RNA beskrivs. Den nuvarande metoden kan detektera ändringar i olika RNA och kontroller under olika experimentell design.

Protocol

OBS: Den totala RNA-m 6 En nivå innehåller rRNA, mRNA och andra små RNA. Eftersom ribosomalt RNA har rikligt m 6 A modifieringar, mätning av m 6 A nivåer kommer att behöva överväga detta faktum.

1. RNA-isolering

  1. Använda ribonukleas sanering lösning (sprutas på pappershanddukar), torka av pipetter och labbbänkytor. Våta pappershanddukar med nukleasfritt vatten och torka av pipetter och labbbänkytor igen.
  2. RNA-extraktion
    1. Total RNA Isolation
      1. Med användning av en överliggande omrörare, homogenisera 50-100 mg vävnad eller 5-10 x 10 6 celler i 1 ml RNA isolering lösning som hölls vid 4 ° C.
        OBS: Mer vävnad (100-150 mg) kan krävas för fettvävnadsprover från möss på grund av de lägre RNA koncentrationer däri. Prover kommer från mus hjärta, lever, skelettmuskel, lunga, hjärna, och makrofager har använts tidigare fyra.
      2. Icubate provhomogenat under 5 min vid rumstemperatur.
      3. Tillsätt 100 | il av en-brom-3-klorpropan (BCP) per 1 mL prov homogenat. Skaka rören kraftigt i 15 sekunder och fortsätt att isolera totalt RNA enligt tillverkarens anvisningar 24.
    2. Polyadenylerad mRNA Rening från isolerat Total RNA
      1. Rena polyadenylerade mRNA med hjälp av tillgängliga kit eller protokoll.
        1. Skaka noggrant för att återsuspendera var och en av följande lösningar: 2x bindande lösning, oligo (DT) polystyrenpärlor, och tvättlösningen. Säkerställa att den oligo (dT) pärlor varm till rumstemperatur före användning.
        2. Överföra 120 mikroliter av elueringslösning per beredning till ett rör och värm till 70 ° C i ett värmeblock.
        3. Pipettera upp till 500 | j, g av totalt RNA till ett mikrocentrifugrör. Med nukleasfritt vatten, justera volymen till 250 mikroliter.
        4. Tillsätt 250 | il av 2x bindningslösningen till totalt RNA sålution och vortex en kort stund för att blanda innehållet.
        5. Tillsätt 15 mikroliter av oligo (dT) pärlor och vortexa grundligt för att blanda.
        6. Inkubera blandningen vid 70 ° C under 3 min.
        7. Avlägsna provet från värmeblocket och låt den stå vid rumstemperatur under 10 min.
        8. Centrifugera vid 15.000 xg under 2 min.
        9. Försiktigt bort supernatanten och lämnar efter sig cirka 50 mikroliter.
        10. Tillsätt 500 pl tvättlösning för att återsuspendera pelleten genom pipettering.
        11. Pipett suspensionen i en spinnfilter / provrör set.
        12. Centrifugera vid 15.000 xg under 2 min. Avlägsna kolonnen från uppsamlingsröret och kassera genomströmning. Återgå kolumnen till provröret.
        13. Pipett 500 mikroliter av tvättlösning på spinnfilter.
        14. Centrifugera vid 15.000 x g under 2 minuter.
        15. Överföra spin filter till en färsk uppsamlingsrör.
        16. Pipettera 50 | il av elueringslösning upphettadestill 70 ° C på mitten av spinnfiltret.
        17. Inkubera under 2-5 min vid 70 ° C. Centrifugera vid 15.000 xg i 1 min.
        18. Pipettera en ytterligare 50 mikroliter av elueringslösning upphettades till 70 ° C på mitten av spinnfiltret.
        19. Upprepa steg 1.2.2.1.18.
      2. Tillsätt 100 | ig / ml glykogen, 0,1 volym av 3 M natriumacetatbuffert (pH 5,2), och 2,5 volymer absolut etanol. Fällning natten vid -80 ° C.
      3. Centrifugera vid 15.000 xg under 25 min vid 4 ° C. Kassera supernatanten.
      4. Tvätta pelleten med 1 ml 75% etanol. Centrifugera vid 15.000 xg under 15 min vid 4 ° C. Försiktigt bort etanolen.
      5. Torka i luft under 3-5 min.
      6. Tillsätt 10 mikroliter av nukleasfritt vatten för att lösa upp pelleten.
      7. Förvara vid -70 ° C.
  3. RNA Kval och kvantifiering
    1. Användning av en spektrofotometer, fastställa vilken RNA-koncentration genom noting av absorbansen vid 260 nm och 280 nm. A 260 / A 280 Förhållandet bör vara 1,8-2,2.
    2. Kontrollera RNA-provet kvalitet med hjälp 0,8% agarosgelelektrofores 25.
      OBS: Den intakta eukaryota totalt RNA bör visa intensiva 28S och 18S rRNA-banden. Förhållandet mellan 28S mot 18S rRNA bandintensitet för en bra RNA preparat är ~ 2.

2. Gelelektrofores och överföring

OBS: De buffertberedningsprotokoll ges i tabell 1.

  1. Formaldehyd Gel Preparation (1%)
    1. Skölj alla elektrofores utrustning med dietylpyrokarbonat (DEPC) vatten.
    2. Smält 2,5 g agaros i 215 ml DEPC vatten helt i en mikrovågsugn.
    3. Lägg 12,5 ml 10x 3- (N- morfolino) propansulfonsyra (MOPS) buffert och 22,5 ml 37% formaldehyd.
    4. Häll den i elektroforesapparaten med en 1,5 mm tjock kam.
    5. Eliminera bubblor eller tryck tfåll till kanterna av gelén med en ren kam.
    6. Tillåt gelén stelna vid rumstemperatur.
  2. prov~~POS=TRUNC
    1. Blanda 1-10 pg av total RNA och 11,3 mikroliter provbuffert.
    2. Blanda 2 mikrogram av RNA-markör (1 mikrogram / mikroliter) med 11,3 mikroliter av provbufferten.
    3. Lägg nukleasfritt vatten till proverna från 2.2.1 och 2.2.2 till en total volym av 16 mikroliter.
    4. Värm vid 60 ° C under 5 min, och sedan kyla på is.
    5. Blanda 16 mikroliter av provet från 2.2.3 med fyra mikroliter av spårning färgämne, som innehåller 0,1 pg / pL etidiumbromid på is.
      VARNING: Etidiumbromid är möjligen teratogent och giftig vid inandning. Läs etidiumbromid säkerhetsdatablad.
  3. Elektrofores
    1. Tillsätt 200 ml av 10x MOPS buffert till 1800 ml DDH 2 O för att göra en 1x MOPS löpbufferten.
    2. Använd 1x MOPS löpbufferten att skölja brunnarna i gelen.
    3. Pre-run than gel vid 20 V under 5 min.
    4. Ladda de RNA-prover i brunnarna hos gelén.
    5. Täck med folie för att undvika ljusexponering. Kördes vid 35 V under cirka 17 timmar (över natten)
    6. Undersök och fotografera gel under en UV-ljus.
  4. Överföring
    1. Skär gel för att avlägsna den oanvända delen.
    2. Förbereda 500 ml 10x SSC-buffert (250 ml 20x SSC-buffert och 250 ml DEPC vatten).
    3. Tvätta gelén två gånger med 10x SSC-buffert under 20 min med skakning vid 50 rpm.
    4. Skär en filterpappersarket tillräckligt stor för att fungera som en veke papper, som absorberar överföringsbuffert från överföringsbrickan (Figur 1).
    5. Klipp 4 bitar av filterpapper för att i samma storlek som gelén.
    6. Skära ett ark av positivt laddade nylonmembran till samma storlek som gelén.
    7. Markera ett hack på gelén och membranet som en markör för att säkerställa rätt orientering.
    8. Blötlägg membranet i 2 x SSC-buffert under 15 min.
    9. Häll 500 ml of 10x SSC-buffert i överföringsbrickan.
    10. Lägga stora filterpappersarket tvärs över glasplatta och väta filterpappret med överföringsbuffert.
    11. Rulla ut eventuella bubblor med en pipett.
    12. Blötlägg 2 bitar av pre-cut filterpapper i överföringsbuffert och placera dem i mitten av filterpapper från steg 2.4.5. Avlägsna eventuella bubblor.
    13. Lade sig på filterpapper gel ovansidan.
    14. Lägga membranet på toppen av gelén. Rikta in skårorna av gelén och membranet.
    15. Placera 2 st pre-cut filterpapper ovanpå membranet och väta filterpapper med överföringsbuffert.
    16. Avlägsna eventuella bubblor mellan skikten.
    17. Tillämpa plastfolie runt gelén för att säkerställa att de handdukar endast suga upp buffert som passerar genom gelén och membranet.
    18. Stapla pappershanddukar ovanpå filterpapperet.
    19. Placera en överdimensionerad glasplatta på toppen av handdukar.
    20. Placera en vikt på toppen av stacken.
    21. Hålla över natten för att göra det möjligt för RNA för att överföra från gelén till membranet.

3. Detektion av N 6 -methyladenosine

  1. membran Tvärbindning
    1. Hålla membranet fuktig i 2 x SSC-buffert.
    2. Placera 2 ark av filterpapper nedsänkt med 10x SSC-buffert i UV tvärbindningsmedel.
    3. Placera membranet ovanpå filterpapperet, med RNA-adsorberade vänd uppåt.
    4. Välj "autocrosslink läge" (120.000 μJ) och tryck på "Start" -knappen för att starta bestrålningen.
    5. Undersök membranet och gelén med en UV-gel bildfångaren för att bekräfta RNA överföring från gelén till membranet.
  2. Immunblotting
    1. Blockera membranet i 5% fettfri mjölk i Tris-buffrad saltlösning med Tween 20 (TBST) buffert vid rumstemperatur under 1 timme.
    2. Tvätta tre gånger med TBST-buffert under 15 min.
    3. Inkubera membranet över natten i m 6 A (<em> N 6 -methyladenosine) antikroppslösning (1: 1000 i 5% fettfri mjölk TBST-buffert) vid 4 ° C.
    4. Tvätta membranet tre gånger med TBST-buffert under 15 min.
    5. Inkubera membranet i HRP-konjugerad åsne-anti-kanin-antikropp-lösning (1: 2000 i 5% fettfri mjölk TBST-buffert) under 1 h vid rumstemperatur.
    6. Tvätta membranet tre gånger med TBST-buffert under 15 min.
    7. Applicera den förstärkta kemiluminiscerande substrat (0,125 ml per cm 2 av membran).
    8. Fånga kemiluminescensen med de optimala inställningarna för den digitala imager, enligt tillverkarens instruktioner 26.
  3. m 6 En Kvantifiering
    1. Mäta den relativa m 6 En kemiluminiscent intensitet med hjälp av ImageJ programvara.
      1. Under ImageJ programvara menyn, välj "File" för att öppna den aktuella filen.
      2. Välj "Rektangel" verktyg från ImageJ och rita en ram runtsignalerna.
      3. Om ribosomalt RNA är inte i fokus för experimenten, undvika 18S och 28S ribosomalt RNA m 6 A band för beräkningen.
      4. Klicka på "Command" och "1" för att bekräfta den valda körfält.
      5. Tryck på "Command" och "3" för att visa den valda tomten.
      6. Klicka på "Straight" verktyg och dra linjer för att skilja den segmenterade området.
      7. Klicka på "Wand" verktyg för att registrera mätningarna.
      8. Exportera data.
      9. Normalisera nivåer av m 6 A med 18S ribosomala RNA-band från etidiumbromidfärgning.

Representative Results

Efter 14 dagar i normal ljus-mörker cirkadiska fasen ades vildtyp möss placeras i konstant mörker. De RNA från levern samplas med 4 timmars intervall och studerade med modifierad Northern blotting. Metyleringen av rRNA, mRNA, och små RNA tydligt detekteras (figur 2). Jämförelsen mellan olika dygnsrytm gånger (CT) exakt kan beräknas med 18S rRNA-standarden. Det var stark dygnsrytm svängning m 6 A nivåer i rRNA, mRNA, och små RNA.

För att undvika interferensen erbjudna av rRNA kan polyadenylerade RNAs renas, såsom i steg 1.2.2. Efter rening, kan den rRNA i stor utsträckning elimineras för att möjliggöra bättre visualisering av andra RNA (figur 3).

Figur 1
g> Figur 1: Montera blot överföringsenheten. Kapillären överföringsenheten för blotting av RNA till membranet visas. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

figur 2
Figur 2: dygnsrytmen av de m 6 A nivåer i C57BL / 6J-möss. Denna figur visar den m 6 En blöt av totalt RNA från lever av vildtyp möss avlivades på den första dagen i den mörka-mörka fasen efter 14 dagar av en normal ljus-mörker-fasen vid 4 timmars intervall. Kvantifieringen utfördes med användning av m 6 En bild densitetsskillnad mellan 18S och 28S rRNA. M 6 Ett överflöd normaliserades till 18S rRNA-bandet från den formaldehydgel längst ner.et = "_ blank"> Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 3
Figur 3: m 6 A blottar med eller utan rRNA. Representativ m 6 A blottar av totalt RNA och polyadenylerad RNA från lever av vildtyp möss visas. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Tabell 1: Buffertar och lösningar.

Disclosures

Författarna har ingenting att lämna ut.

Materials

1 10x MOPS-buffert (pH 7,0, skydda mot ljus)
MOPS 41,85 g 0,2 M
Natriumacetat 4,1 g 0,05 M
EDTA, dinatriumsalt 3,7 g 0,01 M
DEPC vatten
Total 1 L
Rör om vid rumstemperatur
2 20x SSC-buffert (pH 7,0)
Natriumklorid 175,3 g 3 M
trinatriumcitrat 88,3 g 0,3 M
DEPC vatten
Total 1 L
Rör om vid rumstemperatur, sedan autoklavera
3 spårnings Dye
10x MOPS-buffert 500 mikroliter 1x
Ficoll 400 0,75 g 15%
bromfenolblått 0,01 g 0,2%
xylencyanol 0,01 g 0,2%
DEPC vatten
Total 5 ml
Förvara vid -20 ° C
4 DEPC vatten
Späd uppgick vid 1: 1000 av DEPC i DDH 2 O
Rör om över natt vid rumstemperatur, sedan autoklavera
5 Provbuffert (skydda från ljus)
10x MOPS-buffert 200 mikroliter
37% formaldehyd 270 mikroliter
formamid 660 mikroliter
Förvara vid -20 ° C
Name Company Catalog Number Comments
RNaseZap solution Ambion AM9782 Protocol 1.1
TRI Reagent solution Ambion AM9738 Protocol 1.2.1.1
1-Bromo-3-chloropropane (BCP) Sigma B9673 Protocol 1.2.1.3
Ethanol JTbaker 8006 Protocol 1.2.1.3
Isopropanol Sigma I9516 Protocol 1.2.1.3
GenElute mRNA Miniprep Kit Sigma MRN70 Protocol 1.2.2.1
Glycogen Ambion AM9510 Protocol 1.2.2.2
Sodium acetate Fluka 71183 Protocol 1.2.2.2
Nuclease-free water Ambion AM9930 Protocol 1.2.2.6
DEPC Sigma D5758 Protocol 2.1.1
Agarose JT Baker A426 Protocol 2.1.2
MOPS Sigma M1254 Protocol 2.1.3
37% formaldehyde Solution Sigma F8775 Protocol 2.1.3
EDTA, Disodium Salt JT Baker 8993 Protocol 2.1.3 10x MOPS buffer
formamide Sigma F7503 Protocol 2.2.1
RNA Millennium Marker Ambion AM7150 Protocol 2.2.2
Ethidium Bromide Amresco X328 Protocol 2.2.5
Ficoll PM400 GE Healthcare 17-0300-10 Protocol 2.2.5 tracking dye
Bromophenol blue Sigma 114391 Protocol 2.2.5 tracking dye
Xylene Cyanol FF Sigma X4126 Protocol 2.2.5 tracking dye
Sodium chloride dihydrate JT Baker 3624 Protocol 2.4.2 20x SSC buffer
Trisodium citrate Sigma S1804 Protocol 2.4.2 20x SSC buffer
Hybond Blotting Paper GE Healthcare RPN6101M Protocol 2.4.4
GE Hybond-N+ membrane GE Healthcare RPN303B Protocol 2.4.6
Stratalinker UV Crosslinker 2400 Stratagene 400075 Protocol 3.1.2
Gel Catcher 1500 ANT Technology Gel Catcher 1500 Protocol 3.1.5
Anti-m6A (N6-methyladenosine) Synaptic Systems 202003 Protocol 3.2.3
Amersham ECL Anti-Rabbit IgG, HRP-linkd whole Ab GE Healthcare NA934 Protocol 3.2.5
ChemiDoc MP System BIO-RAD 1708280 Protocol 3.2.8

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Thammana, P., Held, W. A. Methylation of 16S RNA during ribosome assembly in vitro. Nature. 251 (5477), 682-686 (1974).
  2. Meyer, K. D., Jaffrey, S. R. The dynamic epitranscriptome: N6-methyladenosine and gene expression control. Nat Rev Mol Cell Biol. 15 (5), 313-326 (2014).
  3. Niu, Y., et al. N6-methyl-adenosine (m6A) in RNA: an old modification with a novel epigenetic function. Genomics Proteomics Bioinformatics. 11 (1), 8-17 (2013).
  4. Wang, C. Y., et al. Loss of FTO in adipose tissue decreases Angptl4 translation and alters triglyceride metabolism. Sci Signal. 8 (407), 127 (2015).
  5. Wang, X., et al. N6-methyladenosine-dependent regulation of messenger RNA stability. Nature. 505 (7481), 117-120 (2014).
  6. Berulava, T., Rahmann, S., Rademacher, K., Klein-Hitpass, L., Horsthemke, B. N6-adenosine methylation in MiRNAs. PLoS One. 10 (2), 0118438 (2015).
  7. Deng, X., et al. Widespread occurrence of N6-methyladenosine in bacterial mRNA. Nucleic Acids Res. 43 (13), 6557-6567 (2015).
  8. Dominissini, D., et al. The dynamic N-methyladenosine methylome in eukaryotic messenger RNA. Nature. , (2016).
  9. Fustin, J. M., et al. RNA-methylation-dependent RNA processing controls the speed of the circadian clock. Cell. 155 (4), 793-806 (2013).
  10. Geula, S., et al. Stem cells. m6A mRNA methylation facilitates resolution of naive pluripotency toward differentiation. Science. 347 (6225), 1002-1006 (2015).
  11. Wang, C. Y., et al. FTO modulates fibrogenic responses in obstructive nephropathy. Sci Rep. , SREP18874 (2016).
  12. Jia, G., et al. N6-methyladenosine in nuclear RNA is a major substrate of the obesity-associated FTO. Nat Chem Biol. 7 (12), 885-887 (2011).
  13. Du, T., et al. An association study of the m6A genes with major depressive disorder in Chinese Han population. J Affect Disord. 183, 279-286 (2015).
  14. Wang, C. Y., Yeh, J. K., Shie, S. S., Hsieh, I. C., Wen, M. S. Circadian rhythm of RNA N6-methyladenosine and the role of cryptochrome. Biochem Biophys Res Commun. 465 (1), 88-94 (2015).
  15. Wang, C. Y., Shie, S. S., Hsieh, I. C., Tsai, M. L., Wen, M. S. FTO modulates circadian rhythms and inhibits the CLOCK-BMAL1-induced transcription. Biochem Biophys Res Commun. 464 (3), 826-832 (2015).
  16. Heyn, H., Esteller, M. An Adenine Code for DNA: A Second Life for N6-Methyladenine. Cell. 161 (4), 710-713 (2015).
  17. Xiao, W., et al. Nuclear m(6)A Reader YTHDC1 Regulates mRNA Splicing. Mol Cell. 61 (4), 507-519 (2016).
  18. Meyer, K. D., et al. Comprehensive analysis of mRNA methylation reveals enrichment in 3' UTRs and near stop codons. Cell. 149 (7), 1635-1646 (2012).
  19. Horowitz, S., Horowitz, A., Nilsen, T. W., Munns, T. W., Rottman, F. M. Mapping of N6-methyladenosine residues in bovine prolactin mRNA. Proc Natl Acad Sci U S A. 81 (18), 5667-5671 (1984).
  20. Resnick, R. J., Noreen, D., Munns, T. W., Perdue, M. L. Role of N6-methyladenosine in expression of Rous sarcoma virus RNA: analyses utilizing immunoglobulin specific for N6-methyladenosine. Prog Nucleic Acid Res Mol Biol. 29, 214-218 (1983).
  21. Golovina, A. Y., et al. Method for site-specific detection of m6A nucleoside presence in RNA based on high-resolution melting (HRM) analysis. Nucleic Acids Res. 42 (4), 27 (2014).
  22. Dominissini, D., et al. Topology of the human and mouse m6A RNA methylomes revealed by m6A-seq. Nature. 485 (7397), 201-206 (2012).
  23. Linder, B., et al. Single-nucleotide-resolution mapping of m6A and m6Am throughout the transcriptome. Nat Methods. 12 (8), 767-772 (2015).
  24. Fu, L., et al. Simultaneous Quantification of Methylated Cytidine and Adenosine in Cellular and Tissue RNA by Nano-Flow Liquid Chromatography-Tandem Mass Spectrometry Coupled with the Stable Isotope-Dilution Method. Anal Chem. 87 (15), 7653-7659 (2015).
  25. Rio, D. C., Ares, M., Hannon, G. J., Nilsen, T. W. Nondenaturing agarose gel electrophoresis of RNA. Cold Spring Harb Protoc. 2010 (6), 5445 (2010).
  26. Wang, C. Y., et al. FTO modulates fibrogenic responses in obstructive nephropathy. Sci Rep. 6, 18874 (2016).
  27. Li, X., et al. Transcriptome-wide mapping reveals reversible and dynamic N-methyladenosine methylome. Nat Chem Biol. , (2016).
  28. Sanschagrin, S., Yergeau, E. Next-generation sequencing of 16S ribosomal RNA gene amplicons. J Vis Exp. (90), (2014).
  29. Kukutla, P., Steritz, M., Xu, J. Depletion of ribosomal RNA for mosquito gut metagenomic RNA-seq. J Vis Exp. (74), (2013).
  30. Mishima, E., et al. Immuno-Northern Blotting: Detection of RNA Modifications by Using Antibodies against Modified Nucleosides. PLoS One. 10 (11), 0143756 (2015).
  31. Klungland, A., Dahl, J. A. Dynamic RNA modifications in disease. Curr Opin Genet Dev. 26, 47-52 (2014).

Tags

Biokemi RNA m Metylering demetylas FTO Epitranscriptome
En metod för mätning av RNA<em&gt; N</em<sup&gt; 6</sup&gt; -methyladenosine Ändringar i celler och vävnader
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Wang, C. Y., Lin, M. H., Su, H. T. A … More

Wang, C. Y., Lin, M. H., Su, H. T. A Method for Measuring RNA N6-methyladenosine Modifications in Cells and Tissues. J. Vis. Exp. (118), e54672, doi:10.3791/54672 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter