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Biochemistry

Un metodo per l'RNA di misura Published: December 5, 2016 doi: 10.3791/54672
Automatic Translation
1, 1, 1
1Department of Cardiology, Chang Gung Memorial Hospital, Chang Gung University College of Medicine

Summary

Un metodo di blotting nord modificato per misurare N 6 -methyladenosine (m 6 a) delle modifiche in RNA è descritto. L'attuale metodo in grado di rilevare le modifiche in diversi RNA e controlli sotto vari disegni sperimentali.

Protocol

NOTA: L'RNA totale m 6 A livello comprende rRNA, mRNA, e altri piccoli RNA. Dal momento che l'RNA ribosomiale è abbondante m 6 modifiche A, la misura di m 6 livelli A dovranno prendere in considerazione questo fatto.

Isolamento 1. RNA

  1. Utilizzando la soluzione di decontaminazione ribonucleasi (spruzzato su tovaglioli di carta), pulire le pipette e le superfici banco di laboratorio. asciugamani di carta bagnati con acqua priva di nucleasi e pulire le pipette e le superfici banco di laboratorio di nuovo.
  2. RNA Estrazione
    1. Isolamento RNA totale
      1. Utilizzando un agitatore, mescolare 50-100 mg di tessuto o 5-10 x 10 6 cellule in 1 ml di soluzione di isolamento dell'RNA mantenuti a 4 ° C.
        NOTA: più tessuto (100-150 mg) può essere richiesto per i campioni di tessuto adiposo di topi a causa delle concentrazioni di RNA inferiori in esso. I campioni provengono da cuore del mouse, fegato, muscolo scheletrico, polmone, cervello e macrofagi sono stati impiegati in precedenza 4.
      2. Incubate omogenati di esempio per 5 min a temperatura ambiente.
      3. Aggiungere 100 ml di 1-bromo-3-cloropropano (BCP) per 1 ml di omogenato del campione. Agitare le provette con forza per 15 s e procedere per isolare l'RNA totale secondo le istruzioni 24 del produttore.
    2. Poliadenilato mRNA Purificazione da RNA totale isolato
      1. Purificare mRNA poliadenilato utilizzando kit o protocolli disponibili.
        1. Agitare accuratamente per risospendere ciascuna delle seguenti soluzioni: soluzione vincolante, oligo (dT) perle di polistirene, e soluzione di lavaggio 2x. Assicurarsi che il oligo (dT) perline calda a temperatura ambiente prima dell'uso.
        2. Trasferire 120 ml di soluzione di eluizione per la preparazione in un tubo e si riscalda a 70 ° C su una piastra riscaldante.
        3. Pipetta fino a 500 mg di RNA totale in una provetta. Con l'acqua priva di nucleasi, regolare il volume a 250 ml.
        4. Aggiungere 250 ml di soluzione vincolante 2x alla RNA totale cosìluzione e brevemente vortex per mescolare il contenuto.
        5. Aggiungere 15 ml di oligo (dt) perline e vortex accuratamente per mescolare.
        6. Incubare la miscela a 70 ° C per 3 min.
        7. Rimuovere il campione dal blocco di riscaldamento e lasciar riposare a temperatura ambiente per 10 min.
        8. Centrifugare a 15.000 xg per 2 min.
        9. Rimuovere con attenzione il surnatante, lasciando dietro di sé circa 50 ml.
        10. Aggiungere 500 ml di soluzione di lavaggio per risospendere il pellet pipettando.
        11. Pipettare la sospensione in un set di tubi filtro rotativo / collezione.
        12. Centrifugare a 15.000 xg per 2 min. Rimuovere la colonna dal tubo di raccolta e scartare il flow-through. Riportare la colonna a tubo di raccolta.
        13. Pipettare 500 ml di soluzione di lavaggio sul filtro rotativo.
        14. Centrifugare a 15.000 x g per 2 minuti.
        15. Trasferire il filtro rotativo in un tubo di raccolta fresca.
        16. Pipettare 50 ml di soluzione di eluizione riscaldataa 70 ° C sul centro del filtro rotativo.
        17. Incubare per 2-5 minuti a 70 ° C. Centrifugare a 15.000 xg per 1 min.
        18. Pipettare un ulteriore 50 ml di soluzione di eluizione riscaldata a 70 ° C sul centro del filtro rotativo.
        19. Ripetere il passo 1.2.2.1.18.
      2. Aggiungere 100 mg glicogeno / mL, 0,1 volumi di tampone di 3 M acetato di sodio (pH 5,2) e 2,5 volumi di etanolo assoluto. Precipitato durante la notte a -80 ° C.
      3. Centrifugare a 15.000 xg per 25 min a 4 ° C. Eliminare il surnatante.
      4. Lavare il pellet con 1 ml di etanolo al 75%. Centrifugare a 15.000 xg per 15 min a 4 ° C. Rimuovere con attenzione l'etanolo.
      5. A secco in aria per 3-5 minuti.
      6. Aggiungere 10 ml di acqua priva di nucleasi per dissolvere il pellet.
      7. Conservare a -70 ° C.
  3. RNA qualificazione e quantificazione
    1. Utilizzando uno spettrofotometro, determinare la concentrazione di RNA da noting l'assorbanza a 260 nm e 280 nm. Il rapporto A 260 / A 280 dovrebbe essere 1,8-2,2.
    2. Controllare la qualità del campione di RNA utilizzando 0,8% gel elettroforesi 25.
      NOTA: L'RNA totale eucariotica intatto dovrebbe mostrare intense bande 28S e 18S rRNA. Il rapporto di 28S contro intensità banda 18S rRNA per una buona preparazione RNA è ~ 2.

2. elettroforesi su gel e di trasferimento

NOTA: I protocolli di preparazione del buffer sono riportati nella tabella 1.

  1. Formaldeide Gel di Preparazione (1%)
    1. Risciacquare tutte le apparecchiature elettroforesi con dietilpirocarbonato acqua (DEPC).
    2. Sciogliere 2.5 g di agarosio in 215 mL di acqua DEPC completamente in un forno a microonde.
    3. Aggiungere 12,5 ml di 10x 3- (N-morfolino) propanosulfonico (MOPS) buffer e 22,5 ml di formaldeide al 37%.
    4. Versare il tutto nell'apparecchio elettroforesi con un pettine 1,5 mm di spessore.
    5. Eliminare le bolle o spingere torlo per i bordi del gel con un pettine pulito.
    6. Lasciare il gel solidificare a temperatura ambiente.
  2. Preparazione del campione
    1. Mescolare 1-10 mg di RNA totale e 11,3 ml di tampone campione.
    2. Mescolare 2 ug del marcatore RNA (1 mg / mL) con 11.3 ml di tampone campione.
    3. Aggiungere acqua priva di nucleasi ai campioni da 2.2.1 e 2.2.2 ad un volume totale di 16 microlitri.
    4. Riscaldare a 60 ° C per 5 minuti, e poi raffreddare su ghiaccio.
    5. Mescolare 16 microlitri del campione da 2.2.3 con 4 ml di colorante inseguimento, che contiene 0,1 mg / mL di bromuro di etidio in ghiaccio.
      ATTENZIONE: il bromuro di etidio è forse teratogeno e tossico se inalato. Leggi bromuro di etidio scheda di sicurezza.
  3. elettroforesi
    1. Aggiungere 200 ml di 10x tampone MOPS a 1.800 ml di DDH 2 O per fare un tampone di corsa 1x MOPS.
    2. Utilizzare il tampone di corsa 1x MOPS per sciacquare i pozzetti del gel.
    3. Pre-run tegli gel a 20 V per 5 min.
    4. Caricare i campioni di RNA nei pozzetti del gel.
    5. Coprire con un foglio per evitare l'esposizione alla luce. Eseguire a 35 V per circa 17 ore (durante la notte)
    6. Esaminare e fotografare il gel sotto una luce UV.
  4. Trasferimento
    1. Tagliare il gel per rimuovere la parte non utilizzata.
    2. Preparare 500 ml di 10x tampone SSC (250 mL di 20x tampone SSC e 250 mL di acqua DEPC).
    3. Lavare il gel due volte con 10x tampone SSC per 20 minuti con agitazione a 50 giri al minuto.
    4. Tagliare 1 filtro foglio di carta grande abbastanza per servire come una carta stoppino, che assorbe buffer di trasferimento dalla sezione Trasferimento (Figura 1).
    5. Tagliare 4 pezzi di carta da filtro per la stessa dimensione del gel.
    6. Tagliare 1 foglio di membrana di nylon caricata positivamente alla stessa dimensione come il gel.
    7. Tracciare una tacca sul gel e la membrana come marcatore per assicurare il corretto orientamento.
    8. Immergere la membrana in tampone SSC 2x per 15 min.
    9. Versare 500 ml of 10x SSC tampone nel cassetto di trasferimento.
    10. Disporre il grande foglio di carta filtrante attraverso la piastra di vetro e bagnare la carta da filtro con il tampone di trasferimento.
    11. Stendete le bolle con una pipetta.
    12. Immergere 2 pezzi di carta da filtro pre-tagliati in buffer di trasferimento e metterli al centro della carta da filtro dal punto 2.4.5. Rimuovere eventuali bolle.
    13. Posare il gel superiore rivolto verso il basso sulla carta da filtro.
    14. Disporre la membrana sulla superficie del gel. Allineare le tacche del gel e la membrana.
    15. Mettere 2 pezzi di carta filtro pre-taglio sulla parte superiore della membrana e bagnare la carta da filtro con il tampone di trasferimento.
    16. Rimuovere eventuali bolle tra gli strati.
    17. Applicare pellicola intorno al gel di garantire che gli asciugamani assorbono solo fino tampone passa attraverso il gel e la membrana.
    18. Stack i tovaglioli di carta sulla parte superiore della carta da filtro.
    19. Inserire un lastra di vetro di grandi dimensioni sulla parte superiore degli asciugamani.
    20. Collocare un peso in cima alla pila.
    21. Mantenere notte per consentire l'RNA di trasferire dal gel alla membrana.

3. Rilevamento di N 6 -methyladenosine

  1. membrana reticolazione
    1. Mantenere la membrana umida nel tampone 2x SSC.
    2. Mettere 2 fogli di carta da filtro immersa con 10x SSC tampone in reticolante UV.
    3. Posizionare la membrana sulla parte superiore della carta da filtro, con il lato di RNA-adsorbito rivolto verso l'alto.
    4. Selezionare "modalità autocrosslink" (120.000 μJ) e premere il pulsante "Start" per avviare l'irradiazione.
    5. Esaminate la membrana ed il gel con UV immagine Gel collettore per confermare il trasferimento RNA dal gel alla membrana.
  2. immunoblotting
    1. Bloccare la membrana in latte scremato 5% in soluzione salina tamponata con Tris con Tween 20 (TBST) tampone a temperatura ambiente per 1 ora.
    2. Lavare tre volte con tampone TBST per 15 min.
    3. Incubare la membrana durante la notte in m 6 A (<em> soluzione N 6 -methyladenosine) anticorpo (1: 1.000 in 5% senza grassi del latte tampone TBST) a 4 ° C.
    4. Lavare la membrana tre volte con tampone TBST per 15 min.
    5. Incubare la membrana nella soluzione HRP-coniugato asino anti-coniglio anticorpo (1: 2.000 in tampone latte TBST 5% non grassa) per 1 ora a temperatura ambiente.
    6. Lavare la membrana tre volte con tampone TBST per 15 min.
    7. Applicare il substrato chemiluminescente potenziato (0,125 ml per cm 2 di membrana).
    8. Cattura il chemiluminescenza con le impostazioni ottimali del imager digitale, secondo le istruzioni del produttore 26.
  3. m 6 una quantificazione
    1. Misurare la relativa m 6 A intensità chemiluminescente utilizzando il software ImageJ.
      1. Sotto il menu del software ImageJ, selezionare l'opzione "File" per aprire il file pertinente.
      2. Selezionare lo strumento "Rettangolo" da ImageJ e disegnare una cornice intornoi segnali.
      3. Se RNA ribosomiale non è il focus degli esperimenti, evitare le 18S e 28S RNA ribosomiale m 6 fasce A per il calcolo.
      4. Fai clic su "Comando" e "1" per confermare la corsia selezionato.
      5. Premere il tasto "Comando" e "3" per mostrare la trama selezionata.
      6. Fare clic sullo strumento "Straight" e tracciare le linee per separare l'area segmentata.
      7. Fare clic sullo strumento "Bacchetta" per registrare le misurazioni.
      8. Esportare i dati.
      9. Normalizzare i livelli di m 6 A con la 18S RNA ribosomiale banda dalla colorazione bromuro di etidio.

Representative Results

Dopo 14 giorni nel normale fase circadiana luce-buio, i topi wild-type sono stati collocati in buio costante. Gli RNA dal fegato sono stati campionati ad intervalli di 4 ore e studiate con modificato blotting settentrionale. La metilazione di rRNA, mRNA, e piccoli RNA erano chiaramente rilevata (Figura 2). Il confronto tra differenti tempi circadiani (CT) può essere accuratamente calcolata con lo standard 18S rRNA. C'era robusta oscillazione circadiana di m 6 livelli A in rRNA, mRNA, e piccoli RNA.

Per evitare l'interferenza offerto da rRNA, RNA poliadenilato possono essere purificate, come al punto 1.2.2. Dopo la purificazione, l'rRNA può essere sostanzialmente eliminato per consentire una migliore visualizzazione di altri RNA (Figura 3).

Figura 1
g> Figura 1: Montaggio della unità di trasferimento macchia. è indicata l'unità di trasferimento capillare per asciugare l'RNA alla membrana. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

figura 2
Figura 2: il ritmo circadiano delle m 6 levels in C57BL / 6J. Questa figura mostra la m 6 A blot di RNA totale da fegati di topi wild-type sacrificato il primo giorno della fase dark-scuro dopo 14 giorni di una normale fase leggera-buio a 4 h intervalli. La quantificazione è stata effettuata utilizzando il m 6 A differenza di densità delle immagini tra 18S e 28S rRNA. La m 6 A abbondanza stato normalizzato alla banda 18S rRNA dal gel formaldeide in basso.et = "_ blank"> Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 3
Figura 3: I m 6 una macchie con o senza rRNA. Rappresentante m sono mostrati 6 una macchie del totale RNA e l'RNA poliadenilato dal fegato di topi wild-type. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Tabella 1: Tamponi e soluzioni.

Disclosures

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Materials

1 10x tampone MOPS (pH 7,0, proteggere dalla luce)
MOPS 41.85 g 0.2 M
Acetato di sodio 4.1 g 0,05 M
EDTA, Disodium Salt 3.7 g 0,01 M
acqua DEPC
Totale 1 L
Mescolare a temperatura ambiente
2 20x tampone SSC (pH 7,0)
Cloruro di sodio 175,3 g 3 M
citrato trisodico 88.3 g 0.3 M
acqua DEPC
Totale 1 L
Mescolare a temperatura ambiente, poi in autoclave
3 Dye monitoraggio
Buffer 10x MOPS 500 microlitri 1x
Ficoll 400 0.75 g 15%
bromofenolo blu 0.01 g 0,2%
xilene cianolo 0.01 g 0,2%
acqua DEPC
Totale 5 mL
Conservare a -20 ° C
4 acqua DEPC
Diluire il rapporto a 1: 1.000 di DEPC in DDH 2 O
Mescolare notte a temperatura ambiente, poi in autoclave
5 tampone campione (riparo dalla luce)
Buffer 10x MOPS 200 microlitri
37% di formaldeide 270 microlitri
formammide 660 microlitri
Conservare a -20 ° C
Name Company Catalog Number Comments
RNaseZap solution Ambion AM9782 Protocol 1.1
TRI Reagent solution Ambion AM9738 Protocol 1.2.1.1
1-Bromo-3-chloropropane (BCP) Sigma B9673 Protocol 1.2.1.3
Ethanol JTbaker 8006 Protocol 1.2.1.3
Isopropanol Sigma I9516 Protocol 1.2.1.3
GenElute mRNA Miniprep Kit Sigma MRN70 Protocol 1.2.2.1
Glycogen Ambion AM9510 Protocol 1.2.2.2
Sodium acetate Fluka 71183 Protocol 1.2.2.2
Nuclease-free water Ambion AM9930 Protocol 1.2.2.6
DEPC Sigma D5758 Protocol 2.1.1
Agarose JT Baker A426 Protocol 2.1.2
MOPS Sigma M1254 Protocol 2.1.3
37% formaldehyde Solution Sigma F8775 Protocol 2.1.3
EDTA, Disodium Salt JT Baker 8993 Protocol 2.1.3 10x MOPS buffer
formamide Sigma F7503 Protocol 2.2.1
RNA Millennium Marker Ambion AM7150 Protocol 2.2.2
Ethidium Bromide Amresco X328 Protocol 2.2.5
Ficoll PM400 GE Healthcare 17-0300-10 Protocol 2.2.5 tracking dye
Bromophenol blue Sigma 114391 Protocol 2.2.5 tracking dye
Xylene Cyanol FF Sigma X4126 Protocol 2.2.5 tracking dye
Sodium chloride dihydrate JT Baker 3624 Protocol 2.4.2 20x SSC buffer
Trisodium citrate Sigma S1804 Protocol 2.4.2 20x SSC buffer
Hybond Blotting Paper GE Healthcare RPN6101M Protocol 2.4.4
GE Hybond-N+ membrane GE Healthcare RPN303B Protocol 2.4.6
Stratalinker UV Crosslinker 2400 Stratagene 400075 Protocol 3.1.2
Gel Catcher 1500 ANT Technology Gel Catcher 1500 Protocol 3.1.5
Anti-m6A (N6-methyladenosine) Synaptic Systems 202003 Protocol 3.2.3
Amersham ECL Anti-Rabbit IgG, HRP-linkd whole Ab GE Healthcare NA934 Protocol 3.2.5
ChemiDoc MP System BIO-RAD 1708280 Protocol 3.2.8

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