Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

Een methode voor het meten van RNA Published: December 5, 2016 doi: 10.3791/54672
Automatic Translation
1, 1, 1
1Department of Cardiology, Chang Gung Memorial Hospital, Chang Gung University College of Medicine

Summary

Gemodificeerde Northern blotting methode voor het meten N6 -methyladenosine (m 6 A) veranderingen in RNA wordt beschreven. De huidige methode kan wijzigingen in diverse RNA's en controles onder verschillende experimentele ontwerpen te detecteren.

Protocol

Opmerking: Het totale RNA m 6 Een niveau omvat rRNA, mRNA, en andere kleine RNAs. Sinds ribosomaal RNA heeft overvloedige m 6 A wijzigingen, de meting van m 6 A levels moet dit feit te overwegen.

1. RNA Isolation

  1. Met behulp van de ribonuclease decontaminatie-oplossing (gespoten op papieren handdoeken), veeg de pipetten en de labtafel oppervlakken. Natte papieren handdoeken met nuclease-vrij water en veeg naar beneden pipetten en labtafel oppervlakken weer.
  2. RNA-extractie
    1. Total RNA Isolation
      1. Met een bovenroerder, gehomogeniseerd 50-100 mg weefsel of 5-10 x 10 6 cellen in 1 ml RNA-isolatie oplossing gehandhaafd op 4 ° C.
        OPMERKING: More weefsel (100-150 mg) vereist voor vetweefsel monsters van muizen vanwege de lagere concentraties RNA daarin. Monsters afkomstig van muis hart, lever, skeletspier, long, hersenen en macrofagen zijn eerder gebruikt 4.
      2. Incubate het monster homogenaten gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur.
      3. Voeg 100 ul van 1-broom-3-chloorpropaan (BCP) per 1 ml gehomogeniseerd. Schud de buizen krachtig gedurende 15 s en ga verder met totaal RNA te isoleren volgens de instructies van de fabrikant 24.
    2. Gepolyadenyleerde mRNA Zuivering van Geïsoleerde Totaal RNA
      1. Zuiveren gepolyadenyleerde mRNA met behulp van beschikbare kits of protocollen.
        1. Schud grondig resuspendeer elk van de volgende oplossingen: 2x bindoplossing, oligo (dT) polystyreen kralen en wasoplossing. Zorg ervoor dat de oligo (dT) kralen warm tot kamertemperatuur vóór gebruik.
        2. Transfer 120 ul van elutieoplossing per preparaat in een buis en verhit tot 70 ° C in een verwarmingsblok.
        3. Pipet tot 500 ug totaal RNA in een microcentrifugebuis. Met nuclease-vrij water, het volume aanpassen tot 250 ul.
        4. Voeg 250 ul 2x binding oplossing van het totale RNA datlutie en vortex kort naar de inhoud te mengen.
        5. Voeg 15 ul van oligo (dT) kralen en vortex grondig te mengen.
        6. Incubeer het mengsel bij 70 ° C gedurende 3 min.
        7. Verwijder het monster uit het verwarmingsblok en laten staan ​​bij kamertemperatuur gedurende 10 min.
        8. Centrifugeer bij 15.000 xg gedurende 2 minuten.
        9. Verwijder voorzichtig het supernatant, met achterlating van ongeveer 50 ul.
        10. Voeg 500 ul van wassen oplossing voor resuspendeer de pellet door pipetteren.
        11. Pipetteer de suspensie in een spin filter / collectie buis set.
        12. Centrifugeer bij 15.000 xg gedurende 2 minuten. Verwijder de kolom verzamelbuis en gooi het doorstroomkanaal. Breng de kolom aan de collectie buis.
        13. Pipetteer 500 ul van wassen oplossing op de spin-filter.
        14. Centrifuge bij 15.000 x g gedurende 2 min.
        15. Breng de spin-filter in een frisse collectie buis.
        16. Pipetteer 50 ul van elutie verhittot 70 ° C op het midden van het rotatiefilter.
        17. Incubeer gedurende 2-5 minuten bij 70 ° C. Centrifugeer bij 15.000 xg gedurende 1 min.
        18. Pipetteer een extra 50 ui elutie-oplossing verwarmd tot 70 ° C op het midden van het rotatiefilter.
        19. Herhaal stap 1.2.2.1.18.
      2. Voeg 100 ug / ml glycogeen, 0,1 volume 3 M natriumacetaat buffer (pH 5,2) en 2,5 volumes absolute ethanol. Precipiteren nacht bij -80 ° C.
      3. Centrifugeer bij 15.000 xg gedurende 25 min bij 4 ° C. Verwijder het supernatant.
      4. Was de pellet met 1 ml 75% ethanol. Centrifugeer bij 15.000 xg gedurende 15 min bij 4 ° C. Verwijder de ethanol voorzichtig.
      5. Droge lucht gedurende 3-5 min.
      6. Voeg 10 ul nuclease-vrij water aan de pellet lossen.
      7. Bewaar bij -70 ° C.
  3. RNA kwalificatie en kwantificering
    1. Met behulp van een spectrofotometer, bepalen de RNA concentratie kennisgevingng de absorptie bij 260 nm en 280 nm. De A260 / A280-verhouding moet 1,8-2,2.
    2. Controleer de RNA-monster kwaliteit met behulp van 0,8% agarosegelelektroforese 25.
      LET OP: De intacte eukaryotische totaal RNA moet intense 28S en 18S rRNA bands laten zien. De verhouding van 28S versus 18S rRNA band intensiteit voor een goede voorbereiding is het RNA ~ 2.

2. Gel Elektroforese en Transfer

OPMERKING: De buffervoorbereiding protocollen zijn in tabel 1.

  1. Formaldehyde Gel Bereiding (1%)
    1. Spoel alle elektroforese-apparatuur met diethylpyrocarbonaat (DEPC) water.
    2. Smelt 2,5 g agarose in 215 ml DEPC water volledig in de magnetron.
    3. Voeg 12,5 ml 10x 3- (N- morfolino) propaansulfonzuur (MOPS) buffer en 22,5 ml 37% formaldehyde.
    4. Giet het in de electroforese-inrichting met een 1,5 mm dik kam.
    5. Elimineer bellen of duw tzoom aan de randen van de gel met een schone kam.
    6. Laat de gel stollen bij kamertemperatuur.
  2. monstervoorbereiding
    1. Meng 1-10 ug totaal RNA en 11,3 pl monsterbuffer.
    2. Meng 2 ug van het RNA marker (1 ug / ul) met 11,3 pl monsterbuffer.
    3. Add nuclease-vrij water aan de monsters van 2.2.1 en 2.2.2 tot een totaal volume van 16 ul.
    4. Verhit bij 60 ° C gedurende 5 minuten, en vervolgens relaxen op ijs.
    5. Meng 16 pl van het monster 2.2.3 met 4 pl traceerkleurstof, die 0,1 ug bevat / ul ethidiumbromide op ijs.
      LET OP: Ethidiumbromide is mogelijk teratogeen en giftig bij inademing. Lees ethidiumbromide veiligheidsinformatieblad.
  3. elektroforese
    1. Voeg 200 ml 10x MOPS buffer tot 1.800 ml DDH 2 O tot een 1X MOPS loopbuffer te maken.
    2. Gebruik de 1x MOPS loopbuffer aan de putjes van de gel te spoelen.
    3. Pre-run tHij gel bij 20 V gedurende 5 min.
    4. Laad de RNA monsters in de putjes van de gel.
    5. Dek af met folie om blootstelling aan licht te voorkomen. Run op 35 V gedurende ongeveer 17 uur ( 's nachts)
    6. Onderzoeken en fotograferen van de gel onder een UV-licht.
  4. Overdracht
    1. Snijd de gel om het ongebruikte deel te verwijderen.
    2. Bereid 500 ml 10 x SSC buffer (250 ml 20 x SSC buffer en 250 ml DEPC water).
    3. Was de gel tweemaal met 10x SSC buffer gedurende 20 min met schudden bij 50 rpm.
    4. Snijd 1 filtreerpapier vel groot genoeg om als een lont papier, dat transferbuffer opneemt uit de overdrachtschaalvorm (figuur 1).
    5. Snijd 4 filtreerpapiertjes dezelfde grootte als de gel.
    6. 1 gesneden vel positief geladen nylonmembraan dezelfde grootte als de gel.
    7. Markeer een inkeping op de gel en het membraan als een marker om de juiste oriëntatie te verzekeren.
    8. Geniet van het membraan in 2x SSC buffer gedurende 15 min.
    9. Giet 500 ml of 10x SSC buffer in de overdracht lade.
    10. Leg de grote filter vel papier over de glasplaat en bevochtig de filter papier met de overdracht buffer.
    11. Uitrollen eventuele luchtbellen met een pipet.
    12. 2 weken stukjes voorgesneden filtreerpapier in overdrachtsbuffer en plaats ze op het midden van het filterpapier uit stap 2.4.5. Verwijder eventuele luchtbellen.
    13. Leg de gel top-kant naar beneden op het filter papier.
    14. Lag het membraan bovenop de gel. Lijn de inkepingen van de gel en het membraan.
    15. Leg 2 stukken van pre-cut filter papier op de top van het membraan en nat de filter papier met de overdracht buffer.
    16. Verwijder eventuele luchtbellen tussen de lagen.
    17. Toepassen plastic rond de gel dat de handdoeken alleen genieten buffer die door de gel en het membraan.
    18. De stapel papieren handdoeken bovenop het filterpapier.
    19. Plaats een grote glasplaat boven op de handdoeken.
    20. Plaats een gewicht op de bovenkant van de stapel.
    21. Blijf gedurende de nacht om het RNA om van de gel naar het membraan.

3. Detectie van N 6 -methyladenosine

  1. membraan Crosslinking
    1. Houd het membraan vocht in 2x SSC buffer.
    2. Plaats 2 vellen filterpapier ondergedompeld met 10x SSC buffer in UV crosslinker.
    3. Plaats het membraan boven op het filterpapier, met de RNA-geadsorbeerde zijde naar boven.
    4. Selecteer "autocrosslink mode" (120.000 uJ) en druk op de knop "Start" om de bestraling te starten.
    5. Onderzoek de membraan en de gel met een UV-afbeelding gel catcher aan het RNA transfer van de gel aan het membraan te bevestigen.
  2. immunoblotting
    1. Blokkeer het membraan in 5% vetvrije melk in Tris-gebufferde zoutoplossing met Tween 20 (TBST) buffer bij kamertemperatuur gedurende 1 uur.
    2. Was driemaal met TBST buffer gedurende 15 min.
    3. Incubeer het membraan overnacht in m 6 A (<em> N 6 -methyladenosine) antilichaamoplossing (1: 1000 in 5% vetvrije melk TBST buffer) bij 4 ° C.
    4. Was het membraan driemaal met TBST buffer gedurende 15 min.
    5. Incubeer het membraan in het HRP-geconjugeerd ezel anti-konijn antilichaam-oplossing (1: 2000 in 5% vetvrije melk TBST buffer) gedurende 1 uur bij kamertemperatuur geroerd.
    6. Was het membraan driemaal met TBST buffer gedurende 15 min.
    7. Breng het versterkt chemiluminescent substraat (0,125 ml per cm2 membraan).
    8. Leg de chemiluminescentie met de optimale instellingen voor de digitale beeldvormer volgens de instructies van de fabrikant 26.
  3. m 6 een kwantificering
    1. Meet de relatieve m 6 een chemiluminescentie-intensiteit met de ImageJ software.
      1. Onder de ImageJ software menu de optie "File" om het relevante bestand te openen.
      2. Selecteer de "rechthoek" tool van ImageJ en trek een kader rondde signalen.
      3. Als ribosomaal RNA is niet de focus van de experimenten, vermijd de 18S en 28S ribosomale RNA m 6 A banden voor de berekening.
      4. Klik "Commando" en "1" om de geselecteerde baan te bevestigen.
      5. Druk op "Command" en "3" om de geselecteerde plot tonen.
      6. Klik op de "Straight" tool en lijnen te vestigen op de gesegmenteerde te scheiden.
      7. Klik op de "Wand" tool om de metingen te nemen.
      8. De gegevens exporteren.
      9. Normaliseren van de niveaus van m 6 A met de 18S ribosomale RNA band uit ethidium bromide kleuring.

Representative Results

Na 14 dagen in normaal licht-donker circadiane fase werden de wild-type muizen geplaatst in constante duisternis. De RNA's uit de lever werden bemonsterd op 4 uur intervallen en studeerde met gemodificeerde Noord-blotting. De methylering van rRNA, mRNA's en kleine RNA duidelijk gedetecteerd (figuur 2). De vergelijking tussen verschillende circadiane tijden (CT) kan nauwkeurig worden berekend met de 18S rRNA standaard. Er was sterke circadiane oscillatie van m 6 A niveaus in rRNA, mRNA, en kleine RNAs.

Om de storing aangeboden door rRNA te voorkomen, kan gepolyadenyleerde RNA's worden gezuiverd, zoals in stap 1.2.2. Na zuivering, kan het rRNA grotendeels geëlimineerd om een betere visualisatie van andere RNA's (figuur 3).

Figuur 1
g> Figuur 1: Montage van de vlek transporteenheid. De capillaire blotting overbrengeenheid voor het RNA aan het membraan getoond. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 2
Figuur 2: circadiane ritme van de m 6 A levels in C57BL / 6J muizen. Deze figuur toont de m 6 Een blot van totaal RNA van levers van wild-type muizen geofferd op de eerste dag van de donkere donkere fase na 14 dagen van een normaal licht-donker fase bij 4 uur intervallen. De kwantificering werd gedaan met behulp van de m 6 beeld Een dichtheidsverschil tussen 18S en 28S rRNA. De m 6 een overvloed werd genormaliseerd naar het 18S rRNA band uit de formaldehyde gel op de bodem.et = "_ blank"> Klik hier om een ​​grotere versie van deze figuur te bekijken.

figuur 3
Figuur 3: De m 6 Een blots met of zonder rRNA. Representatieve m 6 Een blots van totaal RNA en gepolyadenyleerd RNA uit de lever van wildtype muizen worden getoond. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Tabel 1: Buffers en oplossingen.

Disclosures

De auteurs hebben niets te onthullen.

Materials

1 10x MOPS buffer (pH 7,0, bescherming tegen licht)
MOPS 41.85 g 0,2 M
Natriumacetaat 4.1 g 0,05 M
EDTA, Disodium Salt 3.7 g 0,01 M
DEPC water
Totaal 1 L
Roer bij kamertemperatuur
2 20x SSC-buffer (pH 7,0)
natriumchloride 175.3 g 3 M
trinatriumcitraat 88.3 g 0,3 M
DEPC water
Totaal 1 L
Roer bij kamertemperatuur, vervolgens autoclaveren
3 Tracking Dye
10x MOPS buffer 500 pl 1x
Ficoll 400 0.75 g 15%
broomfenolblauw 0.01 g 0,2%
xyleencyanol 0.01 g 0,2%
DEPC water
Totaal 5 mL
Bewaren bij -20 ° C
4 DEPC water
Verdun ratio 1: 1000 in met DEPC DDH 2 O
Roer overnacht bij kamertemperatuur, vervolgens autoclaveren
5 Monsterbuffer (bescherming tegen licht)
10x MOPS buffer 200 pl
37% formaldehyde 270 pl
formamide 660 pl
Bewaren bij -20 ° C
Name Company Catalog Number Comments
RNaseZap solution Ambion AM9782 Protocol 1.1
TRI Reagent solution Ambion AM9738 Protocol 1.2.1.1
1-Bromo-3-chloropropane (BCP) Sigma B9673 Protocol 1.2.1.3
Ethanol JTbaker 8006 Protocol 1.2.1.3
Isopropanol Sigma I9516 Protocol 1.2.1.3
GenElute mRNA Miniprep Kit Sigma MRN70 Protocol 1.2.2.1
Glycogen Ambion AM9510 Protocol 1.2.2.2
Sodium acetate Fluka 71183 Protocol 1.2.2.2
Nuclease-free water Ambion AM9930 Protocol 1.2.2.6
DEPC Sigma D5758 Protocol 2.1.1
Agarose JT Baker A426 Protocol 2.1.2
MOPS Sigma M1254 Protocol 2.1.3
37% formaldehyde Solution Sigma F8775 Protocol 2.1.3
EDTA, Disodium Salt JT Baker 8993 Protocol 2.1.3 10x MOPS buffer
formamide Sigma F7503 Protocol 2.2.1
RNA Millennium Marker Ambion AM7150 Protocol 2.2.2
Ethidium Bromide Amresco X328 Protocol 2.2.5
Ficoll PM400 GE Healthcare 17-0300-10 Protocol 2.2.5 tracking dye
Bromophenol blue Sigma 114391 Protocol 2.2.5 tracking dye
Xylene Cyanol FF Sigma X4126 Protocol 2.2.5 tracking dye
Sodium chloride dihydrate JT Baker 3624 Protocol 2.4.2 20x SSC buffer
Trisodium citrate Sigma S1804 Protocol 2.4.2 20x SSC buffer
Hybond Blotting Paper GE Healthcare RPN6101M Protocol 2.4.4
GE Hybond-N+ membrane GE Healthcare RPN303B Protocol 2.4.6
Stratalinker UV Crosslinker 2400 Stratagene 400075 Protocol 3.1.2
Gel Catcher 1500 ANT Technology Gel Catcher 1500 Protocol 3.1.5
Anti-m6A (N6-methyladenosine) Synaptic Systems 202003 Protocol 3.2.3
Amersham ECL Anti-Rabbit IgG, HRP-linkd whole Ab GE Healthcare NA934 Protocol 3.2.5
ChemiDoc MP System BIO-RAD 1708280 Protocol 3.2.8

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Thammana, P., Held, W. A. Methylation of 16S RNA during ribosome assembly in vitro. Nature. 251 (5477), 682-686 (1974).
  2. Meyer, K. D., Jaffrey, S. R. The dynamic epitranscriptome: N6-methyladenosine and gene expression control. Nat Rev Mol Cell Biol. 15 (5), 313-326 (2014).
  3. Niu, Y., et al. N6-methyl-adenosine (m6A) in RNA: an old modification with a novel epigenetic function. Genomics Proteomics Bioinformatics. 11 (1), 8-17 (2013).
  4. Wang, C. Y., et al. Loss of FTO in adipose tissue decreases Angptl4 translation and alters triglyceride metabolism. Sci Signal. 8 (407), 127 (2015).
  5. Wang, X., et al. N6-methyladenosine-dependent regulation of messenger RNA stability. Nature. 505 (7481), 117-120 (2014).
  6. Berulava, T., Rahmann, S., Rademacher, K., Klein-Hitpass, L., Horsthemke, B. N6-adenosine methylation in MiRNAs. PLoS One. 10 (2), 0118438 (2015).
  7. Deng, X., et al. Widespread occurrence of N6-methyladenosine in bacterial mRNA. Nucleic Acids Res. 43 (13), 6557-6567 (2015).
  8. Dominissini, D., et al. The dynamic N-methyladenosine methylome in eukaryotic messenger RNA. Nature. , (2016).
  9. Fustin, J. M., et al. RNA-methylation-dependent RNA processing controls the speed of the circadian clock. Cell. 155 (4), 793-806 (2013).
  10. Geula, S., et al. Stem cells. m6A mRNA methylation facilitates resolution of naive pluripotency toward differentiation. Science. 347 (6225), 1002-1006 (2015).
  11. Wang, C. Y., et al. FTO modulates fibrogenic responses in obstructive nephropathy. Sci Rep. , SREP18874 (2016).
  12. Jia, G., et al. N6-methyladenosine in nuclear RNA is a major substrate of the obesity-associated FTO. Nat Chem Biol. 7 (12), 885-887 (2011).
  13. Du, T., et al. An association study of the m6A genes with major depressive disorder in Chinese Han population. J Affect Disord. 183, 279-286 (2015).
  14. Wang, C. Y., Yeh, J. K., Shie, S. S., Hsieh, I. C., Wen, M. S. Circadian rhythm of RNA N6-methyladenosine and the role of cryptochrome. Biochem Biophys Res Commun. 465 (1), 88-94 (2015).
  15. Wang, C. Y., Shie, S. S., Hsieh, I. C., Tsai, M. L., Wen, M. S. FTO modulates circadian rhythms and inhibits the CLOCK-BMAL1-induced transcription. Biochem Biophys Res Commun. 464 (3), 826-832 (2015).
  16. Heyn, H., Esteller, M. An Adenine Code for DNA: A Second Life for N6-Methyladenine. Cell. 161 (4), 710-713 (2015).
  17. Xiao, W., et al. Nuclear m(6)A Reader YTHDC1 Regulates mRNA Splicing. Mol Cell. 61 (4), 507-519 (2016).
  18. Meyer, K. D., et al. Comprehensive analysis of mRNA methylation reveals enrichment in 3' UTRs and near stop codons. Cell. 149 (7), 1635-1646 (2012).
  19. Horowitz, S., Horowitz, A., Nilsen, T. W., Munns, T. W., Rottman, F. M. Mapping of N6-methyladenosine residues in bovine prolactin mRNA. Proc Natl Acad Sci U S A. 81 (18), 5667-5671 (1984).
  20. Resnick, R. J., Noreen, D., Munns, T. W., Perdue, M. L. Role of N6-methyladenosine in expression of Rous sarcoma virus RNA: analyses utilizing immunoglobulin specific for N6-methyladenosine. Prog Nucleic Acid Res Mol Biol. 29, 214-218 (1983).
  21. Golovina, A. Y., et al. Method for site-specific detection of m6A nucleoside presence in RNA based on high-resolution melting (HRM) analysis. Nucleic Acids Res. 42 (4), 27 (2014).
  22. Dominissini, D., et al. Topology of the human and mouse m6A RNA methylomes revealed by m6A-seq. Nature. 485 (7397), 201-206 (2012).
  23. Linder, B., et al. Single-nucleotide-resolution mapping of m6A and m6Am throughout the transcriptome. Nat Methods. 12 (8), 767-772 (2015).
  24. Fu, L., et al. Simultaneous Quantification of Methylated Cytidine and Adenosine in Cellular and Tissue RNA by Nano-Flow Liquid Chromatography-Tandem Mass Spectrometry Coupled with the Stable Isotope-Dilution Method. Anal Chem. 87 (15), 7653-7659 (2015).
  25. Rio, D. C., Ares, M., Hannon, G. J., Nilsen, T. W. Nondenaturing agarose gel electrophoresis of RNA. Cold Spring Harb Protoc. 2010 (6), 5445 (2010).
  26. Wang, C. Y., et al. FTO modulates fibrogenic responses in obstructive nephropathy. Sci Rep. 6, 18874 (2016).
  27. Li, X., et al. Transcriptome-wide mapping reveals reversible and dynamic N-methyladenosine methylome. Nat Chem Biol. , (2016).
  28. Sanschagrin, S., Yergeau, E. Next-generation sequencing of 16S ribosomal RNA gene amplicons. J Vis Exp. (90), (2014).
  29. Kukutla, P., Steritz, M., Xu, J. Depletion of ribosomal RNA for mosquito gut metagenomic RNA-seq. J Vis Exp. (74), (2013).
  30. Mishima, E., et al. Immuno-Northern Blotting: Detection of RNA Modifications by Using Antibodies against Modified Nucleosides. PLoS One. 10 (11), 0143756 (2015).
  31. Klungland, A., Dahl, J. A. Dynamic RNA modifications in disease. Curr Opin Genet Dev. 26, 47-52 (2014).

Tags

Biochemie RNA m methylatie demethylase FTO Epitranscriptome
Een methode voor het meten van RNA<em&gt; N</em<sup&gt; 6</sup&gt; -methyladenosine Wijzigingen in cellen en weefsels
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Wang, C. Y., Lin, M. H., Su, H. T. A … More

Wang, C. Y., Lin, M. H., Su, H. T. A Method for Measuring RNA N6-methyladenosine Modifications in Cells and Tissues. J. Vis. Exp. (118), e54672, doi:10.3791/54672 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter