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Biochemistry

RNA 측정 방법 Published: December 5, 2016 doi: 10.3791/54672
Automatic Translation
1, 1, 1
1Department of Cardiology, Chang Gung Memorial Hospital, Chang Gung University College of Medicine

Summary

RNA에 N 6 -methyladenosine (m 6 A) 변형을 측정하기위한 수정 북부 블로 팅 방법을 설명한다. 현재의 방법은 여러 가지 실험 설계에 따라 다양한 RNA를에서 수정 및 컨트롤을 감지 할 수 있습니다.

Protocol

참고 : 6 수준은 rRNA의, mRNA를, 및 기타 소형의 RNA를 포함 총 RNA의 m. 리보솜 RNA 풍부한 m 6 수정,도 6a 레벨이 사실을 고려할 필요가 m의 측정을 가지고 있기 때문이다.

1. RNA 분리

  1. (종이 타월에 분사)가 리보 뉴 클레아 제의 오염 제거 용액을 사용하여, 피펫 및 실험실 벤치의 표면을 닦으십시오. 젖은 종이 클레아없는 물과 수건을 다시 피펫 및 실험실 벤치 표면을 닦아.
  2. RNA 추출
    1. 총 RNA 분리
      1. 오버 헤드 교반기를 사용하여, 조직을 50 내지 100 mg을 4 ℃에서 유지 RNA 분리 액 1ml에 5 내지 10 × 106 세포를 균질화시킨다.
        주 : 자세한 조직 (100-150 mg)을하기 때문에 내부 하부 RNA 농도 생쥐 지방 조직 샘플에 대해 요구 될 수있다. 샘플은 마우스 심장, 간, 골격근, 폐, 뇌에서 공급하고, 대 식세포는 이전에 4 사용되어왔다.
      2. 에서실온에서 5 분 동안 샘플을 균질화 cubate.
      3. 샘플 파쇄 1 ㎖ 당 1- 브로 모 -3- 클로로 프로판 (BCP) 100 μL를 추가한다. 15 초 동안 적극적으로 튜브를 흔들 제조업체의 지침 (24)에 따라 총 RNA를 분리로 진행합니다.
    2. 격리 된 총 RNA에서 폴리아 데 닐화 mRNA의 정제
      1. 사용 가능한 키트 또는 프로토콜을 사용하여 폴리아 데 닐화의 mRNA를 정화.
        1. 다음 솔루션의 각을 다시 중단 철저하게 흔들어 : 배 결합 솔루션, 올리고 (DT) 폴리스티렌 구슬 및 세척 솔루션을. 올리고 (DT)를 사용하기 전에 실온에 따뜻한 비즈 있는지 확인합니다.
        2. 가열 블럭에서 70 ℃로 튜브 열로 제조 당 용출 용액 120 μL를 옮긴다.
        3. 미세 원심 관에 총 RNA의 500 μg의 최대 피펫. 클레아없는 물로, 250 μL에 볼륨을 조정합니다.
        4. 총 RNA에 2 배 결합 액 250 μL를 추가하기 때문에lution와 소용돌이 짧게 내용을 혼합합니다.
        5. 올리고 15 μL를 추가 (DT) 구슬과 소용돌이는 철저하게 혼합합니다.
        6. 3 분 동안 70 ℃에서 혼합물을 인큐베이션.
        7. 가열 블록의 샘플을 제거하고 10 분 동안 실온에서 서하자.
        8. 2 분 동안 15,000 XG에 원심 분리기.
        9. 조심스럽게 뒤 약 50 μL를 떠나, 뜨는을 제거합니다.
        10. 피펫으로 펠렛을 다시 중단 세척 용액 500 μL를 추가합니다.
        11. 스핀 필터 / 수집 튜브 세트로 현탁액을 피펫.
        12. 2 분 동안 15,000 XG에 원심 분리기. 포집 관에서 열을 제거하고 흐름을 통해 폐기하십시오. 수집 튜브에 열을 돌려줍니다.
        13. 스핀 필터 상에 세척 용액의 피펫 500 μL.
        14. 15,000 X 원심 분리기 2 분 동안 g.
        15. 신선한 수집 관에 스핀 필터를 전송합니다.
        16. 용출 용액의 피펫 50 μL 가열70 ° C 스핀 필터의 중심 상.
        17. 70 ℃에서 2-5 분 동안 품어. 1 분 동안 15,000 XG에 원심 분리기.
        18. 스핀 필터의 중심에 70 ° C로 가열 용출 용액의 추가 50 μL 피펫.
        19. 단계를 반복 1.2.2.1.18.
      2. 100 μg의 / ㎖ 글리코겐, 3 M 아세트산 나트륨 완충액 (pH 5.2), 및 무수 에탄올 2.5 부피 0.1 볼륨. -80 ° C에서 하룻밤 침전.
      3. 4 ℃에서 25 분 동안 15,000 XG에 원심 분리기. 상층 액을 버린다.
      4. 75 % 에탄올 1 mL로 펠렛을 씻으십시오. 4 ℃에서 15 분 동안 15,000 XG에 원심 분리기. 조심스럽게 에탄올을 제거합니다.
      5. 3-5 분 동안 공기 건조.
      6. 펠렛을 용해 뉴 클레아없는 물 10 μL를 추가합니다.
      7. -70 ° C에서 보관하십시오.
  3. RNA 자격 및 정량화
    1. 분광 광도계를 사용하여, NotI에 의해 RNA의 농도를 결정260 nm 내지 280 nm에서의 흡광도 겨. 다음은 260 / A 280 비율은 1.8-2.2해야합니다.
    2. 0.8 % 아가 로스 겔 전기 영동 (25)를 사용하여 RNA 샘플 품질을 확인합니다.
      참고 :이 그대로 진핵 총 RNA는 강렬한 28S와 18S rRNA의 밴드를 표시해야합니다. 좋은 RNA 준비를위한 18S rRNA의 밴드 강도를 비교 28S의 비율은 1 ~ 2이다.

2. 젤 전기 영동 및 전송

참고 : 버퍼 준비 프로토콜은 표 1에 제시되어있다.

  1. 포름 알데히드 젤 준비 (1 %)
    1. 디 에틸 피로 카보 (DEPC) 물과 모든 전기 장비를 씻어.
    2. 완전히 전자 레인지 DEPC 물 215 ㎖의 2.5 g 아가 용융.
    3. 10 배 3- (N- 모르 폴리 노) 프로판 술폰산 (MOPS)의 12.5 mL의 버퍼와 37 %의 포름 알데히드 22.5 mL를 넣고.
    4. 1.5 mm 두께의 빗 전기 영동 장치에 그것을 따르십시오.
    5. t 거품을 제거 또는 푸시깨끗한 빗과 젤의 가장자리에 밑단.
    6. 겔은 실온에서 응고 할 수 있습니다.
  2. 샘플 준비
    1. 샘플 버퍼의 총 RNA의 1-10 μg의 11.3 μL를 섞는다.
    2. 샘플 버퍼의 11.3 μL와 RNA 마커 (1 μg의 / μL) 2 μg의 혼합.
    3. 16 μL의 총 볼륨 2.2.1과 2.2.2에서 샘플 뉴 클레아없는 물을 추가합니다.
    4. 5 분 동안 60 ℃에서 가열 한 후 얼음에 진정.
    5. 얼음 / μL 에티 디움 브로마이드 0.1 μg의를 포함 추적 염료의 4 μL와 2.2.3에서 샘플 16 μL를 섞는다.
      주의 : 흡입하면 에티 디움 브로마이드 가능성이 기형 독성이다. 에티 디움 브로마이드 물질 안전 보건 자료를 참조하십시오.
  3. 전기 영동
    1. 10 배 MOPS의 200 ㎖가 1 배 MOPS 실행 버퍼를 만들기 위해 DDH 2 O의 1,800 mL의 버퍼에 추가합니다.
    2. 젤의 우물을 씻어하기 위해 1 배 MOPS 실행 버퍼를 사용합니다.
    3. 사전 실행 t그는 5 분 동안 20 V에서 젤.
    4. 겔의 우물에 RNA 샘플을로드합니다.
    5. 빛의 노출을 방지하기 위해 호일로 커버. (야간) 약 17 시간 동안 35 V에서 실행
    6. 검사 및 자외선 아래에서 젤을 촬영.
  4. 이전
    1. 사용되지 않는 부분을 제거하는 젤을 잘라.
    2. 10 배 SSC 버퍼 (20 배 SSC 버퍼의 250 mL의 DEPC 물 250 mL)을 500 ㎖를 준비합니다.
    3. 50 rpm으로 진탕 20 분 동안 10 배 SSC 버퍼로 두 번 젤을 씻으십시오.
    4. 반송 트레이 (도 1)로부터 전송 버퍼를 흡수 심지 종이의 역할을하기에 충분히 큰 1 필터 종이 낱장.
    5. 젤과 같은 크기로 종이 필터 4 조각을 잘라.
    6. 겔과 같은 크기로 양전하 나일론 막 중 1 매를 잘랐다.
    7. 겔의 노치와 올바른 방향을 보장하기 위해 마커로 막을 표시합니다.
    8. 15 분 동안 2 × SSC 완충액에서 막을 담근다.
    9. 500 mL의 O를 붓고F 10 배 SSC 전송 트레이에 버퍼.
    10. 유리판을 가로 지르는 큰 필터 종이 시트를 놓고 전송 버퍼 여과지 젖은.
    11. 피펫있는 모든 거품을 굴립니다.
    12. 전송 버퍼에 미리 차단 필터 종이의 2 개를 적시 단계 2.4.5에서 여과지의 중앙에 배치합니다. 모든 거품을 제거합니다.
    13. 아래 필터 종이에 젤 상단 측을 놓습니다.
    14. 겔의 상단에 막을 놓습니다. 겔과 멤브레인의 노치에 맞 춥니 다.
    15. 멤브레인 위에 프리 컷 여과지의 2 개를 배치하고 전송 버퍼 여과지 젖은.
    16. 층 사이의 거품을 제거합니다.
    17. 수건은 겔 멤브레인을 통과 버퍼를 흡수되도록하여 겔 주위에 랩을 적용합니다.
    18. 필터 종이 위에 종이 타월 스택.
    19. 수건 위에 대형 유리 접시를 놓습니다.
    20. 스택의 상단에 무게를 둡니다.
    21. RNA가 막에 겔로부터 전송할 수 밤새 유지.

N 6 -methyladenosine 3. 검출

  1. 막 가교
    1. 배 SSC 버퍼에 젖은 멤브레인을 유지합니다.
    2. UV 가교제에 10 배 SSC 버퍼에 몰입 필터 종이 2 장을 놓습니다.
    3. RNA의 흡착면이 위를 향하도록, 여과지 위에 멤브레인을 놓습니다.
    4. "autocrosslink 모드"(12 μJ)를 선택하고 조사를 시작하기 위해 "시작"버튼을 누릅니다.
    5. 멤브레인을 겔에서 RNA의 전사를 확인하기 위해 UV 겔 화상 포수 막 겔을 조사한다.
  2. 면역
    1. 실온에서 1 시간 동안 트윈 -20 (TBST) 완충액 TBS 버퍼에서 5 % 무 지방 우유 막을 차단.
    2. 15 분 동안 TBST 완충액으로 세 번 씻으십시오.
    3. 밤새 m (6) A (에 멤브레인을 품어 <EM> N 6 -methyladenosine) 항체 용액 (1 : 1,000 5 % 무 지방 우유 TBST 버퍼) 4 ° C에서.
    4. 15 분 동안 TBST 완충액으로 세 번 멤브레인을 씻으십시오.
    5. 실온에서 1 시간 동안 (5 % 무 지방 우유 TBST 버퍼 2000 1) HRP 접합 된 당나귀 항 - 토끼 항체 용액의 막을 인큐베이션.
    6. 15 분 동안 TBST 완충액으로 세 번 멤브레인을 씻으십시오.
    7. 강화 된 화학 발광 기판 (막 cm 2 당 0.125 ml)에 적용합니다.
    8. 제조자의 지시 (26)에있어서, 상기 디지털 영상 기의 최적 설정으로 화학 발광 캡처.
  3. m 6 정량화
    1. ImageJ에 소프트웨어를 사용하여 상대 m 6 화학 발광 강도를 측정한다.
      1. ImageJ에 소프트웨어 메뉴 아래에서 해당 파일을 열 수있는 "파일"옵션을 선택합니다.
      2. ImageJ에에서 "직사각형"도구를 선택하고 주변에 프레임을 그립니다신호.
      3. 리보솜 RNA는 실험의 초점없는 경우 계산을위한 18S 및 28S 리보솜 RNA m도 6A 대역을 피한다.
      4. 선택한 차선을 확인하는 "명령"과 "1"을 클릭합니다.
      5. 보도는 "명령"과 "3"선택한 플롯을 표시합니다.
      6. 가 "STRAIGHT"도구를 클릭하고 분할 영역을 구분하는 선을 그립니다.
      7. 측정 값을 기록하기 위해 "지팡이"도구를 클릭합니다.
      8. 데이터를 내 보냅니다.
      9. 에티 디움 브로마이드 염색 중 18S 리보솜 RNA 밴드 m (6) (A)의 레벨을 정규화한다.

Representative Results

정상 명암 주기성 단계 14 일 후에 야생형 마우스 상수 어둠 속에 넣었다. 간에서 RNA를 4 시간 간격으로 샘플링 및 수정 북부 블로 팅으로 연구 하였다. rRNAs, mRNA를, 작은 RNA를의 메틸화는 명확하게 (그림 2) 검출되었다. 상이한 주기성 시간 사이의 비교 (CT)을 정확하게 18S rRNA의 기준을 산출 할 수있다. rRNA의, mRNA를, 작은 RNA를에서 m 6 수준의 강력한 일중 진동이 있었다.

rRNA의 proffered 의해 간섭을 방지하기 위해, 폴리아 데 닐화 RNA를 단계 1.2.2와 같이 정제 될 수있다. 정제 후, rRNA의 크게 다른 RNA를 (도 3)의보다 나은 시각화를 허용하도록 제거 될 수있다.

그림 1
g>도 1 : 오 이송 유닛 조립. 멤브레인에 블 롯팅을위한 RNA를 모세관 반송 유니트가 도시되어있다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 2
그림 2 : C57BL / 6J 마우스의 m 6 수준의 활동 일주기. 이 그림은 m 6 야생형 생쥐의 간에서 총 RNA의 얼룩은 4 시간 간격으로 정상 명암 단계 14 일 이후에 어두운 어두운 단계의 첫 번째 날에 희생 보여줍니다. 정량화는 6 m 18S와 28S rRNA의 사이의 화상 농도의 차이를 사용하여 수행 하였다. m 개의 6 풍요 로움은 맨 아래에있는 포름 알데히드 겔에서 18S rRNA의 대역으로 표준화되었다.등 = "_ 빈">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 3
그림 3 : 또는 rRNA의없는 m 6의 말. 대표 m는 총 RNA와 야생형 생쥐의 간에서 폴리아 데 닐화 RNA의 6 롯이 표시됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

표 1 : 버퍼 및 솔루션을 제공합니다.

Disclosures

저자는 공개 아무것도 없어.

Materials

1 10 배 MOPS 완충액 (pH 7.0, 빛으로부터 보호)
MOPS 41.85 지 0.2 M
아세트산 나트륨 4.1 지 0.05 M
EDTA,이 나트륨 소금 3.7 지 0.01 M
DEPC 물
합계 1 엘
실온에서 교반
이 20 배의 SSC 완충액 (pH 7.0)
염화나트륨 175.3 지 3 M
트리 소듐 시트 레이트 88.3 지 0.3 M
DEPC 물
합계 1 엘
실온에서 교반 한 후, 오토 클레이브
삼 추적 염료
10 배 MOPS 버퍼 (500) μL 1 배
피콜 (400) 0.75 지 15 %
블루 브로 모 페놀 0.01 지 0.2 %
크실렌 Cyanol 0.01 지 0.2 %
DEPC 물
합계 (5) mL의
스토어 -20 ° C에서
4 DEPC 물
1 비율로 희석 : DEPC의 1,000 DDH 2 O에
실온에서 밤새 교반 한 후, 오토 클레이브
(5) 샘플 버퍼 (빛으로부터 보호)
10 배 MOPS 버퍼 (200) μL
37 % 포름 알데히드 (270) μL
포름 아미드 (660) μL
스토어 -20 ° C에서
Name Company Catalog Number Comments
RNaseZap solution Ambion AM9782 Protocol 1.1
TRI Reagent solution Ambion AM9738 Protocol 1.2.1.1
1-Bromo-3-chloropropane (BCP) Sigma B9673 Protocol 1.2.1.3
Ethanol JTbaker 8006 Protocol 1.2.1.3
Isopropanol Sigma I9516 Protocol 1.2.1.3
GenElute mRNA Miniprep Kit Sigma MRN70 Protocol 1.2.2.1
Glycogen Ambion AM9510 Protocol 1.2.2.2
Sodium acetate Fluka 71183 Protocol 1.2.2.2
Nuclease-free water Ambion AM9930 Protocol 1.2.2.6
DEPC Sigma D5758 Protocol 2.1.1
Agarose JT Baker A426 Protocol 2.1.2
MOPS Sigma M1254 Protocol 2.1.3
37% formaldehyde Solution Sigma F8775 Protocol 2.1.3
EDTA, Disodium Salt JT Baker 8993 Protocol 2.1.3 10x MOPS buffer
formamide Sigma F7503 Protocol 2.2.1
RNA Millennium Marker Ambion AM7150 Protocol 2.2.2
Ethidium Bromide Amresco X328 Protocol 2.2.5
Ficoll PM400 GE Healthcare 17-0300-10 Protocol 2.2.5 tracking dye
Bromophenol blue Sigma 114391 Protocol 2.2.5 tracking dye
Xylene Cyanol FF Sigma X4126 Protocol 2.2.5 tracking dye
Sodium chloride dihydrate JT Baker 3624 Protocol 2.4.2 20x SSC buffer
Trisodium citrate Sigma S1804 Protocol 2.4.2 20x SSC buffer
Hybond Blotting Paper GE Healthcare RPN6101M Protocol 2.4.4
GE Hybond-N+ membrane GE Healthcare RPN303B Protocol 2.4.6
Stratalinker UV Crosslinker 2400 Stratagene 400075 Protocol 3.1.2
Gel Catcher 1500 ANT Technology Gel Catcher 1500 Protocol 3.1.5
Anti-m6A (N6-methyladenosine) Synaptic Systems 202003 Protocol 3.2.3
Amersham ECL Anti-Rabbit IgG, HRP-linkd whole Ab GE Healthcare NA934 Protocol 3.2.5
ChemiDoc MP System BIO-RAD 1708280 Protocol 3.2.8

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References

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생화학 문제 (118) RNA m 메틸화 Demethylase FTO Epitranscriptome
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