Introduction
Humane neurologiske lidelser, såsom mikrocefali, kan kun dårligt undersøgt i dyremodeller på grund af det faktum, at den menneskelige hjerne har et udvidet kortikale overflade, en unik funktion adskiller sig fra ikke-humane dyr.
Dette aspekt gør menneskelige hjerne udvikling en kompleks proces, der ikke i tilstrækkelig grad undersøgt i et 2D, in vitro cellekultursystem. Nye 3D dyrkningsteknikker tillade frembringelsen af vævslignende organoider fra inducerede pluripotente stamceller (iPSCs). In vitro differentiering af pluripotente stamceller i en 3D suspensionskultur tillader dannelsen af forskellige celletyper i en rettidig og region-specifik måde, hvilket giver anledning til en organiseret, lagdelt væv 1, 2, 3. Takket være laboratorier, banebrydende 3D kultur teknologier og afmystificeret kompleksitet organdannelse, startende fra stamceller,vi udviklet en robust metode til generering hjernen organoider at afgrænse tidlige begivenheder af menneskelige hjerne udvikling og at modellere mikrocefali in vitro 1, 2, 3. Det er bemærkelsesværdigt, at vi tilpasset den oprindelige metode udviklet af Lancaster et al. at generere cerebrale organoider 1. Denne metode blev ændret i henhold til vores eksperimentelle krav.
Formålet med en undersøgelse fra Gabriel et al. var at analysere de cellulære og molekylære mekanismer i neural stamcelle vedligeholdelse under hjernens udvikling. For at gøre dette blev en mekanistisk forsøg udført med analyse neurale progenitorceller (NPCs) i 3D hjernen organoider afledt fra en mikrocefali patient 4. Denne patient bar en mutation i CPAP, en konserveret centrosomal protein, der kræves for centrosomreplikation biogenese 5. En bredt accepteret hypotese er, at mikrocefali er resultatet af en udtynding af NPC pool, og dette kan enten skyldes celledød eller for tidlig differentiering 1, 6, 7, 8, 9.
Ved at analysere de ventrikulære zoner (VZs) af mikrocephali hjerne organoider blev det vist, at et betydeligt antal NPC undergår asymmetrisk celledeling i modsætning hjernen organoider afledt fra en rask donor 4. Omfattende mikroskopiske og biokemiske analyser af microcephalic hjerne organoider afslørede en uventet rolle for CPAP i tide cilia demontering 4. Specifikt er muteret CPAP forbundet med retarderet cilium demontering og forsinket cellecyklus genindførsel, der fører til for tidlig differentiering af NPCs 4. Disse resultater tyder på en rolle for cilier i mikrocefali og thEIR inddragelse under neurogenese og hjerne størrelseskontrol 10.
Den første del af denne protokol er en beskrivelse af en tretrins metode til at generere homogene hjerne organoider. Som nævnt før, blev den oprindelige Lancaster protokol tilpasset og modificeret så de passer til vores formål 1. Første, humane iPSCs dyrkes i et defineret feeder-fri tilstand på Engelbreth-Holm-Swarm (EHS) matrix. Dette trin undgår variationer af feeder-afhængige pluripotente stamceller cellekulturer. I denne protokol, at induktionen af neural differentiering danne neurale epitel starter direkte fra iPSCs. Ved at springe embryoiddannelsesmuligheden legeme (EB) dannelse trin, neurale differentierings forløber i en mere kontrolleret og styret måde. Denne fremgangsmåde begrænser spontan og ikke-orienteret dannelse af andre kim cellelag, såsom mesoderm og endoderm. Ved at anvende denne protokol, kan neurosfærer indeholdende neurale rosetter høstes på dag 5 for EHS matrix indlejring og stationær suspensionskultur. Det organoide medium, der anvendes til det tredje trin i vores protokol er suppleret med dorsomorphin og SB431542. Dorsomorphin er et lille-molekyle inhibitor af knoglemorfogent protein (BMP), og SB431542 hæmmer TGFp / activin / nodal signalvej. Kombinationen af disse faktorer kan fremme neural differentiering mere effektivt end retinsyre alene 11, 12, 13, 14.
Tilsammen disse modifikationer muliggøre reproducerbar generation af hjernens organoider, med minimale variationer tværs organoider. Vigtigere, blev denne fremgangsmåde anvendt på robust generere microcephalic hjerne organoider fra patientens iPSCs, som bærer mutationer i gener, der påvirker centrosomer og celle-cyklus dynamik.
Den anden del af denne protokol giver instruktioner til at forberede brain organoider til analyse og fortolkning af cellulære defekter i mikrocefali. Dette omfatter fiksering, Fremstilling af frysesnit, immunfluorescensfarvning og konfokal mikroskopisk analyse. Denne protokol vil give læseren en detaljeret beskrivelse af de forventede resultater, og med vejledning til fortolkning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. generation af Brain organoider (23 dage)
- Initiering af neuroectoderm (5 dage)
BEMÆRK: Følgende punkter bør overvejes før starten af differentiering. Omprogrammering metode (lentiviral-, Sendai-virus-, episomal- eller microRNA-baserede etc.) til opnåelse af humane iPSCs bør ideelt set være den samme for alle patient og styre IPSC linjer. Forskellige omprogrammering kits og instruktioner bygger på offentliggjorte protokoller er tilgængelige 15, 16, 17, 18. Kvaliteten af de humane IPSC linjer er nøglen til opnåelse af en optimal differentiering. Overvåg koloni og cellemorfologi med et mikroskop og validere pluripotens ved at teste ekspressionen af markører såsom Oct3 / 4, Nanog, eller TRA-1-60.- Kultur menneskelige iPSCs under fødefri forhold i medium A på et fad belagt med Engelbreth-Holm-Swarm(EHS) matrix.
BEMÆRK: Grow humane iPSCs feeder-frit og serum-frit for at opretholde en defineret kultur tilstand og for at undgå et yderligere trin til fjernelse af muse embryonale fødeceller (MEF'er) før starten af differentiering. Det optimale passagenummer for humane iPSCs at starte differentierings spænder fra passagen 15 ved omprogrammering til passage 70 i alt. Når passage, frigøre hiPSC kolonier som celler aggregerer med et egnet celle løsrivelse opløsning med lav mekanisk belastning og en 2-ml serologisk pipette til at overføre aggregater til en ny skål. Undgå dissociation til enkelte celler, da dette kan fremkalde differentiering og apoptose i de fleste IPSC linjer. Det blev rapporteret, at langvarig, kan encellede passage øge genomiske ændringer i human iPSCs 19, 20. Undgå Cellefrigørelse procedurer, som kræver et centrifugeringstrin til fjernelse af løsrivelse opløsning, da dette reducerer den samlede levedygtighed iPSCs. Prøvealle kulturer til mikrobielle forureninger, især mycoplasma, på en regelmæssig basis, da dette kan ændre kvaliteten af iPSCs og deres differentiering kapacitet.- Coat en 60 mm vævskulturskål med EHS matrix i henhold til fabrikantens anvisninger.
- Tø en alikvot på 1 x 10 6 humane iPSCs. Pode iPSCs i en 60-mm vævskulturskål overtrukket i EHS matrix og indeholdende 5 ml medium A (se Materialer tabellen). Ændre mediet dagligt og passage efter 5 til 7 dage, hvor cellerne når ~ 80% sammenflydning.
BEMÆRK: Passage de optøede iPSCs ved 80% konfluens ved anvendelse af standardmetoder, såsom enzymfri frigørelse af kolonier 21, mindst én gang før start af differentiering. Kort fortalt fjernes iPSC medium, vaske cellerne en gang med forvarmet 37 ° C Dulbeccos modificerede Eagles medium: Nutrient Mixture F12 (DMEM / F12), og inkuberes iPSCs følge fabrikantensinstruktioner ved anvendelse reagens A (se materialer tabel). Overskrid ikke den anbefalede inkubationstid for at undgå dissociation til enkelte celler. Humane iPSCs bør tages af og flyder som aggregater og ikke som enkeltceller. De kan derefter overføres til nye EHS matrix skåle coatet; for eksempel iPSC aggregater fra en 60 mm skål kan distribueres til 4 nye 60 mm skåle. - Check for mycoplasma med en mycoplasma detektion kit i overensstemmelse med producentens anvisninger. Brug kun mycoplasma-fri iPSCs, som mycoplasma kan ændre differentieringen evne iPSCs.
- Dissocierer iPSCs (80% konfluente) og forberede en enkelt-cellesuspension under anvendelse af reagens B.
- Vask iPSCs gang med foropvarmet (37 ° C) DMEM / F12.
- Tilføje forvarmet reagens B (fx 1 ml i en 60 mm skål) og inkuber iPSCs i 5 minutter ved 37 ° C og 5% CO2.
- Flick 20 gange med en fingerspids på siden og bunden affadet at frigøre iPSCs. Check for frigørelse af celler under mikroskopet.
- Pipette cellesuspensionen op og ned i skålen 5 gange med en 1-ml mikropipette.
- Tilsæt 3 ml medium A at fortynde 1 ml reagens B og indsamle cellesuspensionen i et 15-ml centrifugerør.
- Forsigtigt dreje ned iPSCs (500 xg) i 4 minutter ved stuetemperatur.
- Resuspender cellepelleten i 1 ml medium B og tælle antallet af celler med en hæmocytometer.
BEMÆRK: Vær opmærksom på kun at bruge medium B for resuspension. Undgå at bruge medium A, da det indeholder en for høj koncentration af bFGF, som kan inhibere differentiering.
- Fortynd cellesuspensionen til 4,5 x 10 5 celler pr ml i medium B suppleret med 10 pM rho-associeret protein kinase inhibitor (Y-27632).
- Tilsæt 100 uL per brønd i en ikke-klæbende, v-bund, plade med 96 brønde.
BEMÆRK: Sørg for cellerne ligeligt fordelt i suspension ved at ryste røret hver gang, før du tager ud 100 pi portioner. Det er vigtigt, at hver brønd skal indeholde et tilsvarende celleantal for at opnå neurosfærer homogene i størrelse og form (runde, defineret overflader). - Forsigtigt spin ned pladen med cellerne ved 500 xg og stuetemperatur i 3 minutter og inkuberes ved 37 ° C og 5% CO2.
- Ændre mediet dagligt ved at fjerne 50 pi og tilsætning af 50 pi frisk medium B i hver brønd i de næste 5 dage.
- Kultur menneskelige iPSCs under fødefri forhold i medium A på et fad belagt med Engelbreth-Holm-Swarm(EHS) matrix.
2. Embedding Neurosfærer i EHS Matrix (4 dage)
- Forberede neurosfære medium ved at blande følgende: 1: 1 blanding af DMEM / F12 og medium C (vol / vol), 1: 200 (v / v) supplement 1, 1: 100 (v / v) supplement 2 uden (vægt / o) vitamin A, 1: 100 L-glutamin, 0,05 mM ikke-essentielle aminosyrer (MEM), 100 U / ml penicillin, 100 pg / ml streptomycin, 1,6 g / l insulin og 0,05 mM β-mercaptoethanol.
- Opsaml neurosfærer witha 200 pi mikropipette under anvendelse af et ~ 2 mm spids tidligere skåret med steril saks.
- Placer neurosfærerne ca. 5 mm væk fra hinanden på paraffin film (3 x 3 cm2) i en tom 100 mm skål og omhyggeligt fjerne så meget af det resterende medium som muligt.
- Tilføj en dråbe (7 pi) af EHS matrix på hver enkelt neurosfære.
- Inkubér EHS matrix falder med neurosfærerne i 15 minutter i en inkubator.
- Vask neurosfærer omhyggeligt fra paraffin filmen ved at skylle dem med neurosphære medium. At skylle Brug en 1 ml mikropipette og en ny 100 mm petriskål indeholdende 10 ml neurosfære medium.
- Inkubér neurosfærer for de næste 4 dage og der tilsættes 2 ml frisk neurosphære medium på dag 2.
BEMÆRK: Sørg for, at hylderne i inkubatoren er flade, så de EHS matrix-indlejrede neurosfærer ikke vil klumpe sammen på den ene side af skålen.
3. organoider i en Rotary SuspensionKultur (14 dage)
- Forberede hjerne organoide medium ved at blande følgende: 1: 1 blanding af DMEM / F12 og medium C (vol / vol), 1: 200 (v / v) supplement 1, 1: 100 (v / v) supplement 2 w / o vitamin A, 1: 100 L-glutamin, 0,05 mM MEM, 100 U / ml penicillin, 100 pg / ml streptomycin, 1,6 g / l insulin, 0,5 uM dorsomorphin, 5 pM SB431542 og 0,05 mM β-mercaptoethanol.
- Tilsæt 100 ml hjerne organoide medium til hver spinnerkolbe gennem sine sidearme og placere dem i en inkubator i forvarmning i mindst 20 min.
- Opsæt en omrøring program ved 25 rpm, i overensstemmelse med producentens anvisninger.
BEMÆRK: Før overføre EHS matrix-indlejrede neurosfærer ind spinner kolber, skal du sørge for, at de alle er adskilt. Hvis to eller flere er forbundet gennem EHS matrix, adskille dem ved at skære den forbindende matrix med en skalpel. - overføre omhyggeligt EHS matrix-indlejrede neurosfærer i spinner kolber indeholdende 100 ml organoide medium osing en 2 ml serologisk pipette. Brug sidearmene af spinnerkolben at overføre neurosfærerne i kolben.
- Placer spinnerkolber på en magnetisk omrøring platform i en inkubator ved 37 ° C og 5% CO2; dette er dag 0 i organoide kultur.
- Skift mediet en gang om ugen (eller oftere, når der er en farveændring) ved at fjerne halvdelen af mediet og tilføje den samme mængde frisk medium.
BEMÆRK: Når du tager de spinner kolber ud af kuvøsen, vent 3-5 min for at lade organoider synke ned til bunden af kolben. Fjern mediet ved at placere glasset pipettespidsen (forbundet med en pumpe) på overfladen af væsken; aspirere mediet forsigtigt gennem en sideåbning / arm af kolben. Disse manipulationer skal ske under laminar hætte.
4. Analyse af Brain organoider
- Fiksering af organoider
- Indsamle organoider på dag 14 af spinnerkolben kultur with et snit 1 ml mikropipette (cut ~ 5 mm). Sætte dem alle i en 60 mm skål og vaskes en gang med 5 ml varm DMEM / F12 i 3 minutter.
- Forberede et 1,5 ml rør med 500 pi varm 4% paraformaldehyd (PFA).
Forsigtig: Bær hud og øjenbeskyttelse og arbejde under en sikkerheds hætte ved håndtering PFA fiksativ. - Placer hver organoide separat i hvert rør og fikseres i mindst 30 minutter ved stuetemperatur. Må ikke fastsætte organoider i mere end 60 min. At flytte organoider, bruge en podning sløjfe eller enhver anden udtænke, der er praktisk.
- Fjern PFA og vask de faste organoider to gange i 10 minutter hver med 1 ml PBS.
- Opbevar organoider i 1 ml PBS ved 4 ° C i op til 7 dage, indtil videre anvendelse.
- Integrering af organoider for Fremstilling af frysesnit
- Fjern PBS og tilsættes 1 ml 30% saccharose i destilleret vand opløsning per rør at dehydrere de organoider før cryofreezing dem; efter tilsætning sucrose opløsning bør organoider være flydende på overfladen. Opbevar organoider natten over i sucroseopløsning ved 4 ° C; ved den næste dag, bør organoider have sunket ned til bunden af røret.
BEMÆRK: organoider kan opbevares i op til 3-5 dage ved 4 ° C i saccharoseopløsning, om nødvendigt. - Fyld en vinyl prøve støbeform med 400 pi optimal opskæring temperatur (OCT) forbindelse og bruge en podning løkke til at sætte en organoide i midten af formen. Mærk kanten af formen med navnet prøven.
- Fryse det organoide-holdige form ved -80 ° C indtil Fremstilling af frysesnit.
- Coat glas cryoslides med 0,1% poly-l-lysin-opløsning (PLL) i PBS i 5 minutter ved stuetemperatur, og lad objektglassene tørre i 3 timer. Opbevar dias ved 4 ° C og varme dem op til værelset tempereret før brug.
BEMÆRK: PLL-belægning er et vigtigt skridt, da det vil forhindre organoide skiver fra flydende væk. Indsamle og opbevare PLL opløsning ved 4 ° C i op til 3måneder. Før genbrug, filtrere det med en 0,22 um sprøjte og lad den varme op til stuetemperatur. - Sektion cryofrozen organoider i 20-50 um tykke skiver på PLL-overtrukne glas cryoslides 22. Lad objektglassene med sektionerne tørre i 1 time ved stuetemperatur. Opbevar sektioner ved -80 ° C indtil yderligere bearbejdning.
- Fjern PBS og tilsættes 1 ml 30% saccharose i destilleret vand opløsning per rør at dehydrere de organoider før cryofreezing dem; efter tilsætning sucrose opløsning bør organoider være flydende på overfladen. Opbevar organoider natten over i sucroseopløsning ved 4 ° C; ved den næste dag, bør organoider have sunket ned til bunden af røret.
5. Immunfluorescerende Farvning af organoidt Sektioner
BEMÆRK: den generelle karakterisering af organoider, farvning med nestin, et neuralt progenitor markering, og TUJ1, en pan-neuronal markering, anbefales. Som yderligere eksempler, immunfluorescensfarvning med phospho-vimentin (p-Vim), hvilke etiketter mitotiske apikale radiale glialceller, og Arl13b, for cilium, er beskrevet. For at teste apoptose bruge Terminal deoxynucleotidyltransferase (TdT) dUTP Nick-endemærkning (TUNEL) assay. Placer dias i en plastboks under inkubationer at beskytte dem mod støv, lys,og udtørring.
- Optø objektglassene i 30 minutter ved stuetemperatur.
- Vaskes objektglassene to gange med 200 pi PBS-glycin (0,225 g glycin i PBS) i 3 minutter for at standse PFA-induceret autofluorescens.
- Permeabilisere sektioner med 200 pi 0,5% Triton X100 / 0,1% tween i PBS-opløsning i 10 minutter ved stuetemperatur.
- Vaske dem to gange med 200 pi PBS-glycin opløsning i 3 minutter.
- Inkubere dem med 200 pi 0,5% fiskegelatine / 0,1% Triton X100 i PBS i 1 time ved stuetemperatur eller natten over ved 4 ° C for at blokere uspecifik antigenbinding.
BEMÆRK: Hvis en TUNEL analyse er påkrævet, udføre analysen som pr producentens protokol. Starte med TUNEL-analyse før udførelse af immunfarvning som den kunne genere sekundære antistoffer og slukke fluorophorer når de anvendes bagefter. - Fortynd antistofferne i blokeringsopløsning i følgende koncentrationer: nestin, 1: 200; p-Vim, 1: 500; TUJ1, 1: 200;Arl13b 1:20; og sekundære antistoffer, 1: 1.000.
- Inkuber med 200 pi af det første primære antistof (fx nestin) i 1-2 timer ved stuetemperatur eller natten over ved 4 ° C.
- Vask 3 x 3 min med 200 pi blokeringsopløsning.
- Fortynd den første (anti-muse 488) sekundært antistof 1: 1.000 i blokeringsopløsning og inkuber glideren i 200 pi i 1-2 timer ved stuetemperatur. Fra nu af, altid beskytte dias mod lys.
- Vask 3 x 3 min med 200 pi blokeringsopløsning.
- Inkuber med 200 pi af den næste primære antistof (fx TUJ1) i 1-2 timer ved stuetemperatur eller natten over ved 4 ° C.
- Vask 3 x 3 min med 200 pi blokeringsopløsning.
- Tilsæt 200 pi af den næste sekundært antistof (anti-kanin 647) i 1-2 timer ved stuetemperatur.
- Vask 3 x 3 min. med 200 pi blokeringsopløsning.
- Tilsæt 200 pi 4' , 6-diamidino-2-phenylindol (DAPI) ved en 30 nM concentration i PBS i 15 minutter ved stuetemperatur for nuklear farvning.
- Vask 2 x 3 min med 200 pi blokeringsopløsning.
- Vask 1 x 1 min med 200 pi destilleret vand og lad sektionerne tørre i 10-20 min, indtil ingen indlysende vanddråbe er synlig mere.
- Monter sektioner med indlejring medium. Opbevar dem beskyttet mod lys ved 4 ° C i op til flere uger.
- Fortsæt med mikroskopisk analyse af billedet et overblik over det organoide, ventrikulær zone, primitive cortical plade, og andre områder af interesse.
- Anvende et konfokalt mikroskop med et 63X olie objektive og fluorescerende filtre, valgt i overensstemmelse med de fluorescerende farvestof-mærkede sekundære antistoffer, der anvendes 1, 10.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Frembringelsen af hjernen organoider kræver mindst tre ugers kontinuerlig dyrkning (figur 1A). For at opnå reproducerbare resultater, anbefaler vi, at forskeren dokumenterer hvert skridt og, vigtigst, undgår eventuelle ændringer med hensyn til mellemstore komponenter, tidspunkter og celle håndtering. Her giver vi en oversigt over, hvordan man kan vurdere, om de kritiske milepæle nås for at opnå organoider af tilstrækkelig kvalitet ved afslutningen af forsøget. Dannelsen af neurosfærer i en plade med 96 brønde bør være klart synlig fra dag 4. Neurosfærer kan anerkendes som veldefinerede kugler på bunden af hver brønd (figur 1B, trin 1).
På dag 5 bør neurosfærer være ~ 500 um i diameter og udviser en glat overflade, med en lys kant omgiver en mørk center. Det kunne være muligt at allerede observere neurale roset-lignende udvidet kæmperctures i denne lyse kant (figur 1C, starte fra trin 2). Hvis neurosfærerne falde fra hinanden eller synes mere som celleaggregater, bør differentiering ikke fortsættes yderligere. Endelig bør organoider øges og udviser en lignende størrelse under differentieringen proces i centrifugekolber (figur 1D, trin 3). Se tabellen fejlmelding (tabel 1) for yderligere information.
Kvaliteten af dag-14 organoider skal verificeres ved lysmikroskopi. VZs er sammensat af tykke lag af nestin-positive NPCs / radiale gliaceller med en palisade nukleart form ved den apikale side. På den anden side vil den primitive kortikale plade indeholder rigelige TUJ1-positive neuroner på den basale side, rumligt adskilte fra den apikale side (figur 1E). Vigtigere, bør TUJ1-positive neuroner ikke ses ved den apikale side af VZ.
(figur 1F og G) 23,24. Når der er tilstrækkelig arg ekspansion er nået, neurogenese begynder, de delende celler ændre deres orientering mod hulrummet, og divisionen plan skifter fra vandret (symmetrisk) til lodret (asymmetrisk) 4, 12, 24.
Figur 1: Generering af Brain organoider fra humane iPS Cells. (A) Workflow af differentieringen protokol. Trin 1: Start af differentiering. I denne fase, dannelsen af neurosfærer fra humane iPSCs i en plade med 96 brønde forekommer. Den tid varighed er 5 dage. Trin 2: Integrering neurosfærerne i EHS matrix dråber. En stationær suspensionskultur af EHS matrix-indlejrede neurosfærer har en varighed på 4 dage. Trin 3: organoider i spinnerkolber. Overførsel af EHS matrix-indlejrede neurosfærer at spinnerkolber finder sted. Den tid varighed er 14 dage. (B) En neurosfære i en multi-brønds plade. Repræsentativt billede af en neurosfære på dag 4 i en 96-brønds plade under trin 1 er vist. Kuglen skal være klart synlig på bunden af brønden, med en glat, rund overflade (rød pilvægt). (C) Morfologi af neurosfærer før EHS matrix indlejring. Neurosfærer opsamlet på dag 5 i trin 1 bør være ensartet i størrelse og vise en glat overflade med en lys rand (beslag og pil). (D) organoider i spinnerkolber. En spinnerkolbe med hjerne organoider under trin 3 (røde pile) er vist her. (E) Immunofluorescens billeddannelse af cryosectioned organoider udviser en typisk VZ og primitiv cortical plade. Det venstre panel viser den nukleare farvning af celler på VZ. VZ spænder fra den apikale side (lumen L) til det basale side (gul linje). Bemærk, at celler i VZ display palisade-lignende kerner, hvilket antyder, at de er radiale glialceller. Højre panel viser immunfluorescerende farvning af nestin-positive NPCs (grøn) i VZ og TUJ1-positive neuroner (magenta) i primitive kortikale plade. Målestok = 50 um. (F) Immunofluorescens billeddannelse af cryosectioned organoider. To eksempleraf VZs farvet med p-Vim og Arl13b (I og III). Regionerne markeret med hvide firkanter er forstørret til højre for hvert billede indpresningsdybde (ii og iv). Opdelingen plan anafase apikale radiale glialceller (args). Opdeling apikale radiale glialceller på den apikale side af VZ er p-Vim-positive (magenta). Eksempler på symmetrisk delende argS er vist (hvide firkanter og mellemværker). Opdelingen flyet er givet som en hvid streg. Opdelingen plan en anafase celle er vandret på lumen overflade linie (gul stiplet linie) og er præget af Arl13b farvning (grøn). Målestok = 50 um. (G) Denne skematiske tilvejebringer lodret eller vandret orientering af args i anafase i forhold til hulrummet. De delende celler af kontrol organoider på dag 14 er for det meste horisontalt orienteret (0-30 °) i forhold til hulrummet overflade VZ. Den apikale side af hulrummet er foret med den primære cilier af argS, som specificerer lumen overflade VZ (grøn linje). I kontrast, MOSt af de radiale gliaceller af mikrocephali organoider vise en lodret orienteret (60-90 °) division plan. Den hvide linie viser akse division plan. Klik her for at se en større version af dette tal.
| Problem: | Mulige årsager: | Forslag: |
| Trin 1.1.1.2 | Dårlig effektivitet omprogrammering | Tjek hiPSCs til pluripotensmarkør: hvis kvaliteten er lav, manuelt vælge udifferentierede kolonier for få passager til at berige pluripotente kolonier |
| Humane iPSCs differentiere før start af differentiering | ||
| Stress på grund af tidlig passage eller passaging som enkeltceller | Må ikke passage før 80% sammenflydning er nået. Passage som aggregater, ikke enkeltceller | |
| Forurening med mycoplasma | Test for mycoplasma forurening | |
| Trin 2 | Dårlig kvalitet af hiPSCs | Forbedre kvaliteten af hiPSCs (se ovenfor) |
| Neurosphærer ikke danner på alle eller falde fra hinanden på dag 5 efter start af differentiering | Begyndende antal celler per brønd er for lav eller for høj | Præcist tælle antallet af celler og distribuere dem ligeligt i hver brønd |
| hiPSC medium blev anvendt i stedet for neural differentiering medium | Bruge neural differentiering medium | |
| Centrifugering skridt var for barsk eller mild | Spin 96 brønde 500 xg i 3 min og kontrollere, om celler akkumuleret centralt påbunden af hver brønd | |
| Ingen Y-27632 i starten af differentiering | Brug Y-27632 at øge cellens overlevelse | |
| Celler bundet og voksede i bunden af pladen | Sørg for, at en ikke-klæbende 96 brønde v-bundplade bruges. | |
| Trin 2 | Ingen daglige medium forandring | Skift halv mængde medium daglig |
| Neurosphærer er ikke homogene i størrelse | Start antal celler per brønd ikke var lig | Bland rør med enkelt cellesuspension hver gang før udtagning af 100 pi cellesuspension |
| Medium ændring blev ikke gjort for hver brønd daglig | Sørg for, at hver brønd får medium forandring dagligt | |
| Trin 2 | hiPSC blev ikke dissocierede into enkelte celler før starten af differentiering | Kontroller under lup, hvis hiPSC er dissocieret til enkelte celler efter Accutase behandling. Hvis der stadig er aggregater, pipette celler 10 gange op og ned med 100 pi mikropipette og tjek igen eller gentage Accutase behandling |
| Neurosphærer ikke vise en lys kant eller runding de danner store cyster ved overfladen | Start antal celler pr var for høj | Præcist tælle antallet af celler og distribuere dem ligeligt i hver brønd |
| Medium ændring blev ikke gjort dagligt i hver brønd | Skift halvdelen mediet daglige | |
| trin 2.7 | Dårlig kvalitet af hiPSCs | Forbedre kvaliteten af hiPSCs (se ovenfor) |
| EHS matrix indlejrede neurosfærer klæbe og klumpe sammen | Ikke nok medium (volumen) | Giv enmindst 10 ml medium i en 100 mm petriskål |
| Hylde af inkubator ikke engang | Placer fadet på en jævn overflade | |
| Efter at have placeret i kuvøse, flytte fadet, så neurosfærer fordeles jævnt |
Tabel 1: Fejlfindingstabel.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
MCPH er en kompleks human neurologisk lidelse, der ikke kan rekapituleres i dyremodeller in vivo eller in simpel human cellekultur nærmer in vitro. Den kliniske manifestation af MCPH begynder at dukke op i løbet af første trimester, når tidligt neurogenese begynder. Således 3D hjernen organoider repræsenterer et pålideligt eksperimentelt system til at modellere MCPH udvikling. Desuden 3D menneskelige hjerne organoider er en ideel fremgangsmåde, da i) de tillader tilpasning af et spektrum af patientprøver med forskellige genetiske baggrunde, ii) de udviser organiseret væv indeholdende forskellige neurale celletyper, og, vigtigere, iii) diverse differentiering stadier af nervesystemets i denne in vitro fremgangsmåde er knyttet til deres in vivo modstykker 25, 26, 27. For eksempel er den neurale roset er en ækvivalent struktur til den udviklende neuralerør.
Lancaster et al. anvendes to gange antallet af patientens iPSCs sammenlignet for at kontrollere iPSCs for at lykkes i at generere patient organoider. Notatet med protokollen beskrevet her, ved at ændre de eksisterende metoder, kunne vi skabe kontrol og mikrocephali hjerne organoider startende fra de samme celleantal 4. Dette var muligt på grund af de definerede dyrkningsbetingelser for iPSCs og grundet en mere rettet differentiering. I denne protokol blev organoide generation forbedres ved at erstatte den almindeligt udførte EB formation trin ved at initiere neural differentiering direkte fra iPSCs. For det andet, i trin 3, dorsomorphin og SB431542 blev suppleret i dyrkningsmediet i stedet for retinsyre alene. Retinsyre let isomeriseres ved påføring på cellekulturmedium 28. Derfor dets biologiske aktivitet er mindre defineret end mere stabile forbindelser såsom dorsomorphin. Dorsomorphin hæmmerden BMP4 signalvej og SB431542 er en inhibitor af activin / nodal signalvej (TGF-β1 ALK-inhibitor). En kombination af begge forbindelser fører til hæmning af BMP og activin / nodal signalvej, inducerer neural differentiering, og reducerer differentiering til andre slægter i forskellige cellelinier fra humane ES eller humane iPS-celler med en lignende effektivitet 29. Forbindelse stabilitet og universel celle respons til en forbindelse er vigtige punkter for oprettelse af en protokol, der kan anvendes på forskellige patientgrupper cellelinier at modellere en sygdom in vitro. Således en robust og effektiv differentiering påfører homogen hjerne organoide kulturer og i sidste ende, i mere reproducerbare data.
Med disse modifikationer, er kritiske trin i protokollen minimeret til indledningen af differentiering i trin 1. På dette tidspunkt er det vigtigt at forsigtigt dissociere iPSCs i en enkelt-cellesuspension ennd at distribuere dem nøjagtigt og jævnt til hver brønd af 96-brønds plade. Rho-associeret protein kinase inhibitor (Y-27632) skal lægges til medium B i de første 24 timer, da den understøtter overlevelsen af iPSCs på deres dissociation til enkeltceller. Det er vigtigt at bringe cellerne i tæt kontakt med hinanden ved at dreje dem ned til bunden af brøndene. Når neurosfærer dannet ved enden af trin 1, kan der forventes en vellykket gennemførelse af yderligere eksperimentelle procedurer. I tilfælde neurosfærer ikke danner, pluripotensen af de humane iPSCs, skal kontrolleres den manglende overholdelse af cellerne i 96-brønds plade, og centrifugeringen betingelser. Hele proceduren på dag 0 af trin 1 bør ikke tage længere end 1 time på grund af følsomheden af de menneskelige iPSCs. Medium ændringer i løbet af de følgende dage skal gøres omhyggeligt, undgå stejle kræfter, for ikke at ødelægge nyligt fremstillede celle kontakter mellem cellerne.
Det er bemærkelsesværdigt, at centrosomal mutanter har defekt celleproliferation og ændrede celle-cyklus dynamik. Således modellering MCPH kræver en stærk protokol, som kan modstå de kompromitterede cellulære funktioner. Derfor er den nuværende protokol muliggør frembringelsen af homogene organoider af høj kvalitet og fungerer som et unikt værktøj til at studere stamceller homeostase på VZ. I modsætning til andre protokoller, denne protokol muliggør dannelsen af organoider fra kontrol og patient iPSCs, startende med lige celleantal. For undersøgelser baseret på in vitro-differentiering, identiske dyrkningsbetingelser for forskellige iPSCs er et grundlæggende krav for at identificere sygdomsrelaterede ændringer og undgå kultur-tilstand artefakter. Udover modellering microcephaly af genetisk oprindelse, kan denne protokol også anvendes til mikrocefali af ikke-genetisk oprindelse, herunder fra neurotrofiske virusinfektioner, kemikalier eller stråling. 30 Hertil kommer, moderne molekylærbiologiske værktøjer, såsom CRISPR / Cas9 genom-editing teknologier, kan anvendes på 3D-organoider at dissekere specifikke aspekter af den menneskelige hjerne udvikling paradigme in vitro 31, 32, 33.
På den anden side har den generation af hjernen organoider til dato stadig ikke gået ud over den første og tidlig andet trimester af den menneskelige udvikling 34. Overgår denne begrænsning og muliggøre dannelsen af modne hjerne organoider in vitro ville åbne nye veje til at modellere neurodegenerative lidelser, der manifesterer på senere stadier, såsom Parkinsons eller Alzheimers sygdom. For fremtidige ansøgninger, protokoller dirigere differentiering til flere områder, ligesom forhjernen eller midthjernen, kunne være af interesse at undersøge komplekse neurologiske lidelser som autisme og skizofreni 35, 36, 37, 38.
Vigtigt er det, skal der tages visse aspekter i betragtning, når der drages konklusioner fra organoide studier. Den første begrænsning er, at der ikke er nogen indlysende vaskularisering i organoider. Således, gasudveksling og næringsstoffer in vitro kun tilnærme in vivo betingelser. Sekund, da hjernen organoider ikke er tilsluttet komplekse organsystemer, mangler det organoide model en komplet immun, metaboliske og hormonelle system. Ikke desto mindre er fraværet af disse aspekter giver nogle gange en fordel. For eksempel kunne de her beskrevne organoider erstatte immunsupprimerede in vivo modeller, når man behandler virkningen af immunsystemet i patogenesen af hjernesygdomme.
Med brugen af spinnerkolber, kan genereres et stort antal organoider til biokemiske eksperimenter, hele transkriptom sekventeringsanalyse, og high-throughput drug screeninger. Tilsammen med usynge denne nuværende protokol, kan man danne hjernen organoider fra humane iPSCs-celler, som derefter kan anvendes i en bred vifte af anvendelser, fra sygdomsmodeller til drug test platforme, for at pålideligt erstatte dyreforsøg i fremtiden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Dette arbejde blev støttet af Fritz Thyssen Foundation (Az.10.14.2.152). Vi takker til vævet indlejring facilitet og mikroskopet kerne facilitet i CMMC. Vi er taknemmelige for de diskussioner og teknisk support, som medlemmerne af Laboratoriet for centrosomreplikation og Cytoskeleton Biologi. Vi takker Li Ming Gooi for korrekturlæsning af manuskriptet.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Anti-mouse 488 | Invitrogen | A-11001 | Goat anti-Mouse IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 |
| Anti-rabbit 647 | Invitrogen | A-21245 | Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 647 |
| Arl13b | proteintech | 17711-1-AP | ARL13B rabbit polyclonal antibody |
| CELLSPIN system | IBS Integra Bioscience | 183001 | |
| DAPI | Sigma-Aldrich, US | 32670 | 4′,6-Diamidino-2-phenylindole dihydrochloride; multiple suppliers |
| DMEM/F-12 | Gibco, US | 31331093 | Dulbecco's Modified Eagle Medium: Nutrient Mixture F-12 |
| Dorsomorphin | Sigma-Aldrich, US | P5499 | Compound C; multiple suppliers |
| Embedding medium | AppliChem | A9011, 0100 | Mowiol; embedding medium; multiple suppliers |
| Engelbreth-Holm-Swarm (EHS) matrix | Corning | 354277 | Matrigel hESC-qualified matrix; important: hESC qualified |
| Fish gelatin | Sigma-Aldrich, US | G7765-250ML | Gelatin from cold water fish skin; multiple suppliers; autoclave after adding to PBS to dissolve and sterilize, store at 4 °C |
| Glycine | AppliChem | A1067,1000 | Glycine for molecular biology; multiple suppliers |
| Inoculation loop with needle, disposable (1 µL) | Sigma Aldrich, US | BR452201-1000EA | multiple suppliers |
| Insulin | Sigma-Aldrich, US | I3536-100MG | multiple suppliers |
| L-glutamine | Gibco, US | 25030081 | L-glutamine (200 mM) |
| Medium A | Stem cell technologies | #05850 | mTeSR1 (hiPSC medium) |
| Medium B | Stem cell technologies | #05835 | Neural induction medium (NIM); neural differentiation medium |
| Medium C | Gibco, US | 21103049 | Neural Basal Medium |
| MEM | Gibco, US | 11140035 | MEM non-essential amino acids solution (100x) |
| MycoAlert Mycoplasma Detection Kit | Lonza, Switzerland | #LT07-218 | Mycoplasma detection kit; multiple suppliers |
| Nestin | Novus biologicals | NBP1-92717 | Nestin mouse monoclonal antibody (4D11) |
| Paraformaldehyde (PFA) | AppliChem | A3813, 0500 | 4% in PBS, store solution at -20 °C; caution: wear skin and eye protection and work under hood |
| PBS tablets | Gibco, US | 18912014 | See manufacturer´s instructions; multiple suppliers |
| Penicillin-Streptomycin (10.000 U/mL) | Gibco, US | 15140122 | Multiple suppliers |
| Poly-L-lysine solution (PLL) | Sigma-Aldrich, US | P8920-100ML | Multiple suppliers |
| pVim | MBL | D076-3S | Phospho-Vimentin (Ser55) mAb |
| Reagent A | Stem cell technologies | # 05872 | Note to Protocol 1.1.1.2; ReLSR (Enzyme-free human ES and iPS cell selection and passaging reagent); please follow manufactorer´s protocol; alternative products from muliple suppliers available |
| Reagent B | Sigma-Aldrich, US | A6964-100ML | Accutase solution is an enzymatic solution for single cell dissociation; multiple suppliers; protocol 1.1.2 "enzymatic cell dissociation solution” |
| Research Cryostat Leica CM3050 S | Leica biosystems | CM3050 S | Multiple suppliers |
| SB431542 | Selleckchem.com | S1067 | Multiple suppliers |
| Spinner flask 250 mL | IBS Integra Bioscience | 182026 | |
| Sucrose | AppliChem | A4734, 1000 | Multiple suppliers |
| Superfrost ultra plus microscope slides | Thermo scientific, US | J3800AMNZ | Slides should be labeled with a "+" and positively charged |
| Supplement 1 | Gibco, US | 17502048 | N-2 supplement (100x) |
| Supplement 2 w/o Vitamin A | Gibco, US | 12587010 | B-27 supplement (50x), minus vitamin A; multiple suppliers |
| Tissue-Tek Cryomold | Sakura, NL | 4565 | Multiple suppliers |
| Tissue-Tek O.C.T. compound | Sakura, NL | 4583 | Multiple suppliers |
| Triton X-100 | AppliChem | A1388,0500 | Multiple suppliers |
| TUJ1 | Sigma-Aldrich, US | T2200 | β-Tubulin III (rabbit polyclonal) |
| TUNEL assay | Promega, US | G3250 | DeadEnd Fluorometric TUNEL system; multiple suppliers |
| Tween 20 for molecular biology | AppliChem | A4974,0500 | Multiple suppliers |
| waterproof sheet | BEMIS company, inc. | PM996 | Parafilm “M”; multiple suppliers |
| Y-27632 | Selleckchem.com | S1049 | ROCK-inhibitor (Y-27632 2HCL); multiple suppliers |
| β-mercaptoethanol | Gibco, US | 31350010 | 2-mercaptoethanol (50 mM); multiple suppliers |
References
- Lancaster, M. A., et al. Cerebral organoids model human brain development and microcephaly. Nature. 501, 373-379 (2013).
- Eiraku, M., Sasai, Y. Mouse embryonic stem cell culture for generation of three-dimensional retinal and cortical tissues. Nat Protoc. 7, 69-79 (2012).
- Nakano, T., et al. Self-formation of optic cups and storable stratified neural retina from human ESCs. Cell Stem Cell. 10, 771-785 (2012).
- Gabriel, E., et al. CPAP promotes timely cilium disassembly to maintain neural progenitor pool. EMBO J. 35 (8), 803-819 (2016).
- Al-Dosari, M. S., Shaheen, R., Colak, D., Alkuraya, F. S. Novel CENPJ mutation causes Seckel syndrome. J Med Genet. 47, 411-414 (2010).
- Wollnik, B. A common mechanism for microcephaly. Nat Genet. 42, 923-924 (2010).
- Thornton, G. K., Woods, C. G. Primary microcephaly: do all roads lead to Rome? Trends Genet. 25, 501-510 (2009).
- Barbelanne, M., Tsang, W. Y. Molecular and cellular basis of autosomal recessive primary microcephaly. Biomed Res Int. 2014, 547986 (2014).
- Homem, C. C., Repic, M., Knoblich, J. A. Proliferation control in neural stem and progenitor cells. Nat. Rev. Neurosci. 16, 647-659 (2015).
- Gabriel, E., et al. CPAP promotes timely cilium disassembly to maintain neural progenitor pool. EMBO J. 35, 803-819 (2016).
- Mak, S. K., et al. Small molecules greatly improve conversion of human-induced pluripotent stem cells to the neuronal lineage. Stem Cells Int. , (2012).
- Morizane, A., Doi, D., Kikuchi, T., Nishimura, K., Takahashi, J. Small-molecule inhibitors of bone morphogenic protein and activin/nodal signals promote highly efficient neural induction from human pluripotent stem cells. J. Neurosci. Res. 89, 117-126 (2011).
- Shi, Y., Kirwan, P., Livesey, F. J. Directed differentiation of human pluripotent stem cells to cerebral cortex neurons and neural networks. Nat Protoc. 7, 1836-1846 (2012).
- Zhou, J., et al. High-efficiency induction of neural conversion in human ESCs and human induced pluripotent stem cells with a single chemical inhibitor of transforming growth factor beta superfamily receptors. Stem Cells. 28, 1741-1750 (2010).
- Takahashi, K., et al. Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors. Cell. 131, 861-872 (2007).
- Okita, K., et al. A more efficient method to generate integration-free human iPS cells. Nat Methods. 8, 409-412 (2011).
- Yu, J., et al. Human induced pluripotent stem cells free of vector and transgene sequences. Science. 324, 797-801 (2009).
- Lieu, P. T., Fontes, A., Vemuri, M. C., Macarthur, C. C. Generation of induced pluripotent stem cells with CytoTune, a non-integrating Sendai virus. Methods Mol. Biol. 997, 45-56 (2013).
- Bai, Q., et al. Temporal analysis of genome alterations induced by single-cell passaging in human embryonic stem cells. Stem Cells Dev. 24, 653-662 (2015).
- Garitaonandia, I., et al. Increased risk of genetic and epigenetic instability in human embryonic stem cells associated with specific culture conditions. PLoS One. 10, e0118307 (2015).
- Ohnuma, K., et al. Enzyme-free passage of human pluripotent stem cells by controlling divalent cations. Sci. Rep. 4, 4646 (2014).
- Currle, D. S., Monuki, E. S. Flash freezing and cryosectioning E12.5 mouse brain. J Vis Exp. , (2007).
- Yingling, J., et al. Neuroepithelial stem cell proliferation requires LIS1 for precise spindle orientation and symmetric division. Cell. 132, 474-486 (2008).
- Rakic, P. A small step for the cell, a giant leap for mankind: a hypothesis of neocortical expansion during evolution. Trends Neurosci. 18, 383-388 (1995).
- Hu, B. Y., et al. Neural differentiation of human induced pluripotent stem cells follows developmental principles but with variable potency. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 107, 4335-4340 (2010).
- Wilson, P. G., Stice, S. S. Development and differentiation of neural rosettes derived from human embryonic stem cells. Stem Cell Reviews. 2, 67-77 (2006).
- Dhara, S. K., Stice, S. L. Neural differentiation of human embryonic stem cells. J. Cell Biochem. 105, 633-640 (2008).
- Christie, V. B., et al. Synthesis and evaluation of synthetic retinoid derivatives as inducers of stem cell differentiation. Org Biomol Chem. 6, 3497-3507 (2008).
- Kim, D. S., et al. Robust enhancement of neural differentiation from human ES and iPS cells regardless of their innate difference in differentiation propensity. Stem Cell Reviews. 6, 270-281 (2010).
- Gabriel, E., et al. Recent Zika Virus Isolates Induce Premature Differentiation of Neural Progenitors in Human Brain Organoids. Cell stem cell. , (2017).
- Wu, J., Hunt, S. D., Xue, H., Liu, Y., Darabi, R. Generation and Characterization of a MYF5 Reporter Human iPS Cell Line Using CRISPR/Cas9 Mediated Homologous Recombination. Sci. Rep. 6, 18759 (2016).
- Li, H. L., Gee, P., Ishida, K., Hotta, A. Efficient genomic correction methods in human iPS cells using CRISPR-Cas9 system. Methods. 101, 27-35 (2016).
- Grobarczyk, B., Franco, B., Hanon, K., Malgrange, B. Generation of Isogenic Human iPS Cell Line Precisely Corrected by Genome Editing Using the CRISPR/Cas9 System. Stem Cell Reviews. 11, 774-787 (2015).
- Camp, J. G., et al. Human cerebral organoids recapitulate gene expression programs of fetal neocortex development. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 112, 15672-15677 (2015).
- Qian, X., et al. Brain-Region-Specific Organoids Using Mini-bioreactors for Modeling ZIKV Exposure. Cell. 165, 1238-1254 (2016).
- Jo, J., et al. Midbrain-like Organoids from Human Pluripotent Stem Cells Contain Functional Dopaminergic and Neuromelanin-Producing Neurons. Cell Stem Cell. 19, 248-257 (2016).
- Mariani, J., et al. FOXG1-Dependent Dysregulation of GABA/Glutamate Neuron Differentiation in Autism Spectrum Disorders. Cell. 162, 375-390 (2015).
- D'Avanzo, C., et al. Alzheimer's in 3D culture: challenges and perspectives. Bioessays. 37, 1139-1148 (2015).
