Introduction
Menselijke neurologische stoornissen, zoals microcefalie, kan slechts slecht worden bestudeerd in diermodellen vanwege het feit dat de menselijke hersenen een verlengd corticale oppervlak, een unieke eigenschap die verschilt van niet-humane dieren.
Dit aspect maakt de ontwikkeling van menselijke hersenen een complex proces dat niet voldoende kan worden onderzocht in een 2D in vitro celcultuur. Opkomst 3D kweektechnieken kan de vorming van weefselachtige organoids van geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPSCs). De in vitro differentiatie van pluripotente stamcellen in een 3D suspensiekweek maakt de vorming van verschillende celtypen tijdig en regiospecifieke wijze, hetgeen leidt tot een georganiseerde, gelaagd weefsel 1, 2, 3. Met dank aan laboratoria die 3D-cultuur technologieën pionier en gedemystificeerd de complexiteit van de formatie orgel, uitgaande van stamcellen,ontwikkelden we een robuuste werkwijze voor het genereren hersenen organoids vroege gebeurtenissen van ontwikkeling van menselijke hersenen af te bakenen en microcefalie model in vitro 1, 2, 3. Het is opmerkelijk dat we pasten de originele methode ontwikkeld door Lancaster et al. cerebrale organoids 1 genereren. Deze werkwijze werd gemodificeerd volgens onze experimentele eisen.
Het doel van een studie van Gabriel et al. was om de cellulaire en moleculaire mechanismen van neurale stamcellen onderhoud te analyseren tijdens de ontwikkeling van de hersenen. Om dit te doen, werd een mechanistische onderzoek uitgevoerd door het analyseren van neurale progenitorcellen (NPC) in 3D hersenen organoids afgeleid van een microcefalie patiënt 4. Deze patiënt had een mutatie in CPAP, een geconserveerd centrosomal proteïne noodzakelijk voor centrosome biogenese 5. Een algemeen aanvaard hypostelling is dat microcefalie is het gevolg van een afname van het NPC pool en dit zou te wijten ofwel celdood of differentiatie voortijdige 1, 6, 7, 8, 9.
Door het analyseren van de ventriculaire zone (VZS) van microcefalie hersenen organoids werd aangetoond dat een aanzienlijk aantal NPC ondergaan asymmetrische celdeling, anders dan de hersenen organoids verkregen uit een gezonde donor 4. Uitgebreide microscopische en biochemische analyses van microcefalie hersenen organoids onthulde een onverwachte rol voor de CPAP in tijdig cilia demontage 4. Specifiek wordt gemuteerd CPAP gekoppeld aan achtergebleven cilium demontage en vertraagde celcyclus opnieuw binnenkomen, wat leidt tot voortijdige differentiatie van NPC 4. Deze resultaten suggereren een rol voor cilia in microcefalie en thEIR betrokkenheid tijdens de neurogenese en de omvang van de hersenen controle 10.
Het eerste deel van dit protocol is een beschrijving van een drietrapsmethode homogene hersenen organoids genereren. Zoals eerder vermeld, is de oorspronkelijke Lancaster protocol aangepast en gemodificeerd om ons doel passen 1. Eerst, menselijke iPSCs gekweekt in een gedefinieerde toestand als feeder-on Engelbreth-Holm-Swarm (EHS) matrix. Deze stap vermijdt de variaties van feeder-afhankelijke pluripotente stamcel cultures. In dit protocol, het induceren van neuronale differentiatie onder vorming neurale epitheel begint direct vanuit iPSCs. Sla de embryoiden lichaam (EB) vormingsstap, het neurale differentiatie verloopt in een gecontroleerde en gerichte wijze. Deze aanpak beperkt de spontane en ongestuurde vorming van andere kiemcellen lagen, zoals mesoderm en endoderm. Door toepassing van dit protocol kunnen neurosferen die neurale rozetten worden geoogst op dag 5 EHS matrix inbedden en stationaire suspensiekweek. De organoïde medium dat voor de derde stap van ons protocol is aangevuld met dorsomorphin en SB431542. Dorsomorphin is een klein molecuul remmer van botmorfogeenproteïne (BMP) en SB431542 remt de TGF / activine / nodale signaalroute. De combinatie van deze factoren kunnen neurale differentiatie efficiënter dan retinezuur alleen 11, 12, 13, 14 te bevorderen.
In totaal hebben deze modificaties maken de reproduceerbare vorming van hersenen organoids met minimale verschillen tussen organoids. Belangrijk is dat deze werkwijze toegepast op robuuste genereren microcefalie hersenen organoids van patiënt iPSCs die mutaties dragen in genen die centrosomes en celcyclus dynamica beïnvloeden.
Het tweede deel van dit protocol geeft instructies aan br voorbereidingain organoids voor de analyse en interpretatie van de cellulaire defecten in microcefalie. Dit omvat fixatie, cryosectioning, immunofluorescentie kleuring en confocale microscopische analyse. Dit protocol zal de lezer te voorzien van een gedetailleerde beschrijving van de verwachte resultaten en onder begeleiding voor interpretatie.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Generatie van Brain Organoids (23 dagen)
- Initiatie van neuroectoderm (5 dagen)
OPMERKING: De volgende punten moeten worden overwogen vóór het begin van differentiatie. Herprogrammering methode (lentiviral-, sendai-virus, episomal- of microRNA-gebaseerde etc.) aan humane iPSCs verkrijgen idealiter hetzelfde voor alle patiënten en controle iPSC lijnen. Verschillende herprogrammering kits en instructies op basis van gepubliceerde protocollen beschikbaar 15, 16, 17, 18. De kwaliteit van het menselijk iPSC lijnen is de sleutel voor de realisatie van een optimale differentiatie. Bewaken kolonie celmorfologie met een microscoop en bevestig pluripotentie door het testen van de expressie van merkers zoals Oct3 / 4, Nanog of TRA-1-60.- Humane iPSCs onder feeder-vrije omstandigheden in een medium op een schotel bekleed met Engelbreth-Holm-Swarm(EHS) matrix.
OPMERKING: Grow menselijk iPSCs feeder-vrij en serum-vrij om een bepaalde cultuur conditie te houden en om een extra stap voor de verwijdering van muis embryonale feeder-cellen (MEF) voor de start van differentiatie te voorkomen. Het optimale aantal passages menselijke iPSCs differentiatie varieert gaan van doorgang 15 bij herprogrammering de doorgang 70 in totaal. Bij doorkweken, los iPSC koloniën cellen aggregeren gebruikmaking van een geschikte cel losraken oplossing met een lage spanning en een 2-mL serologische pipet aggregaten naar een nieuwe schaal. Vermijd dissociatie tot enkele cellen, als deze differentiatie en apoptose kan induceren in de meeste iPSC lijnen. Er werd gemeld dat op lange termijn, single-cell passage kon genomische veranderingen in de menselijke iPSCs 19, 20 te verhogen. Voorkomen loslaten van cellen te maken die een centrifugatiestap nodig losraken oplossing te verwijderen, omdat dit de levensvatbaarheid van iPSCs vermindert. Testalle culturen voor microbiële verontreinigingen, in het bijzonder mycoplasma, op regelmatige basis, omdat dit zou de kwaliteit van de iPSCs en hun differentiatie capaciteit te veranderen.- Coat een 60 mm weefselkweek schotel met EHS matrix volgens de instructies van de fabrikant.
- Dooi een hoeveelheid van 1 x 10 6 menselijke iPSCs. Het zaad iPSCs in een 60 mm weefselkweekplaat bekleed EHS matrix en die 5 ml medium A (zie tabel Materials). Verander het medium dagelijks en passage na 5 tot 7 dagen wanneer de cellen bereiken ~ 80% confluentie.
OPMERKING: Passage de ontdooide iPSCs bij 80% confluentie onder toepassing van standaardwerkwijzen, zoals de enzymvrije losmaken van kolonies 21, ten minste eenmaal voordat de differentiatie. Kortom verwijderen iPSC medium, was de cellen eenmaal met voorverwarmd 37 ° C Dulbecco's gemodificeerd Eagle's medium: Nutrient Mixture F12 (DMEM / F12), en incubeer de iPSCs na de fabrikantinstructies gebruiken reagens A (zie materialen tabel). Niet meer dan de aanbevolen incubatietijd om dissociatie om enkele cellen te voorkomen. Human iPSCs moet worden losgemaakt en drijvende als aggregaten, niet als afzonderlijke cellen. Zij kunnen vervolgens worden overgebracht naar nieuwe EHS-matrix beklede schalen; bijvoorbeeld iPSC aggregaten van een 60-mm plaat kan worden verdeeld 4 nieuwe 60-mm schaaltjes. - Controleer of er mycoplasma met een mycoplasma detectie kit volgens de instructies van de fabrikant. Gebruik alleen mycoplasmavrij iPSCs, zoals mycoplasma de differentiatie vermogen van iPSCs kan veranderen.
- Dissociëren iPSCs (80% confluent) en bereiden een eencellige suspensie gebruikt reagens B.
- Was de iPSCs eenmaal met voorverwarmde (37 ° C) DMEM / F12.
- Add voorverwarmde reagens B (bijvoorbeeld 1 ml in een 60 mm schaal) en incubeer de iPSCs gedurende 5 minuten bij 37 ° C en 5% CO2.
- Flick 20 keer met een vinger aan de zijkant en onderkant vande schotel naar de iPSCs los. Controleer voor het losmaken van de cellen onder de microscoop.
- Pipetteer de celsuspensie op en neer in de schaal 5 maal met 1 ml micropipet.
- Voeg 3 ml medium A verdund 1 ml reagens B en verzamel de celsuspensie in een 15 ml centrifugebuis.
- Voorzichtig spin down de iPSCs (500 xg) gedurende 4 minuten bij kamertemperatuur geroerd.
- Resuspendeer de celpellet in 1 ml medium B en tel het aantal cellen met een hemocytometer.
LET OP: Wees je bewust van het gebruik van alleen medium B voor resuspensie. Vermijd het gebruik medium A, omdat een te hoge concentraties van bFGF, die differentiatie kunnen remmen bevat.
- Verdun de celsuspensie tot 4,5 x 10 5 cellen per ml in medium B aangevuld met 10 pM rho-associated protein kinase inhibitor (Y-27632).
- Voeg 100 ul per putje in een niet-hechtende, v-bodem 96-well plaat.
OPMERKING: Zorg ervoor dat de cellen worden gelijk verdeeld in de suspensioen door schudden van de buis iedere keer voor het afsluiten van 100 ul porties. Het is belangrijk dat elke well een equivalent aantal cellen om neurosferen homogeen in grootte en vorm (rond, gedefinieerd oppervlakken) te verkrijgen moet bevatten. - Voorzichtig spin down de plaat met de cellen bij 500 xg en kamertemperatuur gedurende 3 min en incubeer bij 37 ° C en 5% CO2.
- Verander het medium dagelijks door het verwijderen van 50 ui en het toevoegen van 50 ul vers medium B in elk putje voor de komende 5 dagen.
- Humane iPSCs onder feeder-vrije omstandigheden in een medium op een schotel bekleed met Engelbreth-Holm-Swarm(EHS) matrix.
2. Embedding Neurosferen in EHS Matrix (4 dagen)
- Bereid neurosfeer medium door mengen van de volgende: 1: 1 mengsel van DMEM / F12 en middelgrote C (v / v), 1: 200 (v / v) supplement 1, 1: 100 (v / v) supplement 2 zonder (w / o) Vitamine A, 1: 100 L-glutamine, 0,05 mM niet-essentiële aminozuren (MEM), 100 U / ml penicilline, 100 ug / ml streptomycine, 1,6 g / l insuline, en 0,05 mM β-mercaptoethanol.
- Verzamel de neurospheres witha 200 pl micropipet met gebruik van een tip mm ~ 2 werd gesneden met een steriele schaar.
- Plaats de neurosferen ongeveer 5 mm afstand van elkaar op paraffinefilm (3 x 3 cm2) in een lege 100 mm schaal en verwijder zoveel mogelijk van de resterende medium mogelijk.
- Voeg een druppel (7 uL) van EHS matrix op elke afzonderlijke neurosfeer.
- Incubeer de EHS matrix druppels met de neurosferen gedurende 15 minuten in een incubator.
- Was de neurospheres voorzichtig uit de paraffine film door hen te spoelen met neurosphere medium. Te spoelen, gebruik dan een 1 ml micropipet en een nieuwe 100 mm petrischaal met 10 ml neurosphere medium.
- Incubeer de neurospheres de komende 4 dagen en voeg 2 ml vers neurosphere medium op dag 2.
OPMERKING: Zorg ervoor dat de schappen in de incubator zijn plat, zodat de EHS-matrix ingebed neurosferen niet samen aan een zijde van de schaal zal klonteren.
3. Organoids in een roterende SuspensionKweek (14 dagen)
- Bereid hersenen organoïde medium door mengen van de volgende: 1: 1 mengsel van DMEM / F12 en middelgrote C (v / v), 1: 200 (v / v) supplement 1, 1: 100 (v / v) supplement 2 w / o vitamine A, 1: 100 L-glutamine, 0,05 mM MEM, 100 U / ml penicilline, 100 ug / ml streptomycine, 1,6 g / l insuline, 0,5 pM dorsomorphin, 5 uM SB431542 en 0,05 mM β-mercaptoethanol.
- Voeg 100 mL van hersenen organoïde medium aan elk centrifugekolf door de zijarmen en plaats ze in een incubator voorverwarmen gedurende ten minste 20 min.
- Opzetten van een programma roeren bij 25 rpm volgens de instructies van de fabrikant.
LET OP: Voor het uitvoeren van de EHS-matrix ingebed neurospheres in spinner-flessen, zorg ervoor dat ze allemaal van elkaar gescheiden. Als twee of meer zijn via EHS matrix scheiden door het snijden van de verbindende matrix met een scalpel. - Breng voorzichtig de EHS-matrix ingebed neurosferen in spinner kolven die 100 ml medium organoïde onsing 2 mL serologische pipet. Met de zijarmen van de centrifugekolf de neurosferen te zetten in de kolf.
- Plaats de spinner kolven op een platform magnetisch roeren in een incubator bij 37 ° C en 5% CO2; dit is dag 0 van de organoïde cultuur.
- Verander het medium een keer per week (of vaker als er een kleurverandering) door het verwijderen van de helft van het medium en het toevoegen van dezelfde hoeveelheid verse medium.
OPMERKING: Bij het nemen van de spinner kolven uit de incubator, wacht 3-5 minuten te laten de organoids zinken naar de bodem van de kolf. Verwijder het medium door het plaatsen van het glas pipetpunt (verbonden met een pomp) op het oppervlak van de vloeistof; Zuig het medium voorzichtig door een zijopening / arm van de kolf. Deze manipulaties worden uitgevoerd onder laminaire afzuigkap.
4. Analyse van Brain Organoids
- Fixatie van organoids
- Verzamel de organoids op dag 14 van de centrifugekolf cultuur with a cut 1 ml micropipet (cut ~ 5 mm). Zet allemaal in een 60 mm schaal en wassen eenmaal met 5 ml warm DMEM / F12 gedurende 3 min.
- Bereid een 1,5 ml buis met 500 ui warm 4% paraformaldehyde (PFA).
Let op: Draag huid en oogbescherming en werken onder een beschermkap bij het hanteren van PFA fixeermiddel. - Plaats elke organoïde afzonderlijk in elke buis en bevestig ze gedurende ten minste 30 minuten bij kamertemperatuur geroerd. Laat de organoids niet vast te stellen voor langer dan 60 min. De organoids verplaatsen gebruikt een entoog of andere bedenken dat handig.
- Verwijder de PFA en spoel de vaste organoids tweemaal gedurende 10 min elk 1 ml PBS.
- Bewaar het organoids in 1 ml PBS bij 4 ° C gedurende maximaal 7 dagen, tot verder gebruik.
- Inbedden van de organoids voor cryosectioning
- Verwijder de PBS en voeg 1 ml 30% sucrose in gedestilleerd water oplossing per tube naar organoids voor hen cryofreezing dehydrateren; na toevoeging Sucrose oplossing moet de organoids worden aan het wateroppervlak. Bewaar het organoids overnacht in sucroseoplossing bij 4 ° C; de volgende dag zou de organoids beneden gezonken naar de bodem van de buis.
LET OP: Organoids kan worden opgeslagen voor maximaal 3-5 dagen bij 4 ° C in sucrose oplossing, indien nodig. - Vul een vinyl exemplaar mal met 400 pl optimale snijtemperatuur (OCT) verbinding en gebruik een entoog een organoïde in het middelpunt van de matrijs. Label de rand van de vorm met de naam sample.
- Bevries de organoïde-bevattende vorm bij -80 ° C tot cryosectioning.
- Coat glas cryoslides met 0,1% poly-L-lysine-oplossing (PLL) in PBS gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur en de objectglaasjes laat drogen gedurende 3 uur. Bewaar de dia's bij 4 ° C en warm ze tot kamer gematigd voor gebruik.
OPMERKING: PLL-coating is een belangrijke stap, omdat het voorkomt dat de organoïde plakjes wegdrijven. Verzameld en opgeslagen PLL oplossing bij 4 ° C gedurende maximaal 3maanden. Voor hergebruik, filteren met een 0,22-um spuit en laat het warm tot kamertemperatuur. - Sectie cryofrozen organoids in 20-50 urn dikke plakjes op PLL-beklede glazen cryoslides 22. Laat de dia's met de secties drogen gedurende 1 uur bij kamertemperatuur geroerd. Bewaar de secties bij -80 ° C tot verdere verwerking.
- Verwijder de PBS en voeg 1 ml 30% sucrose in gedestilleerd water oplossing per tube naar organoids voor hen cryofreezing dehydrateren; na toevoeging Sucrose oplossing moet de organoids worden aan het wateroppervlak. Bewaar het organoids overnacht in sucroseoplossing bij 4 ° C; de volgende dag zou de organoids beneden gezonken naar de bodem van de buis.
5. Immunofluorescentie kleuring van secties organoïde
LET OP: Voor de algemene karakterisering van organoids, kleuring met nestin, een neurale marker, en TUJ1, een pan-neuronale marker, wordt aanbevolen. Als verdere voorbeelden, immunofluorescentiekleuring met fosfo-vimentine (p-Vim), die mitotische apicale radiale gliacellen labels en Arl13b voor cilium, worden beschreven. Om apoptose te testen, gebruik maken van de Terminal (TdT) dUTP Nick-End Labeling (TUNEL) assay. Plaats de dia's in een plastic doos tijdens de incubaties om ze te beschermen tegen stof, licht,en uitdroging.
- Ontdooi de objectglaasjes gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur geroerd.
- Was de glaasjes tweemaal met 200 pi PBS-glycine (0,225 g glycine in PBS) gedurende 3 minuten om de PFA-geïnduceerde autofluorescentie doven.
- Permeabel de secties met 200 pl 0,5% Triton X100 / 0,1% Tween in PBS gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur.
- Was ze tweemaal met 200 pi PBS-glycine gedurende 3 min.
- Incubeer ze met 200 pl 0,5% visgelatine / 0,1% Triton X100 in PBS gedurende 1 uur bij kamertemperatuur of overnacht bij 4 ° C om niet specifieke antigeenbinding te blokkeren.
OPMERKING: Indien een TUNEL assay vereist is, voert de test volgens het protocol van de fabrikant. Begin met de TUNEL-assay voor het uitvoeren van de immunokleuring, aangezien het zou kunnen interfereren met secundaire antilichamen en lessen fluoroforen wanneer achteraf gebruikt. - Verdun de antilichamen in blokkeeroplossing bij de volgende concentraties: nestin, 1: 200; p-Vim, 1: 500; TUJ1, 1: 200;Arl13b, 01:20; en secundaire antilichamen, 1: 1000.
- Incuberen met 200 ui van het eerste primaire antilichaam (bijvoorbeeld nestine) gedurende 1-2 uur bij kamertemperatuur of overnacht bij 4 ° C.
- Was 3 x 3 minuten met 200 pl blokkeeroplossing.
- Verdun de eerste (anti-muizen-488) secundair antilichaam 1: 1000 in blokkerende oplossing en incubeer de slede in 200 uL gedurende 1-2 uur bij kamertemperatuur. Van nu af aan, altijd de dia's te beschermen tegen licht.
- Was 3 x 3 minuten met 200 pl blokkeeroplossing.
- Incuberen met 200 ui van het volgende primaire antilichaam (bijvoorbeeld TUJ1) gedurende 1-2 uur bij kamertemperatuur of overnacht bij 4 ° C.
- Was 3 x 3 minuten met 200 pl blokkeeroplossing.
- Voeg 200 ul van het volgende secundaire antilichaam (anti-konijn 647) gedurende 1-2 uur bij kamertemperatuur.
- Was 3 x 3 min. met 200 pl blokkeeroplossing.
- Voeg 200 ul van 4' , 6-diamino-2-fenylindool (DAPI) bij 30 nM concentration in PBS gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur nucleaire kleuring.
- Was 2 x 3 min met 200 pl blokkeeroplossing.
- Was 1 x 1 min met 200 pl gedestilleerd water en laat de onderdelen drogen gedurende 10-20 minuten, totdat er geen duidelijke water druppel zichtbaar meer.
- Monteer de profielen met inbedding medium. Bewaar ze beschermd tegen licht bij 4 ° C gedurende maximaal enkele weken.
- Ga verder met microscopische analyse op de foto om een overzicht van de organoïde, ventriculaire zone, primitief corticale plaat, en andere gebieden van belang.
- Gebruik een confocale microscoop met een 63x olie objectief en fluorescente filters, gekozen overeenkomstig de fluorescerende kleurstof gemerkte secundaire antilichamen gebruikt 1, 10.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Het genereren van hersenen organoids vereist ten minste drie weken continue kweek (Figuur 1A). Om reproduceerbare resultaten te bereiken, raden wij aan dat de onderzoeker documenteert elke stap en, belangrijker nog, vermijdt eventuele wijzigingen met betrekking tot medium componenten, tijdstippen, en de behandeling cel. Hier geven we een samenvatting van hoe om te evalueren of kritische mijlpalen zijn bereikt om organoids van voldoende kwaliteit aan het eind van het experiment te verkrijgen. De vorming van neurosferen in een 96-putjesplaat moet duidelijk zichtbaar vanaf dag 4 Neurosferen kunnen worden herkend als goed gedefinieerde gebieden op de bodem van elk putje (figuur 1B, stap 1) zijn.
Op dag 5, moet neurosferen worden -500 urn in diameter en bezitten een glad oppervlak, met een heldere rand rond een donker centrum. Het zou mogelijk zijn om neurale rozet-achtige uitgebreid stru al observerenctures op deze heldere rand (figuur 1C begin van stap 2). Als de neurospheres uit elkaar vallen of lijken meer zoals mobiele aggregaten, differentiatie moet niet verder worden voortgezet. Tenslotte moet organoids vergroten en vertonen een vergelijkbare grootte tijdens het differentiatieproces in spinner kolven (figuur 1D, stap 3). Foto storinglijst (tabel 1) voor meer informatie.
De kwaliteit van de dag-14 organoids dient te worden geverifieerd door het licht microscopie. VZS bestaan uit dikke lagen nestine-positieve NPC / radiale gliale cellen met een omheining nucleaire vorm aan de apicale kant. Anderzijds zal de primitieve corticale plaat overvloedige TUJ1-positieve neuronen aan de basale kant, ruimtelijk los van de apicale zijde (figuur 1E) bevatten. Belangrijkste is dat TUJ1-positieve neuronen niet te zien aan de apicale zijde van de VZ.
(figuur 1F en G) 23,24. Wanneer voldoende Arg expansie wordt bereikt, begint neurogenese, de delende cellen veranderen hun oriëntatie op het lumen en het delingsvlak schakelt van horizontale (symmetrisch) verticale (asymmetrische) 4, 12, 24.
Figuur 1: Genereren van menselijke hersenen Organoids van iPS cellen. (A) workflow van het differentiatieprotocol. Stap 1: Start van differentiatie. Tijdens deze fase, de vorming van neurosferen uit menselijke iPSCs in een 96-wells plaat optreedt. De tijdsduur is 5 dagen. Stap 2: Verankering van neurosferen EHS matrix druppels. Een stationaire suspensiekweek van EHS-matrix ingebed neurosferen een tijdsduur van 4 dagen. Stap 3: Organoids in spinner kolven. De overdracht van de EHS-matrix ingebed neurospheres te kolven spinner plaatsvindt. De tijdsduur is 14 dagen. (B) Een neurosphere in een multi-well plaat. Representatief beeld van een neurosfeer op dag 4 in een 96-puts plaat bij stap 1 weergegeven. De bol moet duidelijk zichtbaar op de bodem van de put, met een gladde, ronde oppervlak (rode arrow). (C) Morfologie neurosferen vóór EHS matrix inbedden. Neurosferen verzameld op dag 5 van trap 1 zou sterk in grootte en een glad oppervlak vertonen met een heldere rand (beugel en pijl). (D) Organoids in spinner kolven. Een centrifugekolf met hersen organoids tijdens stap 3 (rode pijl) weergegeven. (E) Immunofluorescente beeldvorming van cryosectioned organoids weergeven van een typische VZ primitieve corticale plaat. Het linkerpaneel toont nucleaire kleuring van cellen op de VZ. De VZ reikt van de apicale zijde (lumen L) aan de basale zijde (gele lijn). Merk op dat cellen in de VZ scherm omheining-achtige nuclei, wat suggereert dat zij radiale gliale cellen. Het rechterpaneel toont de immunofluorescentiekleuring van nestine-positieve NPC (groen) in de VZ en TUJ1-positieve neuronen (magenta) in de primitieve corticale plaat. Schaalstaaf = 50 urn. (F) Immunofluorescente beeldvorming van cryosectioned organoids. twee voorbeeldenvan VZS gekleurd met p-Vim en Arl13b (i en iii). Gekenmerkt door de witte vierkanten gebieden vergroot rechts voor elke afbeelding inzet (ii en iv). Het delingsvlak van anafase apicale radiale gliacellen (argumenten). Delen apicale radiale gliale cellen aan de apicale zijde van de VZ zijn p-Vim-positieve (magenta). Voorbeelden van symmetrisch verdelen argumenten getoond (witte vierkanten en bijvoegsels). De delingsvlak wordt gegeven als een witte lijn. Het delingsvlak van de anafase cel horizontaal aan het lumen mantellijn (gele stippellijn) en wordt gekenmerkt door Arl13b kleuring (groen). Schaalstaaf = 50 urn. (G) Dit schema geeft de verticale of horizontale oriëntatie van argumenten in anafase opzichte van het lumen. De delende cellen van controle organoids op dag 14 meestal horizontaal georiënteerd (0-30 °) ten opzichte van het lumen oppervlak van de VZ. De apicale zijde van het lumen wordt gevoerd door de primaire cilia arg, waarvan het lumen oppervlak van de VZ (groene lijn) specificeren. In contrast, most van de radiale gliale cellen van microcefalie organoids vertonen een verticaal georiënteerd (60-90 °) delingsvlak. De witte lijn geeft de hartlijn van het delingsvlak. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
| Probleem: | Mogelijke redenen: | suggesties: |
| stap 1.1.1.2 | Slechte efficiëntie van herprogrammering | Controleer hiPSCs voor pluripotentie markers: als de kwaliteit laag is, handmatig ongedifferentieerde kolonies plukken voor enkele passages aan pluripotente kolonies te verrijken |
| Human iPSCs differentiëren voor aanvang van differentiatie | ||
| Stress als gevolg van vroege passage of passaging als enkele cellen | Niet passage voor 80% samenvloeiing is bereikt. Passage als aggregaten, geen enkele cellen | |
| Contaminatie met mycoplasma | Test voor mycoplasmabesmetting | |
| Stap 2 | Slechte kwaliteit van hiPSCs | Verbeteren van de kwaliteit van hiPSCs (zie hierboven) |
| Neurosferen vormen geen helemaal of uit elkaar vallen op dag 5 na het begin van de differentiatie | Vanaf aantal cellen per putje te laag of te hoog | Nauwkeurig te tellen het aantal cellen en verspreid ze even in elk putje |
| iPSC medium werd gebruikt in plaats van neurale differentiatiemedium | Gebruik neurale differentiatie medium | |
| Centrifugeren stap was te hard of te zacht | Spin 96-well plaat 500 xg gedurende 3 min en controleer of cellen centraal geaccumuleerd opbodem van elk putje | |
| Geen Y-27632 bij begin van differentiatie | Gebruik Y-27632 om de overleving cel verbeteren | |
| Gehechte cellen en groeide de bodem van de plaat | Ervoor zorgen dat een niet-adherente 96-well V-bodemplaat wordt gebruikt. | |
| Stap 2 | Geen dagelijkse medium verandering | Verander helfthoeveelheid medium dagelijks |
| Neurospheres zijn niet homogeen in omvang | Vanaf aantal cellen per putje was niet gelijk | Meng de buis met enkele celsuspensie telkens voor het afsluiten van 100 ui celsuspensie |
| Medium wijziging is nog niet klaar voor elke wel dagelijks | Zorg ervoor dat elk goed krijgt medium verandering dagelijks | |
| Stap 2 | iPSC werden niet los into enkele cellen voorafgaand aan differentiatie | Controleer onder de microscoop als iPSC worden gescheiden om enkele cellen na Accutase. Als er nog steeds aggregaten, pipet cellen 10 maal op en neer met 100 pl micropipet en controleer opnieuw of herhaalde Accutase |
| Neurosferen geen heldere rand of rond oppervlak vertonen; ze vormen grote cysten in het oppervlak | Vanaf aantal cellen per putje te hoog was | Nauwkeurig te tellen het aantal cellen en verspreid ze even in elk putje |
| Medium verandering werd niet dagelijks gedaan voor elk putje | Verander de helft van het medium dagelijkse | |
| stap 2.7 | Slechte kwaliteit van hiPSCs | Verbeteren van de kwaliteit van hiPSCs (zie hierboven) |
| EHS matrix ingebedde neurosferen plakken en samenklonteren | Niet genoeg medium (volume) | Verschaffenminimaal 10 ml medium in een 100 mm petrischaal |
| Plat van incubator niet eens | Plaats de schotel op een vlakke ondergrond | |
| Na het plaatsen in incubator, beweegt de schaal waardoor neurosferen gelijkmatig zijn verdeeld |
Tabel 1: Problemen oplossen In tabel.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
MCPH is een complexe menselijke neurologische aandoening die niet in dierlijke modellen kunnen worden gerecapituleerd in vivo of in eenvoudige menselijke celculturen benaderingen in vitro. De klinische manifestatie van MCPH begint te verschijnen tijdens het eerste trimester, toen de eerste neurogenese begint. Zo 3D hersenen organoids vertegenwoordigen een betrouwbaar experimenteel systeem om MCPH ontwikkelingsmodel. Bovendien 3D menselijke hersenen organoids een ideale benadering omdat i) zij maken de aanpassing van een spectrum van patienten met verschillende genetische achtergronden, ii) het georganiseerde weefsel dat verschillende neurale celtypen vertonen, en, belangrijker nog, iii) verschillende differentiatie stadia van neurologische deze in vitro benadering zijn gekoppeld aan hun tegenhangers in vivo 25, 26, 27. Bijvoorbeeld de neurale rozet een gelijkwaardige constructie aan de ontwikkeling van neuralebuis.
Lancaster et al. gebruikt tweemaal zoveel patiënt iPSCs opzichte iPSCs controleren om te slagen in het genereren patiënt organoids. Van de nota, met de hier beschreven, door aanpassing van de bestaande methoden protocol, we konden controle en microcefalie hersenen organoids vanaf dezelfde cel nummers 4 te genereren. Dit was mogelijk door de gedefinieerde kweekomstandigheden van iPSCs en door een gerichte differentiatie. In dit protocol werd organoïde generatie verbeterd door het vervangen van de algemeen uitgevoerd EB vormingsstap door direct initiëren neurale differentiatie van iPSCs. Ten tweede, in stap 3, dorsomorphin en SB431542 aangevuld in het kweekmedium in plaats van retinoïnezuur alleen. Retinoïnezuur wordt gemakkelijk geïsomeriseerd bij toepassing op celkweekmedium 28. Daarom zijn biologische activiteit minder gedefinieerd dan stabielere verbindingen zoals dorsomorphin. Dorsomorphin remtBMP4 de signaalroute en SB431542 is een remmer van het activine / nodale signaalweg (TGF-β1 ALK remmer). Een combinatie van beide verbindingen tot het remmen van BMP en activine / nodale signaalroute induceert neuronale differentiatie en verlaagt de differentiatie in andere geslachten in verschillende cellijnen van humane of humane ES iPS cellen met een vergelijkbare efficiëntie 29. Verbinding stabiliteit en universele responscel een verbinding gen zijn belangrijk voor het vaststellen van een protocol dat kan worden toegepast op verschillende patiënten cellijnen een ziektemodel in vitro. Dus een robuuste en efficiënte differentiatie leidt tot homogene hersenen organoïde culturen en uiteindelijk meer reproduceerbare data.
Met deze wijzigingen worden kritische stappen in het protocol geminimaliseerd om de initiatie van differentiatie in stap 1. Op dit moment, is het belangrijk om voorzichtig dissociëren de iPSCs in een enkele-celsuspensie and om deze nauwkeurig en gelijkmatig aan elk putje van de plaat met 96 putjes. Rho-associated protein kinase inhibitor (Y-27632) moeten medium B worden toegevoegd tijdens de eerste 24 uur, omdat het overleven van iPSCs steunt op hun dissociatie tot enkele cellen. Het is belangrijk om de cellen in nauw contact met elkaar te brengen door het draaien van hen neer op de bodem van de putten. Zodra neurosferen worden gevormd aan het einde van trap 1, kan de succesvolle voltooiing van verdere experimentele procedures worden verwacht. Indien neurosferen vormen geen de pluripotentie van humane iPSCs, moet de niet-aanhechting van de cellen in de plaat met 96 putjes en centrifugering voorwaarden worden gecontroleerd. De hele procedure op dag 0 van stap 1 mag niet langer dan 1 uur te wijten aan de gevoeligheid van de menselijke iPSCs. Medium veranderingen tijdens de volgende dagen moet zorgvuldig gebeuren, het vermijden van pure krachten, om pas gevormde cel contacten tussen de cellen niet te vernietigen.
Het is opmerkelijk dat centrosomal mutanten defect celproliferatie en veranderde celcyclus dynamiek. Zo, het modelleren MCPH vereist een krachtig protocol dat de gecompromitteerde cellulaire functies kunnen weerstaan. Vandaar dat de huidige protocol maakt het genereren van homogene organoids hoogwaardige en dient als een uniek instrument om stamcellen homeostase studeren aan de VZ. In tegenstelling tot andere protocollen Dit protocol maakt het genereren van organoids van controle en patiënt iPSCs, beginnend met gelijke celaantallen. Voor studies op basis van in vitro differentiatie, identieke kweekomstandigheden voor verschillende iPSCs is een basisvoorwaarde voor ziektegerelateerde veranderingen identificeren en cultuur-toestand artefacten te vermijden. Naast modelleren microcefalie genetisch kan dit protocol ook worden toegepast op microcefalie van niet-genetische oorsprong, met inbegrip van neurotrope virusinfecties, chemicaliën of straling. 30 Bovendien is de moderne moleculaire biologie hulpmiddelen, zoals CRISPR / Cas9 genoom bewerkening technologieën, kan worden toegepast op 3D organoids op specifieke aspecten van het menselijk brein ontwikkelingsparadigma ontleden in vitro 31, 32, 33.
Aan de andere kant heeft de generatie van de hersenen organoids tot op heden nog steeds niet verder gegaan dan de eerste en het begin van het tweede trimester van de menselijke ontwikkeling 34. Het overtreffen van deze beperking en waardoor de generatie van volwassen hersenen organoids in vitro zou nieuwe wegen openen voor neurodegeneratieve aandoeningen die zich manifesteren in latere stadia, zoals Parkinson of de ziekte van Alzheimer te modelleren. Voor toekomstige toepassingen, protocollen regisseren differentiatie meer specifieke gebieden, zoals de voorhersenen en middenhersenen, interessant kunnen zijn om complexe neurologische aandoeningen zoals schizofrenie en autisme 35, 36, 37 bestuderen 38.
Het is belangrijk dat bepaalde aspecten in overweging worden genomen bij het trekken van conclusies uit organoïde studies. De eerste beperking is dat er geen duidelijke vascularisatie in organoids. Aldus gasuitwisseling en voedingsstoffen in vitro slechts bij benadering in vivo omstandigheden. Ten tweede, aangezien hersenen organoids geen verbinding complexe orgaansystemen, de organoïde model mist volledig immuun, metabole en hormonale systeem. Toch is de afwezigheid van deze aspecten biedt soms een voordeel. Zo zou de hier beschreven organoids vervangen immuungesuppresseerde in vivo modellen bij de aanpak van de gevolgen van het immuunsysteem in de pathogenese van hersenaandoeningen.
Met het gebruik van spinner flessen, kan een groot aantal organoids worden gegenereerd voor biochemische experimenten hele transcriptoom sequentieanalyse en high-throughput drug screenings. Samengenomen, door Uzing deze stroom protocol, kan men hersenen organoids iPSCs uit humane cellen, die vervolgens kunnen worden gebruikt in een breed toepassingsgebied, van ziektemodel drug testplatformen, genereren om betrouwbaar te vervangen dierproeven in de toekomst.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Dit werk werd ondersteund door de Fritz Thyssen Foundation (Az.10.14.2.152). We zijn dankbaar voor het weefsel inbedding faciliteit en de microscoop kernfaciliteit van CMMC. We zijn dankbaar voor de besprekingen en technische steun van de leden van het Laboratorium voor centrosome en cytoskelet Biology. Wij danken Li Ming Gooi voor het nalezen van het manuscript.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Anti-mouse 488 | Invitrogen | A-11001 | Goat anti-Mouse IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 |
| Anti-rabbit 647 | Invitrogen | A-21245 | Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 647 |
| Arl13b | proteintech | 17711-1-AP | ARL13B rabbit polyclonal antibody |
| CELLSPIN system | IBS Integra Bioscience | 183001 | |
| DAPI | Sigma-Aldrich, US | 32670 | 4′,6-Diamidino-2-phenylindole dihydrochloride; multiple suppliers |
| DMEM/F-12 | Gibco, US | 31331093 | Dulbecco's Modified Eagle Medium: Nutrient Mixture F-12 |
| Dorsomorphin | Sigma-Aldrich, US | P5499 | Compound C; multiple suppliers |
| Embedding medium | AppliChem | A9011, 0100 | Mowiol; embedding medium; multiple suppliers |
| Engelbreth-Holm-Swarm (EHS) matrix | Corning | 354277 | Matrigel hESC-qualified matrix; important: hESC qualified |
| Fish gelatin | Sigma-Aldrich, US | G7765-250ML | Gelatin from cold water fish skin; multiple suppliers; autoclave after adding to PBS to dissolve and sterilize, store at 4 °C |
| Glycine | AppliChem | A1067,1000 | Glycine for molecular biology; multiple suppliers |
| Inoculation loop with needle, disposable (1 µL) | Sigma Aldrich, US | BR452201-1000EA | multiple suppliers |
| Insulin | Sigma-Aldrich, US | I3536-100MG | multiple suppliers |
| L-glutamine | Gibco, US | 25030081 | L-glutamine (200 mM) |
| Medium A | Stem cell technologies | #05850 | mTeSR1 (hiPSC medium) |
| Medium B | Stem cell technologies | #05835 | Neural induction medium (NIM); neural differentiation medium |
| Medium C | Gibco, US | 21103049 | Neural Basal Medium |
| MEM | Gibco, US | 11140035 | MEM non-essential amino acids solution (100x) |
| MycoAlert Mycoplasma Detection Kit | Lonza, Switzerland | #LT07-218 | Mycoplasma detection kit; multiple suppliers |
| Nestin | Novus biologicals | NBP1-92717 | Nestin mouse monoclonal antibody (4D11) |
| Paraformaldehyde (PFA) | AppliChem | A3813, 0500 | 4% in PBS, store solution at -20 °C; caution: wear skin and eye protection and work under hood |
| PBS tablets | Gibco, US | 18912014 | See manufacturer´s instructions; multiple suppliers |
| Penicillin-Streptomycin (10.000 U/mL) | Gibco, US | 15140122 | Multiple suppliers |
| Poly-L-lysine solution (PLL) | Sigma-Aldrich, US | P8920-100ML | Multiple suppliers |
| pVim | MBL | D076-3S | Phospho-Vimentin (Ser55) mAb |
| Reagent A | Stem cell technologies | # 05872 | Note to Protocol 1.1.1.2; ReLSR (Enzyme-free human ES and iPS cell selection and passaging reagent); please follow manufactorer´s protocol; alternative products from muliple suppliers available |
| Reagent B | Sigma-Aldrich, US | A6964-100ML | Accutase solution is an enzymatic solution for single cell dissociation; multiple suppliers; protocol 1.1.2 "enzymatic cell dissociation solution” |
| Research Cryostat Leica CM3050 S | Leica biosystems | CM3050 S | Multiple suppliers |
| SB431542 | Selleckchem.com | S1067 | Multiple suppliers |
| Spinner flask 250 mL | IBS Integra Bioscience | 182026 | |
| Sucrose | AppliChem | A4734, 1000 | Multiple suppliers |
| Superfrost ultra plus microscope slides | Thermo scientific, US | J3800AMNZ | Slides should be labeled with a "+" and positively charged |
| Supplement 1 | Gibco, US | 17502048 | N-2 supplement (100x) |
| Supplement 2 w/o Vitamin A | Gibco, US | 12587010 | B-27 supplement (50x), minus vitamin A; multiple suppliers |
| Tissue-Tek Cryomold | Sakura, NL | 4565 | Multiple suppliers |
| Tissue-Tek O.C.T. compound | Sakura, NL | 4583 | Multiple suppliers |
| Triton X-100 | AppliChem | A1388,0500 | Multiple suppliers |
| TUJ1 | Sigma-Aldrich, US | T2200 | β-Tubulin III (rabbit polyclonal) |
| TUNEL assay | Promega, US | G3250 | DeadEnd Fluorometric TUNEL system; multiple suppliers |
| Tween 20 for molecular biology | AppliChem | A4974,0500 | Multiple suppliers |
| waterproof sheet | BEMIS company, inc. | PM996 | Parafilm “M”; multiple suppliers |
| Y-27632 | Selleckchem.com | S1049 | ROCK-inhibitor (Y-27632 2HCL); multiple suppliers |
| β-mercaptoethanol | Gibco, US | 31350010 | 2-mercaptoethanol (50 mM); multiple suppliers |
References
- Lancaster, M. A., et al. Cerebral organoids model human brain development and microcephaly. Nature. 501, 373-379 (2013).
- Eiraku, M., Sasai, Y. Mouse embryonic stem cell culture for generation of three-dimensional retinal and cortical tissues. Nat Protoc. 7, 69-79 (2012).
- Nakano, T., et al. Self-formation of optic cups and storable stratified neural retina from human ESCs. Cell Stem Cell. 10, 771-785 (2012).
- Gabriel, E., et al. CPAP promotes timely cilium disassembly to maintain neural progenitor pool. EMBO J. 35 (8), 803-819 (2016).
- Al-Dosari, M. S., Shaheen, R., Colak, D., Alkuraya, F. S. Novel CENPJ mutation causes Seckel syndrome. J Med Genet. 47, 411-414 (2010).
- Wollnik, B. A common mechanism for microcephaly. Nat Genet. 42, 923-924 (2010).
- Thornton, G. K., Woods, C. G. Primary microcephaly: do all roads lead to Rome? Trends Genet. 25, 501-510 (2009).
- Barbelanne, M., Tsang, W. Y. Molecular and cellular basis of autosomal recessive primary microcephaly. Biomed Res Int. 2014, 547986 (2014).
- Homem, C. C., Repic, M., Knoblich, J. A. Proliferation control in neural stem and progenitor cells. Nat. Rev. Neurosci. 16, 647-659 (2015).
- Gabriel, E., et al. CPAP promotes timely cilium disassembly to maintain neural progenitor pool. EMBO J. 35, 803-819 (2016).
- Mak, S. K., et al. Small molecules greatly improve conversion of human-induced pluripotent stem cells to the neuronal lineage. Stem Cells Int. , (2012).
- Morizane, A., Doi, D., Kikuchi, T., Nishimura, K., Takahashi, J. Small-molecule inhibitors of bone morphogenic protein and activin/nodal signals promote highly efficient neural induction from human pluripotent stem cells. J. Neurosci. Res. 89, 117-126 (2011).
- Shi, Y., Kirwan, P., Livesey, F. J. Directed differentiation of human pluripotent stem cells to cerebral cortex neurons and neural networks. Nat Protoc. 7, 1836-1846 (2012).
- Zhou, J., et al. High-efficiency induction of neural conversion in human ESCs and human induced pluripotent stem cells with a single chemical inhibitor of transforming growth factor beta superfamily receptors. Stem Cells. 28, 1741-1750 (2010).
- Takahashi, K., et al. Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors. Cell. 131, 861-872 (2007).
- Okita, K., et al. A more efficient method to generate integration-free human iPS cells. Nat Methods. 8, 409-412 (2011).
- Yu, J., et al. Human induced pluripotent stem cells free of vector and transgene sequences. Science. 324, 797-801 (2009).
- Lieu, P. T., Fontes, A., Vemuri, M. C., Macarthur, C. C. Generation of induced pluripotent stem cells with CytoTune, a non-integrating Sendai virus. Methods Mol. Biol. 997, 45-56 (2013).
- Bai, Q., et al. Temporal analysis of genome alterations induced by single-cell passaging in human embryonic stem cells. Stem Cells Dev. 24, 653-662 (2015).
- Garitaonandia, I., et al. Increased risk of genetic and epigenetic instability in human embryonic stem cells associated with specific culture conditions. PLoS One. 10, e0118307 (2015).
- Ohnuma, K., et al. Enzyme-free passage of human pluripotent stem cells by controlling divalent cations. Sci. Rep. 4, 4646 (2014).
- Currle, D. S., Monuki, E. S. Flash freezing and cryosectioning E12.5 mouse brain. J Vis Exp. , (2007).
- Yingling, J., et al. Neuroepithelial stem cell proliferation requires LIS1 for precise spindle orientation and symmetric division. Cell. 132, 474-486 (2008).
- Rakic, P. A small step for the cell, a giant leap for mankind: a hypothesis of neocortical expansion during evolution. Trends Neurosci. 18, 383-388 (1995).
- Hu, B. Y., et al. Neural differentiation of human induced pluripotent stem cells follows developmental principles but with variable potency. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 107, 4335-4340 (2010).
- Wilson, P. G., Stice, S. S. Development and differentiation of neural rosettes derived from human embryonic stem cells. Stem Cell Reviews. 2, 67-77 (2006).
- Dhara, S. K., Stice, S. L. Neural differentiation of human embryonic stem cells. J. Cell Biochem. 105, 633-640 (2008).
- Christie, V. B., et al. Synthesis and evaluation of synthetic retinoid derivatives as inducers of stem cell differentiation. Org Biomol Chem. 6, 3497-3507 (2008).
- Kim, D. S., et al. Robust enhancement of neural differentiation from human ES and iPS cells regardless of their innate difference in differentiation propensity. Stem Cell Reviews. 6, 270-281 (2010).
- Gabriel, E., et al. Recent Zika Virus Isolates Induce Premature Differentiation of Neural Progenitors in Human Brain Organoids. Cell stem cell. , (2017).
- Wu, J., Hunt, S. D., Xue, H., Liu, Y., Darabi, R. Generation and Characterization of a MYF5 Reporter Human iPS Cell Line Using CRISPR/Cas9 Mediated Homologous Recombination. Sci. Rep. 6, 18759 (2016).
- Li, H. L., Gee, P., Ishida, K., Hotta, A. Efficient genomic correction methods in human iPS cells using CRISPR-Cas9 system. Methods. 101, 27-35 (2016).
- Grobarczyk, B., Franco, B., Hanon, K., Malgrange, B. Generation of Isogenic Human iPS Cell Line Precisely Corrected by Genome Editing Using the CRISPR/Cas9 System. Stem Cell Reviews. 11, 774-787 (2015).
- Camp, J. G., et al. Human cerebral organoids recapitulate gene expression programs of fetal neocortex development. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 112, 15672-15677 (2015).
- Qian, X., et al. Brain-Region-Specific Organoids Using Mini-bioreactors for Modeling ZIKV Exposure. Cell. 165, 1238-1254 (2016).
- Jo, J., et al. Midbrain-like Organoids from Human Pluripotent Stem Cells Contain Functional Dopaminergic and Neuromelanin-Producing Neurons. Cell Stem Cell. 19, 248-257 (2016).
- Mariani, J., et al. FOXG1-Dependent Dysregulation of GABA/Glutamate Neuron Differentiation in Autism Spectrum Disorders. Cell. 162, 375-390 (2015).
- D'Avanzo, C., et al. Alzheimer's in 3D culture: challenges and perspectives. Bioessays. 37, 1139-1148 (2015).
