Introduction
desordens do neurodesenvolvimento, tais como humanos, microcefalia, só pode ser pobremente estudado em modelos animais, devido ao facto de que os cérebros humanos têm uma superfície cortical estendida, uma característica única que difere a partir de animais não-humanos.
Este aspecto torna o desenvolvimento do cérebro humano de um processo complexo que não pode ser suficientemente estudado num 2D, no sistema de cultura de células in vitro. Emergentes técnicas de cultura 3D permitem a geração de Organóides de tecido semelhante a partir de células estaminais pluripotentes induzidas (IPSCs). A diferenciação in vitro de células estaminais pluripotentes numa cultura em suspensão em 3D permite a formação de vários tipos de células de uma maneira atempada e específico de região, dando origem a, um tecido organizado estratificada 1, 2, 3. Graças a laboratórios que foram pioneiros tecnologias de cultura 3D e desmistificadas a complexidade da formação de órgãos, começando a partir de células estaminais,foi desenvolvido um método robusto de gerar Organóides cerebrais para delinear eventos precoces do desenvolvimento do cérebro humano e para modelar microcefalia in vitro 1, 2, 3. É digno de nota que nós adaptamos o método original desenvolvido por Lancaster et al. para gerar Organóides cerebrais 1. Este método foi modificado de acordo com as necessidades experimentais.
O objectivo de um estudo de Gabriel et al. foi analisar os mecanismos celulares e moleculares da manutenção de células estaminais neurais durante o desenvolvimento do cérebro. A fim de fazer isso, um estudo mecanicista foi realizada através da análise de células progenitoras neurais (NPCs) em Organóides cerebrais 3D derivadas de um paciente microcefalia 4. Este paciente levou uma mutação em CPAP, uma proteína conservada centrosomal necessário para a biogénese centrossoma 5. Uma hipoglicemia amplamente aceitotese é que microcefalia é o resultado de um esgotamento do pool de NPC, e isto pode ser devido tanto a morte celular ou a diferenciação precoce 1, 6, 7, 8, 9.
Ao analisar as zonas ventriculares (vzs) de Organóides cerebrais microcefalia, mostrou-se que um número significativo de NPCs sofrem divisão celular assimétrica, ao contrário Organóides cerebrais derivadas de um dador saudável 4. Análises microscópicas e bioquímicas extensas de Organóides cerebrais microcéfalos revelou um papel inesperado para CPAP em cílios oportuna desmontagem 4. Especificamente, CPAP mutado está associada com a desmontagem cílio retardado e a re-entrada do ciclo celular retardada, levando à diferenciação precoce de NPCs 4. Estes resultados sugerem um papel para cílios em microcefalia e thenvolvimento eir durante a neurogênese e tamanho do cérebro de controle 10.
A primeira parte deste protocolo é uma descrição de um método de três passos para gerar Organóides cerebrais homogéneas. Como mencionado anteriormente, o protocolo Lancaster original foi adaptado e modificado para se adequar a uma finalidade. Em primeiro lugar, iPSCs humanos são cultivados num estado livre de alimentador definido em Engelbreth-Holm-Swarm (EHS) matriz. Este passo evita as variações de culturas de culas estaminais pluripotentes dependente de alimentação. Neste protocolo, a indução de diferenciação neuronal para formar epitélio neural começa directamente a partir iPSCs. Por saltando a etapa de formação de corpos embrióides (EB), os rendimentos de diferenciação neuronais de uma maneira mais controlada e orientada. Esta abordagem limita a formação espontânea e não-dirigida de outras camadas de células germinais, tal como mesoderme e endoderme. Ao aplicar este protocolo, neuroesferas contendo rosetas neurais podem ser colhidas no dia 5 para EHS incorporação matriz e cultura de suspensão estacionária. O meio utilizado para o organóide terceiro passo do nosso protocolo é suplementado com dorsomorphin e SB431542. Dorsomorphin é um inibidor de molécula pequena de proteína morfogénica do osso (BMP), e SB431542 inibe a via do TGFp / activina / nodal sinalização. A combinação destes factores poderia promover a diferenciação neuronal de forma mais eficiente do que o ácido retinóico sozinho 11, 12, 13, 14.
Em conjunto, estas alterações permitem que a geração reprodutível de Organóides cerebrais, com variações mínimas através Organóides. Importante, este método foi aplicado para gerar robustamente Organóides cerebrais microcéfalos de iPSCs paciente, que transportam mutaes nos genes que afectem centrossomas e dinâmica do ciclo celular.
A segunda parte deste protocolo dá instruções para preparar brain Organóides para a análise e interpretação dos defeitos celulares em microcefalia. Isto inclui a fixação, cryosectioning, coloração de imunofluorescência, e análise microscópica confocal. Este protocolo irá fornecer ao leitor uma descrição detalhada dos resultados previstos e com orientação para interpretação.
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Protocol
1. Geração de Cérebro Organóides (23 dias)
- Iniciação de neuroectoderme (5 dias)
Nota: Os seguintes pontos devem ser considerados antes do início da diferenciação. O método de reprogramação (lentiviral- etc, à base de microARN Sendai-a vírus, episomal-, OR) para obter iPSCs humanos devem, idealmente, ser o mesmo para todos os pacientes e controlar linhas IPSC. Vários kits de reprogramação e instruções baseadas em protocolos publicados estão disponíveis 15, 16, 17, 18. A qualidade das linhas de IPSC humanos é a chave para realizar uma diferenciação óptima. Monitorar colónia e morfologia das células com um microscópio e validar pluripotência, testando a expressão de marcadores, tais como OCT3 / 4, Nanog, ou TRA-1-60.- iPSCs cultura humanos sob condições isentas de alimentação em meio A em um prato revestido com Engelbreth-Holm-Swarm(EHS) matriz.
NOTA: Cresça iPSCs humanos e para manter uma condição de cultura definido e para evitar um passo adicional para a remoção de células de alimentação de rato embrionários (MEFs) antes do início da diferenciação sem soro livre de alimentador. O número de passagem óptima para iPSCs humanos para iniciar gamas de diferenciação a partir da passagem 15 em cima de reprogramação a passagem 70, no total. Quando passaging, separar colónias hiPSC como células agregação utilizando uma solução de separação celular apropriado com baixo esforço mecânico e uma pipeta serológica 2-mL para transferir agregados a um novo prato. Evitar a dissociação de células individuais, como este pode induzir a diferenciação e apoptose na maioria das linhas IPSC. Foi relatado que a longo prazo, a passagem de célula única poderiam aumentar alterações genómicas em iPSCs humano 19, 20. Evitar procedimentos de destacamento das células, as quais requerem um passo de centrifugação para remover a solução de desprendimento, pois isso reduz a viabilidade global de iPSCs. Testetodas as culturas para contaminações microbianas, particularmente micoplasma, em uma base regular, pois isso pode alterar a qualidade das iPSCs e sua capacidade de diferenciação.- O revestimento de um tecido 60 milímetros prato de cultura com matriz EHS de acordo com as instruções do fabricante.
- Descongelar uma aliquota de 1 x 10 6 iPSCs humanos. Semear as iPSCs em uma placa de cultura de tecidos de 60 mm revestidas com matriz EHS e contendo 5 mL de meio A (ver a Tabela Materiais). Alterar a forma e diariamente após a passagem de 5 a 7 dias, quando as células atingem ~ 80% de conflucia.
NOTA: Passagem das iPSCs descongeladas a 80% de confluência utilizando métodos padrão, tais como o descolamento isenta de enzima de colónias de 21, pelo menos uma vez antes de iniciar a diferenciação. Em breve, remover o meio CIPS, lave as células uma vez com pré-aquecida até 37 Meio de Eagle Modificado de Dulbecco ° C: Mistura de Nutrientes F12 (DMEM / F12), e incuba-se as iPSCs seguindo o fabricante deinstruções usando o reagente A (ver a tabela de materiais). Não exceda o tempo de incubação recomendado para evitar a dissociação de células individuais. iPSCs humanos deve ser destacado e que flutua na forma de agregados, as células não é tão simples. Eles podem então ser transferidas para novas placas revestidas com matriz de EHS; por exemplo, iPSC agrega a partir de um prato de 60 mm pode ser distribuído a 4 novos pratos de 60 mm. - Verifique para micoplasma com um kit de detecção de micoplasma de acordo com as instruções do fabricante. Use iPSCs única isentos de micoplasma, como micoplasma pode alterar a capacidade de diferenciação iPSCs.
- Dissociar iPSCs (80% confluentes) e preparar uma suspensão de célula única usando o reagente B.
- Lavam-se as iPSCs uma vez com pré-aquecido (37 ° C) de DMEM / F12.
- Adicionar pré-aquecido reagente B (por exemplo, 1 ml de uma placa de 60 mm) e incuba-se as iPSCs durante 5 min a 37 ° C e 5% de CO 2.
- Flick 20 vezes com a ponta dos dedos sobre o lado inferior e deo prato para separar as iPSCs. Entrada para o destacamento de células sob o microscópio.
- Pipetar a suspensão de células para cima e para baixo no prato 5 vezes com uma micropipeta 1 ml.
- Adicionar 3 ml de meio A para diluir 1 mL de reagente B e recolher a suspensão celular num tubo de centrífuga de 15 mL.
- Suavemente girar para baixo as iPSCs (500 xg) durante 4 min temperatura ambiente.
- Ressuspender o sedimento celular em 1 ml de meio B e contar o número de células com um hemocitómetro.
NOTA: Lembre-se de utilizar apenas meio B para a ressuspensão. Evitar o uso de meio A, uma vez que contém uma muito alta concentração de bFGF, que pode inibir a diferenciação.
- Dilui-se a suspensão de células a 4,5 x 10 5 culas por ml em meio B suplementado com 10 ^ M-rho associado inibidor de proteína cinase (Y-27632).
- Adicionar 100 por po de uma forma não-aderente, de fundo em v, placa de 96 poços.
NOTA: Certifique-se as células são igualmente distribuídos no SUSpensão por agitação do tubo de cada vez para retirar porções de 100 uL. É importante que cada cavidade deve conter um número de células equivalente, a fim de obter neuroesferas homogéneas em tamanho e forma (redondos, superfícies definidas). - Suavemente girar para baixo a placa com as células a 500 xg e a temperatura ambiente durante 3 min e incubar a 37 ° C e 5% de CO 2.
- Mudar a forma diariamente através da remoção de 50 mL e adicionar 50 mL de meio fresco B em cada cavidade para os próximos 5 dias.
- iPSCs cultura humanos sob condições isentas de alimentação em meio A em um prato revestido com Engelbreth-Holm-Swarm(EHS) matriz.
2. Incorporação de neuroesferas em EHS Matriz (4 dias)
- Preparar o meio neuroesfera por mistura do seguinte: uma mistura de DMEM / F12 e meio C (v / v), 1:: 200 (v / v) suplemento 1, 1: 1 100 (v / v) suplemento 2 sem (w / o) A vitamina A, 1: 100 de L-glutamina, 0,05 mM de aminoácidos não essenciais (MEM), 100 U / mL de penicilina, 100 ug / ml de estreptomicina, 1,6 g / l de insulina, e mM β-mercaptoetanol 0,05.
- Recolher o wit neurospheresha 200 mL micropipeta com uma ponta ~ 2 milímetros previamente cortado com tesoura estéreis.
- Coloque as neuroesferas aproximadamente 5 mm de distância umas das outras no filme de parafina (3 x 3 cm2) numa placa vazia 100 mm e remover cuidadosamente tanto do meio restante quanto possível.
- Adicionar uma gota (7 uL) de matriz para cada EHS único neuroesfera.
- Incubar a matriz EHS gotas com as neuroesferas durante 15 minutos em uma incubadora.
- Lavam-se as neuroesferas cuidadosamente a partir da película de parafina por rubor-los com meio neuroesfera. Para lavar, usar uma micropipeta 1 ml e um novo 100 milímetros placa de Petri contendo 10 ml de meio de neuroesfera.
- Incubar as neuroesferas para os 4 dias seguintes e adicionar 2 mL de meio fresco neuroesfera no dia 2.
NOTA: Certifique-se de que as prateleiras na incubadora são planas para que os neurospheres incorporado de matriz EHS não vai se aglutinarem em um lado do prato.
3. Organóides numa suspensão rotativaCultura (14 dias)
- Prepare cérebro médio organ�de por mistura do seguinte: uma mistura de DMEM / F12 e meio C (v / v), 1:: 200 (v / v) suplemento 1, 1: 100 (v / v) suplemento de 2 W / o um A vitamina A, 1: 100 de L-glutamina, MEM 0,05 mM, 100 U / mL de penicilina, 100 ug / ml de estreptomicina, 1,6 g / L de insulina, 0,5 uM dorsomorphin, 5 uM SB431542, e mM β-mercaptoetanol 0,05.
- Adicionar 100 mL de cérebro organ�de meio a cada bal rotativo através dos seus braços laterais e colocá-los em uma incubadora para o pré-aquecimento durante pelo menos 20 min.
- Defina-se um programa de agitação a 25 rpm, de acordo com as instruções do fabricante.
NOTA: Antes de transferir os neurospheres incorporado de matriz EHS em frascos spinner, certifique-se que todos eles estão separados. Se dois ou mais estão ligados através da matriz de EHS, separá-los por corte da matriz de ligação com um bisturi. - transferir cuidadosamente as neuroesferas incorporado-matriz EHS em frascos de agitação contendo 100 mL de meio nos organ�deing uma pipeta serológica 2 mL. Utilizar os braços laterais do balão rotativo para transferir as neuroesferas para o balão.
- Colocar os frascos rotativos numa plataforma de agitação magnética numa incubadora a 37 ° C e 5% de CO 2; este é dia 0 da cultura organóides.
- Alterar o meio de uma vez por semana (ou mais frequentemente quando há uma mudança de cor), removendo metade do meio e adicionando a mesma quantidade de meio fresco.
NOTA: Quando tirar os frascos spinner fora da incubadora, espere 3-5 minutos para permitir que os Organóides afundar até o fundo do frasco. Remover o meio, colocando a ponta da pipeta de vidro (ligada a uma bomba) sobre a superfície do líquido; Aspirar o meio cuidadosamente através de uma abertura lateral / braço do balão. Estas manipulações deve ser feito sob a capa laminar.
4. Análise do cérebro Organóides
- Fixação de Organóides
- Recolher os Organóides no dia 14 de cultura o wi bal rotativoth um corte de 1 mL micropipeta (corte a 5 mm). Coloque todos eles em um prato de 60 mm, e lavá-los uma vez com 5 mL de DMEM morno / F12, durante 3 min.
- Preparar um tubo de 1,5 mL com 500 uL de paraformaldeído a quente 4% (PFA).
Cuidado: use pele e proteção para os olhos e trabalhar sob um capuz de segurança ao manusear PFA fixador. - Colocar cada organ�de separadamente em cada tubo e corrigi-los por pelo menos 30 min à temperatura ambiente. Não corrigir os Organóides por mais de 60 min. Para mover os Organóides, utilizar uma ansa de inoculação ou qualquer outro conceber que é conveniente.
- Remover o PFA e lavar os Organóides fixas duas vezes durante 10 minutos cada um com 1 mL de PBS.
- Armazenar os Organóides em 1 ml de PBS a 4 ° C durante até 7 dias, até à sua utilização.
- Incorporar os Organóides para cryosectioning
- Remover o PBS e adicionar 1 ml de sacarose a 30% em solução de água destilada por cada tubo para desidratar os Organóides antes cryofreezing-los; após a adição sucrosolução si, os Organóides deve ser flutuante na superfície. Armazenar os Organóides durante a noite em solução de sacarose a 4 ° C; no dia seguinte, as Organóides deve ter afundado até o fundo do tubo.
NOTA: Organóides pode ser armazenado durante até 3-5 dias a 4 ° C numa solução de sacarose, se necessário. - Encher um molde de espécime de vinilo com 400 uL de temperatura de corte óptima composto (OCT) e utilizar uma ansa de inoculação a colocar um organóide no centro do molde. Rotular o aro do molde com o nome da amostra.
- Congelar o molde contendo organ�de-se a -80 ° C até cryosectioning.
- cryoslides vidro do revestimento com 0,1% de solução de lisina de poli-L-(PLL) em PBS durante 5 min à temperatura ambiente e deixar secar as lâminas durante 3 h. Armazenar os slides a 4 ° C e aquecê-los até temperado ambiente antes do uso.
NOTA: PLL-revestimento é um passo importante, uma vez que irá evitar que as fatias de organ�de flutuando para longe. Recolha e armazenamento da solução de PLL, a 4 ° C durante até 3meses. Antes de reutilização, filtra-se com uma seringa de 0,22 um e deixe aquecer até à temperatura ambiente. - Organóides secção cryofrozen em fatias 20-50 um de espessura em um vidro revestido de PLL-cryoslides 22. Deixe as lâminas com as secções secar durante 1 h à temperatura ambiente. Armazenar as secções a -80 ° C até processamento adicional.
- Remover o PBS e adicionar 1 ml de sacarose a 30% em solução de água destilada por cada tubo para desidratar os Organóides antes cryofreezing-los; após a adição sucrosolução si, os Organóides deve ser flutuante na superfície. Armazenar os Organóides durante a noite em solução de sacarose a 4 ° C; no dia seguinte, as Organóides deve ter afundado até o fundo do tubo.
5. imunofluorescência Coloração de secções organóides
NOTA: Para a caracterização geral de Organóides, coloração com a nestina, um marcador de células progenitoras neurais, e TUJ1, um marcador pan-neuronal, é recomendado. Como exemplos adicionais, a coloração imunofluorescente com fosfo-vimentina (p-Vim), os marcadores de células gliais radiais apicais mitóticos, e Arl13b, para cílio, são descritos. Para testar a apoptose, utilizar o ensaio terminal desoxinucleotidilo transferase (TdT) dUTP Nick-End Rotulagem (TUNEL). Colocar as lâminas em uma caixa de plástico durante as incubações para protegê-los da poeira, luz,e secar.
- Descongelar as lâminas durante 30 minutos à temperatura ambiente.
- Lavar as lâminas duas vezes com 200 ul de PBS-glicina (0,225 g de glicina em PBS) durante 3 minutos para extinguir a autofluorescência induzida PFA.
- Permeabilizar as secções com 200 uL de 0,5% de Triton X100 a 0,1% / tween em solução de PBS durante 10 min à temperatura ambiente.
- Lavar duas vezes com 200 uL de solução de PBS-glicina durante 3 min.
- Incubar deles com 200 uL de 0,5% de gelatina de peixe / 0,1% de Triton X100 em PBS durante 1 h à temperatura ambiente ou durante a noite a 4 ° C para bloquear a ligação não específica de antigénio.
NOTA: Se um ensaio de TUNEL for necessário, realizar o ensaio de acordo com o protocolo do fabricante. Comece com o ensaio TUNEL antes de realizar a imunocoloração, como ele pode interferir com os anticorpos secundários e extinguir fluoróforos quando utilizado posteriormente. - Dilui-se os anticorpos em solução com as seguintes concentrações de bloqueio: nestina, 1: 200; p-Vim, 1: 500; TUJ1, 1: 200;Arl13b, 01:20; e anticorpos secundários, 1: 1.000.
- Incubar com 200 uL do primeiro anticorpo primário (por exemplo, nestina) durante 1-2 h à temperatura ambiente ou durante a noite a 4 ° C.
- Lavar 3 x 3 min com 200 ul de solução de bloqueio.
- Dilui-se a primeira (anti-ratinho 488) Anticorpo secundário 1: 1000 em solução de bloqueio e incubar a corrediça em 200 ul durante 1-2 h à temperatura ambiente. De agora em diante, sempre proteger os slides da luz.
- Lavar 3 x 3 min com 200 ul de solução de bloqueio.
- Incubar com 200 uL do anticorpo primário ao lado (por exemplo, TUJ1) durante 1-2 h à temperatura ambiente ou durante a noite a 4 ° C.
- Lavar 3 x 3 min com 200 ul de solução de bloqueio.
- Adicionar 200 uL da próxima anticorpo secundário (anti-coelho de 647) durante 1-2 h à temperatura ambiente.
- Lavar 3 x 3 min. com 200 ul de solução de bloqueio.
- Adicionar 200 uL de 4' , 6-diamidino-2-fenilindole (DAPI) a uma conc nM 30entration em PBS durante 15 min à temperatura ambiente para coloração nuclear.
- Lavar 2 x 3 min com 200 ul de solução de bloqueio.
- Lavar 1 x 1 min com 200 mL de água destilada e deixar as secções secar durante 10-20 minutos, até que nenhuma gota de água é óbvia visível mais.
- Montar as secções com meio de inclusão. Armazená-los ao abrigo da luz a 4 ° C durante até várias semanas.
- Prosseguir com a análise microscópica para a imagem uma visão geral da zona organóides, ventricular, placa cortical primitiva, e outras áreas de interesse.
- Usar um microscópio confocal com um óleo de 63X filtros objectivos e fluorescentes, escolhido de acordo com os anticorpos secundários etiquetados com corante fluorescente utilizado 1, 10.
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Representative Results
A geração de Organóides cerebrais requer pelo menos três semanas de cultura contínua (Figura 1A). Para conseguir resultados reproduzíveis, recomendamos que o pesquisador documenta cada passo e, sobretudo, evita quaisquer alterações em relação componentes do meio, pontos de tempo e manipulação de célula. Aqui, damos um resumo de como avaliar se marcos críticos são atingidos a fim de obter Organóides de qualidade suficiente no final do experimento. A formação de neuroesferas em uma placa de 96 poços devem ser claramente visível do dia 4. As neuroesferas podem ser reconhecidos como esferas bem definidas na parte inferior de cada cavidade (Figura 1B, passo 1).
No dia 5, as neuroesferas deve ser ~ 500 um de diâmetro e apresentam uma superfície lisa, com um aro circundante brilhante um centro escuro. Pode ser possível já observar neural stru estendidos roseta-likectures dentro deste aro brilhante (Figura 1C, o início da etapa 2). Se os neurospheres desmoronar ou aparecer mais como agregados celulares, diferenciação não deve ser continuado ainda mais. Finalmente, devem aumentar Organóides e apresentam um tamanho semelhante, durante o processo de diferenciação, em frascos rotativos (Figura 1D, o passo 3). Consulte a tabela de resolução de problemas (Tabela 1) para mais informações.
A qualidade do dia-14 Organóides deverá ser verificada por microscopia de luz. Vzs são compostas de camadas espessas de NPCs células gliais nestina-positivas / radiais com uma forma nuclear paliçada no lado apical. Por outro lado, a placa cortical primitiva conterá neurónios Tuj1-positivo abundantes sobre o lado basal, espacialmente distintas do lado apical (Figura 1E). Importante, neurónios TUJ1-positivos não deve ser visto no lado apical da VZ.
(Figura 1F e G) 23,24. Quando a expansão Arg suficiente é atingido, a neurogese começa, as células em divisão alterar a sua orientação para o lúmen, e o plano de divisão muda de horizontal (simétrica) para a vertical (assimétrica) 4, 12, 24.
Figura 1: Geração de Organóides cérebro a partir de células iPS humano. (A) do fluxo de trabalho do protocolo de diferenciação. Passo 1: Início de diferenciação. Durante esta fase, a formação de neuroesferas de iPSCs humanos em uma placa de 96 poços ocorre. O período de tempo é de 5 dias. Passo 2: Incorporação as neuroesferas em gotículas de matriz EHS. Uma cultura de suspensão estacionária de EHS neuroesferas incorporado-matriz tem uma duração de tempo de 4 dias. Passo 3: Organóides em frascos rotativos. A transferência de EHS neurospheres incorporado de matriz para spinner frascos ocorre. O tempo de duração é de 14 dias. (B) Uma neuroesfera em uma placa de multi-cavidades. imagem representativa de uma neuroesfera no dia 4 em uma placa de 96 poços durante o passo 1 é mostrado. A esfera deve ser claramente visível na parte inferior do poço, com uma superfície lisa, redonda (arro vermelhoW). Incorporação da matriz (C) Morfologia de neuroesferas antes de EHS. As neuroesferas recolhidas no dia 5 do passo 1 deve ser uniforme em tamanho e apresentar uma superfície lisa com um aro brilhante (e suporte de seta). (D) Organóides em frascos rotativos. Um balão rotativo com Organóides cerebrais durante o passo 3 (setas vermelhas) é mostrada aqui. (E) imagiologia imunofluorescente de Organóides criosseccionada exibindo um VZ típico e placa cortical primitivo. O painel da esquerda mostra a coloração nuclear de células no VZ. O VZ se estende desde o lado apical (lúmen L) para o lado basal (linha amarela). Note-se que as células dentro dos núcleos de exibição VZ paliçada semelhante, sugerindo que eles são células gliais radiais. O painel da direita mostra a colorao imunofluorescente de NPCs nestina-positivas (verde) no interior da VZ e neurónios TUJ1-positivas (magenta) na placa cortical primitivo. Escala da barra = 50 m. (F) imagiologia imunofluorescente de Organóides criosseccionada. dois exemplosde vzs coradas com P-Vim e Arl13b (I e III). As regiões marcadas por quadrados brancos são ampliados à direita para cada inserção de imagem (II e IV). O plano de divisão das células gliais radiais anafase apical (args). Dividindo células gliais radiais apical para o lado apical da VZ são p-Vim-positivo (magenta). Exemplos para args simetricamente em divisão são mostrados (quadrados brancos e inserções). O plano de divisão é dado como uma linha a branco. O plano de divisão de uma célula anafase é horizontal para a linha de superfície lúmen (linha pontilhada amarelo) e é marcado por coloração Arl13b (verde). Escala da barra = 50 m. (L) Este esquema proporciona a orientação vertical ou horizontal da Args em anafase em relação ao lúmen. As células em divisão de Organóides de controlo no dia 14 estão principalmente orientados horizontalmente (0-30 °) em relação à superfície do lúmen do VZ. O lado apical do lúmen está alinhada pelos cílios primário de Args, que especificam a superfície do lúmen do VZ (linha verde). Em contraste, most das células gliais radiais de Organóides microcefalia exibir um (60-90 °) plano divisão orientada verticalmente. A linha branca mostra o eixo do plano de divisão. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
| Problema: | Razões possíveis: | sugestões: |
| passo 1.1.1.2 | Baixa eficiência de reprogramação | Verifique hiPSCs de marcadores de pluripotência: se a qualidade é baixa, escolher manualmente colônias indiferenciadas para algumas passagens para enriquecer colônias pluripotentes |
| iPSCs humanos diferenciar antes do início da diferenciação | ||
| Estresse devido a passagem precoce ou passaging células como única | Não passagem antes de 80% de confluência é atingido. Passagem como agregados, células não individuais | |
| A contaminação com micoplasma | Teste para a contaminação por micoplasma | |
| Passo 2 | Má qualidade do hiPSCs | Melhorar a qualidade de hiPSCs (veja acima) |
| Neurospheres não formam em todos ou desmoronar no dia 5 após o início da diferenciação | Começando número de células por poço é muito baixa ou muito alta | Com precisão contar o número de células e distribui-los igualmente em cada poço |
| hiPSC meio foi utilizado em vez do meio de diferenciação neural | Use meio de diferenciação neural | |
| etapa de centrifugação foi muito dura ou leve | Rotação placa de 96 poços a 500 xg durante 3 min e verificar se as células acumuladas centralmente nofundo de cada poço | |
| N Y-27632 em início de diferenciação | Use Y-27632 para melhorar a sobrevivência de células | |
| As células cresceram em anexo e na parte inferior da placa | Certifique-se de que uma placa de 96 poços de fundo em v não aderente é usado. | |
| Passo 2 | Nenhuma mudança média diária | Alterar metade da quantidade de média diária |
| Neurospheres não são homogêneas em tamanho | Começando número de células por poço não era igual | Mistura-se o tubo com uma suspensão de célula única de cada vez antes de tomar a suspensão de células de 100 uL |
| mudança Médio não foi feito para cada bem diariamente | Certifique-se de todos os poços fica mudança média diária | |
| Passo 2 | hiPSC não foram dissociadas intS células individuais antes do início da diferenciação | Verifique sob o microscópio se hiPSC são dissociados para células individuais após o tratamento Accutase. Se ainda houver agrega, células de pipeta 10 vezes para cima e para baixo com 100 micropipeta mL e verifique novamente ou repetir Accutase tratamento |
| Neurospheres não exibir uma borda brilhante ou superfície arredondada; eles formam quistos grandes na superfície | Começando número de células por poço era muito alto | Com precisão contar o número de células e distribui-los igualmente em cada poço |
| mudança Médio não foi feito diariamente por cada poço | Alterar metade da diária média | |
| passo 2.7 | Má qualidade do hiPSCs | Melhorar a qualidade de hiPSCs (veja acima) |
| EHS matriz incorporado neurospheres ficar e se aglutinarem | Não médio suficiente (volume) | Providencie ummínimo de 10 mL de meio numa placa de Petri 100 milímetros |
| Prateleira de incubadora nem mesmo | Coloque prato sobre uma superfície uniforme | |
| Depois de colocar na incubadora, movimentar o prato de modo a que as neuroesferas são distribuídos uniformemente |
Tabela 1: Tabela de problemas.
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Discussion
MCPH é um distúrbio neurológico humano complexo que não pode ser recapitulado em modelos animais in vivo, ou em cultura de células humanas simples abordagens in vitro. A manifestação clínica da MCPH começa a aparecer durante o primeiro trimestre, quando no início neurogênese começa. Assim, Organóides cerebrais 3D representam um sistema experimental confiável para modelar desenvolvimento MCPH. Além disso, 3D Organóides cérebro humano são uma abordagem ideal uma vez que i) que permita a adaptação de um espectro de amostras de doentes com vários fundos genéticos, ii) exibir tecido organizado contendo diferentes tipos de células neurais, e, mais importante, iii) vários diferenciação estágios de neurodesenvolvimento nesta abordagem in vitro estão ligados aos seus homólogos in vivo 25, 26, 27. Por exemplo, a roseta neural é uma estrutura equivalente para o desenvolvimento neuraltubo.
Lancaster et al. utilizado o dobro do número de pacientes em comparação iPSCs para controlar iPSCs para ter sucesso na geração Organóides paciente. De notar, com o protocolo descrito aqui, através da modificação dos métodos existentes, que poderia gerar controlo e Organóides cerebrais microcefalia a partir dos mesmos números de células 4. Isto foi possível devido às condições de cultura definidas de iPSCs e devido a uma diferenciação mais dirigida. Neste protocolo, geração organ�de foi melhorada substituindo o passo de formação de EB geralmente realizada por início diferenciação neural directamente a partir iPSCs. Em segundo lugar, no passo 3, e dorsomorphin SB431542 foram suplementadas no meio de cultura em vez de ácido retinóico sozinho. O ácido retinóico é rapidamente isomerizado quando aplicado a meio de cultura celular 28. Portanto, a sua actividade biológica é menos definida do que a de compostos mais estáveis, tais como dorsomorphin. inibe Dorsomorphina via de sinalização BMP4, e SB431542 é um inibidor da via de sinalização de activina / nodal (TGF-β1 ALK inibidor). Uma combinação de ambos os compostos conduz à inibição da BMP e a via de sinalização de activina / nodal, induz a diferenciação neuronal, e reduz a diferenciação em linhagens outros em várias linhas de células ES a partir de humanos ou células iPS humanos com uma eficiência semelhante 29. Composto estabilidade e resposta celular universal para um composto são pontos importantes para o estabelecimento de um protocolo que pode ser aplicado a diferentes linhas de células de doentes para modelar uma doença in vitro. Assim, uma diferenciação robustos e eficientes resultados em cérebro homogénea organ�de culturas e, finalmente, em dados mais reprodutíveis.
Com estas modificações, passos críticos dentro do protocolo são minimizados para o início de diferenciação no passo 1. Neste ponto, é importante para dissociar suavemente as iPSCs em uma única célula de uma suspensãond a distribuí-los uniformemente e com precisão para cada uma das cavidades da placa de 96 poços. inibidor da proteína cinase Rho-associado (Y-27632) deve ser adicionado ao meio B durante as primeiras 24 h, uma vez que suporta a sobrevivência de iPSCs após a sua dissociação de células individuais. É importante para trazer as células em contacto próximo umas com as outras por fiação-los para baixo para o fundo dos poços. Uma vez neuroesferas são formadas no final do passo 1, a conclusão bem sucedida de outros procedimentos experimentais pode ser esperado. No caso de neuroesferas não formam, a pluripotência das iPSCs humanos, a falta de adesão das células na placa de 96 poços, e as condições de centrifugação deve ser verificada. Todo o procedimento no dia 0 do passo 1 não é mais do que 1 h deve tomar devido à sensibilidade de iPSCs humanos. mudanças de meio, durante os dias seguintes deve ser feita cuidadosamente, evitando a forças de corte, de modo a não destruir os contactos de células recentemente formadas entre as células.
Vale ressaltar que centrosomal mutantes têm a proliferação de células defeituoso e dinâmica do ciclo celular alteradas. Assim, modelando MCPH requer um protocolo poderoso que pode suportar as funções celulares comprometidas. Assim, o protocolo de corrente permite a geração de Organóides homogéneas de alta qualidade e serve como uma ferramenta única para estudar a homeostase de células estaminais no VZ. Em contraste com outros protocolos, este protocolo permite a geração de Organóides de controlo e de pacientes iPSCs, começando com o número de células iguais. Para estudos com base na diferenciação in vitro, as condições de cultura idênticas para diferentes iPSCs são um requisito básico para identificar as alterações relacionadas com a doença e para evitar artefactos de cultura de condição. Além de modelar microcefalia de origem genética, este protocolo pode também ser aplicado a microcefalia de origem não-genética, incluindo a partir de infecções virais neurotróficos, produtos químicos ou radiação. 30 Além disso, ferramentas modernas de biologia molecular, tais como CRISPR / cas9 genoma-editaring tecnologias, pode ser aplicado a Organóides 3D para dissecar os aspectos específicos do paradigma desenvolvimento do cérebro humano in vitro 31, 32, 33.
Por outro lado, a geração de Organóides cerebrais para data ainda não foi além do primeiro e início do segundo trimestre de desenvolvimento humano 34. Ultrapassando essa limitação e permitindo a geração de Organóides cerebrais maduras in vitro iria abrir novas vias para modelar doenças neurodegenerativas que se manifestam em fases posteriores, tais como doença de Parkinson ou doença de Alzheimer. Para futuras aplicações, protocolos de dirigir a diferenciação de regiões mais específicos, como o cérebro anterior ou mesencéfalo, pode ser de interesse para o estudo das doenças neurológicas complexos como o autismo e esquizofrenia 35, 36, 37, 38.
Importante, deve ser tomado certos aspectos em consideração ao tirar conclusões a partir de estudos organóides. A primeira limitação é que não há vascularização óbvio em Organóides. Assim, a troca de gases e o fornecimento de nutrientes in vitro aproximarem das condições in vivo. Em segundo lugar, uma vez que Organóides cerebrais não são ligados a sistemas de órgãos complexos, o modelo organóide carece de um imunitário completo, metabólica, e o sistema hormonal. No entanto, a ausência desses aspectos, por vezes, fornece uma vantagem. Por exemplo, os descritos aqui Organóides poderia substituir imunossuprimidos em modelos in vivo, ao abordar o impacto do sistema imune na patogénese de perturbações cerebrais.
Com o uso de frascos com agitador, um grande número de Organóides pode ser gerada para análise, experiências bioquímicas transcriptoma sequenciação inteiro, e exames de drogas de alto rendimento. Tomados em conjunto, por ucantar este protocolo actual, pode-se gerar a partir de células do cérebro Organóides IPSCs humanos, que podem então ser utilizados numa vasta gama de aplicações, desde a modelação de doença para plataformas de teste de drogas, a fim de substituir de forma fiável os testes em animais no futuro.
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Acknowledgments
Este trabalho foi apoiado pela Fundação Fritz Thyssen (Az.10.14.2.152). Somos gratos à facilidade de incorporação do tecido e da instalação do núcleo microscópio de CMMC. Estamos gratos pelas discussões e suporte técnico fornecido pelos membros do Laboratório de centrossoma e citoesqueleto Biology. Agradecemos Li Ming Gooi pela revisão do manuscrito.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Anti-mouse 488 | Invitrogen | A-11001 | Goat anti-Mouse IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 |
| Anti-rabbit 647 | Invitrogen | A-21245 | Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 647 |
| Arl13b | proteintech | 17711-1-AP | ARL13B rabbit polyclonal antibody |
| CELLSPIN system | IBS Integra Bioscience | 183001 | |
| DAPI | Sigma-Aldrich, US | 32670 | 4′,6-Diamidino-2-phenylindole dihydrochloride; multiple suppliers |
| DMEM/F-12 | Gibco, US | 31331093 | Dulbecco's Modified Eagle Medium: Nutrient Mixture F-12 |
| Dorsomorphin | Sigma-Aldrich, US | P5499 | Compound C; multiple suppliers |
| Embedding medium | AppliChem | A9011, 0100 | Mowiol; embedding medium; multiple suppliers |
| Engelbreth-Holm-Swarm (EHS) matrix | Corning | 354277 | Matrigel hESC-qualified matrix; important: hESC qualified |
| Fish gelatin | Sigma-Aldrich, US | G7765-250ML | Gelatin from cold water fish skin; multiple suppliers; autoclave after adding to PBS to dissolve and sterilize, store at 4 °C |
| Glycine | AppliChem | A1067,1000 | Glycine for molecular biology; multiple suppliers |
| Inoculation loop with needle, disposable (1 µL) | Sigma Aldrich, US | BR452201-1000EA | multiple suppliers |
| Insulin | Sigma-Aldrich, US | I3536-100MG | multiple suppliers |
| L-glutamine | Gibco, US | 25030081 | L-glutamine (200 mM) |
| Medium A | Stem cell technologies | #05850 | mTeSR1 (hiPSC medium) |
| Medium B | Stem cell technologies | #05835 | Neural induction medium (NIM); neural differentiation medium |
| Medium C | Gibco, US | 21103049 | Neural Basal Medium |
| MEM | Gibco, US | 11140035 | MEM non-essential amino acids solution (100x) |
| MycoAlert Mycoplasma Detection Kit | Lonza, Switzerland | #LT07-218 | Mycoplasma detection kit; multiple suppliers |
| Nestin | Novus biologicals | NBP1-92717 | Nestin mouse monoclonal antibody (4D11) |
| Paraformaldehyde (PFA) | AppliChem | A3813, 0500 | 4% in PBS, store solution at -20 °C; caution: wear skin and eye protection and work under hood |
| PBS tablets | Gibco, US | 18912014 | See manufacturer´s instructions; multiple suppliers |
| Penicillin-Streptomycin (10.000 U/mL) | Gibco, US | 15140122 | Multiple suppliers |
| Poly-L-lysine solution (PLL) | Sigma-Aldrich, US | P8920-100ML | Multiple suppliers |
| pVim | MBL | D076-3S | Phospho-Vimentin (Ser55) mAb |
| Reagent A | Stem cell technologies | # 05872 | Note to Protocol 1.1.1.2; ReLSR (Enzyme-free human ES and iPS cell selection and passaging reagent); please follow manufactorer´s protocol; alternative products from muliple suppliers available |
| Reagent B | Sigma-Aldrich, US | A6964-100ML | Accutase solution is an enzymatic solution for single cell dissociation; multiple suppliers; protocol 1.1.2 "enzymatic cell dissociation solution” |
| Research Cryostat Leica CM3050 S | Leica biosystems | CM3050 S | Multiple suppliers |
| SB431542 | Selleckchem.com | S1067 | Multiple suppliers |
| Spinner flask 250 mL | IBS Integra Bioscience | 182026 | |
| Sucrose | AppliChem | A4734, 1000 | Multiple suppliers |
| Superfrost ultra plus microscope slides | Thermo scientific, US | J3800AMNZ | Slides should be labeled with a "+" and positively charged |
| Supplement 1 | Gibco, US | 17502048 | N-2 supplement (100x) |
| Supplement 2 w/o Vitamin A | Gibco, US | 12587010 | B-27 supplement (50x), minus vitamin A; multiple suppliers |
| Tissue-Tek Cryomold | Sakura, NL | 4565 | Multiple suppliers |
| Tissue-Tek O.C.T. compound | Sakura, NL | 4583 | Multiple suppliers |
| Triton X-100 | AppliChem | A1388,0500 | Multiple suppliers |
| TUJ1 | Sigma-Aldrich, US | T2200 | β-Tubulin III (rabbit polyclonal) |
| TUNEL assay | Promega, US | G3250 | DeadEnd Fluorometric TUNEL system; multiple suppliers |
| Tween 20 for molecular biology | AppliChem | A4974,0500 | Multiple suppliers |
| waterproof sheet | BEMIS company, inc. | PM996 | Parafilm “M”; multiple suppliers |
| Y-27632 | Selleckchem.com | S1049 | ROCK-inhibitor (Y-27632 2HCL); multiple suppliers |
| β-mercaptoethanol | Gibco, US | 31350010 | 2-mercaptoethanol (50 mM); multiple suppliers |
References
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