Introduction
disturbi dello sviluppo neurologico umana, come la microcefalia, possono essere studiate solo male in modelli animali a causa del fatto che il cervello umano ha una superficie corticale estesa, una caratteristica unica diversa da animali non umani.
Questo aspetto rende lo sviluppo del cervello umano un processo complesso che non può essere studiato sufficientemente in 2D, nel sistema di coltura cellulare in vitro. Emergenti tecniche di coltura 3D consentono la generazione di organoidi tessuto simile da cellule staminali pluripotenti indotte (iPSCs). La differenziazione in vitro di cellule staminali pluripotenti in coltura in sospensione 3D permette la formazione di vari tipi di cellule in un modo tempestivo e regione specifica, dando origine ad un organizzato, tessuto stratificato 1, 2, 3. Grazie a laboratori che pionieri tecnologie di coltura 3D e demistificato la complessità della formazione degli organi, partendo da cellule staminali,abbiamo sviluppato un metodo robusto di generare organoidi cerebrali delineare eventi precoci di sviluppo del cervello umano e modellare microcefalia in vitro 1, 2, 3. È da notare che abbiamo adattato il metodo originale sviluppato da Lancaster et al. generare organoidi cerebrali 1. Questo metodo è stato modificato in base alle nostre esigenze sperimentali.
L'obiettivo di uno studio da Gabriel et al. sia per analizzare i meccanismi cellulari e molecolari della neurale mantenimento delle cellule staminali durante lo sviluppo cerebrale. Per fare questo, uno studio meccanicistico è stato effettuato analizzando le cellule progenitrici neurali (NPC) in organoidi cervello 3D derivate da un paziente microcefalia 4. Questo paziente portava una mutazione in CPAP, una proteina conservata centrosomica richiesto per la biogenesi centrosome 5. Una crisi ipoglicemica ampiamente accettatatesi è che microcefalia è il risultato di una deplezione del pool NPC, e questo potrebbe essere dovuto sia a morte cellulare o alla differenziazione precoce 1, 6, 7, 8, 9.
Analizzando le zone ventricolari (VZS) di organoidi cerebrali microcefalia, è stato dimostrato che un numero significativo di NPC subisce divisione cellulare asimmetrica, a differenza organoidi cerebrali derivate da un donatore sano 4. Ampie analisi microscopiche e biochimiche del cervello organoidi microcefalia hanno rivelato un ruolo inaspettato per CPAP in tempo utile lo smontaggio cilia 4. Specificamente, CPAP mutato è associato ritardato smontaggio cilium e ritardata ciclo cellulare rientro, porta alla differenziazione precoce di NPC 4. Questi risultati suggeriscono un ruolo per cilia in microcefalia e THcoinvolgimento EIR durante la neurogenesi e le dimensioni del cervello di controllo 10.
La prima parte di questo protocollo è una descrizione di un metodo in tre fasi per generare organoidi cerebrali omogenei. Come accennato prima, il protocollo Lancaster originale è stato adattato e modificato per soddisfare il nostro scopo 1. In primo luogo, iPSCs umani sono coltivate in una condizione priva di alimentazione definita sulla matrice Engelbreth-Holm-Swarm (EHS). Questo passaggio evita le variazioni di colture di cellule staminali pluripotenti alimentatore-dipendente. In questo protocollo, l'induzione della differenziazione neurale per formare epitelio neurale parte direttamente dal iPSCs. Saltando la fase di formazione del corpo embrioide (EB), i neurali procede differenziazione in maniera più controllata e diretta. Questo approccio limita la formazione spontanea e non orientato di altri strati di cellule germinali, come mesoderma e endoderma. Applicando questo protocollo, neurosfere contenenti rosette neurali possono essere raccolte il giorno 5 per EHS matrice incorporamento e coltura in sospensione stazionario. Il mezzo organoide utilizzato per il terzo gradino del nostro protocollo è completato con dorsomorphin e SB431542. Dorsomorphin è un inibitore della piccola molecola di proteina morfogenica ossea (BMP), e inibisce la SB431542 / activin / via di segnalazione nodale TGFp. La combinazione di questi fattori potrebbe promuovere la differenziazione neuronale più efficiente rispetto all'acido retinoico solo 11, 12, 13, 14.
Complessivamente, queste modifiche consentono la generazione riproducibile di organoidi cerebrali, con variazioni minime attraverso organoidi. È importante sottolineare che questo metodo è stato applicato per generare robusto organoidi cerebrali microcefalia da iPSCs paziente, che portano le mutazioni nei geni che influiscono centrosomi e dinamiche del ciclo cellulare.
La seconda parte di questo protocollo fornisce le istruzioni per preparare brain organoidi per l'analisi e l'interpretazione dei difetti cellulari in microcefalia. Questo include la fissazione, criosezionamento, colorazione di immunofluorescenza e analisi al microscopio confocale. Questo protocollo fornirà al lettore una descrizione dettagliata dei risultati attesi e con la guida per l'interpretazione.
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Protocol
1. Generazione di Brain organoidi (23 giorni)
- Avvio di neuroectoderma (5 giorni)
Nota: I seguenti punti dovrebbero essere considerati prima dell'inizio della differenziazione. Il metodo riprogrammazione (ecc lentiviral-, basata microRNA Sendai-virus-, episomal-, o) per ottenere iPSCs umani dovrebbe essere idealmente la stessa per tutti i pazienti e controllare linee IPSC. Vari kit e le istruzioni sulla base di protocolli pubblicati riprogrammazione sono disponibili 15, 16, 17, 18. La qualità delle linee IPSC umani è la chiave per realizzare una differenziazione ottimale. Monitorare colonia e la morfologia delle cellule con un microscopio e convalidare pluripotency testando l'espressione di marcatori come Oct3 / 4, Nanog, o TRA-1-60.- iPSCs cultura umani in condizioni di assenza di alimentazione di mezzo A su un piatto rivestito con Engelbreth-Holm-Swarm(EHS) matrice.
NOTA: Grow iPSCs umane e di mantenere una condizione di cultura definita e per evitare un ulteriore passo per la rimozione di cellule feeder embrionali di topo (MEF) prima dell'inizio della differenziazione senza siero privo di alimentatore. Il numero di passaggio ottimale per iPSCs umani per iniziare intervalli differenziazione dal passaggio 15 sulla riprogrammazione del passaggio 70 in totale. Quando passaging, staccare colonie hiPSC come cellule aggregato utilizzando una soluzione distacco cellulare appropriata con ridotte sollecitazioni meccaniche e una pipetta sierologica 2 mL per trasferire aggregati ad un nuovo piatto. Evitare di dissociazione di singole cellule, in quanto questo potrebbe indurre la differenziazione ed apoptosi nelle maggior parte delle linee IPSC. E 'stato riferito che a lungo termine, passaging unicellulare potrebbe aumentare alterazioni genomiche in iPSCs umano 19, 20. Evitare procedure distacco delle cellule, che richiedono una fase di centrifugazione per rimuovere la soluzione distacco, in quanto ciò riduce la vitalità complessiva di iPSCs. Testtutte le culture di contaminazioni microbiche, in particolare micoplasma, su base regolare, poiché questo potrebbe alterare la qualità delle iPSCs e la loro capacità di differenziazione.- Cappotto 60 millimetri di tessuto coltura piatto con matrice EHS secondo le istruzioni del produttore.
- Scongelare un'aliquota di 1 x 10 6 iPSCs umani. Seme i iPSCs in un 60-mm piatto di coltura di tessuto rivestito in matrice EHS e contenente 5 ml di terreno A (vedere la Tabella Materials). Cambiare la media giornaliera e il passaggio dopo 5 a 7 giorni in cui le cellule raggiungono ~ 80% di confluenza.
NOTA: Passaggio le iPSCs scongelati a 80% di confluenza con metodi standard, come il distacco privo di enzimi di colonie 21, almeno una volta prima di iniziare la differenziazione. In breve, rimuovere il terreno COPSI, lavare le cellule una volta con pre-riscaldato 37 mezzo di Eagle modificato di Dulbecco ° C: Nutrient Mixture F12 (DMEM / F12), e incubare i iPSCs seguendo il produttoreistruzioni utilizzando il reagente A (vedere la tabella materiali). Non superare il tempo di incubazione consigliato al fine di evitare la dissociazione di singole cellule. iPSCs umani dovrebbero essere staccati e galleggianti come aggregati, cellule non come singoli. Possono poi essere trasferite in EHS piatti matrici rivestite; per esempio, COPSI aggregati da un piatto di 60 mm può essere distribuito a 4 nuovi piatti 60 mm. - Verificare la presenza di micoplasma con un kit di rilevamento micoplasma secondo le istruzioni del produttore. Utilizzare iPSCs solo libero-Mycoplasma, come micoplasma può alterare la capacità di differenziazione dei iPSCs.
- Dissociare iPSCs (80% confluenti) e preparare una sospensione singola cella utilizzando reagente B.
- Lavare le iPSCs una volta con pre-riscaldato (37 ° C) DMEM / F12.
- Aggiungere preriscaldata reagente B (ad esempio, 1 ml in piastre da 60 mm) e incubare le iPSCs per 5 min a 37 ° C e 5% CO 2.
- Flick 20 volte con un dito sulla parte inferiore eil piatto permette il distacco dei iPSCs. Controllare per il distacco delle cellule sotto il microscopio.
- Pipetta la sospensione cellulare su e giù nel piatto 5 volte con una micropipetta 1 mL.
- Aggiungere 3 ml di terreno A diluire 1 ml di reagente B e raccogliere la sospensione cellulare in una provetta da centrifuga da 15 ml.
- girare con cautela l'iPSCs (500 xg) per 4 minuti a temperatura ambiente.
- Risospendere il pellet di cellule in 1 ml di terreno B e contare il numero di cellule con un emocitometro.
NOTA: Essere consapevoli di utilizzare unico mezzo per B risospensione. Evitare l'uso medio A, in quanto contiene una troppo elevata concentrazione di bFGF, che potrebbe inibire la differenziazione.
- Diluire la sospensione cellulare di 4,5 x 10 5 cellule per ml in terreno B supplementato con 10 pM rho associata inibitore della proteina chinasi (Y-27632).
- Aggiungere 100 microlitri per pozzetto in un non-aderenti, v-bottom, piastra da 96 pozzetti.
NOTA: Assicurarsi che le celle sono equamente distribuiti nel suspensione agitando la provetta ogni volta prima di estrarre porzioni 100 microlitri. È importante che ogni pozzetto deve contenere un numero di cellule equivalente per ottenere neurosfere omogenee in dimensione e forma (tonda, superfici definite). - Girare delicatamente la piastra con le cellule a 500 xg e temperatura ambiente per 3 min e incubare a 37 ° C e 5% CO 2.
- Cambiare la media giornaliera, eliminando 50 microlitri e l'aggiunta di 50 ml di mezzo fresco B in tutti i pozzetti per i prossimi 5 giorni.
- iPSCs cultura umani in condizioni di assenza di alimentazione di mezzo A su un piatto rivestito con Engelbreth-Holm-Swarm(EHS) matrice.
2. Incorporare Neurosfere a EHS Matrix (4 giorni)
- Preparare mezzo neurosfere miscelando il seguente: 1: 1 miscela di DMEM / F12 e media C (v / v), 1: 200 (v / v) integratore 1, 1: 100 (v / v) integratore 2 senza (w / o) La vitamina A, 1: 100 L-glutammina, 0,05 mM aminoacidi non essenziali (MEM), 100 U / ml di penicillina, 100 ug / ml streptomicina, 1,6 g / L di insulina, e 0,05 mM β-mercaptoetanolo.
- Raccogliere il neurosfere ingegnoah 200 microlitri micropipetta con una punta ~ 2 millimetri precedentemente tagliato con forbici sterili.
- Posizionare i neurosfere circa 5 mm distanti sulla pellicola paraffina (3 x 3 cm 2) in un piatto vuoto 100 mm e rimuovere con attenzione tanto del mezzo rimanente come possibile.
- Aggiungere una goccia (7 mL) di matrice EHS su ogni singola neurosfere.
- Incubare la matrice EHS gocce con le neurosfere per 15 minuti in un incubatore.
- Lavare le neurosfere con attenzione dal film di paraffina da vampate di calore con il mezzo neurosfere. Per lavare, utilizzare una micropipetta 1 ml e un nuovo 100 millimetri Petri contenenti 10 ml di terreno neurosfere.
- Incubare le neurosfere per i prossimi 4 giorni e aggiungere 2 ml di terreno neurosfere fresco il giorno 2.
NOTA: Assicurarsi che gli scaffali in incubatrice sono piatte in modo che i EHS neurosfere matrice-incorporato non ammassarsi su un lato del piatto.
3. organoidi in una sospensione RotaryCultura (14 giorni)
- Preparare cervello medio organoide miscelando il seguente: 1: 1 miscela di DMEM / F12 e media C (v / v), 1: 200 (v / v) integratore 1, 1: 100 (v / v) integratore 2 w / o vitamina A, 1: 100 L-glutammina, 0,05 mM MEM, 100 U / ml di penicillina, 100 ug / ml streptomicina, 1,6 g / L di insulina, 0,5 uM dorsomorphin, 5 pM SB431542, e 0,05 mM β-mercaptoetanolo.
- Aggiungere 100 ml di cervello organoide mezzo a ciascuna beuta trottola attraverso i suoi bracci laterali e metterli in un incubatore per pre-riscaldamento per almeno 20 min.
- Impostare un programma di agitazione a 25 giri al minuto, secondo le istruzioni del produttore.
NOTA: Prima di trasferire le neurosfere matrice-embedded EHS in fiasche filatore, accertarsi che siano tutti separati. Se due o più sono collegati attraverso matrice EHS, separarli tagliando la matrice di collegamento con un bisturi. - Trasferire accuratamente le neurosfere matrice-embedded EHS in fiasche filatore contenenti 100 ml di terreno organoide noiing una pipetta sierologica 2 ml. Utilizzare i bracci laterali del pallone filatore per trasferire i neurosfere nel pallone.
- Posizionare i contenitori filatore su una piattaforma di agitazione magnetica in un incubatore a 37 ° C e 5% di CO 2; questo è il giorno 0 della cultura organoide.
- Modificare la media una volta alla settimana (o più spesso quando c'è un cambiamento di colore), eliminando la metà del mezzo e aggiungendo la stessa quantità di terreno fresco.
NOTA: Quando si riprendono i palloni filatore fuori dell'incubatore, attendere 3-5 minuti per consentire le organoidi affondare fino al fondo del pallone. Rimuovere il supporto posizionando la punta di vetro pipetta (collegato ad una pompa) sulla superficie del liquido; aspirare il mezzo attenzione attraverso un'apertura laterale / braccio del pallone. Queste manipolazioni devono essere eseguite sotto il cofano laminare.
4. Analisi di cervello organoidi
- Fissazione di organoidi
- Raccogliere le organoidi il giorno 14 del pallone filatore cultura with un taglio 1 micropipetta mL (taglio ~ 5 mm). Mettere tutti in piastre da 60 mm e lavare una volta con 5 ml di caldo DMEM / F12 per 3 min.
- Preparare una provetta da 1,5 ml con 500 ml di caldo 4% paraformaldeide (PFA).
Attenzione: Indossare pelle e protezione per gli occhi e il lavoro sotto una cappa di sicurezza durante la manipolazione PFA fissativo. - Collocare ogni organoide separatamente in ciascun tubo e correggerli per almeno 30 minuti a temperatura ambiente. Non fissare le organoidi per più di 60 min. Per spostare i organoidi, utilizzare un ciclo inoculazione o qualsiasi altro escogitare che è conveniente.
- Rimuovere il PFA e lavare i organoidi fissati due volte per 10 minuti ciascuno con 1 ml di PBS.
- Memorizzare i organoidi in 1 ml di PBS a 4 ° C fino a 7 giorni, fino ad ulteriore utilizzo.
- Incorporare le organoidi per criosezionamento
- Rimuovere il PBS e aggiungere 1 ml di 30% di saccarosio in soluzione acqua distillata per provetta a disidratare le organoidi prima di loro cryofreezing; dopo l'aggiunta di Sucrosoluzione se le organoidi dovrebbe essere galleggiante in superficie. Conservare le organoidi durante la notte in soluzione di saccarosio a 4 ° C; il giorno dopo, i organoidi dovrebbero hanno affondato fino al fondo della provetta.
NOTA: organoidi possono essere conservati per un massimo di 3-5 giorni a 4 ° C in soluzione di saccarosio, se necessario. - Riempire uno stampo vinile campione con 400 ml di temperatura di taglio ottimale (OCT) composto e utilizzare un ciclo inoculazione di effettuare un organoide al centro dello stampo. Etichettare il bordo dello stampo con il nome del campione.
- Congelare lo stampo organoide contenente a -80 ° C fino criosezionamento.
- cryoslides vetro cappotto con 0,1% di soluzione di lisina poli-l-(PLL) in PBS per 5 minuti a temperatura ambiente e lasciate asciugare i vetrini per 3 h. Conservare i campioni a 4 ° C e caldo fino a camera temperato prima dell'uso.
NOTA: PLL-rivestimento è un passo importante, poiché impedisce le fette organoide dal galleggiante via. Raccogliere e conservare soluzione PLL a 4 ° C fino a 3mesi. Prima di riutilizzo, filtrare con una siringa 0,22-micron e farlo riscaldare a temperatura ambiente. - Organoidi sezione cryofrozen in 20-50 fette um di spessore su vetro PLL rivestite cryoslides 22. Lasciate che i vetrini con sezioni asciugare per 1 ora a temperatura ambiente. Conservare le sezioni a -80 ° C fino ad ulteriore trasformazione.
- Rimuovere il PBS e aggiungere 1 ml di 30% di saccarosio in soluzione acqua distillata per provetta a disidratare le organoidi prima di loro cryofreezing; dopo l'aggiunta di Sucrosoluzione se le organoidi dovrebbe essere galleggiante in superficie. Conservare le organoidi durante la notte in soluzione di saccarosio a 4 ° C; il giorno dopo, i organoidi dovrebbero hanno affondato fino al fondo della provetta.
5. immunofluorescenza colorazione di sezioni organoide
NOTA: Per la caratterizzazione generale della organoidi, colorazione con nestina, un marker progenitore neuronale, e TUJ1, un marker pan-neuronale, è raccomandato. Come esempi aggiuntivi, immunofluorescenza con fosfo-Vimentin (p-Vim), le etichette mitotiche apicali cellule gliali radiali, e Arl13b, per ciglia, sono descritti. Per testare l'apoptosi, utilizzare il test Terminal deossinucleotidil transferasi (TdT) dUTP Nick-End Labeling (TUNEL). Porre i vetrini in una scatola di plastica durante le incubazioni per proteggerli da polvere, luce,e l'essiccazione.
- Scongelare i vetrini per 30 minuti a temperatura ambiente.
- Lavare i vetrini due volte con 200 microlitri di PBS-glicina (0,225 g di glicina in PBS) per 3 min per estinguere l'autofluorescenza PFA-indotta.
- Permeabilize sezioni con 200 microlitri di 0,5% Triton X100 / 0,1% Tween in PBS per 10 minuti a temperatura ambiente.
- lavarli due volte con 200 microlitri di soluzione di PBS-glicina per 3 min.
- incubare con 200 ml di 0,5% gelatina di pesce / 0,1% Triton X100 in PBS per 1 ora a temperatura ambiente o per una notte a 4 ° C per bloccare l'antigene legame aspecifico.
NOTA: Se è richiesto un saggio di TUNEL, eseguire il test come da protocollo del produttore. Iniziare con il saggio TUNEL prima di eseguire l'immunocolorazione, come potrebbe interferire con anticorpi secondari e spegnere fluorofori quando utilizzati in seguito. - Diluire gli anticorpi nel bloccare soluzione alle seguenti concentrazioni: nestin, 1: 200; p-Vim, 1: 500; TUJ1, 1: 200;Arl13b, 01:20; e anticorpi secondari, 1: 1000.
- Incubare con 200 microlitri del primo anticorpo primario (per esempio, nestina) per 1-2 ore a temperatura ambiente o per una notte a 4 ° C.
- Lavare 3 x 3 min con 200 microlitri di soluzione di blocco.
- Diluire il primo (anti-topo 488) anticorpo secondario 1: 1.000 in soluzione bloccante e incubare il vetrino in 200 microlitri per 1-2 ore a temperatura ambiente. D'ora in poi, proteggere sempre le diapositive dalla luce.
- Lavare 3 x 3 min con 200 microlitri di soluzione di blocco.
- Incubare con 200 microlitri della successiva anticorpo primario (per esempio, TUJ1) per 1-2 ore a temperatura ambiente o per una notte a 4 ° C.
- Lavare 3 x 3 min con 200 microlitri di soluzione di blocco.
- Aggiungere 200 microlitri della prossima anticorpo secondario (anti-coniglio 647) per 1-2 ore a temperatura ambiente.
- Lavare 3 x 3 min. con 200 microlitri di soluzione di blocco.
- Aggiungere 200 ml di 4' , 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) ad una nM conc 30entration in PBS per 15 minuti a temperatura ambiente per colorazione nucleare.
- Lavare 2 x 3 min con 200 microlitri di soluzione di blocco.
- Lavare 1 x 1 min con 200 ml di acqua distillata e lasciare che le sezioni asciugare per 10-20 minuti, fino a quando non goccia d'acqua ovvia è più visibile.
- Montare le sezioni con mezzo di inclusione. Conservarli al riparo dalla luce a 4 ° C per un massimo di diverse settimane.
- Procedere con l'analisi microscopica all'immagine una panoramica, zona organoide ventricolare, corticale primitivo, e altre aree di interesse.
- Utilizzare un microscopio confocale con un olio 63X filtri obiettive e fluorescenti, scelti in base alle anticorpi secondari colorante fluorescente-tag utilizzati 1, 10.
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Representative Results
La generazione di organoidi cerebrali richiede almeno tre settimane di coltura continua (Figura 1A). Per ottenere risultati riproducibili, è consigliabile che il ricercatore documenta ogni passo e, soprattutto, evita alcuna modifica per quanto riguarda i componenti di media, punti di tempo, e la manipolazione delle cellule. Qui, diamo una sintesi di come valutare se le tappe critiche sono raggiunti al fine di ottenere organoidi di qualità sufficiente alla fine dell'esperimento. La formazione di neurosfere in una piastra a 96 pozzetti deve essere chiaramente visibile dal giorno 4. neurosfere possono essere riconosciuti come sfere ben definite sul fondo di ciascun pozzetto (Figura 1B, passaggio 1).
Il giorno 5, neurosfere dovrebbero essere ~ 500 um di diametro e presentano una superficie liscia, con un bordo luminoso che circonda un centro scuro. Potrebbe essere possibile osservare già neurale stru esteso rosetta-likectures all'interno di questo cerchio luminoso (Figura 1C, inizio del passo 2). Se le neurosfere cadono a pezzi o appaiono più come aggregati di cellule, differenziazione non deve essere continuato ulteriormente. Infine, organoidi dovrebbero aumentare e presentano una dimensione simile durante il processo di differenziazione in fiaschi filatore (Figura 1D, passaggio 3). Vedere la tabella di risoluzione dei problemi (Tabella 1) per ulteriori informazioni.
La qualità del giorno-14 organoidi vanno verificate mediante microscopia ottica. VZS sono composti da spessi strati di NPC / cellule gliali radiali nestina positive con una forma nucleare palizzate sul lato apicale. D'altra parte, la piastra corticale primitivo conterrà abbondanti neuroni TUJ1-positivo sul lato basale, spazialmente distinte dal lato apicale (Figura 1E). È importante sottolineare che i neuroni TUJ1-positivi non dovrebbero essere visti al lato apicale del VZ.
(Figura 1F e G) 23,24. Quando viene raggiunto l'espansione Arg sufficiente, neurogenesi comincia, le cellule in divisione cambiano il loro orientamento verso il lume, e il piano di separazione commutatori da orizzontale (simmetrica) a verticale (asimmetrica) 4, 12, 24.
Figura 1: Generazione di organoidi cerebrali da cellule IPS. (A) del flusso di lavoro del protocollo di differenziazione. Fase 1: Inizio della differenziazione. Durante questa fase, la formazione di neurosfere da iPSCs umani in una piastra a 96 pozzetti si verifica. La durata è di 5 giorni. Fase 2: Incorporare le neurosfere in EHS goccioline matrice. Una coltura in sospensione stazionaria EHS neurosfere matrice-embedded ha una durata di 4 giorni. Fase 3: organoidi in fiaschi Spinner. Il trasferimento di EHS neurosfere matrice-embedded trottola fiasche avviene. La durata è di 14 giorni. (B) Un neurosfere in una piastra a pozzetti multipli. è mostrato Rappresentante immagine di un neurosfere il giorno 4 in una piastra da 96 pozzetti durante la fase 1. La sfera deve essere chiaramente visibile sul fondo del pozzo, con una superficie liscia e rotonda (arro rossow). (C) Morfologia neurosfere prima EHS matrice incorporamento. Neurosfere raccolti il giorno 5 del passaggio 1 devono essere uniformi per dimensioni e visualizzare una superficie liscia con un bordo luminoso (staffa e freccia). (D) organoidi in fiaschi filatore. Un pallone filatore con organoidi cervello durante la fase 3 (frecce rosse) è mostrato qui. (E) l'imaging immunofluorescente di organoidi cryosectioned visualizzazione di una tipica VZ e piastra corticale primitivo. Il pannello di sinistra mostra la colorazione nucleare di cellule al VZ. Il VZ estende dal lato apicale (lume L) al lato basale (linea gialla). Si noti che le cellule all'interno del display VZ nuclei palizzata-like, suggerendo che essi sono cellule gliali radiali. Il pannello di destra mostra l'immunofluorescenza di NPC nestina-positive (verde) all'interno del VZ e neuroni TUJ1-positivi (magenta) nella piastra corticale primitivo. bar scala = 50 pm. (F) di imaging immunofluorescente di organoidi cryosectioned. due esempidi VZS colorati con p-Vim e Arl13b (I e III). Le regioni contrassegnati da quadrati bianchi sono ingrandite a destra per ogni inserto immagine (ii e iv). Il piano di separazione di anafase apicale cellule gliali radiali (args). Dividendo apicali cellule gliali radiali sul lato apicale del VZ sono p-Vim-positivi (magenta). Esempi di args simmetricamente divisori sono mostrati (quadrati bianchi e inserti). Il piano di separazione è data come una linea bianca. Il piano di separazione di una cella anaphase è orizzontale rispetto alla linea di superficie lume (giallo linea tratteggiata) ed è caratterizzato da Arl13b colorazione (verde). bar scala = 50 pm. (G) Questo schema prevede l'orientamento verticale o orizzontale ARG anafase rispetto al lume. Le cellule in divisione di organoidi controllo al giorno 14 sono principalmente orientati orizzontalmente (0-30 °) rispetto alla superficie del lume VZ. Il lato apicale del lume è fiancheggiata dalle ciglia primario args, che specificano la superficie lume del VZ (linea verde). In contrasto, most delle cellule gliali radiali di organoidi microcefalia visualizzare una (60-90 °) piano di separazione orientato verticalmente. La linea bianca indica l'asse del piano di separazione. Si prega di cliccare qui per vedere una versione più grande di questa figura.
| Problema: | I motivi possibili: | suggerimenti: |
| passo 1.1.1.2 | Scarsa efficienza della riprogrammazione | Controllare hiPSCs per i marcatori pluripotenza: se la qualità è bassa, scegliere manualmente colonie indifferenziate per alcuni passaggi per arricchire colonie pluripotenti |
| iPSCs umani differenziano prima dell'inizio della differenziazione | ||
| Lo stress a causa di passaging presto o passaging come singole cellule | Non farlo è raggiunto il passaggio prima che l'80% di confluenza. Passage come aggregati, le cellule non singoli | |
| La contaminazione con micoplasma | Test per la contaminazione da micoplasma | |
| Passo 2 | Scarsa qualità del hiPSCs | Migliorare la qualità della hiPSCs (vedi sopra) |
| Neurosfere non formano affatto o cadere a pezzi al giorno 5 dopo l'inizio della differenziazione | numero iniziale di cellule per pozzetto è troppo bassa o troppo alta | Accuratamente contare il numero di cellule e distribuirli equamente in ciascun pozzetto |
| media hiPSC è stato utilizzato al posto del terreno di differenziamento neurale | Utilizzare terreno di differenziamento neurale | |
| fase di centrifugazione era troppo dura o per lievi | Spin 96 pozzetti 500 xg per 3 min e verificare se le cellule accumulate centrale aifondo di ciascun pozzetto | |
| No Y-27632 all'inizio di differenziazione | Utilizzare Y-27632 per migliorare la sopravvivenza cellulare | |
| Cellule attaccate e cresciuto sul fondo del piatto | Assicurarsi che un non aderente a 96 pozzetti piastra v-bottom viene utilizzato. | |
| Passo 2 | Nessun cambiamento medio giornaliero | Modificare la metà quantità di mezzo di tutti i giorni |
| Neurosfere non sono omogenee in termini di dimensioni | numero di cellule di partenza per pozzetto non era uguale | Mescolare il tubo con sospensione cellulare singolo ogni volta prima di estrarre 100 microlitri di sospensione cellulare |
| il cambiamento medio non è stato fatto per ogni bene tutti i giorni | Assicurarsi che ogni pozzo ottiene il cambiamento medio giornaliero | |
| Passo 2 | hiPSC non fosse dissociato into singole cellule prima dell'inizio della differenziazione | Controllare al microscopio se hiPSC sono dissociate da singole cellule dopo il trattamento accutase. Se ci sono ancora aggregati, le cellule pipette 10 volte su e giù con 100 microlitri micropipetta e controllare di nuovo o ripetere il trattamento accutase |
| Neurosfere non visualizzano un cerchio o una superficie circolare; formano grandi cisti in superficie | numero di cellule di partenza per pozzetto era troppo alto | Accuratamente contare il numero di cellule e distribuirli equamente in ciascun pozzetto |
| il cambiamento medio non è stato fatto ogni giorno per ogni pozzetto | Modificare la metà del quotidiano medio | |
| fase 2.7 | Scarsa qualità del hiPSCs | Migliorare la qualità della hiPSCs (vedi sopra) |
| EHS matrice incorporata neurosfere attaccano e ciuffo insieme | Non abbastanza media (volume) | Fornire unminimo di 10 ml di mezzo in un petridish 100 millimetri |
| Mensola di incubatore nemmeno | Posizionare piatto su una superficie piana | |
| Dopo aver posizionato in incubatrice, spostare il piatto in modo che neurosfere sono distribuiti uniformemente |
Tabella 1: risoluzione dei problemi Tabella.
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Discussion
MCPH è un disordine dello sviluppo neurologico umana complessa che non può essere ricapitolato in modelli animali in vivo o in cultura semplici cellule umane in vitro si avvicina. La manifestazione clinica della MCPH comincia ad apparire durante il primo trimestre, quando comincia presto neurogenesi. Così, organoidi cerebrali in 3D rappresentano un sistema sperimentale affidabile per modellare lo sviluppo MCPH. Inoltre, 3D organoidi cervello umano sono un approccio ideale in quanto i) che consentono l'adattamento di uno spettro di campioni con vari background genetico, ii) essi mostrano tessuto organizzata contenente diversi tipi di cellule neuronali, e, soprattutto, iii) differenziazione varie fasi di neurodevelopment in questo approccio in vitro sono collegate alle loro controparti in vivo 25, 26, 27. Ad esempio, la rosetta neurale è una struttura equivalente al neurale sviluppotubo.
Lancaster et al. usato due volte il numero di iPSCs pazienti rispetto ai controlli iPSCs per riuscire a generare organoidi paziente. Da notare, con il protocollo qui descritto, modificando i metodi esistenti, si potrebbe generare controllo e organoidi cerebrali microcefalia partire dagli stessi numeri di cella 4. Ciò è stato possibile grazie alle condizioni di coltura definite iPSCs ea causa di una differenziazione più diretto. In questo protocollo, generazione organoide stata migliorata sostituendo la fase di formazione EB comunemente eseguita avviando differenziamento neurale direttamente da iPSCs. In secondo luogo, nel passaggio 3, dorsomorphin e SB431542 sono stati completati nel mezzo di coltura al posto dell'acido retinoico solo. L'acido retinoico è facilmente isomerizzato quando applicato a mezzo di coltura cellulare 28. Pertanto, la sua attività biologica è meno definito rispetto a quella dei composti più stabili, come dorsomorphin. inibisce Dorsomorphinil percorso di segnalazione BMP4 e SB431542 è un inibitore della / pathway nodale activin (TGF-β1 ALK inibitore). Una combinazione di entrambi i composti porta all'inibizione della BMP e / percorso di segnalazione nodale activin, induce la differenziazione neuronale, e riduce la differenziazione in altre linee in varie linee cellulari ES umane o cellule iPS umane con un'efficienza simile 29. Stabilità composto e risposta cellulare universale ad un composto sono punti importanti per stabilire un protocollo che può essere applicata a diverse linee cellulari paziente per modellare una malattia in vitro. Così, un robusto ed efficiente risultati differenziazione nel cervello omogenea organoide culture e, alla fine, in dati più riproducibili.
Con queste modifiche, fasi critiche nel protocollo sono minimizzati per l'apertura di differenziazione nel passaggio 1. A questo punto, è importante dissociare delicatamente i iPSCs in una cella singola sospensione and di distribuire con precisione e in modo uniforme a ciascun pozzetto della piastra a 96 pozzetti. inibitore della proteina chinasi Rho-associata (Y-27632) deve essere aggiunto a un terreno B durante le prime 24 ore, in quanto supporta la sopravvivenza di iPSCs sulla loro dissociazione di cellule singole. E 'importante portare cellule in stretto contatto tra loro da farli girare fino al fondo dei pozzetti. Una volta neurosfere sono formati alla fine del passaggio 1, il completamento delle procedure sperimentali può essere previsto. Nel caso neurospheres non formano, la pluripotenza delle iPSCs umani, la non-aderenza delle cellule nella piastra a 96 pozzetti, e le condizioni di centrifugazione deve essere controllato. L'intera procedura il giorno 0 della fase 1 non dovrebbe più di 1 h prendere a causa della sensibilità di iPSCs umani. cambiamenti medi nei giorni successivi deve essere fatto con attenzione, evitando forze di taglio, in modo da non distruggere contatti cellulari appena formata tra le celle.
È interessante notare che centrosomAl mutanti hanno proliferazione cellulare difettoso e dinamiche del ciclo cellulare alterati. Così, modellando MCPH richiede un protocollo potente che può resistere alle funzioni cellulari compromesse. Quindi, l'attuale protocollo consente la generazione di organoidi omogenei di alta qualità e serve come uno strumento unico per studiare omeostasi cellulare fusto alla VZ. A differenza di altri protocolli, questo protocollo permette la generazione di organoidi dal controllo e pazienti iPSCs, iniziando con un numero uguale di cellule. Per gli studi basati sulla differenziazione in vitro, condizioni di coltura identiche per diversi iPSCs sono un requisito fondamentale per identificare alterazioni correlati alla malattia e per evitare cultura condizione artefatti. Oltre modellazione microcefalia di origine genetica, questo protocollo può anche essere applicato a microcefalia di origine non genetica, anche da infezioni virali neurotrofici, prodotti chimici o radiazioni. 30 Inoltre, i moderni strumenti di biologia molecolare, come CRISPR / Cas9 genoma-editing tecnologie, possono essere applicati a organoidi 3D dissezionare aspetti specifici del paradigma sviluppo del cervello umano in vitro 31, 32, 33.
D'altra parte, la generazione di organoidi cerebrali fino ad oggi non ha ancora superato il primo e l'inizio del secondo trimestre di sviluppo umano 34. Superando questo limite e consentendo la generazione di organoidi cervello maturo in vitro aprirebbe nuove strade per modellare patologie neurodegenerative che si manifestano nelle fasi successive, come il Parkinson o il morbo di Alzheimer. Per le applicazioni future, i protocolli di dirigere la differenziazione a regioni più specifici, come il prosencefalo o mesencefalo, potrebbe essere di interesse per studiare i disturbi neurologici complessi come l'autismo e la schizofrenia 35, 36, 37, 38.
È importante sottolineare che alcuni aspetti devono essere presi in considerazione quando trarre conclusioni dagli studi organoide. La prima limitazione è che non c'è vascolarizzazione evidente organoidi. Così, lo scambio gassoso e di nutrienti in vitro solo approssimativa in vivo condizioni. In secondo luogo, dal momento che organoidi cervello non sono collegati a sistemi di organi complessi, il modello organoide manca un immunitaria completa, metaboliche, e il sistema ormonale. Tuttavia, l'assenza di questi aspetti talvolta fornisce un vantaggio. Ad esempio, i organoidi qui descritte potrebbero sostituire immunodepressi modelli in vivo, quando affrontare l'impatto del sistema immunitario nella patogenesi dei disturbi cerebrali.
Con l'uso di palloni filatore, un gran numero di organoidi può essere generato per esperimenti biochimici, intero trascrittoma sequenziamento, e alto throughput screening droga. Nel loro insieme, da ucantare questo protocollo attuale, si può generare organoidi cerebrali da cellule iPSCs umane, che possono poi essere utilizzati in una vasta gamma di applicazioni, dalla modellazione malattie alle piattaforme di prova della droga, al fine di sostituire in modo affidabile sperimentazione animale in futuro.
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Acknowledgments
Questo lavoro è stato sostenuto dalla Fondazione Fritz Thyssen (Az.10.14.2.152). Siamo grati alla struttura del tessuto embedding e la struttura di base del microscopio di CMMC. Siamo grati per le discussioni e il supporto tecnico forniti dai membri del Laboratorio per Centrosome e citoscheletro Biology. Ringraziamo Li Ming Gooi per la correzione delle bozze del manoscritto.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Anti-mouse 488 | Invitrogen | A-11001 | Goat anti-Mouse IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 |
| Anti-rabbit 647 | Invitrogen | A-21245 | Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 647 |
| Arl13b | proteintech | 17711-1-AP | ARL13B rabbit polyclonal antibody |
| CELLSPIN system | IBS Integra Bioscience | 183001 | |
| DAPI | Sigma-Aldrich, US | 32670 | 4′,6-Diamidino-2-phenylindole dihydrochloride; multiple suppliers |
| DMEM/F-12 | Gibco, US | 31331093 | Dulbecco's Modified Eagle Medium: Nutrient Mixture F-12 |
| Dorsomorphin | Sigma-Aldrich, US | P5499 | Compound C; multiple suppliers |
| Embedding medium | AppliChem | A9011, 0100 | Mowiol; embedding medium; multiple suppliers |
| Engelbreth-Holm-Swarm (EHS) matrix | Corning | 354277 | Matrigel hESC-qualified matrix; important: hESC qualified |
| Fish gelatin | Sigma-Aldrich, US | G7765-250ML | Gelatin from cold water fish skin; multiple suppliers; autoclave after adding to PBS to dissolve and sterilize, store at 4 °C |
| Glycine | AppliChem | A1067,1000 | Glycine for molecular biology; multiple suppliers |
| Inoculation loop with needle, disposable (1 µL) | Sigma Aldrich, US | BR452201-1000EA | multiple suppliers |
| Insulin | Sigma-Aldrich, US | I3536-100MG | multiple suppliers |
| L-glutamine | Gibco, US | 25030081 | L-glutamine (200 mM) |
| Medium A | Stem cell technologies | #05850 | mTeSR1 (hiPSC medium) |
| Medium B | Stem cell technologies | #05835 | Neural induction medium (NIM); neural differentiation medium |
| Medium C | Gibco, US | 21103049 | Neural Basal Medium |
| MEM | Gibco, US | 11140035 | MEM non-essential amino acids solution (100x) |
| MycoAlert Mycoplasma Detection Kit | Lonza, Switzerland | #LT07-218 | Mycoplasma detection kit; multiple suppliers |
| Nestin | Novus biologicals | NBP1-92717 | Nestin mouse monoclonal antibody (4D11) |
| Paraformaldehyde (PFA) | AppliChem | A3813, 0500 | 4% in PBS, store solution at -20 °C; caution: wear skin and eye protection and work under hood |
| PBS tablets | Gibco, US | 18912014 | See manufacturer´s instructions; multiple suppliers |
| Penicillin-Streptomycin (10.000 U/mL) | Gibco, US | 15140122 | Multiple suppliers |
| Poly-L-lysine solution (PLL) | Sigma-Aldrich, US | P8920-100ML | Multiple suppliers |
| pVim | MBL | D076-3S | Phospho-Vimentin (Ser55) mAb |
| Reagent A | Stem cell technologies | # 05872 | Note to Protocol 1.1.1.2; ReLSR (Enzyme-free human ES and iPS cell selection and passaging reagent); please follow manufactorer´s protocol; alternative products from muliple suppliers available |
| Reagent B | Sigma-Aldrich, US | A6964-100ML | Accutase solution is an enzymatic solution for single cell dissociation; multiple suppliers; protocol 1.1.2 "enzymatic cell dissociation solution” |
| Research Cryostat Leica CM3050 S | Leica biosystems | CM3050 S | Multiple suppliers |
| SB431542 | Selleckchem.com | S1067 | Multiple suppliers |
| Spinner flask 250 mL | IBS Integra Bioscience | 182026 | |
| Sucrose | AppliChem | A4734, 1000 | Multiple suppliers |
| Superfrost ultra plus microscope slides | Thermo scientific, US | J3800AMNZ | Slides should be labeled with a "+" and positively charged |
| Supplement 1 | Gibco, US | 17502048 | N-2 supplement (100x) |
| Supplement 2 w/o Vitamin A | Gibco, US | 12587010 | B-27 supplement (50x), minus vitamin A; multiple suppliers |
| Tissue-Tek Cryomold | Sakura, NL | 4565 | Multiple suppliers |
| Tissue-Tek O.C.T. compound | Sakura, NL | 4583 | Multiple suppliers |
| Triton X-100 | AppliChem | A1388,0500 | Multiple suppliers |
| TUJ1 | Sigma-Aldrich, US | T2200 | β-Tubulin III (rabbit polyclonal) |
| TUNEL assay | Promega, US | G3250 | DeadEnd Fluorometric TUNEL system; multiple suppliers |
| Tween 20 for molecular biology | AppliChem | A4974,0500 | Multiple suppliers |
| waterproof sheet | BEMIS company, inc. | PM996 | Parafilm “M”; multiple suppliers |
| Y-27632 | Selleckchem.com | S1049 | ROCK-inhibitor (Y-27632 2HCL); multiple suppliers |
| β-mercaptoethanol | Gibco, US | 31350010 | 2-mercaptoethanol (50 mM); multiple suppliers |
References
- Lancaster, M. A., et al. Cerebral organoids model human brain development and microcephaly. Nature. 501, 373-379 (2013).
- Eiraku, M., Sasai, Y. Mouse embryonic stem cell culture for generation of three-dimensional retinal and cortical tissues. Nat Protoc. 7, 69-79 (2012).
- Nakano, T., et al. Self-formation of optic cups and storable stratified neural retina from human ESCs. Cell Stem Cell. 10, 771-785 (2012).
- Gabriel, E., et al. CPAP promotes timely cilium disassembly to maintain neural progenitor pool. EMBO J. 35 (8), 803-819 (2016).
- Al-Dosari, M. S., Shaheen, R., Colak, D., Alkuraya, F. S. Novel CENPJ mutation causes Seckel syndrome. J Med Genet. 47, 411-414 (2010).
- Wollnik, B. A common mechanism for microcephaly. Nat Genet. 42, 923-924 (2010).
- Thornton, G. K., Woods, C. G. Primary microcephaly: do all roads lead to Rome? Trends Genet. 25, 501-510 (2009).
- Barbelanne, M., Tsang, W. Y. Molecular and cellular basis of autosomal recessive primary microcephaly. Biomed Res Int. 2014, 547986 (2014).
- Homem, C. C., Repic, M., Knoblich, J. A. Proliferation control in neural stem and progenitor cells. Nat. Rev. Neurosci. 16, 647-659 (2015).
- Gabriel, E., et al. CPAP promotes timely cilium disassembly to maintain neural progenitor pool. EMBO J. 35, 803-819 (2016).
- Mak, S. K., et al. Small molecules greatly improve conversion of human-induced pluripotent stem cells to the neuronal lineage. Stem Cells Int. , (2012).
- Morizane, A., Doi, D., Kikuchi, T., Nishimura, K., Takahashi, J. Small-molecule inhibitors of bone morphogenic protein and activin/nodal signals promote highly efficient neural induction from human pluripotent stem cells. J. Neurosci. Res. 89, 117-126 (2011).
- Shi, Y., Kirwan, P., Livesey, F. J. Directed differentiation of human pluripotent stem cells to cerebral cortex neurons and neural networks. Nat Protoc. 7, 1836-1846 (2012).
- Zhou, J., et al. High-efficiency induction of neural conversion in human ESCs and human induced pluripotent stem cells with a single chemical inhibitor of transforming growth factor beta superfamily receptors. Stem Cells. 28, 1741-1750 (2010).
- Takahashi, K., et al. Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors. Cell. 131, 861-872 (2007).
- Okita, K., et al. A more efficient method to generate integration-free human iPS cells. Nat Methods. 8, 409-412 (2011).
- Yu, J., et al. Human induced pluripotent stem cells free of vector and transgene sequences. Science. 324, 797-801 (2009).
- Lieu, P. T., Fontes, A., Vemuri, M. C., Macarthur, C. C. Generation of induced pluripotent stem cells with CytoTune, a non-integrating Sendai virus. Methods Mol. Biol. 997, 45-56 (2013).
- Bai, Q., et al. Temporal analysis of genome alterations induced by single-cell passaging in human embryonic stem cells. Stem Cells Dev. 24, 653-662 (2015).
- Garitaonandia, I., et al. Increased risk of genetic and epigenetic instability in human embryonic stem cells associated with specific culture conditions. PLoS One. 10, e0118307 (2015).
- Ohnuma, K., et al. Enzyme-free passage of human pluripotent stem cells by controlling divalent cations. Sci. Rep. 4, 4646 (2014).
- Currle, D. S., Monuki, E. S. Flash freezing and cryosectioning E12.5 mouse brain. J Vis Exp. , (2007).
- Yingling, J., et al. Neuroepithelial stem cell proliferation requires LIS1 for precise spindle orientation and symmetric division. Cell. 132, 474-486 (2008).
- Rakic, P. A small step for the cell, a giant leap for mankind: a hypothesis of neocortical expansion during evolution. Trends Neurosci. 18, 383-388 (1995).
- Hu, B. Y., et al. Neural differentiation of human induced pluripotent stem cells follows developmental principles but with variable potency. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 107, 4335-4340 (2010).
- Wilson, P. G., Stice, S. S. Development and differentiation of neural rosettes derived from human embryonic stem cells. Stem Cell Reviews. 2, 67-77 (2006).
- Dhara, S. K., Stice, S. L. Neural differentiation of human embryonic stem cells. J. Cell Biochem. 105, 633-640 (2008).
- Christie, V. B., et al. Synthesis and evaluation of synthetic retinoid derivatives as inducers of stem cell differentiation. Org Biomol Chem. 6, 3497-3507 (2008).
- Kim, D. S., et al. Robust enhancement of neural differentiation from human ES and iPS cells regardless of their innate difference in differentiation propensity. Stem Cell Reviews. 6, 270-281 (2010).
- Gabriel, E., et al. Recent Zika Virus Isolates Induce Premature Differentiation of Neural Progenitors in Human Brain Organoids. Cell stem cell. , (2017).
- Wu, J., Hunt, S. D., Xue, H., Liu, Y., Darabi, R. Generation and Characterization of a MYF5 Reporter Human iPS Cell Line Using CRISPR/Cas9 Mediated Homologous Recombination. Sci. Rep. 6, 18759 (2016).
- Li, H. L., Gee, P., Ishida, K., Hotta, A. Efficient genomic correction methods in human iPS cells using CRISPR-Cas9 system. Methods. 101, 27-35 (2016).
- Grobarczyk, B., Franco, B., Hanon, K., Malgrange, B. Generation of Isogenic Human iPS Cell Line Precisely Corrected by Genome Editing Using the CRISPR/Cas9 System. Stem Cell Reviews. 11, 774-787 (2015).
- Camp, J. G., et al. Human cerebral organoids recapitulate gene expression programs of fetal neocortex development. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 112, 15672-15677 (2015).
- Qian, X., et al. Brain-Region-Specific Organoids Using Mini-bioreactors for Modeling ZIKV Exposure. Cell. 165, 1238-1254 (2016).
- Jo, J., et al. Midbrain-like Organoids from Human Pluripotent Stem Cells Contain Functional Dopaminergic and Neuromelanin-Producing Neurons. Cell Stem Cell. 19, 248-257 (2016).
- Mariani, J., et al. FOXG1-Dependent Dysregulation of GABA/Glutamate Neuron Differentiation in Autism Spectrum Disorders. Cell. 162, 375-390 (2015).
- D'Avanzo, C., et al. Alzheimer's in 3D culture: challenges and perspectives. Bioessays. 37, 1139-1148 (2015).
